KR102466932B1 - 약학적 조성물의 제조에서의 사이토크롬 bc1 복합체 저해제의 용도 - Google Patents

약학적 조성물의 제조에서의 사이토크롬 bc1 복합체 저해제의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 평활근 경련과 관련된 질환을 치료하고, 염증 질환을 치료하고, 통증을 완화하는 약학적 조성물의 제조에 있어 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제의 용도에 관한 것이다.

Description

약학적 조성물의 제조에서의 사이토크롬 bc1 복합체 저해제의 용도
본 발명은 생물 약제학 분야에 관한 것이며, 보다 상세하게는 의학에서의 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 평활근 경련-관련 질환의 치료, 염증 질환의 치료 및 통증 완화를 위한 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제의 용도에 관한 것이다.
미토콘드리아 사이토크롬 bc1 복합체는 시토크롬 c 리덕타제 또는 미토콘드리아 호흡 체인 복합체 III (mitochondrial respiratory chain complex III)라고도 하며, 미토콘드리아와 대부분의 박테리아의 호흡 전자 전달 체인의 중요한 구성 요소로서, 유비퀴논에서 사이토크롬 c (박테리아에서는 사이토크롬 c2)로의 전자의 이동을 촉매한다. 사이토크롬 bc1 복합체는 기능성 퀴논-결합 부위 2개를 가지고 있다: 하나는 헴 bL에 근접한 막사이 공간 (intermembrane space)의 한면에 위치한 산화 부위 QO이고, 다른 하나는 헴 bH에 근접한 매트릭스의 한면에 위치한 환원 부위 Qi이다. 따라서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 2개의 범주로 나눌 수 있다: 하나는 미토콘드리아 내막의 내벽에 위치한 Qi 부위에 결합하며, 이런 타입의 저해제는 안티마이신 (antimycin) 및 시아조파미드 (cyazofamid) 등의 Qi 부위 저해제로 지칭되며; 다른 하나는 미토콘드리아 내막의 외벽에 위치한 QO 부위에 결합하며, 이러한 타입의 저해제는 메톡시아크릴레이트 살균제 및 이미다졸리논 등의 QO 부위 저해제로 지칭된다.
사이토크롬 bc1 복합체의 저해제에 대한 현행 연구는 주로 살균 및 살충 효과에 집중되어 있어, 이들 저해제를 이용한 인간 질환 치료에 대한 보고는 거의 없는 실정이다.
미국 공개특허공보 제2015/0203445호(2015.07.23)
Jan Rybniker, et al., Lansoprazole is an antituberculous prodrug targeting cytochrome bc1, Nature Communications, volume 6, Article number: 7659 (2015), 1-8 Diana Ortiz et al., Targeting the Cytochrome bc1 Complex of Leishmania Parasites for Discovery of Novel Drugs, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2016 Aug;60(8):4972-82 Allison M. Stickles et al., Inhibition of Cytochrome bc1 as a Strategy for Single-Dose, Multi-Stage Antimalarial Therapy, Am. J. Trop. Med. Hyg., 92(6), 2015, pp. 1195-1201 Francisco-Javier Gamo, Antimalarial drug resistance: new treatments options for Plasmodium, Drug Discov Today Technol. 2014 Mar;11:81-88
본 발명은, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제에 의한 평활근 경련-관련 질환의 치료 방법, 염증 질환의 치료 방법 및/또는 통증 완화 방법, 평활근 경련-관련 질환의 치료용, 염증 질환의 치료용 및/또는 통증 완화용 약제의 제조에 있어 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제의 용도, 및 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 Qo 부위 저해제이다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 Qi 부위 저해제이다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 스트로빌루린 (strobilurin) 유사체이다. 일부 특정 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 스트로빌루린 유사체는 플루아크리피림 (fluacrypyrim, FAPM), 아족시스트로빈 (azoxystrobin), 트리플록시스트로빈 (trifloxystrobin), 크레스옥심-메틸 (kresoxim-methyl), 피라클로스트로빈 (pyraclostrobin), 피콕시스트로빈 (picoxystrobin), 디목시스트로빈 (dimoxystrobin), 플루옥사스트로빈 (fluoxastrobin) 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 피리돈 유사체이다. 일부 특정 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 피리돈 유사체는 클로피돌 (clopidol), GW844520, GSK932121 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 하이드록시나프토퀴논 유사체이다. 일부 특정 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 하이드록시나프토퀴논 유사체는 아토바쿠온 (atovaquone), 파르바쿠온 (parvaquone), 부파르바쿠온 (buparvaquone), S-10576, NQ3 (2-OH-3-(2-메틸-트리플루오로옥틸)-8-메틸-나프토퀴논) 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 퀴놀론 유사체이다. 일부 특정 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 퀴놀론 유사체는 RCQ06, 엔도킨 (Endochin) 및 엔도킨-유사 퀴놀론 (ELQ), 예를 들어 ELQ-118, ELQ-120, ELQ-121, ELQ-136, ELQ-233, ELQ-245, ELQ-260, ELQ-271, ELQ-274, ELQ-300, ELQ-314, ELQ-316, ELQ-317, ELQ-319, ELQ-337, ELQ-338, ELQ-351, ELQ-370, ELQ-372, ELQ-380, ELQ-384, ELQ-385, ELQ-388, ELQ-390, ELQ-400, ELQ-404, ELQ-428, P4Q-95 및 P4Q-391, 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 아크리딘다이온 (acridinedione) 유사체이다. 일부 특정 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 아크리딘다이온 유사체는 플록사크린 (floxacrine), WR249685, WR243246 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 스타틴 (statin) 유사체이다. 일부 특정 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 스타틴 유사체는 심바스타틴 (simvastatin), 세리바스타틴 (cerivastatin), 로수바스타틴 (rosuvastatin), 프라바스타틴 (pravastatin), 피타바스타틴 (pitavastatin), 메바스타틴 (mevastatin), 로바스타틴 (lovastatin), 플루바스타틴 (fluvastatin), 아토르바스타틴 (atorvastatin) 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 안티마이신 A (antimycin A), 란소프라졸 (lansoprazole), 란소프라졸 설파이드 (lansoprazole sulfide), 오메프라졸 (omeprazole), 펜타미딘 (pentamidine) 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 평활근 경련-관련 질환은 월경통; 기도 경련-관련 질환, 예를 들어 기관지 천식, 천식성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐 질환 또는 기도 과민반응; 혈관 경련-관련 질환, 예를 들어 뇌혈관 경련, 편두통 또는 군발성 두통 (cluster headache); 위장 경련-관련 질환, 예를 들어 급성 위염, 만성 위염, 위 궤양, 십이지장 궤양, 급성 장염, 만성 장염, 크론 질환, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염 또는 장 결핵; 고혈압; 관상 동맥 경련-관련 질환, 예를 들어 변형 협심증; 녹내장; 수술 후 장 폐색증; 빈뇨 (frequent urination); 섬유근육통; 성교통; 과민성 장 증후군; 목 근육 및 눈꺼풀 경련; 과민성 방광; 수술 후 안구 염증 및 호흡 곤란 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현예에서, 염증 질환은 류마티스 관절염, 골관절염, 골용해, 건염, 건막염 및 염증성 호흡 질환, 예를 들어 만성 폐쇄성 폐 질환, 섬유증, 폐기종 또는 급성 호흡 곤란 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현예에서, 통증은 염증성 통증이다.
도 1은 FAPM 및 그 유도체의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 PGF2α에 의해 유발된 랫 자궁 평활근의 수축에 대한 FAPM 및 그 유도체의 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 PGF2α에 의해 유발된 랫 자궁 평활근의 수축에 대한 사이토크롬 bc1 복합체의 Qo 부위 저해제의 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 랫 옥시토신에 의해 유발된 랫 자궁 평활근의 수축에 대한 FAPM의 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 아세틸콜린에 의해 유발된 랫 자궁 평활근의 수축에 대한 FAPM의 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 염화칼륨에 의해 유발된 랫 자궁 평활근의 수축에 대한 FAPM의 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 PGF2α에 의해 유발된 랫 자궁 평활근의 수축에 대한 아토바쿠온의 저해 효과를 나타낸 것이다. IC50 = 8.44±0.7 μM.
도 8은 PGF2α에 의해 유발된 랫 평활근에서 MLC20의 인산화에 대한 FAPM의 저해 효과를 나타낸 것이다.
여러가지 장기들에서 발생하는 명백하게 상이한 병인을 가진 다수의 질병들이 평활근 세포의 생화학적 기능 부전에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. 평활근 세포의 적절한 기능성이 평활근 세포가 중요한 역할을 수행하는 모든 장기에서 건강상의 문제를 피하는 열쇠이다.
