KR101043825B1

KR101043825B1 - 잔토휴몰 또는 그 유도체들을 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101043825B1
Application number: KR1020080097329A
Authority: KR
Inventors: 김정애; 이용록; 이종숙; 곽미경
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2008-10-02
Filing date: 2008-10-02
Publication date: 2011-06-22
Also published as: KR20100037963A

Abstract

본 발명은 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 잔토휴몰 및 그 유도체들에서 선택된 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 융모요막 모델에서의 신생혈관형성 억제효과 및 암세포 전이 억제효과가 탁월하여, 암전이를 비롯한 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물로 사용할 수 있다.

잔토휴몰, 혈관신생, 암전이, 약학조성물

Description

잔토휴몰 또는 그 유도체들을 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating angiogenesis relating diseases comprising xanthohumol or its derivatives}

본 발명은 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 잔토휴몰 및 그 유도체들에서 선택된 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정으로서, 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아 발생(embryonic development), 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며 이러한 경우에도 엄격히 조절되어 진행된다(Folkman J et al., Int. Rev. Exp. Pathol., 16, pp207-248, 1976).

성인의 경우 혈관내피세포는 매우 느리게 자라며, 다른 종류의 세포에 비하여 상대적으로 잘 분열하지 않는다. 혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 혈관신생 촉진인자의 자극에 의하여 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피 세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다.

그러나 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있다. 병리학적 상태에서 나타나는 혈관신생에 관련된 질환으로는 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형 및 심혈관 질환인 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증이 있고, 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유 증식증, 과립성 결막염 등이 있다.

관절염과 같은 만성 염증성 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환, 알츠하이머 및 비만도 혈관신생과 관련이 있으며, 암의 성장과 전이는 반드시 혈관신생에 의존한다(D'Amato RJ et al., Ophthalmology, 102(9), pp1261-1262, 1995 ; Arbiser JL, J. Am. Acad. Dermatol., 34(3), pp486-497, 1996 ; O'Brien KD et al. Circulation, 93(4), pp672-682, 1996 ; Hanahan D et al., Cell, 86, pp353-364, 1996).

특히 암의 경우 혈관신생은 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다. 종양은 신생혈관을 통하여 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급받으며, 또한 종양까지 침투한 신생 혈관들은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어가는 기회를 줌으로써 암세포가 전이되도록 한다(Folkman and Tyler, Cancer Invasion and metastasis, Biologic mechanisms and Therapy(S.B. Day ed.) Raven press, New York, pp94-103, 1977; Polverini PJ, Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 6(3), pp230- 247, 1995).

암 환자가 사망하는 주원인은 전이이며, 현재 임상에서 사용되는 화학요법이나 면역요법들이 암 환자의 생존율을 높이는데 기여하지 못하고 있는 것은 바로 암의 전이 때문이다.

염증성 질환의 대표적인 질환인 관절염은 자가면역 이상이 원인이지만, 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증이 혈관신생을 유도하여 연골이 파괴된다. 즉, 염증을 유도하는 사이토카인의 도움으로 활액세포와 혈관내피세포가 활액강에서 증식을 하여 혈관신생이 진행되면서 연골부에 발생하는 결합조직층인 관절 판누스를 형성하여 쿠션 역할을 하는 연골이 파괴된다(Koch AE et al., Arthritis. Rheum., 29, pp471-479, 1986; Stupack DG et al., Braz J. Med. Biol. Rcs., 32(5), pp578-581, 1999; Koch AE, Atrhritis. Rheum., 41(6), pp951-962, 1998).

해마다 전 세계적으로 수백만 명이 실명하게 되는 많은 안과질환도 혈관신생이 원인이 되고 있다(Jeffrey MI et al., J. Clin. Invest., 103, pp1231-1236, 1999). 그 대표적인 예로 노인에게 일어나는 퇴화반(macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장과 신생혈관에 의한 각막 질환과 같은 질병은 혈관신생이 원인이 되는 질병들이다(Adamis AP et al., Angiogenesis, 3, pp9-14, 1999). 그 중 당뇨병성 망막증은 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게 되는 질병이다.

