CN109985028A

CN109985028A - 黄腐酚及其衍生物在预防或治疗神经退行性疾病中的应用

Info

Publication number: CN109985028A
Application number: CN201711472048.2A
Authority: CN
Inventors: 夏俊霞; 齐菲; 张在军; 王亮
Original assignee: Shenzhen Xia Xi Wan Medicine Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Xia Xi Wan Medicine Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-07-09

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及黄腐酚及其衍生物在制备用于预防或治疗神经退行性疾病、尤其是阿尔茨海默症的药物中的用途，发明人通过阿尔次海病转基因细胞验验证了黄腐酚及其衍生物具有显著降低Aβ1‑40/42浓度，从而抑制Aβ聚集，并且能够通过抑制CDK‑5活性，抑制Tau蛋白磷酸化，可作为潜在的阿尔茨海默病等神经退行性疾病治疗药物进行进一步开发和利用。

Description

黄腐酚及其衍生物在预防或治疗神经退行性疾病中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及黄腐酚及其衍生物在预防或治疗神经退行性疾病中的用途。

背景技术

黄腐酚是一种异戊烯类黄酮化合物，是啤酒花中特有的一种物质，目前获得的黄腐酚主要从啤酒花中提取获得，例如，可以通过大孔树脂吸附法、有机溶剂提取法、超声技术提取法、色谱提取法以及它们的结合从啤酒花中进行提取，黄腐酚具有独特的健康属性，目前已经针对黄腐酚的药理活性进行研究，其最主要的作用是抗癌作用，主要表现在通过调节肿瘤形成的途径来达到预防效果，以及抑制癌细胞增殖的作用；同时，还发现黄腐酚预防和治疗糖尿病的作用，具体表现在其能够抑制大鼠肝脏中甘油三酸脂的形成以及二酰基甘油酰基转移酶的活性，还能够降低胆固醇；另外，黄腐酚分子结构中具有多个游离酚羟基，具有类黄酮的特性，因此，还具有一定的抗氧化作用，可有效用于降低心血管疾病的发病率。然而，关于黄腐酚及其衍生物在预防或治疗神经退行性疾病方面的作用尚未见报道。

发明内容

为了进一步扩展黄腐酚及其衍生物在医药领域的应用，发明人采用不同细胞模型，针对可有效治疗神经退行性疾病的各种途径，对黄腐酚及其衍生物的活性进行测定，惊奇地发现黄腐酚及其衍生物能够通过多种途径影响神经退行性疾病的发生和发展，可作为潜在化合物进行药物开发，从而完成本发明。

因此，本发明涉及黄腐酚及其衍生物在制备用于预防或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

黄腐酚化学式为C₂₁H₂₂O₅，结构式为

所述黄腐酚衍生物包括：

优选地，所述神经退行性疾病包括但不限于阿尔茨海默症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、老年痴呆症、克雅二氏病等，主要为阿尔茨海默症。

具体地，研究发现黄腐酚及其衍生物在不同浓度下对细胞存活力不产生较大影响；并在细胞实验中能够显著降低β-淀粉样蛋白1-40/42(Aβ1-40/42)的浓度，从而抑制β-淀粉样蛋白(Aβ)的聚集，可有效预防或改善线粒体损伤；并且在N2a细胞和HEK293细胞中均能抑制CDK-5，显示出抑制Tau蛋白异常聚集形成神经元纤维缠结的作用，可作为预防或治疗神经退行性疾病的潜在药物进行进一步开发。

本发明的黄腐酚及其衍生物在制备成药物时，可单独使用或与其它药物联合使用。所述其它药物例如多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、美金刚、米非司酮、银杏叶制剂等。

本发明的黄腐酚及其衍生物可与本领域已知的常用辅料混合，制备成口服剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂等，所述辅料包括但不限于稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、着色剂、防腐剂等，各剂型可根据本领域常规工艺制备获得。

本发明的益处在于：发明人通过细胞水平试验验证了黄腐酚及其衍生物具有显著降低Aβ1-40/42浓度，从而抑制Aβ聚集的作用，同时在体外对N2a细胞活性不产生较大影响，并且能够通过抑制CDK-5，抑制Tau蛋白异常聚集等活性，可作为潜在的治疗药物进行进一步开发和利用。

附图说明

图1示出了黄腐酚(Xn)在0.1875μM、0.75μM、3μM浓度下对N2a细胞活性的影响。

图2-图7示出了采用黄腐酚(Xn)在0.1875μM、0.75μM、3μM浓度下对N2a细胞进行处理，由ELISA法测定的裂解液或培养基中Aβ1-40/42的浓度。