본 발명자들은, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제가 평활근의 수축을 생체내에서 저해할 수 있으며, 따라서 평활근 경련-관련 질환을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을, 놀랍게도 알게 되었다.
이에, 제1 측면에서, 본 발명은, 개체에게 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제를 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 평활근 경련-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
임의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 MLC20의 인산화를 방지함으로써 평활근 수축을 저해할 수 있다. 미오신 경쇄 키나제 (myosin light chain kinase, MLCK)는 미오신 II의 미오신 경쇄 (MLC20)를 특이적으로 인산화하는, 칼슘 이온 및 칼모듈린 의존적인 단백질 키나제이다. MLC20의 인산화는 미오신의 굵은 필라멘트와 액틴의 가는 필라멘트 간의 상호작용을 촉매한다. MLCK-매개의 MLC20의 인산화는 평활근 수축을 개시하는데 필수적이다. 본 발명자들은, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제가 MLC20의 인산화를 방지할 수 있으며, 따라서 평활근 수축을 저해함으로써 평활근 경련-관련 질환을 치료할 수 있다는 것을, 놀랍게도 알게 되었다.
본원에서, "평활근"은, 비-제한적인 예로, 자궁 평활근, 방광 평활근, 홍채 근육, 생식기 평활근, 나팔관 평활근, 기관지 평활근, 혈관 평활근 및 위장 평활근 등을 포함한다.
본원에서, "평활근 경련-관련 질환"은, 비-제한적인 예로, 하기 (1) - (8)로부터 선택되는 질병을 포함한다:
(1) 부인과 질환 (자궁 평활근): 월경통; 조산; 및 만삭 전 조기 양막 파열 (preterm premature rupture of membrane);
(2) 비뇨계 질환 (요도 평활근, 방광 평활근): 양성 전립선 과형성증; 비뇨기계 결석, 예를 들어, 신장 결석 및 요관 결석; 과민성 방광; 빈뇨; 및 발기부전;
(3) 소화기계 질환 (식도 평활근, 괄약근, 위장 평활근): 식도 및 들문의 이완불능증; 과민성 장 증후군; 오디 괄약근 기능부전 (sphincter of Oddi dysfunction); 위장 경련성 복통, 예를 들어 위염, 위 궤양, 십이지장 궤양, 궤양성 대장염, 크론 질환 및 급성 및 만성 충수염; 담석증; 급성 및 만성 담낭염; 급성 및 만성 췌장염; 급성 및 만성 복막염; 및 장 폐색.
(4) 호흡계 질환 (기관 및 기관지 평활근): 천식, 예를 들어 만성 기관지염 천식, 알레르기성 천식, 약물-유발성 천식, 노인 천식, 기침 이형 천식 (cough variant asthma), 만성 천식, 운동-유발성 천식 및 어린이 천식; 기관염; 급성 및 만성 기관지염; 만성 폐쇄성 폐 질환; 및 호흡 곤란 증후군;
(5) 심혈관 질환 (혈관 평활근): 고혈압; 문맥 고혈압; 죽상동맥경화증; 협심증, 예를 들어 변형 협심증, 불안정 협심증 및 안정형 협심증; 심근경색; 및 비대성 심근증;
(6) 뇌 혈관 경련-관련 질환: 허혈성 뇌혈관 질환, 예를 들어 뇌 경색, 일과성 허혈성 발작 및 뇌 혈전증; 혈관 치매; 뇌 동맥경화; 어지러움; 두통; 및 난치성 딸꾹질;
(7) 말초 혈관 경련-관련 질환: 편두통; 간헐성 파행증; 레이노드 증후군; 녹내장; 돌발성 난청; 이명; 현훈증 (vertigo); 및 멀미; 및
(8) 기타: 안검경련 (blepharospasm).
예를 들어, "평활근 경련-관련 질환"은 월경통; 기도 경련-관련 질환, 예를 들어 기관지 천식, 천식성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐 질환 또는 기도 과민반응; 혈관 경련-관련 질환, 예를 들어 뇌혈관 경련, 폐 고혈압, 혈관 난청, 편두통 또는 군발성 두통; 위장 경련-관련 질환, 예를 들어 담낭염, 담관염, 담석, 급성 위염, 만성 위염, 위 궤양, 십이지장 궤양, 급성 장염, 만성 장염, 크론 질환, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염 또는 장 결핵; 고혈압; 관상 동맥 경련-관련 질환, 예를 들어 변형 협심증; 방광염; 요관 결석; 신장산통 (renal colic) 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, "평활근 경련-관련 질환"은 또한 예를 들어 수술 후 장 폐색증, 빈뇨, 섬유근육통, 성교통, 과민성 장 증후군, 목 근육 및 눈꺼풀 경련, 과민성 방광, 수술 후 안구 염증 및 호흡 곤란 증후군을 포함할 수 있다.
예를 들어, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제를 이용한 치료는 적어도 일부 평활근 세포의 현저한 이완을 유발하여, 주요 동맥 (예, 대동맥) 및 중간 크기 동맥의 동맥 직경을 증가시킴으로써 혈압을 낮추고, 중간 크기 동맥 (예, 관상 동맥)의 직경을 증가시킴으로써 협심증을 감소시키며; 폐 세기관지 평활근 세포를 이완시켜 기도 직경을 증가시킴으로써 천식 증상을 완화하고; 눈의 카테터 시스템 (catheter system)을 이완하여, 예를 들어 누관의 직경을 증가시킴으로써 안구 내압을 떨어뜨리고, 이로써 녹내장 및 실명 위험성을 낮추고; 나팔관 및 자궁의 평활근 세포를 이완시켜 근육 조직의 이완을 유발함으로써 생식력을 개선시키고 및/또는 월경통 증상을 완화하고; 담관, 요관 및 요도의 평활근 세포를 이완시켜 카테터의 직경을 증가시킴으로써 담석 또는 신장 결석으로 인한 경련 위험성을 낮추고; 위장 평활근을 이완시켜, 예를 들어 경련성 산통을 완화할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 평활근 경련-관련 질환은 월경통이다. 다른 바람직한 구현예에서, 평활근 경련-관련 질환은 원발성 월경통 (primary dysmenorrhea)이다.
또한, 본 발명자들은, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제가 염증 증상을 생체내에서 현저하게 저해할 수 있다는 것을, 놀랍게도 알게 되었다. 예를 들어, 실시예 5에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제가 마우스에서 크실렌-유발성 귓바퀴 부종과 랫에서 카라기난-유발성 발바닥 부종을 저해할 수 있는 것으로 확인된다.
이에, 제2 측면에서, 본 발명은 개체에게 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제를 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 개체에서 염증 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
임의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 질소 산화물 (NO)의 생산을 저해함으로써 염증을 저해할 수 있다. NO는 생명 활동을 조절하는 중요한 소분자 물질이며, 이는 질소 산화물 신테타제 (NOS)를 통해 L-아르기닌으로부터 만들어진다. NOS 동종효소 (isoenzyme)에는 3가지 서브타입, 즉 정상 조건에서 발현되는 뉴런 질소 산화물 신타제 (nNOS) 및 내피 질소 산화물 신타제 (eNOS)와, 상해 후 유도되는 유도성 질소 산화물 신타제 (iNOS)가 있다. 대식세포는 숙주 방어 시스템뿐만 아니라 면역 및 염증성 반응에서 중요한 역할을 담당한다. 대식세포에서의 iNOS 발현은 병리학적 상황에서 현저하게 증가하며, 합성된 다량의 NO는 신체의 다양한 급성 및 만성 염증성 반응에 참여한다. 본 발명자들은, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제가 대식세포에 의한 질소 산화물의 생산을 저해할 수 있으며, 따라서 염증 질환을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을, 놀랍게도 알게 되었다. 예를 들어, 실시예 3에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제가 마우스에서 단핵구 대식세포에 의한 NO 생산을 저해할 수 있다는 것이, 입증되었다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 염증 질환의 예로는, 류마티스 관절염, 골관절염, 골용해, 건염, 건막염, 통풍, 알츠하이머 질환, 사구체신염, 신우신염, 죽상경화성 질환, 혈관염 및 염증성 호흡 질환 (예, 만성 폐쇄성 폐 질환, 섬유증, 폐기종 및 급성 호흡 곤란 증후군) 등이 있다. 바람직하게는, 염증 질환은 비-감염성 염증 질환이다.
또한, 본 발명자들은, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제가 생체내에서 진통 효과를 가진다는 것을, 놀랍게도 발견하였다. 예를 들어, 본 발명의 실시예 4에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제의 투여가 아세트산, 다이에틸스틸베스트롤 및 PGF2α에 의해 유발되는 마우스의 몸부림 (writhing)치는 횟수를 현저하게 줄일 수 있다.