붉은 반점과 인설의 피부가 특징인 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데 치유되지 않으며 고통과 기형을 수반한다. 정상인 경우 각질세포가 한달에 한번 증식하는데 비해 건선 환자는 적어도 일주일에 한번 증식한다. 이런 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어날 수밖에 없다(Folkman J, J. Invest. Dermatol., 59, pp40-48, 1972).

혈관 신생 억제제를 이러한 각종 혈관신생 관련 질환의 치료제로 적용할 수 있으므로, 최근에 혈관신생을 억제시켜서 상기 질환들을 치료하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이와 같은 혈관신생 억제제는 보통 환자에게 장기적으로 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이어야 가장 이상적인 치료제로 사용할 수 있다. 따라서 혈관신생 억제제로서 독성이 미비한 약제의 개발이 요구되어지고 있다.

한편, 잔토휴몰은 맥주의 원료로 사용되는 홉(Hop)에 들어있는 성분으로서, 광범위한 생리활성효과를 가지고 있다. 예를들어, 체내의 유해성분들이 물에 쉽게 용해되어 체외로 배출되도록 돕는 작용을 하고, 산화스트레스(oxidative stress)를 줄여주고 지방대사를 조절하고, 콜레스테롤을 낮춰주며, 골다공증과 심장병을 예방하는 것으로 알려져 있다.

이에, 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 잔토휴몰 및 그 유도체들이 우수한 혈관신생 억제효과 및 암전이 억제효과를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 잔토휴몰 및 그 유도체들을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 잔토휴몰 및 그 유도체들에서 선택된 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다:

상기 화학식 1 및 화학식 2에서,

상기 R₁ 내지 R₅는 같거나 또는 서로 다르며, 각각은 히드록시, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 티오알콕시, 알콕시알콕시, 할로게노알킬, 할로게노알케닐 또는 알콕시알킬에서 선택된 어느 하나임.

본 발명의 화합물은 R₁ 내지 R₅가 같거나 또는 서로 다르며, 각각은 히드록시, 알킬, 알콕시, 알케닐, 트리알킬실릴알콕시알콕시 또는 알콕시알콕시에서 선택된 어느 하나이며, 바람직하게는 R₁내지 R₅가 같거나 또는 서로 다르며, 각각은 히드록시, 메틸, 메톡시, 이소펜테닐, 트리메틸실릴에톡시메톡시(SEMO) 또는 메톡시메톡시에서 선택된 어느 하나이다.

본 발명의 화합물로서 대표적인 화합물은 하기 화학식 3로 표시되는 4-O-메틸잔토휴몰, 화학식 4로 표시되는 4-O-메틸잔토휴몰 유도체, 화학식 5로 표시되는 잔토휴몰 C 및 화학식 6으로 표시되는 잔토휴몰 C 유도체이다.

상기 혈관신생으로 인한 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암의 침윤과 전이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 화합물은 하기 기술된 방법에 따라 수득될 수 있다.

화학식 3으로 표시되는 4-O-메틸잔토휴몰은 1-[2-히드록시-4,6-디메톡시-3-(3-메틸부트-2-에닐)페닐]-3-[4-(2-트리메틸실라닐에톡시메톡시)페닐]프로페논{1-[2-hydroxy-4,6-dimethoxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]-3-[4-(2-trimethylsilanylethoxymethoxy)phenyl]propenone} 화합물에 메탄올 또는 에탄올 용매 하에서 농염산(c-HCl) 또는 3N 염산(HCl)과의 반응을 통해 제조할 수 있다.

화학식 4로 표시되는 4-O-메틸잔토휴몰 유도체는 1-[2-히드록시-4,6-디메톡시-3-(3-메틸부트-2-에닐)페닐]에타논{1-[2-hydroxy-4,6-dimethoxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]ethanone} 화합물을 메탄올 또는 에탄올 용매 하에서 수산화칼륨 또는 수산화나트륨의 염기를 사용하여 4-(2-트리메틸실라닐에톡시메톡시)벤즈알데히드{4-(2-trimethylsilanylethoxymethoxy)benzaldehyde} 화합물과의 반응을 통해 제조할 수 있다.

화학식 5로 표시되는 잔토휴몰 C는 1-(5-히드록시-7-메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘-6-일)-3-(4-메톡시메톡시페닐)프로페논{1-(5-hydroxy-7-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene-6-yl)-3-(4-methoxymethoxyphenyl)propenone} 화합물에 메탄올 또는 에탄올 용매 하에서 농염산(c-HCl) 또는 3N 염산(HCl)과의 반응을 통해 제조할 수 있다.

