KR101791226B1 - 갈란진 또는 캠퍼롤을 포함하는 항노화 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갈란진 또는 캠퍼롤을 포함하는 항노화 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 발현 증가시 노화를 유발하고, 염증성 질환에도 관여하는 기질 금속 단백질 분해효소인 MMP-9의 발현을 감소 또는 억제시키는 물질이다. 그러므로 본 발명에 따른 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9 발현 억제제를 활용하게 되면, 기질 금속 단백질 분해효소인 MMP-9의 발현을 감소시킴으로 인해 항노화, 항염증 효과가 있어 노화 예방 및 치료, 류마티스 관절염 등 각종 염증 질환 등의 치료 및 예방에 효과적으로 활용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9 발현 억제제는 갈란진 또는 캠퍼롤을 포함하는 것이므로, 항노화, 항염증 효과가 있을 뿐만 아니라, 항산화 작용에도 효과적일 수 있다.

Description

갈란진 또는 캠퍼롤을 포함하는 항노화 조성물{composition comprising galangin or kaempferol for treating or preventing of anti-aging}

본 발명은 갈란진 또는 캠퍼롤을 포함하는 항노화 조성물에 관한 것이다.

기질 금속 단백질 분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)는 아연-의존성 엔도펩티다아제 계열로서, 서로 다른 23 개 유형의 인간 MMP가 있다. 이들 단백질 분해효소는 공통적으로 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 구조 성분을 분해시킨다. MMP에 의한 ECM 단백질의 분해는 배아 발생, 창상 치유, 노화 등에 의하여 조직 재형성을 동반하는 다수의 정상적인 생리학적 변화 과정에서 관찰된다. 또한, MMP 활성이 비정상적으로 제어될 경우에 종양 침윤(invasion), 전이, 류마티스성 관절염, 골관절염, 심혈관 질환과 같은 병리학적 과정에도 관여한다.

특히 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9은 기저막에서 IV형 콜라겐을 분해시킨다. 또한 MMP-9은 노화 과정에서의 역할이 잘 알려져 있다. 피부가 자외선에 노출되면 MMP-9의 발현이 증가하고, 콜라겐을 분해함으로써 피부 노화를 일으키며, MMP-9의 발현은 심장 노화의 마커로도 잘 알려져 있다. 또한, MMP-9 발현 증가는 종양 생성과 암 전이 과정은 물론이고, 염증을 수반하는 여러 질병의 발병에서도 중대한 역할을 한다. 이러한 MMP-9은 성장인자와 염증성 사이토킨에 의해 발현이 증가하는 양상으로 조절된다. 따라서 상기 MMP-9의 발현을 감소시키는 조절은 노화와 암 및 염증 질환을 예방 또는 치료하는데 효과적일 것으로 보고 있다.

한편, 플라보노이드는 식물 기원의 식품에서 매우 흔하게 발견되는 폴리페놀성 화합물이다. 이들은 항산화와 항발암성 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 플라보놀은 3-히드록시 플라본 주쇄를 가진 플라보노이드류이다. 특히 갈란진(또는 갈랑긴, Galangin)은 플라보노이드의 하나로서, 갈랑가 뿌리 속에 들어 있으며, 황색 바늘 모양 결정이면서 녹는점은 214-215 ℃이고, 염화철(Ⅲ)에서 자갈색이며, 수산화알칼리 또는 진한 황산에 황색을 나타내면서 용해되는데 형광을 내지는 않는다. 또한 캠퍼롤(Kaempferol)은 노란색 가루로 전형적인 C6-C3-C6의 구조를 가진 널리 퍼져 있는 중요한 플라보노이드 중의 하나이며, 지방과 DNA의 산화 위험을 막고 강한 항산화 작용을 하고, 혈액 안에서 혈소판을 만들고 LDL(low density lipoprotein)의 산화를 막아 동맥경화증을 예방하며, 암세포 형성을 방해하는 화학적 예방 작용제로서 활동한다.