따라서, 제3 측면에서, 본 발명은 개체에게 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제를 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 개체에서 통증 완화 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 통증은 염증성 통증, 예를 들어, 일련의 신호 전이 경로가 체내에서 염증이 발생한 염증 부위로부터 분비된 염증성 매개인자에 의해 활성화되었을 때, 통증 수용체의 활성화 또는 감작 후 발생되는 통증이다.
본 발명의 다양한 측면에 대한 일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 Qo 부위 저해제이다. 본 발명의 다양한 측면에 대한 일부 다른 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 Qi 부위 저해제이다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 스트로빌루린 유사체이다. 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 스트로빌루린 유사체의 예로는, 비-제한적인 예로, 플루아크리피림 (FAPM), 아족시스트로빈, 트리플록시스트로빈, 크레스옥심-메틸, 피라클로스트로빈, 피콕시스트로빈, 디목시스트로빈, 플루옥사스트로빈 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 피리돈 유사체이다. 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 피리돈 유사체의 예로는, 비-제한적인 예로, 클로피돌 (clopidol), GW844520, GSK932121 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 하이드록시나프토퀴논 유사체이다. 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 하이드록시나프토퀴논 유사체의 예로는, 비-제한적인 예로, 아토바쿠온, 파르바쿠온, 부파르바쿠온, S-10576, NQ3 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 퀴놀론 유사체이다. 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 퀴놀론 유사체의 예로는, 비-제한적인 예로, RCQ06, 엔도킨 (Endochin) 및 엔도킨-유사 퀴놀론 (ELQ), 예를 들어 ELQ-118, ELQ-120, ELQ-121, ELQ-136, ELQ-233, ELQ-245, ELQ-260, ELQ-271, ELQ-274, ELQ-300, ELQ-314, ELQ-316, ELQ-317, ELQ-319, ELQ-337, ELQ-338, ELQ-351, ELQ-370, ELQ-372, ELQ-380, ELQ-384, ELQ-385, ELQ-388, ELQ-390, ELQ-400, ELQ-404, ELQ-428, P4Q-95 및 P4Q-391 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 아크리딘다이온 유사체이다. 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 아크리딘다이온 유사체의 예로는, 비-제한적인 예로, 플록사크린, WR249685, WR243246 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 스타틴 유사체이다. 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 스타틴 유사체의 예로는, 비-제한적인 예로, 심바스타틴, 세리바스타틴, 로수바스타틴, 프라바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 로바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염 등을 포함한다.
일부 다른 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 안티마이신 A (antimycin A), 란소프라졸 (lansoprazole), 란소프라졸 설파이드 (lansoprazole sulfide), 오메프라졸 (omeprazole), 펜타미딘 (pentamidine) 및 이들의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
전술한 사이토크롬 bc1 복합체에 대한 구체적인 저해제 및 본 발명의 사이토크롬 bc1 복합체에 대한 다른 이용가능한 저해제는, 예를 들어, Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jan 20, 112(3): 755-60; Antimicrob Agents Chemother. 2016 Jul 22, 60(8): 4972-82；Am J Trop Med Hyg. 2015 Jun, 92(6): 1195-201；PLoS One. 2013 Aug 12, 8(8): e71726; Nat Commun. 2015 Jul 9, 6: 7659; Cell Metabolism 22, 399-407, September 1, 2015; Nat Chem Biol. 2015 Nov, 11(11): 834-6; J. Med. Chem. 2015, 58, 9371-9381; ACS Med. Chem. Lett., 2012, 3 (12), pp 951-951; J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 3377-3386; J. Phys. Chem. B 2016, 120, 2701-2708; Mol Biochem Parasitol. 2011 May, 177(1): 12-9; US2015/0203445 A1; 및 WO 2012070015 A1에서 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 사이토크롬 bc1 복합체에 대해 저해 기능을 가진 전술한 화합물의 유도체를 포괄한다.
본원에서, 용어 "개체"는 포유류, 바람직하게는 영장류, 더 바람직하게 인간을 지칭한다.
제4 측면에서, 본 발명은 평활근 경련-관련 질환의 치료용, 염증 질환의 치료용 및/또는 통증 완화용 약제의 제조에 있어 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제의 용도를 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 또한 활성 성분으로서 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 평활근 경련-관련 질환의 치료, 염증 질환의 치료 및/또는 통증 완화를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체에 용해 또는 분산된 하나 이상의 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제를 유효량으로 포함한다. "약제학적으로 허용가능한"이라는 표현은, 적절한 경우 동물 (예, 인간)에 투여되었을 때 유해한, 알레르기서 또는 기타 부적절한 반응을 유발하지 않는, 분자 자체 (molecule entity) 및 조성물을 지칭한다. 사이토크롬 bc1 복합체의 하나 이상의 저해제를 포함하는 약학적 조성물의 제조는 본 발명에 따른 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있으며, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 21st Edition, 2005에 예시되어 있으며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, 인간에게 투여하는 경우, 제제는 약제 승인 기구에 의해 부여된 멸균성, 발열성 (pyrogenicity), 전체 안전성 및 순도에 대한 표준을 충족하여야 하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 당해 기술 분야의 당업자들에게 이해되는 바와 같이, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 항산화제, 염, 코팅제, 계면활성제, 보존제 (예, 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트, 소르브산, 항세균제, 항진균제), 등장화제, 용액 차단제 (예, 파라핀), 흡착제 (예, 카올린, 벤토나이트), 약물 안정화제 (예, 소듐 도데실 설페이트), 겔 (gel), 결합제 (예, 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트라가칸트, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸 셀룰로스, 알기네이트), 부형제 (예, 락토스, 폴리에틸렌 글리콜), 붕해제 (예, 아가, 전분, 락토스, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 알긴산, 소르비톨, 글리신), 습윤제 (예, 헥사데카놀, 글리세릴 모노스테아레이트), 윤활제, 흡수 촉진제 (예, 4급 암모늄 염), 식용 오일 (예, 아몬드 오일, 코코넛 오일, 오일성 에스테르 또는 프로필렌 글리콜), 감미제, 착향제, 착색제, 충전제 (예, 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코스, 만니톨, 규산), 타정 윤활제 (tabletting lubricant) (예, 마그네슘 스테아레이트, 전분, 글루코스, 락토스, 초크 (chalk)), 흡입 담체 (예, 탄화수소 추진제), 완충제 또는 기타 및 이들의 조합을 포함한다 (예, "Remington：The Science and Practice of Pharmacy", 21st Edition, 2005). 또한, 치료학적 또는 약학적 조성물에 대한 활성 성분과 비-혼화성이 아닌 다른 임의의 통상적인 담체의 사용도 고려된다.
임의 경우에, 본 조성물은 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 복수의 항산화제를 포함할 수 있다. 항산화제의 예로는 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 설파이트, 소듐 바이설파이트, 소듐 피로설파이트, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시톨루엔, 부틸화 하이드록시아니솔, 레시틴, 프로필 갈레이트 및 토코페롤 등이 있다. 또한, 미생물 작용 방지는, 비-제한적인 예로, 파라벤 (예, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 비롯하여, 다양한 항세균제 및 항진균제와 같은 보존제를 사용함으로써, 달성될 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염으로는, 무기산 (예, 염산, 브롬화수소산 또는 인산) 또는 유기산 (예, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 벤조산, 젖산, 포스폰산, 구연산, 말레산, 푸마르산, 숙신산, 나프탈렌설폰산, 클라불란산, 스테아르산 또는 아몬드산)과 형성된 염 또는 단백질 구성성분의 유리 아미노 기와 형성된 염과 같은, 산 부가 염을 포함한다. 유리 카르복시 기와 형성된 염은 또한 무기 염기 (예, 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 암모늄 하이드록사이드, 칼슘 하이드록사이드, 마그네슘 하이드록사이드 또는 철 하이드록사이드) 또는 유기 염기 (예, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인)으로부터 유래될 수 있다.
조성물이 액체 형태인 경우에 대한 일부 구현예에서, 담체는 용매 또는 분산 매질일 수 있으며, 비-제한적인 예로, 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 액체 (예, 트리글리세라이드, 식물성 오일, 리포좀) 및 이들의 조합 등이 있다. 적절한 유도성은, 예를 들어, 코팅제 (예, 레시틴)를 사용함으로써; 담체 (예, 액체 폴리올 또는 지질) 내 분산에 의해 원하는 입자 크기를 유지함으로써; 계면 활성제 (예, 하이드록시프로필 셀룰로스)를 이용함으로써; 또는 이들 방법을 조합하여 이용함으로써, 유지될 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제 (예, 당, 소듐 클로라이드 또는 이들의 조합)를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의의 적합한 방법을 통해 투여될 수 있다 (예, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, " 21st Edition, 2005). 약학적 조성물은 정맥내, 근육내, 복막내, 척수내, 피하, 관절내, 활액내, 척추강내, 경구, 국소 (local) 또는 흡입 경로를 통해 투여될 수 있다.