화학식 6으로 표시되는 잔토휴몰 C 유도체는 1-(5-히드록시-7-메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘-6일)에타논{1-(5-Hydroxy-7-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)ethanone} 화합물을 메탄올 또는 에탄올 용매 하에서 수산화칼륨 또는 수산화나트륨의 염기를 사용하여 4-메톡시메톡시벤즈알데히드(4-methoxymethoxybenzaldehyde) 화합물과의 반응을 통해 제조할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 수득한 본 발명의 화합물은 닭의 융모요막 모델에서 혈관내피성장인자와 같은 신생혈관형성 유도물질의 처리에 따른 신생혈관형성 증가를 억제하였으며, HT-1080 암세포의 전이를 감소시켰고, 혈관내피성장인자와 함께 중요한 혈관신생의 기여인자인 메탈릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase; MMP) 패밀리인 MMP-2 및 MMP-9의 활성 및 발현을 억제함으로써 혈관신생으로 인한 질환의 치료 및 예방용 약학조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물의 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다.

본 발명의 화합물을 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

또한, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 화합물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 융모요막 모델에서 신생혈관형성을 억제하면서 또한 HT-1080 암세포의 전이를 억제함으로써 이를 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 암전이를 비롯한 혈관신생으로 인한 질환의 치료 및 예방에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이러한 실시예 등은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이러한 실시예 등에 의해 한정되는 것은 아니다.

<참고예 1> 실험재료 및 시약, 기기 분석

유정란은 백자토종닭 농장(청송, 한국)에서 구입하여 사용하였으며, HUVEC 세포는 Cambrex Bioscience (Walksville, MD, USA)에서 구입하였다.

코티존 아세테이트(cortisone acetate)는 알드리치사(Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 혈관내피성장인(VEGF, vascular endothelial growth factor)는 알앤디(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였으며, 와트만 필터 디스크(whatman filter disc)는 와트만사(Whatman, UK) 로부터 구입하였다.

합성된 물질의 구조 규명에는 Bruker AMX 250 MHz 모델을 사용하여 1H-NMR 스펙트라 (spectra)를 얻었으며, 액체크로마토그래피/질량분석기(LC/Mass Spectrometry)는 피니간 LCQ 어드벤티지(Finnigan LCQ Advantage) LC/MS/MS 분광계(spectrometry)를 엑스칼리버(Xcalibur) 프로그램을 이용하여 분석하였다.

TLC(Thin-layer chromatography)와 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)는 머크사 (Merck)의 실리카겔 키젤겔 (Silicagel Kieselgel) 60 F254 (230 ∼ 240 mesh)을 사용하였다.

<실시예 1> 화학식 3으로 표시되는 화합물(L4)의 제조

1-[2-히드록시-4,6-디메톡시-3-(3-메틸부트-2-에닐)페닐]-3-[4-(2-트리메틸실라닐에톡시메톡시)페닐]프로페논{1-[2-Hydroxy-4,6-dimethoxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]-3-[4-(2-trimethylsilanylethoxymethoxy)phenyl]propenone; 0.16 g, 0.31 mmol)에 메탄올(10 mL)을 넣고 c-HCl(5 drops)를 가한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.

메탄올을 날린 후 물(20 mL)을 넣고 EtOAc(3 x 30 mL)를 이용하여 추출하였다. 추출한 용액을 NaHCO₃ 용액(30 mL)과 물(30 mL)로 세척하고 MgSO₄에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하여 잔유물을 얻는 후 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분리하여 생성물(0.08 g, 76% 수율)을 얻었다.