이렇게 상기 MMP-9의 발현 및 활성의 조절은 항노화, 항암 및 항염증 효과가 있으며, 플라보노이드 일종인 갈란진 또는 캠퍼롤은 항산화 및 항암 효과가 있는데, 이러한 MMP-9과 갈란진 또는 캠퍼롤과의 상관 관계에 관한 연구는 현재 전무한 실정이다.

본 발명과 관련된 선행기술문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-0946789호(특허문헌 1)가 개시되어 있으며, 상기 특허문헌 1에는 양강 추출물인 갈란진을 함유하여 치매의 개선 및 치료 효과와 인지기억능 향상 효과를 가지는 물질에 대한 내용이 개시되어 있다.

특허문헌 1. 대한민국 등록특허 제10-0946789호

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 갈란진 또는 캠퍼롤을 포함하는 항노화 조성물, 항염증에 효과적인 약학 조성물을 제공하는 것이 목적이다. 또한 발현 증가시 노화를 유도하고, 염증성 질환에도 관여하는 기질 금속 단백질 분해효소인 MMP-9의 발현을 감소시키거나 억제하는 물질을 제공하는 것이 목적이다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 약학 조성물은 플라보노이드인 갈란진 또는 캠퍼롤 중 어느 하나를 포함하는 항노화 조성물이다.

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본 발명에 따른 항노화 조성물은 노화의 예방, 염증성 관련 질병을 치료하거나 예방하는 효과가 우수한 조성물이다. 또한 본 발명의 또 다른 특징에 따른 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9 발현 억제제는 발현 증가시 세포외 기질 재형성(ECM remodeling)을 통한 피부 및 심장 등 조직의 노화를 유발하고, 염증성 질환에도 관여하는 기질 금속 단백질 분해효소인 MMP-9의 발현을 감소시키거나 억제시키는 물질이다. 또한 본 발명에 따른 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9 발현 억제제는 갈란진 또는 캠퍼롤을 포함하는 것이므로, 항노화, 항염증 효과가 있을 뿐만 아니라, 항산화 작용에도 효과적일 수 있다.

도 1은 플라보노이드 물질들이 MMP-9의 발현 양상에 미치는 영향을 조사한 결과이다.
도 2는 갈란진과 캠퍼롤의 농도별 세포 독성에 미치는 영향을 조사한 결과이다.
도 3은 갈란진과 캠퍼롤이 MMP-9 유전자의 전사를 저해하는지 조사한 결과로서, 갈란진과 캠퍼롤을 세포에 처리한 경우 루시퍼라제의 활성으로 MMP-9 프로모터의 전사 활성을 조사한 결과이다.
도 4는 갈란진과 캠퍼롤이 MAPK 신호전달 경로를 조절하는지 여부를 조사한 결과이다.
도 5는 갈란진과 캠퍼롤이 NF-_ΚB 신호전달경로를 조절하는지 여부를 조사한 결과이다.

이에 본 발명자들은 기질 금속 단백질 분해효소인 MMP-9의 발현을 감소시키거나 억제하는 물질을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9 발현 억제제를 발견하여 본 발명을 완성하였다.

구체적으로 본 발명에 따른 약학 조성물은 플라보노이드인 갈란진 또는 캠퍼롤 중 어느 하나를 포함하거나, 또는 약학적으로 허용 가능한 이들 각각의 염을 포함하는 항노화 조성물이다.

기질 금속 단백질 분해효소인 MMP-9은 발현이 증가하는 경우, 노화를 유발하고, 류마티스 관절염이나 골관절염과 같은 염증성 질환을 유발하거나 발전시키게 된다. 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 플라보노이드인 갈란진 또는 캠퍼롤, 또는 이들의 혼합물을 포함하여 상기 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9의 발현을 억제하거나 감소시키게 된다. 결국, 이렇게 본 발명에 따른 약학 조성물은 기질 금속 단백질 MMP-9의 발현을 억제시키거나 감소시켜 항노화, 항염증 효과를 달성할 수 있다.