경구 투여하는 경우, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 정제, 캡슐제, 사셰, 바이얼, 산제, 과립제, 로젠제, 재구성가능한 산제 또는 액체 제제의 형태일 수 있다. 필요에 따라, 필요한 양의 활성 화합물을 전술한 다른 복수의 성분이 함유된 적절한 용매에 혼합한 다음 이를 여과 및 살균 처리함으로써, 무균성 주사 용액이 제조된다. 일반적으로, 복수의 무균성 활성 성분을 염기성의 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유한 무균성 담체에 투입함으로써, 분산 시스템을 제조한다. 무균성 주사 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 제조하기 위한 무균성 산제의 경우, 바람직한 조제 방법은 진공 건조 또는 동결 건조 기법이며, 이는 활성 성분 + 미리 여과된 무균성 액체 매질로부터 유래된 임의의 적절한 다른 성분을 함유한 산물을 만들어낸다. 필요에 따라, 액체 매질은 적절하게 완충화되어야 하며, 액체 희석제는 충분한 식염수 또는 글루코스를 주사 전에 사용해 등장성이 되어야 한다. 또한, 용매로서 사용되는 DMSO가 매우 신속하게 침투하여, 활성 약제를 고 농도로 작은 영역에 전달시키는 것을 계획한 경우에는, 직접 주입을 위한 고도로 농축된 조성물을 제조하는 것도 고려된다.
본원에서, "치료학적 유효량" 또는 "치료학적 유효 투여량"은 개체에게 투여된 후 치료학적 효과를 발휘하기에 적어도 충분한, 물질, 화합물, 재료 또는 화합물을 함유한 조성물의 양을 지칭한다. 즉, 이는 질환 또는 증상의 증상을 예방, 치유, 개선, 지연 또는 부분적으로 지연하는데 필요한 양이다.
본 발명의 조성물이 환자에게 투여되어야 하는 실제 투여량은 다음과 같은 신체적 및 생리학적 인자에 따라 결정될 수 있다: 체중, 성별, 증상의 중증도, 치료할 질환의 타입, 이전 또는 현행 치료 개입, 환자의 미확인 병인성 질환, 투여시간, 특정 화합물의 배출율 및 투여 경로. 임의 경우에, 조성물 내 활성 성분의 농도 및 개별 개체에 적절한 투여량은 투여를 담당하는 의료인에 의해 결정될 것이다. 일부 특정 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 1-150 mg/체중 kg, 예를 들어 1-100 mg/체중 kg, 1-50 mg/체중 kg, 1-30 mg/체중 kg, 1-20 mg/체중 kg, 1-15 mg/체중 kg, 1-10 mg/체중 kg, 1-5 mg/체중 kg 또는 3-5 mg/체중 kg의 투여량으로 투여된다. 일부 특정 구현예에서, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제 또는 약학적 조성물은 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회 또는 2일에 1회, 3일 간격, 4일 간격, 5일 간격, 6일 간격 또는 7일 간격으로 투여된다.
일부 특정 구현예에서, 주사된 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수 지연제 (예, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합물)를 사용함으로써 달성될 수 있다.
실시예
본 발명은 본원에 제공된 일부 구체적인 실시예들을 참조하여 추가로 이해될 수 있으나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 목적일 뿐이며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 명백하게, 본 발명의 본질로부터 이탈되지 않으면서도 본 발명에 대해 다수의 변형 및 수정을 가할 수 있으며, 따라서 이러한 변형 및 수정 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
실시예 1. 랫 평활근의 수축에 대한 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제의 저해효과
실험 재료 및 방법
1.1 실험 동물:
1. 위스타 랫 (Wistar rat), 암컷, 체중 230-270 g, Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences 사에서 구입, 의학 동물의 Cat. No. D01-3039.
1.2 실험 시약:
옥시토신 주사제 (Nanjing Biochemical Pharmaceutical Factory, Cat number 051069); 다이에틸스티베스트롤 (Beijing Yimin Pharmaceutical Co., Ltd., Cat number 0506150); PGF2α, 크레스옥심-메틸, 아세틸콜린, 아족시스트로빈, 플루옥사스트로빈, 스티그마텔린, 믹소티아졸 및 아토바쿠온 이들 모두 Sigma (St. Louis, MO) 사에서 구입; 트리플록시스트로빈, 피라클로스트로빈, 피콕시스트로빈 및 디목시스트로빈 모두 Santa Cruz Biotechnology 사에서 구입; 플루아크리피림 (FAPM) 및 이의 유도체는 실험실에서 합성 (Int J Cancer. 2010 Sep 1;127(6):1259-70).
1.3 실험 장비
Pclab 생물 신호 획득 및 가공 시스템 (Beijing Microsighalstar Technology Development Co., Ltd.에서 구입); CS502-3C 디지탈 슈퍼서모스타트 (Chongqing SD Experiment Instrument Co., Ltd. 사에서 구입, 온도 변동성 ≤ 0.5℃); GTS 바이오시그널 센서 (Beijing Microsighalstar Technology Development Co., Ltd. 사에서 구입); JZ101 근육 긴장 트랜스듀서 (Gaobeidian Xinhang Electromechanical Equipment Co., Ltd.).
1.4 실험 방법
체중 230-270 g의 건강한 위스타 암컷 랫을 실험에 사용하였다. 실험 2일 전에, 다이에틸스틸베스트롤 현탁액을 0.1 mg/kg로 복막내 1회 주사하여, 인공 발정을 유도하였다. 랫을 경추 탈구에 의해 희생시키고, 개복술로 자궁을 취하여, 즉시 티로드 (Tyrode) 용액이 담긴 유리 플레이트에 넣었다. 자궁벽에 붙어있는 결합 조직과 지방세포 조직을 조심스럽게 벗겨내고, 메산지움 라인 (mesangial line)을 따라 절개하여 자궁을 연 다음 평활근을 따라 전개되어 있는 자궁 수축 밴드를 외과용 칼을 이용해 자궁 한면을 좌 및 우 자궁 근육 스트립으로 자르고, 한면의 자궁 근육 스트립의 말단 2개를 각각 와이어로 결찰한 후, 산소 통기되고 티로드 용액 5 ml이 충전되어 있으며 37.2±0.5℃로 예열된 영양관 (nutrient tube)으로 옮겼으며, 영양관의 하단은 고정되고 상단은 긴장 센서 (tension sensor)와 연결되어 있다. 재료를 20-30분간 두고, 액체를 2-3회 교체한 다음, 자궁에 하중 1 g을 가하여 자궁이 규칙적인 수축 파 (contraction wave)를 나타낼 때까지 30-60분간 유지시켰으며, 40 mM KCl 용액을 10분간 제공하고, 자궁 근육 스트립의 기능을 평가하였다. 그런 다음, 근육 스트립을 이완시켜, 티로드 용액으로 2-3회 세척한 다음 30분간 방치하였으며; 방치 후 자궁 근육 스트립에 하중 1 g을 가하여 30-60분간 유지시키고, 자궁 근육 스트립이 안정적으로 수축된 후 (즉, 규칙적인 수축 파형이 마이크로컴퓨터 디스플레이 스크린에서 나타남) 투여 및 관찰하고, 자궁 평활근 스트립의 수축 텐션 (contraction tension), 진폭 및 수축 곡선 하 면적 등의 관련 데이터의 변화를 기록하였으며, 주어진 약물을 테스트하였다. 실험 동안에, 티로드 용액의 워킹 온도는 37.2±0.5℃로 유지하였으며, 초당 기포 1-2개로 산소를 영양관에 계속적으로 통기시켰다. 누적 투여 방법을 적용하였으며, 5 ㎕씩 각각 투여하였고, 저 농도에서 고 농도로 사용하였다. 최종 약물 농도는 맥파랜드 관 (McFarland tube) 내 5 ml 티로드 용액에 용해된 약물의 농도를 나타낸다.
1.5 통계적 처리
모든 실험 데이터는 "x±s"로 나타내며, SAS 소프트웨어를 사용해 통계적 분석에 대한 단일-인자 멀티-레벨 T 검정을 수행하였으며, 그래프 작성에는 originpro7.5 소프트웨어를 사용하였다. 이미지 처리에는 Photoshop CS2 소프트웨어를 사용하였다.