图8-图9示出了采用黄腐酚(Xn)在0.1875μM、0.75μM、3μM浓度下对N2a细胞进行处理，由western-blot检测法测定的N2a细胞中t-APP、s-APPα、BACE1、PS1的表达水平。

图10-图11示出了采用黄腐酚(Xn)在0.1875μM、0.75μM、3μM浓度下对N2a/APP细胞进行处理，由western-blot检测法测定的P-TauS404、P-TauS396、P-TauS262、P-T231、Tau-1、Tau-5的表达水平。

图12-图13示出了采用黄腐酚(Xn)在0.625μM、1.25μM、2.5μM浓度下对HEK293/Tau细胞进行处理，由western-blot检测法测定的P-TauS404、P-TauS396、P-TauS262、P-T231、Tau-1、Tau-5的表达水平。

图14-图15示出了采用黄腐酚(Xn)在0.1875μM、0.75μM、3μM浓度下对N2a细胞进行处理，由western-blot检测法测定的GSK3、P-GSK3α、P-GSK3β、PP2A、P-PP2A、CDK-5、P25/35的表达水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

本发明所使用的黄腐酚通过常规方法由啤酒花提取获得，并由本司化学合成部纯化，黄腐酚衍生物由常规合成方法合成获得，同样由本司化学合成部提供，其结构、纯度、1HNMR如下表1所示：

表1

采用DMSO将各待测化合物稀释至目标浓度。

实施例1

黄腐酚及其衍生物对N2a细胞活性的影响。

方法：

从液氮中取出N2a/WT细胞(野生型)立即浸泡在37℃水浴中，待溶化后以600r/min离心5min，吸取上清液，加入1mL无菌PBS清洗后，再次离心，除去上清，加入1mL培养基，吹打均匀后接种于培养皿中，置于37℃、5％CO₂环境下培养24h；待细胞贴壁生长至60％时，用0.25％的胰酶消化2min，除去上清，加入适量培养基吹打均匀，以1×10⁴/ml的密度接种于96孔板上，取对数生长期细胞用于实验。

再取96孔板，每孔加入100μl DMEM培养基，以1×10⁴/ml的密度接种N2a/WT细胞，置于37℃、5％CO₂环境下培养至贴壁生长60％时，分别以2.5μM和5μM的浓度加入Xn(黄腐酚)、化合物1-化合物10(实验组)，继续培养24h，空白组为正常培养基，终止培养前4h每孔加入10μl MTT(终质量浓度为0.5mg/ml)工作液，37℃下孵育4h，弃去含MTT的培养液，每孔加入150μl DMSO，振摇10min，用全自动酶标仪检测其在540nm处的吸光度值(OD值)，计算细胞活力，细胞活力＝(实验组平均OD值/空白组平均OD值)×100％。

采用相同的方法测定黄腐酚及其衍生物对N2a/APP695细胞(稳定型)细胞活性的影响。

采用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析，检验水准α＝0.05。

结果：

各实验组和对照组的细胞活力如表2所示，黄腐酚对N2a/WT、N2a/APP细胞活性的影响如图1所示：

表2

由上表可以看出，在黄腐酚及其衍生物浓度为2.5μM时，对N2a/WT和N2a/APP细胞活性影响不大，均在实验误差允许的范围内，将浓度升至5μM，有利于改善N2a/WT细胞活性并抑制N2a/APP细胞活性。

实施例2

黄腐酚及其衍生物抑制Aβ聚集的作用

阿尔茨海默症(AD)是一种伴随着全脑认知功能障碍包括记忆力、方向感、判断力和推理能力下降的神经退行性疾病，如何有效抑制Aβ聚集和神经毒性的产生，是治疗AD的可能有效途径之一，以下对黄腐酚及其衍生物抑制Aβ聚集的作用进行研究。