또한 상기 약학 조성물은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 갈란진, 캠페롤 또는 이들의 혼합물에 대하여 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염의 일실시예로서 상기 갈란진, 캠페롤 또는 이들의 혼합물의 용해도를 증가시키기 위한 것이라면 모두 이에 해당할 수 있고, 바람직한 일실시예에 산부가염이 해당 될 수도 있다.

한편, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 인체에 독성이 낮고 모화합물의 생물학적 활성과 물리화학적 성질에 악영향을 주지 않아야 한다. 또한 상기 약학적으로 허용 가능한 염의 제조에 사용될 수 있는 유리산은 무기산과 유기산으로 나눌 수 있다. 무기산은 염산, 황산, 질산, 인산, 과염소산, 브롬산 등이 사용될 수 있다. 유기산은 초산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 푸마린산, 말레산, 말론산, 프탈산, 숙신산, 젖산, 구연산, 시트르산, 글루콘산, 타타르산, 살리실산, 말산, 옥살산, 벤조산, 엠본산, 아스파르트산, 글루탐산 등이 사용될 수 있다. 유기염기부가염 제조에 사용될 수 있는 유기염기는 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디시클로헥실아민 등이다. 아미노산부가염기 제조에 사용될 수 있는 아미노산은 알라닌, 글라이신 등의 천연아미노산이다. 또한 본 발명에 따른 갈란진, 캠페롤 또는 이들의 혼합물은 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라 모든 수화물 그리고 용매화물도 포함할 수 있다. 상기 수화물 또는 용매화물은 상기 갈란진, 캠페롤 또는 이들의 혼합물을 메탄올, 에탄올, 아세톤, 1,4-디옥산과 같은 물과 섞일 수 있는 용매에 녹인 다음에 유리산 또는 유리염기를 가한 후에 결정화되거나 또는 재결정화될 수 있다. 그러한 경우, 용매화물(특히 수화물)이 형성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 갈란진, 캠페롤 또는 이들의 혼합물로서 동결건조와 같은 방법으로 제조 가능한 다양한 양의 물 함유 화합물 이외에 수화물을 비롯한 화학 양론적 용매화물도 포함할 수 있다.

또한, 상기 갈란진, 캠페롤 또는 이들의 혼합물이거나, 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염은, 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 전체 조성물 100 중량부에 대하여 1-80 중량부로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 20-60 중량부로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 갈란진, 캠페롤 또는 이들의 혼합물이거나, 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염이 1 중량부 미만으로 포함되는 경우에는 본 발명에서 달성하려는 항노화, 항염증 효과를 충분히 발현시키기 어려워 바람직하지 않으며, 상기 갈란진, 캠페롤 또는 이들의 혼합물이거나, 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염이 80 중량부를 초과하는 경우에는 약학적인 응용 제품으로 제조하기 위한 나머지 물질들의 함량을 제한 할 수 있어 바람직하지 않다.

한편, 상기 항노화, 항염증에 관한 치료 또는 예방용 약학 조성물의 투여 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나, 피하로, 직장으로, 비강으로, 임의의 다른 비경구로도 투입될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나 경구 투여하거나 또는 근육 세포에 직접 투입하는 것이 바람직하다.