mp 152-153℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.75 (1H, d, J= 15.8 Hz), 7.70 (1H, d, J= 15.8 Hz), 7.45 (2H, d, J= 8.7 Hz), 6.84 (2H, d, J= 8.7 Hz), 5.97 (1H, s), 5.18 (1H, t, J= 6.9 Hz), 3.91 (3H, s), 3.87 (3H, s), 3.27 (2H, d, J= 6.9 Hz), 1.76 (3H, s), 1.65 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 193.1, 163.9, 163.3, 162.3, 161.3, 157.7, 131.5, 130.3, 128.1, 125.2, 122.6, 115.9, 109.9, 106.4, 86.4, 55.8, 55.5, 25.8, 21.4, 14.1; IR (KBr) 3368, 1607, 1512, 1416, 1329, 1227, 1169, 1138, 1117, 978, 831, 733 cm^-1 EIMS m/z (%) 368 (M⁺, 80), 358 (25), 325 (73), 313 (27), 261 (16), 248 (15), 233 (77), 219 (17), 205 (45), 193 (100), 181 915), 147 (22), 119 (24), 107 (24), 91 (44), 77 (21), 65 (26) HRMS m/z (M⁺) calcd for C₂₂H₂₄O₅: 368.4230. Found: 368.4232.

<실시예 2> 화학식 4로 표시되는 화합물(L5)의 제조

1-[2-히드록시-4,6-디메톡시-3-(3-메틸부트-2-에닐)페닐]에타논{1-[2-Hydroxy-4,6-dimethoxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]ethanone; 0.13 g, 0.5 mmol)에 에탄올(10 mL)을 가한 후 수산화칼륨(0.14 g, 2.5 mmol)과 4-(2-트리메틸실라닐에톡시메톡시)벤즈알데히드{4-(2-trimethylsilanylethoxymethoxy)benzaldehyde; 0.15 g, 0.6 mmol)를 넣고 상온에서 48시간 반응시켰다.

에탄올을 제거하고 물(30 mL)을 넣고 에틸에세테이트(3 x 50 mL)로 추출하고, 2N HCl(30 mL)와 물(30 mL)로 세척하고, MgSO₄에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하여 잔유물을 얻는 후 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분리하여 생성물(0.19 g, 75% 수율)을 얻었다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 14.15 (1H, s), 7.77 (1H, d, J= 15.8 Hz), 7.72 (1H, d, J= 15.8 Hz), 7.52 (2H, d, J= 8.7 Hz), 7.01 (2H, d, J= 8.7 Hz), 5.93 (1H, s), 5.24 (2H, s), 5.19 (1H, t, J= 7.0 Hz), 3.91 (3H, s), 3.87 (3H, s), 3.78 (2H, t, J= 8.6 Hz), 3.27 (2H, d, J= 7.0 Hz), 1.76 (3H, s), 1.66 (3H, s), 0.94 (2H, t, J= 8.6 Hz), -0.01 (9H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 192.9, 164.0, 163.1, 161.1, 159.0, 141.8,131.3, 129.8, 129.1, 125.8, 122.7, 116.3, 109.9, 106.3, 92.6, 86.3, 66.4, 55.7, 55.4, 25.8, 21.3, 18.0, 17.7, -1.5; IR (neat) 2938, 1607, 1514, 1169, 1116 cm^-1 EIMS m/z (%) 498 (M⁺, 34), 400 (16), 397 (27), 372 (50), 371 (52), 233 (22), 207 924), 193 (47), 192 (28), 181 (36), 180 (15), 179 (53), 73 (100).

<실시예 3> 화학식 5로 표시되는 화합물(L6)의 제조

1-(5-히드록시-7-메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘-6-일)-3-(4-메톡시메톡시페닐)프로페논{1-(5-Hydroxy-7-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene-6-yl)-3-(4-methoxymethoxyphenyl)propenone; 79 mg, 0.2 mmol)을 메탄올(10 mL)에 넣고 c-HCl(5 drops)를 가한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.

메탄올을 날린 후 물(20 mL)을 넣고 EtOAc(3 x 30 mL)를 이용하여 추출하였 다. 추출한 용액을 NaHCO₃ 용액(30 mL)과 물 (30 mL)로 세척하고 MgSO₄에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하여 잔유물을 얻는 후 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분리하여 생성물(61 mg g, 86% 수율)을 얻었다.

mp 192-193℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 14.6 (1H, s), 7.73 (2H, s), 7.48 (1H, d, J= 8.2 Hz), 6.82 (2H, d, J= 8.2 Hz), 6.64 (1H, d, J= 10.0 Hz), 5.89 (1H, s), 5.43 (1H, d, J= 10.0 Hz), 3.88 (3H, s), 1.42 (6H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 192.7, 163.3, 162.1, 161.1, 160.5, 144.3, 131.6, 126.7, 126.6, 124.2, 116.9, 116.1, 106.3, 102.9, 92.8, 79.1, 57.2, 28.9; IR (KBr) 3368, 2973, 1616, 1512, 1440, 1341, 1281, 1198, 1148, 980, 832, 725 cm^-1 HRMS m/z (M⁺) calcd for C₂₁H₂₀O₅: 352.1311. Found: 352.1313.