方法：

将N2a/WT细胞和N2a/APP细胞从液氮中，迅速置于37℃水浴锅中解冻，融化后置于6cm培养皿中，用10mL培养基(含10％FBS和1％双抗的DMEM培养基)，置于CO₂细胞培养箱(5％CO₂，37℃)中培养24h，每隔24h更换一次新鲜培养基；待细胞贴壁生长至70％以上，用1mL 0.25％胰酶消化1min，吸掉胰酶，加入适量的培养基吹打均匀，以1×10⁷/mL的密度接种至6孔板上，待细胞贴壁生长至70％以上时处理细胞。不对N2a/WT细胞进行处理作为对照组，分别用0、0.1875、0.75、3μM黄腐酚及3μM的化合物1-10处理N2a/APP细胞24h作为实验组。处理完细胞后，收集细胞培养液(medium)，在4℃，3000rpm下，离心10min收集细胞，用300ul加适量的含0.1％蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(25mM HEPES，5mM EDTA，5mM EGTA，100mMNaCl，10％Glycerol，1％Triton-X-10，pH 7.2-7.4，4℃保存)冰上裂解2h，4℃，12000rpm，离心10min收集上清裂解液(lysate)，-20℃保存备用。

采用ELISA法检测各组样品细胞内和分泌到培养基中的β-淀粉样蛋白42(Aβ1-42)、β-淀粉样蛋白40(Aβ1-40)含量以及β-淀粉样蛋白42\β-淀粉样蛋白40的比例。根据制造商提供的说明书，使用ELISA试剂盒处理样品的细胞裂解液和培养液，用全自动的酶标仪检测其在492nm处的OD值，计算蛋白含量，以pg/mL表示。采用SPSS11.0统计软件对两组样品间均数的比较进行t检验，对多组间均数比较进行单因素方差分析。

结果：

各实验组和对照组的Aβ浓度如表3所示(单位：pg/ml)，对照组、空白组及黄腐酚的测量结果如图2-图7所示，

表3

N＝3，相较于N2a/WT细胞，**P＜0.01；相较于N2a/APP细胞，#P＜0.05，##P＜0.01。

由以上表3可以看出，在N2a/APP细胞模型中，黄腐酚在0.75μM时对Aβ具有较佳的抑制作用。

采用SDS-PAGE和western-blot检测对照组及用Xn处理的细胞内T-APP、s-APPα、BACE1、PS1的表达水平。β-actin作为内参。将4体积的样品的细胞裂解液和1体积的5X SDSloading buffer(含5％的β-巯基乙醇)混匀，然后在沸水中煮5-10min，最后离心上样，可在煮沸前放在室温下静置20-30min。配置10％的SDS-PAGE胶中进行电泳，90V电压电泳3-4h，采用湿转膜法进行转模：预先用甲醇浸泡PVDF膜(2-5cm×8.5cm)2min，用“三明治”法依次放滤纸、分离胶、膜，夹紧转膜架，正确放入转膜槽，加满1X转膜液，恒压90V，开始转膜1-2h。转膜结束后，将膜放入5％脱脂牛奶中室温封闭1-2h，加入抗T-APP、s-APPα、BACE1、PS1和β-actin的一抗，4℃孵育过夜。一抗结束后用适量TTBS(10X TBS缓冲液：29.22g/LNaCl、5mL1M Tris-HCl、500μl Tween-20，用盐酸将pH调整至7.2～7.4，补蒸馏水至1L)缓冲液洗3X10min/次，再用与一抗相应的辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1h。二抗结束后，再用TTBS缓冲液洗3X 10min/次。最后用适量的显色底液覆盖膜，用感光胶片在暗室进行曝光。对胶片上的条带扫描进行分析。

用NIH的Image J软件对Western blot中的条带进行定量统计分析。用NIH ImageJ软件计算western blot胶片中相应条带的灰度值，计算相对强度。各组中，设0μMDAU处理N2a/WT细胞的蛋白表达水平为1，其它样品与之相比得到相对比值。采用SPSS11.0统计软件对两组样品间均数的比较进行t检验，对多组间均数比较进行单因素方差分析，其中对组间两两比较进行Dunnett’s test。

结果如表4以及图8-图9所示，

表4

其中，相较于N2a/WT细胞，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

实施例3

CDK(细胞周期依赖性蛋白激酶)是丝氨酸/苏氨酸激酶家族，被周期蛋白激活后，调控细胞周期的进程，而CDK-5不参与细胞周期的调控，其表达分布于全身组织，尤其神经系统最为丰富，CDK-5可能是神经元死亡的上游感受器。CDK-5在p35、p39等调节亚基的信号作用下锚定于膜上，磷酸化膜性底物，通过平衡促凋亡和促存活信号转导通路，在神经元发育、迁移、神经元存活中发挥重要作用。在Aβ刺激下，经过钙激活蛋白酶的作用，p35能裂解成p25，本实施例采用与实施例2类似的方法，在N2a/APP细胞和HEK293细胞(购于美国ATCC)上进行Xn经由p25/p35抑制tau蛋白磷酸化的作用，从而考察Xn对治疗阿尔茨海默症等神经退行性疾病的潜在活性。