또한 상기 조성물로부터 선택되는 투여 수준은 화합물의 활성, 투여 경로, 치료되는 병태의 중증도 및 치료되는 환자의 병태 및 이전 병력에 따를 것이다. 그러나 원하는 치료 효과의 달성을 위해 요구되는 것보다 낮은 수준의 화합물의 용량에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 서서히 증가시키는 것은 당업계의 지식 내에 있으며, 바람직한 투여량은 나이, 성별, 체형, 체중에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물은 약제학상 허용 가능한 제약 제제로 제제화 되기 전에 추가로 가공될 수 있으며, 바람직하게는 더 작은 입자들로 분쇄 또는 연마될 수 있다. 또한 상기 조성물은 병태 및 치료되는 환자에 따라 달라질 것이지만, 이는 비-독창적으로 결정할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 약학 조성물과 같이 기질 금속 단백질 분해효소인 MMP-9의 발현을 억제할 수 있음은 갈란진과 캠퍼롤로 인해 가능하게 된다. 상기 갈란진과 캠퍼롤은 플라보노이드의 일종으로서 원래 항산화 및 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 본 발명은 상기 갈란진 또는 캠퍼롤이 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9의 발현을 억제 또는 감소시키는 효과가 있음을 확인한 것이다. 상기 갈란진 또는 캠퍼롤은 NF-_KB 또는 AP-1의 활성화를 저해함으로써, PMA에 의해 유도되는 MMP-9의 발현을 저해하게 된다. 또한 상기 갈란진 또는 캠퍼롤의 혼합물을 포함하는 경우에는 상기 갈란진 또는 캠퍼롤이 단독으로 포함되는 경우에 비해 보다 월등한 상승 효과가 달성될 수 있어 바람직하며, 이렇게 혼합되어 사용되는 경우에는 단독으로 사용되는 경우에 비해 1.5-3 배 이상 상승된 효과를 달성할 수 있어 바람직하다. 또한 상기 갈란진 또는 캠퍼롤에 각각 다른 플라보노이드 물질을 혼합하는 경우에 비해 갈란진 및 캠퍼롤 혼합물인 것이 2-3 배 이상 상승된 효과를 달성할 수 있어 바람직하다.

한편, 본 발명에 따른 약학 조성물의 항노화 효과로 인해 치료 또는 예방의 약리효과가 달성되는 질병은 피부 노화 또는 심장 노화가 이에 해당할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학 조성물의 항염증 효과로 인해 치료 또는 예방의 약리효과가 달성되는 질병은 류마티스 관절염, 골관절염, 동맥경화, 천식, 및 궤양으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염증성 질환이 이에 해당할 수 있다.

또한 상기 갈란진 또는 캠퍼롤은 0.1-100 μM로 포함되는 것이 세포 독성에 미치는 영향이 적어 바람직한데, 상기 갈란진 또는 캠퍼롤이 100 μM를 초과하게 되면 세포 독성이 커져 항노화, 항염증의 치료 또는 예방용 약학 조성물로 활용하기 어렵게 되어 바람직하지 않다. 또한 더욱 바람직하게는 상기 갈란진 또는 캠퍼롤은 0.1-30 μM로 포함되는 것이 세포 독성에 미치는 영향이 없어 바람직한데, 상기 갈란진 또는 캠퍼롤이 30 μM을 초과하기 이전까지는 세포 독성이 거의 나타나지 않아 더욱 바람직하다.

한편, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 정제, 캡슐제, 시럽제, 도포제 및 패치제에 첨가되어 사용될 수 있다.

상기 정제는 제조방법에 있어서 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 바람직한 일실시예로서 상기 갈란진 또는 캠퍼롤 중 어느 하나를 포함하거나, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 약학 조성물을 체질하고, 락토오스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분과 혼합한 후에, 정제수를 첨가하여 분말로 과립화하고, 상기 과립을 건조시킨 후에 스테아르산 마그네슘과 혼합하고 압착하여 제조되며, 이때, 정제의 바람직한 성분 및 함량은 본 발명에 따른 상기 약학 조성물 5.0 ㎎, 락토오스 BP 150.0 ㎎, 전분 BP 30.0 ㎎, 전젤라틴화 옥수수 전분 BP 15.0 ㎎ 및 스테아르산 마그네슘 1.0 ㎎이다.