<실시예 4> 화학식 6으로 표시되는 화합물(L7)의 제조

1-(5-히드록시-7-메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘-6일)에타논{1-(5-Hydroxy-7-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)ethanone; 124 mg, 0.5 mmol)에 에탄올(10 mL)을 가한 후 수산화칼륨(0.14 g, 2.5 mmol)과 4-메톡시메톡시벤즈알데히드(4-methoxymethoxybenzaldehyde; 100 mg, 0.6 mmol)를 넣고 상온에서 48시간 반응시켰다.

에탄올을 제거하고 물(30 mL)을 넣고 에틸아세테이트(3 x 50 mL)로 추출하 고, 2N HCl(30 mL)와 물 (30 mL)로 세척하고, MgSO₄에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하여 잔유물을 얻는 후 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분리하여 생성물(159 mg, 80% 수율)을 얻었다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 14.60 (1H, s), 7.76 (2H, s), 7.73 (2H, d, J= 8.2 Hz), 7.04 (2H, d, J= 8.2Hz), 6.66 (1H, d, J= 10.0 Hz), 5.90 (1H, s), 5.39 (1H, d, J= 10.0 Hz), 5.20 (2H, s), 3.89 (3H, s), 3.47 (3H, s), 1.43 (6H, s); IR (neat) 2969, 1605, 1510, 1424, 1339, 1235, 1198, 1150, 1080, 995, 922, 831, 733 cm^-1 HRMS m/z (M⁺) calcd for C₂₃H₂₄O₆: 396.1573. Found: 396.1571.

<실험예 1> 세포독성 실험

세포 생존률을 측정하기 위하여 HT-1080 섬유아종세포(ATCC, Rockville, MA)를 10 % 우태아혈청(fetal bovine serum, GIBCO), 200 IU/㎖ 페니실린, 200 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1 mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)를 포함하는 MEM(powdered Eagle's minimum essential medium, Sigma Chemical CO.) 배지조건, 37 ℃의 온도, 5 % CO₂/ 95 % 공기 조건의 가습 배양기에서 배양하였다.

이때, 배양배지는 하루걸러 한번씩 교체하여 주었다. 컨플루언트 (confluent)하게 성장시킨 후, 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 트립신(trypsin) 처리하여 2차 배양 (subculture)하였다.

상기와 같이 4 내지 5일 배양한 후, 24웰 플레이트에 5X10⁴ 세포/웰의 밀도 로 분주하였고, 각 웰의 배지 용량은 1 ㎖로 맞추었다. 그후 실시예 1 내지 4의 화합물을 각각 0.1, 1, 5, 10, 20, 50, 100 μM 농도로 처리하여 24시간동안 배양한 후, 100㎕의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide ; 5 g MTT/ℓin H₂O]를 첨가한 후 4시간 더 세포를 배양하였다.

그후, 각각의 세포가 포함된 웰에 디메틸술폭사이드(DMSO) 200 ㎕를 첨가하고 환원된 MTT 결정을 용해하기 위하여 피펫으로 혼합하였다. 상대적인 세포 생존률을 540 nm 필터를 가진 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, Menlo Park, CA)로 스캐닝하여 측정하였다.

그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 50% 세포생존율이 잔토휴몰(XN)은 15 μM이며, L7은 100 μM이며, L5 및 L6은 100 μM 이상으로 나타나 세포독성은 크지 않았다.

<실험예 2> CAM 분석을 통한 화합물의 혈관신생 억제효과 검토

생체내 시험상(in vivo)에서의 항혈관신생효과를 확인하기 위하여, 융모요막(chorioallantoic membrane, CAM) 분석을 실시하였다(Nguyen M et al., Microvascular Res., 47, pp31-40, 1994).