将N2a/APP细胞从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中解冻，融化后置于6cm培养皿中，用10mL培养基(含10％FBS和1％双抗的DMEM培养基)，置于CO₂细胞培养箱(5％CO₂，37℃)中培养24h，每隔24h更换一次新鲜培养基；待细胞贴壁生长至70％以上，用1mL 0.25％胰酶消化1min，吸掉胰酶，加入适量的培养基吹打均匀，以1×10⁷/mL的密度接种至6孔板上，待细胞贴壁生长至70％以上时处理细胞。用0μM Xn处理N2a/APP细胞24h作为对照组，分别用0.1875μM、0.75μM、3μM Xn处理N2a/APP细胞24h作为实验组。处理完细胞后，收集细胞培养液(medium)，在4℃，3000rpm下，离心10min收集细胞，用300ul加适量的含0.1％蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(25mM HEPES，5mM EDTA，5mM EGTA，100mMNaCl，10％Glycerol，1％Triton-X-10，pH 7.2-7.4，4℃保存)冰上裂解2h，4℃，12000rpm，离心10min收集上清裂解液(lysate)，-20℃保存备用。

采用与实施例2相同的方法，通过western-blot检测对照组及用Xn处理的细胞内P-TauS404、P-TauS396、P-TauS262、P-T231、Tau-1、Tau-5的表达水平，结果如图10-11以及表5所示：

表5

采用类似的方法，在HEK293细胞中，测定Xn对Tau蛋白表达水平的影响。

将HEK293细胞从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中解冻，融化后置于6cm培养皿中，用10mL培养基(含10％马血清的MEM培养基)，置于CO₂细胞培养箱(5％CO₂，37℃)中培养24h，每隔24h更换一次新鲜培养基；待细胞贴壁生长至70％以上，用1mL 0.25％胰酶消化1min，吸掉胰酶，加入适量的培养基吹打均匀，以1X107/mL的密度接种至6孔板上，待细胞贴壁生长至70％以上时处理细胞。用0μM Xn处理HEK293细胞24h作为对照组，分别用0.625、1.25、2.5μM的Xn处理HEK293细胞24h作为实验组。处理完细胞后，收集细胞培养液，在4℃，3000rpm下，离心10min收集细胞，用300ul加适量的含0.1％蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(25mM HEPES，5mM EDTA，5mM EGTA，100mMNaCl，10％Glycerol，1％Triton-X-10，pH 7.2-7.4，4℃保存)冰上裂解2h，4℃，12000rpm，离心10min收集上清裂解液(lysate)，-20℃保存备用。

采用与实施例2相同的方法，通过western-blot检测对照组及用Xn处理的细胞内P-TauS404、P-TauS396、P-TauS262、P-T231、Tau-1、Tau-5的表达水平，结果如图12-13以及表6所示：

表6

采用与实施例2相同的方法，通过western-blot检测N2a/APP细胞模型中，对照组及用0.1875μM、0.75μM、3μM的Xn处理的细胞内GSK3、P-GSK3α、P-GSK3β、PP2A、P-PP2A、CDK-5、P25/35的表达水平，结果如图14-15以及表7所示：

表7

由以上结果可以看出，无论N2a/APP细胞模型，还是HEK293细胞模型，黄腐酚(Xn)均能有效通过P25/35途径抑制CDK-5，具有潜在地治疗阿尔茨海默症的活性。

以上仅描述了本发明的较佳实施方式，但本发明并不限于上述实施例。本领域技术人员可以理解的是，能够实现本发明技术效果的任何相同或相似手段，均应落入本发明的保护范围内。

Claims

1.黄腐酚及其衍生物在制备用于预防或治疗神经退行性疾病的药物中的用途，其中，黄腐酚的结构式为

黄腐酚衍生物包括：

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病选自于阿尔茨海默症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、老年痴呆症、克雅二氏病。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述所述神经退行性疾病为阿尔茨海默症。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述黄腐酚及其衍生物用于抑制β-淀粉样蛋白聚集。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述黄腐酚及其衍生物通过抑制CDK-5，抑制Tau蛋白异常聚集。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述黄腐酚及其衍生物单独使用或与其它药物联合使用。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述黄腐酚及其衍生物制成口服剂型。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述口服剂型选自于片剂、胶囊剂、颗粒剂。