2. 실험 결과
2.1 PGF2α에 의해 유발된 랫 평활근의 수축에 대한 FAPM 및 그 유도체의 저해 효과
플루아크리피림 (FAPM)은 BASF SE 및 Nippon Soda Co., Ltd. 사에서 개발한 첫번째 스트로빌루린 살비제로서, 미토콘드리아 사이토크롬 bc1 복합체의 Qo 부위 저해제이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, HTFAPM, FAPMA 및 IFAPM은 본 발명자들이 실험실에서 합성한 FAPM 유도체 3종이다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 정상 환경에서는, 분리된 랫 자궁 평활근 스트립은 가끔식 자율적인 수축을 보였으며, 자발적으로 율동적 수축을 발생시킬 수 있었다. PGF2α (450nM)을 영양관에 첨가한 경우, 자궁 평활근 스트립의 수축 진폭 및 빈도가 현저하게 증가하였다. 실험에서, FAPM이 PGF2α-유도성 랫 자궁 평활근 수축의 진폭 및 빈도를 용량 의존적인 방식으로 저해한다는 것이, 확인되었다. 동일한 용량에서, IFAPM은 PGF2α에 의해 유도된 랫 자궁 평활근 수축을 일부 저해한 반면 HTFAPM과 FAPMA는 저해 효과가 없었다. 약물 개입 전과 여러가지 용량의 약물 개입 후 10분째에 평활근 수축 곡선 하 면적을 각각 계산하였다. PGF2α에 의해 유도된 평활근 수축 곡선 하 면적을 100%로서 취하여 약물 용량-효과 그래프를 작성하고, 약물의 자궁 평활근 수축 저해에 대한 평균 유효 용량 (IC50)을 계산하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, FAPM 및 IFAPM의 IC50은 각각 1.84±0.08 μM 및 18.5±3.0 μM이었다. 구조-활성 관계 분석을 통해, FAPM의 O14의 메톡시아크릴레이트가 자궁 평활근 수축을 저해하는데 중요한 작용기인 것으로 밝혀졌다.
2.2 PGF2α에 의해 유도된 랫 평활근 수축에 대한 스트로빌루린 살진균제의 저해 효과
이하, PGF2α에 의해 유도된 랫 평활근 수축에 대한 실험 모델에서, 아족시스트로빈, 트리플록시스트로빈, 크레스옥심-메틸, 플루옥사스트로빈, 피라클로스트로빈, 피콕시스트로빈 및 디목시스트로빈과 같은 다양한 스트로빈루린 살진균제의 자궁 평활근 수축 저해 효과를 체계적으로 비교하였다. 도 3 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 이들 화합물은 PGF2α에 의해 유도된 랫 평활근 수축을 용량-의존적인 방식으로 저해하였으며, IC50 값은 FAPM과 등가인 1.05 - 4.08 μM이었다. 스티그마텔린 및 믹소티아졸은 사이토크롬 bc1 복합체에 대해 보고된 가장 강력한 호흡 억제제로서, 사이토크롬 bc1 복합체를 연구하기 위해 가장 널리 사용되는 소분자 화합물 프로브이다. 이들 2가지 화합물은 PGF2α에 의해 유도된 랫 평활근 수축에 가장 강력한 저해 효과를 나타내었으며, IC50가 나노몰 수준이었다.
표 1. PGF2α에 의해 유도된 랫 평활근 수축에 대한 사이토크롬 bc1 복합체 저해제의 저해 효과
저해제 IC 50(μM)
FAPM 1.69±0.16
아족시스트로빈 1.70±0.12
트리플록시스트로빈 1.77±0.05
크레스옥심-메틸 4.08±0.29
피라클로스트로빈 1.05±0.01
피콕시스트로빈 1.20±0.02
디목시스트로빈 1.65±0.12
플루옥사스트로빈 2.63±0.30
스티그마텔린 89.9 nM
믹소티아졸 214.7 nM
2.3 옥시토신, 아세틸콜린 및 염화칼륨에 의해 유도된 랫 평활근의 수축에 대한 FAPM의 저해 효과
옥시토신은 옥시토신 수용체의 활성화에 의해 자궁 평활근의 율동적 수축을 유발하는 자궁 평활근의 흥분제이다. 아세틸콜린은 평활근 M-타입 콜린 수용체를 활성화하여 자궁 평활근의 율동적 수축을 야기할 수 있는 신경전달물질이다. 염화칼륨은 평활근 세포막을 탈분극화할 수 있으며, 고 농도의 염화칼륨 (40 mM)은 자궁 평활근의 강직성 수축 (tetanic contraction)을 유발할 수 있으며, 저 농도의 염화칼륨 (16 mM)은 자궁 평활근의 율동적 수축을 유발할 수 있다. 도 4-6에 나타낸 바와 같이, FAPM은 옥시토신 (1 mU/ml), 아세틸콜린 (0.25 μM) 및 염화칼륨 (16 mM)에 의해 유도된 자궁 평활근 수축을 용량-의존적인 방식으로 저해하였으며, IC50은 각각 1.6±0.08 μM, 1.36±0.04 μM 및 1.21±0.07 μM이었다.
2.4 PGF2α에 의해 유도된 자궁 평활근 수축에 대한 아토바쿠온의 저해 효과
아토바쿠온은 코엔자임 Q의 상동체인 하이드록시 1,4-나프토퀴놀린이고, 광범위한 항-원충류 활성을 가지고 있다. 미국 식의약청 (FDA)에서는 2011년에 아토바쿠온을 말라리아원충, 주폐포자충 (pneumocystis carinii pneumonia, PCP), 톡소플라즈마 곤디 (toxoplasma gondii) 및 기타 감염에 대한 치료제로서 승인하였으며; 미국 감염병 학회 (IDSA) 지침에서는 2006년에 톡소플라스마증의 치료제로 아토르바스타틴을 권장하였다. 아토바쿠온은 원충류의 사이토크롬 bc1 복합체에 직접 결합할 수 있으며, 이 분자의 약리학적 기전은 사이토크롬 bc1 복합체의 활성을 저해하여, 넓은 범위의 항-원충류 효과를 나타낸다 (Siregar JE, Kurisu G, Kobayashi T, et al. Direct evidence for the atovaquone action on the Plasmodium cytochrome bc1 complex. Parasitol Int. 2015 Jun;64(3):295-300). 이를 토대로, PGF2α에 의해 유도된 랫 자궁 평활근 수축에 대한 아토르바스타틴의 저해 효과를 관찰하였다. 아토르바스타틴은 PGF2α에 의해 유도된 랫 자궁 평활근 수축을 용량-의존적인 방식으로 저해할 수 있으며, IC50 값은 8.44±0.7 μM (도 7)인 것으로 확인되었다.
실시예 2. 랫 평활근 세포에서 MLC20의 인산화에 대한 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 FAPM의 저해 효과
1. 실험 재료 및 방법
1.1. 실험 동물:
위스타 랫 (Wistar rat), 암컷, 체중 230-270 g, Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences 사에서 구입, 의학 동물의 Cat. No. D01-3039.
1.2. 실험 시약:
WB 2x SDS 로딩 완충제, 5x Tris-글리신 전기영동 완충제, 일렉트로트랜스퍼 완충제 및 분리 겔 완충제는 모두 자체 제조하였으며 (용액 준비 참조), 시약 및 X선 감광성 필름은 모두 Beijing Chemical Works 사에서 구입하였고; 포스포-미오신 경쇄-2 (ser19)에 대한 단일클론 항체, 호스래디시 퍼옥시다제 표지된 2차 항체 및 호스래디시 퍼옥시다제 발색 기질 LumiGLO® 기질은 모두 Cell Signaling Technology 사에서 구입하였다.
1.3. 실험 장비:
DNM-9602G 마이크로플레이트 리더, Beijing Perlong New Technology Co., Ltd. 사에서 구입; 안정적인 전압 및 전류 파워 서플라이, 단백질 전기영동 장치, 단백질 일렉트로트랜스터 장치 및 단백질 분자량 마커, New England Biotech 사에서 구입.
1.4. 시험관내 랫 자궁 평활근 세포 배양:
조직 덩어리 (tissue mass) 배양 방법을 적용하였다: 다이에틸스틸베스트롤을 처리한 랫을 탈구에 의해 희생시키고, 소독을 위해 75% 알코올에 침지시킨 후, 무균 조건에서 복강을 열어 자궁을 취하여 플레이트로 옮긴 다음 자궁의 외막을 제거하기 위해 자궁을 열고, 자궁 내막을 블레이드로 조심스럽게 긁어내고, 자궁의 외막을 핀셋으로 조심스럽게 벗겨내었으며, 전체 평활근을 1x1x1 mm3 미만의 작은 조각으로 잘라, 배양 용기의 벽에 균일하게 붙였으며, 배양 용기에는 배양 용액을 바닥부 위로 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 3-4시간 배양한 후 조심스럽게 뒤집어, 조각들이 연결되어 단일층을 배양된 세포를 형성할 때까지 약 1주간 RPMI-1640 배양액 (20% 소 혈청 함유)에 침지하였다. 이때, 용기내 배양 용액을 쏟아내고, 용기내 조직 덩어리는 PBS로 2번 헹군 다음 꺼내고, 0.25% 트립신을 적정량 첨가하였다. 현미경 하에서 대부분의 세포가 수축하여 둥글게 되었을 때, 소 혈청을 첨가하여 반응을 중단시키고, 액체를 쏟아내고, 세포를 PBS로 2번 헹군 다음 RPMI-1640을 적정량 첨가하였으며, 해리된 세포를 파이펫을 사용해 조심스럽게 세척하여, 이후 사용할 세포 현탁액을 준비하였다.