또한 캡슐제는 제조방법에 있어서 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 바람직한 일실시예로서 상기 갈란진 또는 캠퍼롤 중 어느 하나를 포함하거나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 약학 조성물을 체질한 다음 부형제와 혼합한 후에 젤라틴 캡슐에 충전하여 제조되는데, 이때, 캡슐제의 바람직한 성분 및 함량은 본 발명에 따른 상기 약학 조성물 5.0 ㎎, 전분 100.0 ㎎ 및 스테아르산마그네슘 BP 1.0 ㎎이다.

또한 시럽제는 제조방법에 있어서 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 바람직한 일실시예로서 정제수 500 ㎖에 백당을 용해시키고, 별도의 용기에 카르복시메틸셀룰로오스나트륨을 정제수 400 ㎖에 용해시킨 후에, 상기 백당이 용해된 정제수와 메틸셀룰로오스나트륨이 용해된 정제수를 혼합하고, 메틸파라벤과 프로필파라벤을 첨가하여 용해시키고, 에탄올을 첨가한 후에 정제수를 전체 용액의 용량이 1,000 ㎖가 되도록 첨가하고, 여기에 상기 갈란진 또는 캠퍼롤 중 어느 하나이거나, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 약학 조성물을 현탁시켜 제조되는데, 이때, 상기 시럽제의 바람직한 성분 및 함량은 본 발명에 따른 상기 약학 조성물 5.0 g, 백당 637.5 g, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 2.0 g, 메틸파라벤 0.28 g, 프로필파라벤 0.12 g, 에탄올 20 ㎖, 정제수 잔량이다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9(matrix metalloproteinase-9) 발현 억제제는

플라보노이드인 갈란진 또는 캠퍼롤 중 어느 하나를 포함하거나, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9 발현 억제제이며,

상기 발현 억제제는 생체외(in vitro)에서 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9 발현 억제제이다.

본 발명에 따른 상기 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9 발현 억제제는 플라보노이드인 갈란진 또는 캠퍼롤, 또는 이들의 혼합물을 포함하여 상기 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9의 발현을 억제하거나 감소시키게 된다. 결국, 이렇게 본 발명에 따른 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9 발현 억제제를 통해 MMP-9의 발현을 억제시키거나 감소시키게 되며, 이를 생체내(in vivo)에 적용하는 경우 항노화, 항염증 효과를 달성할 수 있다.

이렇게 기질 금속 단백질 분해효소인 MMP-9의 발현을 억제할 수 있음은 갈란진과 캠퍼롤로 인해 가능하게 된다. 상기 갈란진과 캠퍼롤은 플라보노이드의 일종으로서 원래 항산화 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 본 발명은 상기 갈란진 또는 캠퍼롤이 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9의 발현을 억제 또는 감소시키는 효과가 있음을 확인한 것이다. 상기 갈란진 또는 캠퍼롤은 NF-KB 또는 AP-1의 활성화를 저해함으로써, PMA에 의해 유도되는 MMP-9의 발현을 저해하게 된다. 또한 상기 갈란진 또는 캠퍼롤의 혼합물을 포함하는 경우에는 상기 갈란진 또는 캠퍼롤이 단독으로 포함되는 경우에 비해 보다 월등한 상승 효과가 달성될 수 있어 바람직하다.

또한 상기 갈란진 또는 캠퍼롤은 0.1-100 μM로 포함되는 것이 세포 독성에 미치는 영향이 적어 바람직한데, 상기 갈란진 또는 캠퍼롤이 100 μM를 초과하게 되면 세포 독성이 커져 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9 발현 억제제로 활용하기 어렵게 되어 바람직하지 않다. 또한 더욱 바람직하게는 상기 갈란진 또는 캠퍼롤은 0.1-30 μM로 포함되는 것이 세포 독성에 미치는 영향이 없어 바람직한데, 상기 갈란진 또는 캠퍼롤이 30 μM을 초과하기 이전까지는 세포 독성이 거의 나타나지 않아 더욱 바람직하다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9의 발현을 억제하는 방법은