닭의 유정란을 온도 37℃, 상대습도 55%를 유지해주면서 배양시켜 10일째에 기낭(air sac) 부위에 피하주사침 (hypodermic needle, 녹십자의료공업, 한국)을 이용하여 첫 번째 작은 구멍을 뚫고, 창(window)을 낼 유정란의 평평한 부위에 두 번째 구멍을 뚫었다.

첫 번째 구멍인 기낭 부위의 구멍을 통해 공기를 빼냄으로써, 융모요막 (CAM)이 유정란의 껍질로부터 분리가 되게 하여 이 부위를 회전연마기(grinding wheel, Multipro 395JA, Dremel, Mexico)로 절단하여 창을 만들었다.

다음으로, 와트만 필터 디스크(whatman filter disk #1, whatman사, USA)에 코티존 아세테이트(cortisone acetate) 3 ㎎/㎖을 처리하여 건조시킨 후 혈관내피성장인자(VEGF)는 20 ng/CAM의 농도로 적셔두었다.

만들어 둔 창을 통해 필터 디스크를 혈관 위에 얹고, 본 발명의 실시예 3의 화합물(L6) 및 실시예 4의 화합물(L7)을 디메틸술폭사이드(DMSO)로 녹여 인산완충용액(PBS)으로 희석하여 각 농도별(L6은 5, 10, 25㎍/CAM; L7은 5, 25, 50㎍/CAM)로 처리하였다.

약물처리 3일 뒤, 필터 디스크가 얹힌 CAM 부분을 떼어내어 인산완충용액을 이용하여 씻어준 후, 입체현미경(Stemi SV6 stereomicroscope, Carl Zeiss, Germany)과 Image-Pro Plus software(Media Cybernetics; Silver Spring, MD, USA)를 이용하여 이미지를 촬영하여 혈관 가지의 개수를 측정하고 자료를 분석하였다.

그 결과, 도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같이, VEGF로 유도된 신생혈관형성 증가를 본 발명에 따른 화합물 처리로 인해 농도의존적으로 감소되었다.

<실험예 3> HT-1080 암세포에서의 전이 억제효과 검토

본 발명에 따른 화합물의 암세포 전이 억제효과를 알아보기 위하여, in vitro에서 HT-1080 암세포를 이용하여 실험하였다(Mi-Sung Kim et al., Cancer Research, 63, 5454-5461, 2003 Sang-Oh Yoon et al., The journal of Biological chemistry, 276, 20085-20092, 2001; Sonia Zorzet et al., The journal of pharmacology and experimental therapeutics, 295, 927-933, 2000). 여기서 사용된 배양 플레이트는 다수의 8 mm 크기의 구멍(pore)을 갖는 폴리카보네이트(polycarbonate) 필터를 포함하는 24웰 플레이트(Corning Costar, Cambridge, MA)를 사용하였다.

상기 폴리카보네이트 필터의 하면을 0.5㎎/㎖ 농도의 제1형 콜라겐(type Ⅰ collagen) 20ℓ로 코팅하였으며, 그 상면은 1.5㎎/㎖ 농도의 Matrigel(BD biosciences, Bedford, MA) 20ℓ로 코팅하였다.

여기서, 폴리카보네이트 필터의 하부 영역은 10% FBS를 함유한 배지로 채웠으며, HT-1080 암세포는 폴리카보네이트 필터의 상부에 접종하였다.

이때, 본 발명의 실시예 3의 화합물(L6) 및 실시예 4의 화합물(L7)을 디메틸술폭사이드(DMSO)로 녹여 인산완충용액(PBS)으로 희석하여 각각 농도별(5, 25, 50μM)로 24시간 동안 처리하였다.

이렇게 접종된 HT-1080 암세포를 37℃에서 18시간 동안 배양한 다음 폴리카보네이트 필터의 하면에 침투된 세포를 메탄올(methanol)로 고정(fix)하고, 헤마톡시린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였다.

그 결과, 도 3a 및 도 3b에 도시된 바와 같이 본 발명의 화합물은 농도의존적으로 암세포 전이를 억제하였다.