1.5. 전체 세포 단백질 추출:
세포를 105/ml 농도로 조정하여, 6웰 플레이트에 4x105/웰 밀도로 접종하고, 밤새 부착 배양한 후 24시간 동안 혈청을 고갈시킨 다음 여러가지 농도로 FAPM을 전처리하였다. PGF2α 자극 5분 후 세포를 수집하여 빙랭한 PBS로 3번 헹군 다음 2x SDS 로딩 완충제로 세포 용해 (lysis)시켰다. 세포 용해물을 수집하여 10분간 끓인 다음 12000 r/min으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 수집하여 서브패킹한 다음 이후 사용을 위해 -80℃에 보관하였다.
1.6. 면역블롯팅 검출 (웨스턴 블롯팅 혼성화):
서브패킹한 세포 용해물을 실온에서 해동한 다음 SDS-PAGE 겔 전기영동을 수행하였다. 샘플은 마이크로시린지를 사용해 콤 홀에 조심스럽게 주입하고, 브로모페놀 블루 밴드가 분리 겔을 벗어날 때까지 전압을 100 V로 일정하게 하였으며, 그 이후에는 전압을 200 V로 변경하였고; 전기영동 후, 얼음조 안에서 160 mA의 안정적인 전류 하에 막 트랜스퍼를 1시간 수행하여, 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 이동시킨 다음; 막을 플레이트로 옮겨 1시간 동안 실온에서 5% 탈지유 (skim milk)로 블롯킹 처리한 다음, TBS/T로 5분씩 3번 헹구고, 적절한 비율의 1차 항체 희석액을 처리하여 밤새 인큐베이션한 다음 TBS/T로 5분씩 4번 헹구고, 다음날 적절한 비율의 2차 항체 희석액을 처리해 다시 1시간 인큐베이션하고, TBS/T로 5분씩 4번 헹군 다음 LumiGLO® 기질을 처리하여 암 조건 하에 1분간 인큐베이션하였다. X선 필름 현상을 암실에서 수행하였다. 막은 필요에 따라 다른 항체로 재-표지할 수 있으며, 막은 클리어링 완충제 (용액 준비 참조)와 함께 30분간 65℃에서 인큐베이션할 수 있으며, 클리어링 후 막을 TBS/T로 헹구고, 항체는 블록킹 후 표지할 수 있다.
1.7. 통계학적 처리
모든 실험 데이터는 "x±s"로 나타내며, SAS 소프트웨어를 사용해 통계적 분석에 대한 단일-인자 멀티-레벨 T 검정을 수행하였으며, 그래프 작성에는 originpro7.5 소프트웨어를 사용하였다. 이미지 처리에는 Photoshop CS2 소프트웨어를 사용하였다.
2. 결과
도 8에 나타낸 바와 같이, PGF2α 자극이 랫 자궁 평활근 세포에서 MLC20의 인산화를 현저하게 강화하였다. 미리 FAPM을 여러가지 농도로 전처리한 이후에는, MLC20의 인산화 정도가 현저하게 감소되었다. 그레이 분석 (gray analysis)에서, 5 μM 및 10 μM의 FAPM이 PGF2α에 의해 유도된 랫 자궁 평활근 세포에서 MLC20 인산화를 현저하게 저해하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 FAPM과 같은 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제가 MLC20의 인산화를 방지함으로써 평활근 수축을 저해할 수 있다는 것을, 의미한다.
실시예 3. 대식세포에 의한 질소 산화물 생산에 대한 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제의 저해 효과
1. 재료 및 방법
1.1 세포주;
마우스 단핵구 대식세포 RAW 264.7을 Xiehe Cell Bank에서 구입하였다.
1.2 시약 및 장비
리포폴리사카라이드 (LPS)는 Sigma 사에서 구입; RPMI1640 배지, 페니실린, 스트렙토마이신 및 소 태아 혈청은 Invitrogen 사에서 구입; 질소 산화물 검사 키트는 Beyotime Biotechnology 사에서 구입; NM-9602G 마이크로플레이트 리더는 Beijing Perlong New Technology Co., Ltd 사에서 구입.
1.3 세포 배양
마우스 단핵구 대식세포는 10% 소 태아 혈청, 100 μg·mL-1 스트렙토마이신 및 100 units·mL-1 페니실린이 함유된 RPMI1640 배지에서, 정온 인큐베이터에 넣어, 37℃ 및 5% CO2 하에 배양하였으며, 다음날 계대 배양하였다.
1.4 NO 방출 검출
샘플의 NO 함량은 그리스 분석으로 측정하였다. RAW 264.7 세포를 5 x 105 세포/mL로 포함하는 단일 세포 현탁물로 준비하여, 96웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다 (200 ㎕/웰). 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2 하에 12시간 배양한 후, 각각의 웰에 검사 샘플을 여러가지 농도를 첨가하고, 30분 인큐베이션한 다음 LPS (최종 농도 1 μg· mL-1)를 첨가하였다. 각각의 샘플에 대해 LPS 및 블랭크 대조군을 웰 3개씩 설정하였다. 인큐베이터에서 24시간 인큐베이션한 후, 배양액의 상층액 100 ㎕를 흡입하여 효소-표지된 플레이트로 이동시키고, 동일 부피의 그리스 시약을 첨가한 다음 실온에서 10분간 배양한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 저해율을 하기 식으로 계산하였다: 저해율 [OD]LPS - [OD]LPS+샘플/[OD]LPS - [OD]블랭크 x 100%.
2. 결과
마우스 복막 대식세포 세포주 RAW264.7은 염증 실험에서 널리 사용되는 세포 모델 중 하나이다. LPS는 RAW264.7 세포를 자극하여 NO를 생산하기 위해 사용하였으며, 대식세포에 의한 NO 생산에 대한 사이토크롬 bc1 복합체의 다양한 저해제의 저해 효과를 관찰하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제, 즉 아족시스트로빈, 트리플록시스트로빈, 크레스옥심-메틸 및 FAPM 모두 NO 생산을 현저하게 저해하였으며, 각각의 IC50은 1.89±0.35 μM, 0.64±0.21 μM, 2.77±0.69 μM 및 3.80 μM이었다. 최고 저해율은 모두 80% 보다 높았으며, 유효 농도는 자궁 평활근 수축 저해 농도와 동일하였다. 스티그마텔린과 믹소티아졸이 자궁 평활근 수축에 가장 강력한 저해 활성을 나타내었으며, 이들의 NO 생산 저해 IC50 역시 가장 낮아 각각 6.24±1.15 nM 및 2.8 nM이었으며, 최고 저해율은 각각 88.3±3.9% 및 95%이었다.
표 2. 대식세포에 의한 질소 산화물 생산에 대한 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제의 저해 효과
저해제 IC 50(μM) 최고 저해율
아족시스트로빈 1.89±0.35 μM 86.7±4.3
트리플록시스트로빈 0.64±0.21 μM 90.7±2.9
크레스옥심-메틸 2.77±0.69 μM 88.7±5.6
FAPM 3.80 μM 80
스티그마텔린 6.24±1.15 nM 88.3±3.9
믹소티아졸 2.8 nM 95
실시예 4. 생체내 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제의 진통 효과에 대한 실험
1. 재료 및 방법
1.1 실험 동물:
클린 쿤밍 (Kunming) 암컷 및 수컷 마우스, 체중 22-28 g, Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences 사에서 구입, 의학 동물의 Cat. No: D01-3039.
1.2 실험 약물 및 시약
옥시토신 주사제 (Nanjing Biochemical Pharmaceutical Factory, cat. Number: 051069); 다이에틸스티베스트롤 (Beijing Yimin Pharmaceutical Co., Ltd., cat. Number: 0506150); 인도메타신 (indomethacin), PGF2α, 크레스옥심-메틸 및 아족시스트로빈은 Sigma (St. Louis, MO) 사에서 구입; 트리플록시스트로빈, 피콕시스트로빈 및 디목시스트로빈은 Santa Cruz Biotechnology 사에서 구입; FAPM은 실험실에서 발명자들이 합성 (Int J Cancer. 2010 Sep 1; 127(6): 1259-70).