1) 플라보노이드인 갈란진 또는 캠퍼롤 중 어느 하나를 포함하거나, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 물질을 처리하여 생체외(in vitro)에서 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9의 발현을 억제하는 단계;

를 포함하는 기질 금속 단백질 분해효소 MMP-9의 발현을 억제하는 방법이다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

<화학물질>

3-히드록시플라본(순도 > 98.0%)은 Tokyo Chemical Industry(일본)로부터 얻었다. 갈란진(순도 ≥ 95.0 %), 캠퍼롤(순도 ≥ 90.0%), 피세틴(순도 ≥ 98.0 %), 케르세틴(quercetin, 순도 ≥ 98.0 %), 모린(morin, 순도 ≥ 85.0 %)과 미리세틴(myricetin, 순도 ≥ 96.0 %)은 Sigma-Aldrich(미국)로부터 얻었다. 고시페틴(gossypetin, 순도 ≥ 97.0 %)은 Timtec(미국)으로부터 얻었다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)는 Sigma-Aldrich로부터 얻었다. PMA는 A.G. Scientific(미국)으로부터 얻었다. 항-MMP-9, 항-포스포-ERK1/2, 항-ERK, 항-포스포-JNK, 항-JNK, 항-포스포-p38 MAPK, 항-포스포-IκBα와 항-IκBα 항체들은 Cell Signaling Technology(미국)로부터 구입하였다. 항-p38 MAPK 항체는 Santa Cruz Biotechnology(미국)로부터 구입하였다. 항-GAPDH 항체는 AbClon(한국)으로부터 구입하였다. 서양고추냉이 과산화효소-결합 염소-항 마우스 또는 토끼 IgG 항체는 KOMA(한국)로부터 구입하였다.

<세포배양>

5 % CO₂를 함유한 37 ℃의 가습 배양기 안에서 10 % 우태아혈청(FBS), 100 U/ml 페니실린과 100 μg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Thermo Scientific, 미국)에 인간 섬유육종 HT-1080 세포를 유지시켰다. 플라보놀을 세포에 첨가하였을 때, 이들은 디메틸설폭사이드(DMSO)에서 가용화되었다. 최종 농도 0.2 % 미만의 DMSO 함유 DMEM에서 세포를 배양하였다.

<젤라틴 자이모그래피 ( zymography ) 분석법>

100 % 미만으로 밀집된(subconfluent) HT-1080 세포를 12-웰 플레이트에 도말하고 30 ng/ml PMA와 다양한 농도의 플라보놀을 가진 무혈청 배지와 함께 24 시간 배양하였다. 순화(conditioned) 배지를 0.1 % 젤라틴 함유 7.5 % SDS 겔을 이용하여 젤라틴 자이모그래피 분석(Lv et al., 2013, Nam et al., 2011) 처리하였다. 겔을 상온에서 1 시간 동안 리폴딩(refolding) 완충액(50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2.5 % 트리톤 X-100)에서 배양하고 37 ℃에서 16 시간 동안 반응 완충액(50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 10 mM CaCl2)에서 배양하였다. 다음, 겔을 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) R-250으로 염색하였다.

<세포 증식 분석법>

100 % 미만으로 밀집된 HT-1080 세포를 96-웰 플레이트에 도말하고 10 % FBS와 다양한 농도의 갈란진과 캠퍼롤이 첨가된 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 MTT 용액으로 처리하였고, DMSO로 가용화한 다음, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 565 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<이중-루시페라아제 리포터 분석법>