<실험예 4> HT-1080 암세포에서의 MMP 활성 및 발현 억제효과 검토

본 발명에 따른 화합물이 HT-1080 암세포에서 MMP(Matrix Metalloproteinase) 분비에 미치는 효과를 알기 위하여, 6-웰 플레이트(6-well plate)의 각 웰에 1X10⁶개의 HT-1080세포를 주입하였다. 이렇게 주입된 HT-1080 세포는 12시간동안 10% 우태아혈청(FBS)를 포함하는 MEM배지에 배양시켜 플레이트에 HT-1080 세포가 부착되도록 하였다.

그 다음, 우태아혈청(FBS)을 포함하는 MEM배지를 제거하고, 혈청이 포함되지 않은 MEM 배지로 세정하였다. 이 HT-1080세포는 다시 혈청이 포함되지 않은 MEM 배지에 24시간동안 배양되었다. 이렇게 24시간동안 HT-1080 세포를 배양한 다음, 6-웰 플레이트에서 상층액을 각각 수득하여 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)를 수행하였다(Herron et al., J.Biol.Chem., 261, 2814-2818, 1986).

젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography) 과정을 간단하게 설명하면, 상기 6-웰 플레이트에서 얻은 상층액을 젤라틴이 포함된 10% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis) 젤(gel)에서 전기영동하였다. 전기영동을 수행한 후에 SDS를 제거하기 위하여 완충액(50mM Tris-HCl, pH7.5, 100mM NaCl, 2.5% Triton X-100) 에 SDS-PAGE 젤을 두 번 세정하였다. 그 다음으로, SDS-PAGE 젤을 37℃에서 배양완충액(50mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 10mM CaCl_2,0.02% NaN₃)에 배양하였다. 이 SDS-PAGE 젤은 0.25% 쿠마시블루 용액(Coomassie brilliant blue R250, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)으로 염색한 다음 탈색(destaining)하였다.

이때, 본 발명에 따른 화합물이 TPA에 의해 유도된 MMP 활성화에 미치는 영 향을 검토하기 위하여 L6 및 L7 처리시, TPA 12 ng/㎖를 같이 처리하였다.

그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이 L7은 HT-1080 세포에서 농도의존적으로 MMP-9 활성을 억제하였다.

또한, 분비된 MMP-9 단백질의 양을 알려진 문헌을 참조하여(J Neurol 250: 1037-1043, 2003) MMP-9 ELISA 키트(Oncogene^TM Research Product)를 이용하여 측정하였다. 도 5a는 TPA를 L6 및 L7과 함께 처리한 결과로서, L7에서 농도의존적으로 MMP-9 단백질의 양이 감소되었다. 그리고, 도 5b는 TPA를 처리하지 않고 L6 및 L7의 화합물만 처리한 결과로서, L6 및 L7은 MMP-9 단백질 발현에 전혀 영향을 미치지 않았다.

또한, 알려진 문헌을 참조하여(PCR Methods Appl. 2: 137-143, 1992) MMP mRNA 발현 양을 RT-PCR을 이용하여 측정하였고, 그 결과 도 6과 같이 L7의 화합물이 농도의존적으로 MMP mRNA 발현을 억제하였다.

하기에 본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 산제의 제조

L7 300 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

L7 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 3> 캅셀제의 제조

L7 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 4> 주사제의 제조

L7 50 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 혼합한 후 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

도 1은 본 발명에 따른 화합물을 처리한 HT-1080 세포에서의 50% 세포생존율을 MTT 분석으로 검토한 것이고,

도 2a 및 도 2b는 VEGF로 유도된 신생혈관형성에 대한 본 발명에 따른 화합물의 억제효과를 나타낸 것이고,

도 3a 및 도 3b는 본 발명에 따른 화합물의 암세포 전이 억제효과를 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명에 따른 화합물의 MMP 억제효과를 나타낸 것이고,

도 5a 및 도 5b는 본 발명에 따른 화합물의 TPA 유도성 MMP-9 발현 억제효과를 나타낸 것이고,

도 6은 본 발명에 따른 화합물의 TPA 유도성 MMP mRNA 발현 억제효과를 나타낸 것이다.

Claims

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화학식 6으로 표시되는 잔토휴몰 C 유도체를 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물로서, 상기 혈관신생으로 인한 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암의 침윤과 전이로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물:

[화학식 6]
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