1.3 마우스의 아세트산 비틀기 검사 (writhing test)
Xu Shuyun의 "Pharmacological Experimental Methodology"에 기술된 마우스 아세트산 비틀기 검사를 참조하여, 마우스의 복막염 통증 모델을 구축하였다. 건강한 성체 쿤밍 수컷 마우스를 그룹 당 마우스 6-10마리씩 무작위 배정하였다. 실험 1시간 전에, 서로 다른 타입 및 용량의 사이토크롬 bc1 복합체 저해제를 복막내 또는 위내로 제공하였으며, 인도메타신 (50 mg/kg)을 양성 대조군으로 복막내 주사한 다음, 0.6% 빙초산을 0.1 ml/10g으로 복막내 주사하였으며, 비틀기 개시 시간 (반응 잠복기) 및 30분내 비틀기 횟수를 관찰 및 기록하였다.
1.4 마우스의 월경통 모델 확립
마우스 월경통 모델은 Yang L., Cao Z., Yu B. ＆ Chai C. An in vivo mouse model of primary dysmenorrhea. Exp Anim. 2015, Aug 64, 295-303을 참조하여 확립하였다. 건강한 성체 쿠민 암컷 마우스를 그룹 당 10마리씩 무작위 배정하였다. 실험 마우스에는 12일간 다이에틸스틸베스트롤을 매일 0.2 mg씩 위내 제공하였다. 마지막 투여 후 30분 후에 서로 다른 타입 및 용량의 사이토크롬 bc1 복합체 저해제를 복막내 또는 위내 제공하였다. 인도메타신 (50 mg/kg)을 양성 대조군으로 복막내 주사한 다음 1시간 후 PGF2α (1.3 mg/kg) 또는 옥시토신 (20 U/kg)을 복막내 주사하고, 비틀기 개시 시간 (반응 잠복기) 및 30분내 비틀기 횟수를 관찰 및 기록하였다.
1.5 통계학적 처리
모든 실험 데이터는 "x±s"로 나타내며, SAS 소프트웨어를 사용해 통계적 분석에 대한 단일-인자 멀티-레벨 T 검정을 수행하였다.
2. 결과
2.1 마우스에서 아세트산-유도 비틀기에 대한 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제의 저해 효과
통증은 급성 또는 잠재적인 조직 손상으로 인해 유발되는 불쾌한 느낌과 감정 경험이다. 빙초산과 같은 화학적 자극에 의해 수득되는 통증 모델은 현재 가장 많이 연구되고 가장 널리 사용되는 통증 모델이다. 이러한 염증 자극 약물은 호중구 주화성을 통해 급성 염증성 통증을 유발하며, 대식세포의 침윤을 매개하여 지속적인 통증을 야기한다. 마우스 아세트산 비틀기 검사는 비-마약성 진통제를 스크리닝하는데 적합하며, 특히 스테로이드계 항-염증제의 진통 효과를 스크리닝하는 민감하고 간단한 방법이다. 표 3-6에 나타낸 바와 같이, 빙초산 (0.6%, 0.1 ml/10g)을 복막내 주사한 지 30분내에, 마우스는 약 40번 비틀었으며, 잠복기는 2-3분이었다. 실험 1시간 전에, 사이토크롬 bc1 복합체 저해제인 FAPM (50, 100 및 200 mg/Kg) 및 트리플록시스트로빈 (50, 100 및 200 mg/Kg)의 복막내 주사, 또는 아족시스트로빈 (50, 100, 200 및400 mg/Kg)의 위내 투여시, 마우스의 비틀기 횟수는 용량-의존적인 방식으로 억제되었다. 대조군과 비교해, 비틀기 개시 시간 (반응 잠복기)은 FAPM 군과 트리플록시스트로빈 군의 경우에는 현저하게 연장되었고, 용량 효과가 있었지만, 아족시스트로빈 군의 경우에는 현저하게 연장되지 않았다. 치유 효과 측면에서, FAPM, 트리플록시스트로빈 및 아족시스트로빈 100 mg/Kg은 인도메타신 50 mg/Kg과 등가였다. 용량 200 mg/Kg에서, 복막내 투여한 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제, 디목시스트로빈, 크레스옥심-메틸 및 피콕시스트로빈의, 마우스에서의 아세트산-유도성 비틀기 저해 효과들을 비교하였다. 그 결과, 이들 저해제 3종은 마우스의 비틀기 횟수를 명백하게 억제하였지만, 비틀기 개시 시간은 연장시키지 못한 것으로 확인되었다.
표 3. 마우스에서 아세트산-유도성 비틀기에 대한 FAPM의 복막내 투여에 따른 저해 효과
용량 동물 수 비틀기 횟수 비틀기 개시 시간
용매 대조군
인도메타신 군
FAPM

 0.2 ml
50 mg/Kg
50 mg/Kg
100 mg/Kg
200 mg/Kg		 10
10
10
10
10		 38.5±3.8
15.8±3.9**
25.3±4.7**
17.6±3.5**
2.4±2.2** 		2.4±0.9
4.6±0.8**
3.4±1.1**
4.6±1.5**
11.9±2.6**
이식된 대조군과 비교 ** P <0.01.
표 4. 마우스에서 아세트산-유도성 비틀기에 대한 트리플록시스트로빈의 복막내 투여에 따른 저해 효과
용량 동물 수 비틀기 횟수 비틀기 개시 시간
용매 대조군 0.2 ml 6 42.0±5.1 2.3±0.5
트리플록시스트로빈 50 mg/Kg 6 22.3±1.2** 3.3±0.5*
100 mg/Kg 6 14.0±1.7** 4.3±1.6**
200 mg/Kg 6 4.0±2.3** 8.5±2.4**
이식된 대조군과 비교 ** P <0.05; ** P <0.01.
표 5. 마우스에서 아세트산-유도성 비틀기에 대한 아족시스트로빈의 복막내 투여에 따른 저해 효과
용량 동물 수 비틀기 횟수 비틀기 개시 시간
용매 대조군 0.2 ml 10 41.3±3.8 2.5±1.0
인도메타신 군 50 mg/Kg 10 24.8±4.8** 3.4±1.0
아족시스트로빈 50 mg/Kg 10 31.9±3.1** 3.2±1.1
100 mg/Kg 10 24.9±4.6** 3.4±1.8
200 mg/Kg 10 21.6±3.5** 3.7±1.5
400 mg/Kg 10 12.4±4.2** 3.4±1.2
이식된 대조군과 비교 ** P <0.01.
표 6. 마우스에서 아세트산-유도성 비틀기에 대한 디목시스트로빈, 크레스옥심-메틸 및 피콕시스트로빈의 위내 투여에 따른 저해 효과
용량 동물 수 비틀기 횟수 비틀기 개시 시간
용매 대조군 0.2 ml 10 41.3±3.8 3.1±0.7
디목시스트로빈 200 mg/Kg 10 31.5±4.7** 3.3±0.5
크레스옥심-메틸 200 mg/Kg 10 33.0±2.9** 3.4±1.0
피콕시스트로빈 200 mg/Kg 10 29.3±4.7** 3.3±1.0
이식된 대조군과 비교 ** P <0.01.
2.2 월경통 모델 마우스에 대한 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제 FAPM 및 아족시스트로빈의 진통 효과
월경통은 가장 흔한 부인과 증상 중 하나로, 2가지 타입, 원발성 월경통과 2차성 월경통으로 나뉜다. 원발성 월경통은 생식 기관에 기질성 병변없이 발생하는 월경통으로 90% 이상을 차지하고, 2차성 월경통은 골반강 기질성 질환에 의해 유발되는 월경통을 의미한다. 원발성 월경통의 발생은 주로 월경 중의 자궁내막내 프로스타글란딘 함량 증가와 관련있다. PGF2α 함량 증가가 월경통의 주요 요인이다. 월경통의 병리생리학적 기전과 관련된 문헌에 기초하여, 다이에틸스틸베스트롤 감작 및 PGF2α 통증 유도 등의 2-단계 방법에 의해 유도된 마우스 월경통 모델을 확립하였다.
표 7 및 8에 나타낸 바와 같이, 다이에틸스틸베스트롤로 감작화한 후, PGF2α (1.3 mg/kg) 복막내 주입 후 30분 이내에 마우스의 비틀기 횟수는 약 20회에 도달하였으며, 잠복기는 1-2분이었다. 실험 1시간 전, 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제 FAPM (50, 100 및 200 mg/Kg)의 복막내 주사 또는 아족시스트로빈 (50, 100 및 200 mg/Kg)의 위내 투여시, 마우스의 비틀기 횟수가 용량-의존적인 방식으로 억제되었으며, 각 용량 군과 대조군 간의 통계학적 차이가 존재하였다. 비틀기 개시 시간이 현저하게 연장된 200 mg/Kg FAPM 군을 제외하고는, 다른 군들에서 비틀기 개시 시간은 대조군과 비교해 현저한 차이가 없었다. FAPM 및 아족시스트로빈 50 mg/Kg은 치유 효과 측면에서 인도메타신 50 mg/Kg과 동일하였다.