100 % 미만으로 밀집된 HT-1080 세포를 24-웰 플레이트에 도말하고 인간 야생형 MMP-9 프로모터를 함유하는 개똥벌레 루시페라아제 리포터 구조체 pGL3-M9Pwt(Hah and Lee, 2003)와 레닐라(Renilla) 루시페라아제 리포터 벡터 pRL-TK를 동시에 형질 주입(co-transfection)하였다. 제작사 권고사항에 따라 WelFect-EX와 형질 주입 시약(Welgene, 한국)을 이용하여 형질 주입하였다. 완전(complete) 배지에서 24 시간 배양 후, 상기 배지를 무혈청 배지로 대체한 다음, 세포를 30 ng/ml PMA와 30 μM 갈랑긴 또는 캠퍼롤로 24 시간 동안 처리하였다. 이중-루시페라아제 리포터 분석 장치(Promega, 미국)를 이용하여 세포 용해물의 루시페라아제 활성을 측정하였다.

< 웨스턴 블로팅법과 면역 검출법( immunodetection )>

세포를 얼음 상에서 15 분 동안 RIPA 용해용 완충액[50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0.5 % 데옥시콜레이트, 0.1 % SDS, 1 mM NaF, 1 mM 소듐 오르토바나데이트, 단백질 분해효소 저해제 칵테일 세트 I(Calbiochem, 독일)]을 이용하여 용해시킨 후, 4 ℃에서 15 분 동안 13,000 x g으로 원심 분리하였다. 상청액을 100 mM β-메르캅토에탄올 함유 SDS 시료 완충액(50 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 2 % SDS, 0.1 % 브로모페놀 블루, 10 % 글리세롤)에 재현탁하고 SDSPAGE에 의해 분리하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 막에 블로팅하고 1차 및 2차 항체와 함께 배양하였다. Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore, 미국)와 LAS-3000(Fujifilm, 일본)을 이용하여 면역반응 신호를 검출하였다.

<통계분석>

데이터는 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차로서 나타내었다. Student’s t-검정법을 이용하여 집단 평균을 비교하였다.

실험예

< 실험예 1: 일부 플라보놀은 MMP -9의 분비를 감소시킴>

본 발명들은 젤라틴 자이모그래피를 이용하여 HT-1080 세포에서 PMA에 의해 유도되는 MMP-9 발현에 대한 서로 다른 8종의 플라보놀(Hy: 3-히드록시플라본, Ga: 갈란진, Ka: 캠퍼롤, Fi: 피세틴, Qu: 케르세틴, Mo: 모린, My: 미리세틴, Go: 고시페틴)의 효과를 분석하였다. 기대한 바대로, 본 발명자들은 PMA 처리가 proMMP-9의 분비를 현저하게 증가시킨다는 것을 관찰할 수 있었다(도 1A). 각각의 플라보놀을 30 μM의 농도로 첨가하였을 때, PMA에 의해 유도되는 MMP-9 분비는 갈란진과 캠퍼롤에 의해 명백하게 감소하였고, 피세틴에 의해서는 완만하게 감소하였으며, 케르세틴에 의해서는 미약하게 감소하였다(도 1A). 갈란진, 캠퍼롤과 피세틴을 용량-의존적으로 처리하였더니 갈란진과 캠퍼롤이 피세틴보다 MMP-9 분비를 더 효율적으로 감소시킨다는 것이 밝혀졌다(도 1B). 또한 웨스턴 블로팅 분석을 통해 갈란진, 캠퍼롤과 피세틴은 PMA에 의해 유도되는 MMP-9 분비를 감소시킨다는 것을 입증하였다(도 1C).

< 실험예 2: 갈란진과 캠퍼롤은 30 μM 이하의 농도에서는 세포증식에 영향을 주지 않음>

갈란진과 캠퍼롤에 의해 유도되는 MMP-9 분비 감소가 이들의 세포독성에 기인하는 것인지 조사하기 위해서 본 발명자들은 MTT 분석법을 이용하여 갈란진과 캠퍼롤의 HT-1080 세포증식 효과를 분석하였다. 세포증식은 30 μM 갈란진과 캠퍼롤에 의해서는 영향을 받지 않았고 100 μM 갈란진(79.4 %)과 캠퍼롤(74.3 %)에 의해서 미약하게 저해될 뿐이었다(도 2). 이에 따라 30 μM 갈란진 또는 캠페롤은 세포 생존율에 영향을 주지 않았고 아래 실험을 위한 농도로서 선택하였다.

< 실험예 3: 갈란진과 캠퍼롤은 MMP -9 유전자 전사를 저해함>

갈란진과 캠퍼롤이 매개하는 MMP-9 분비 저해가 MMP-9 전사의 억제 때문인지 분석하기 위해서 본 발명자들은 MMP-9 프로모터 서열(pGL3-M9Pwt)에 결합된 루시페라아제 리포터 유전자로 일시적으로 형질 주입시킨 세포를 이용하여 프로모터 분석을 수행하였다. MMP-9 프로모터에 의해 주도된 루시페라아제 활성은 미처리 세포에 비해 PMA로 처리한 세포에서 22 배까지 증가하였다(도 3). 갈란진 또는 캠퍼롤(30 μM)을 세포에 첨가하였더니 대조군의 약 40 %까지 루시페라아제 활성이 감소하였다. 이 결과는 갈란진과 캠퍼롤이 PMA에 의해 유도되는 MMP-9 유전자의 전사 억제를 입증하는 것이다.

< 실험예 4: 갈란진과 캠퍼롤은 NF -κB와 AP -1 경로를 차단함으로써 PMA 에 의해 유도되는 MMP -9 발현을 못하게 함>

MMP-9 유전자 전사는 대개 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPK)와 NF-κB 경로에 의해 활성화된다. 본 발명자들은 먼저 갈란진과 캠퍼롤이 MAPK 신호전달경로를 조절하는지 조사하였다. PMA에 의해 유도되는 MAPK의 활성화를 위한 최적의 시점을 결정하기 위해서 다양한 시간 간격 동안 HT-1080 세포를 PMA로 자극하였다. PMA는 30-60 분 후에 ERK와 JNK를 최대한 활성화하고 10-30 분 후에 p38 MAPK를 활성화하면서 MAPK의 인산화를 유도하였다(도 4A). 갈란진 또는 캠퍼롤과 함께 세포의 전-배양은 PMA에 의해 유도되는 ERK1/2와 p38 MAPK 인산화에 영향을 주지 않는바, 이는 MMP-9 분비를 유도하지 않는 고시페틴 처리와 유사하다. 그러나 갈란진과 캠퍼롤은 PMA에 의해 유도되는 JNK 인산화를 현저하게 감소시켰다(도 4B).

이러한 결과를 확인한 후, 본 발명자들은 갈란진과 캠퍼롤이 NF-κB 신호전달경로를 제어하는지 조사하였다. 기대한 바대로, PMA 처리는 HT-1080 세포에서 IκBα 인산화를 일시적으로 증가시키고 IκBα 농도를 감소시켰다(도 5A). 흥미롭게도 갈란진과 캠퍼롤은 IκBα 인산화를 현저하게 감소시켰고 이에 따라 IκBα 농도 증가가 수반되었다(도 5B). 종합하면, 이들 결과는 갈란진과 캠퍼롤이 NF-κB 활성화를 방해하고 정도는 덜 하지만 JNK 활성화를 저해하여 AP-1 활성화를 감소시킴으로써 PMA에 의해 유도되는 MMP-9 발현을 감소시킨다는 것을 시사하고 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims (17)

1. MMP-9 발현 저해 활성을 갖는 갈란진을 포함하는, 심장 또는 피부의 항노화용 식품 조성물.
   
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7. 제1항에 있어서,
   상기 갈란진은 0.1-30 μM로 포함되는 것을 특징으로 하는 심장 또는 피부의 항노화용 식품 조성물.
   
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