옥시토신은 자궁 평활근의 자극인자이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 다이에틸스틸베스트롤 감작 및 PGF2α 통증 유도 등의 2-단계 방법에 의해 유도된 마우스 월경통 모델에서, 마우스의 비틀기 횟수는 거의 40회였다. 아족시스트로빈 (50, 100 및 200 mg/Kg)을 위내 투여하면, 마우스의 비틀기 횟수가 용량-의존적인 방식으로 억제되었으며, 각 용량 군과 대조군 간에 통계학적 차이가 존재하였다. 이 모델에서, 아족시스트로빈 50 mg/Kg이 치유 효과 측면에서 인도메타신 50 mg/Kg과 동일하였다.
표 7. 마우스에서 PGF2α-유도성 월경통에 대한 FAPM의 복막내 투여에 따른 진통 효과
용량 동물 수 비틀기 횟수 비틀기 개시 시간
용매 대조군 0.2 ml 10 20.0±2.1 1.53±0.54
인도메타신 군 50 mg/Kg 10 15.0±2.1** 1.89±0.6
FAPM 50 mg/Kg 10 18.3±3.3 1.24±0.66
100 mg/Kg 10 12.5±1.7** 1.43±0.73
200 mg/Kg 10 5.8±1.2** 2.15±0.34**
이식 대조군 대비 ** P <0.01.
표 8. 마우스에서 PGF2α-유도성 월경통에 대한 아족시스트로빈의 위내 투여에 따른 진통 효과
용량 동물 수 비틀기 횟수 비틀기 개시 시간
용매 대조군 0.2 ml 10 22.6±2.7 2.0±0.8
인도메타신 군 50 mg/Kg 10 16.8±2.5** 2.1±1.2
아족시스트로빈 50 mg/Kg 10 17.7±1.9** 2.1±1.0
100 mg/Kg 10 12.8±2.4** 2.0±1.1
200 mg/Kg 10 10.3±1.3** 2.2±0.8
이식 대조군 대비 ** P <0.01.
표 9. 마우스에서 옥시토신-유도성 월경통에 대한 아족시스트로빈의 위내 투여에 따른 진통 효과
용량 동물 수 비틀기 횟수 비틀기 개시 시간
용매 대조군 0.2 ml 10 36.7±3.6 3.2±0.9
인도메타신 군 50 mg/Kg 10 14.7±1.4** 3.5±1.0
아족시스트로빈 50 mg/Kg 10 24.2±4.1** 3.3±1.5
100 mg/Kg 10 14.2±2.2** 3.9±1.5
200 mg/Kg 10 7.6±1.9** 3.3±1.3
이식 대조군 대비 ** P <0.01.
실시예 5. 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제 FAPM의 생체내 항-염증 효과에 대한 실험
1. 재료 및 방법
1.1 실험 동물:
클린 쿤밍 (Kunming) 암컷 마우스, 체중 22-28 g 및 SD 랫, 체중 120-140 g, Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences 사에서 구입, 의학 동물의 Cat. No: D01-3039.
1.2 실험 약물 및 시약
인도메타신, 덱사메타손 및 카라기난 크실렌은 Sigma (St. Louis, MO) 사에서 구입하였고; FAPM은 본 발명자가 실험실에서 합성하였다 (Int J Cancer. 2010 Sep 1; 127(6): 1259-70).
1.3 크실렌-유도성 마우스 귀 부종 검사
건강한 성체 수컷 마우스 50마리를 5개의 그룹으로 무작위 배정하였다. 실험 동물에 FAPM (50, 100 및 200 mg/kg)을 여러가지 용량으로 각각 1회 복막내 주사하였다. 대조군에는 용매를 동량으로 주사하였으며, 양성 대조군으로 인도메타신 (50 mg/kg)을 복막내 주사하였다. 투여한지 1시간 후, 크실렌 20 ㎕를 마우스 오른쪽 귀의 양쪽 사이드에 균등하게 도포하였으며, 좌측 귀에는 자가 대조군으로서 크실렌을 도포하진 않았다. 1시간 후, 양쪽 귀를 적출하고, 6 mm 홀 펀치를 사용해 양쪽 귀의 동일한 부위에서 2개의 귀 조각을 절개하였다. 2개의 귀 조각을 정밀 저울에서 무게를 측정하였으며, 부종 정도 (우측 귀 조각의 무게 - 좌측 귀 조각의 무게) 및 부종 저해율 ((우측 귀 조각의 무게 - 좌측 귀 조작의 무게) / 좌측 귀 조각의 무게 X 100%)을 계산하였다.
1.4 카라기난-유도성 랫 발바닥 부종 검사
건강한 성체 수컷 마우스 18마리를 3개의 군으로 무작위 배정하였다. FAPM (100 mg/kg)을 3일 연속하여 매일 1회로 복막내 투여하였다. 대조군에는 용매를 동량으로 주사하였고, 양성 약물인 덱사메타손 (4 mg/kg)은 3일 연속하여 매일 1회로 위내 투여하였다. 마지막으로 투여한지 30분 후, 1% 카라기난 0.1 mL을 각 랫의 오른쪽 뒷발에 피하 주사하고, 주사 전과 주사 1, 2 및 3시간 후 발바닥 두께를 측정하였다. 3시간 후, 탈구에 의해 랫을 희생시켰다. 무릎 관절로부터 발을 절단하여 정밀 정울에서 무게를 측정하였다. 발의 부종 정도 (오른쪽 발 무게 - 왼쪽 발 무게)를 계산하였다.
1.5 통계학적 처리
모든 실험 데이터는 "x±s"로 나타내며, SAS 소프트웨어를 사용해 통계적 분석에 대한 단일-인자 멀티-레벨 T 검정을 수행하였다.
2. 결과
염증은 유해한 자극에 대해 신체에서 발생되는 중요한 방어 기전이다. 염증 반응은 신체의 가장 기본적인 항-손상 반응이다. 염증은 상처 치유 촉진을 돕지만, 관절염, 천식 및 신체 장애 등의 다수의 손상을 야기할 수 있다. 염증은 병인에 따라 감염성 염증, 무균성 염증 (비특이 염증) 및 알레르기성 염증으로 나눌 수 있다. 크실렌-유도성 마우스 귀 부종 검사 및 카라기난-유도성 랫 발 부종 검사는 항-염증제를 평가 및 스크리닝하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이다. 표 10-12에 나타낸 바와 같이, 100 mg/kg FAPM의 복막내 투여는 크실렌-유도성 마우스 귀 부종 및 카라기난-유도성 랫 발 부종을 현저하게 억제하였으며, 대조군과 비교해 통계학적 차이가 존재하였다. 양성 약물인 인도메타신 (10 mg/Kg) 군의 귀 부종 정도가 대조군 보다 낮았지만, 통계학적 차이는 없었다. 양성 약물 덱사메타손 (4 mg/kg)은 카라기난-유도성 랫 발 부종을 현저하게 억제하였으며, 이의 치유 효과는 FAPM 보다 약간 우수하였다.
표 10. 크실렌-유도성 마우스 귀 부종 검사에서 FAPM의 복막내 투여에 따른 저해 효과
용량 동물 수 귀 부종 (mg)
용매 대조군 0.2 ml 10 14.18±1.53
인도메타신 군 10 mg/Kg 10 12±3.74
FAPM 100 mg/Kg 10 7.83±3.85**
대조군 대비 ** P <0.01.
표 11. 카라기난-유도성 마우스 발 부종 두께에 대한 FAPM의 복막내 투여에 따른 저해 효과
용량 동물 수 1h(mm) 2h(mm) 3h(mm)
용매 대조군 0.2 ml 6 6.09±0.09 6.87±0.4 7.16±0.67
인도메타신 군 4 mg/Kg 6 5.52±0.39 5.65±0.39** 6.11±0.15
FAPM 100 mg/Kg 6 5.72±0.29 5.92±0.19** 6.24±0.20
대조군 대비 ** P <0.01.
표 12. 카라기난-유도성 랫 발 부종에 대한 FAPM의 복막내 투여에 따른 저해 효과
용량 동물 수 발 부종 (g)
용매 대조군 0.2 ml 6 1.441±0.28
인도메타신 군 4 mg/Kg 6 0.518±0.05**
FAPM 100 mg/Kg 6 0.834±0.32**
대조군 대비 ** P <0.01.

Claims (19)

  1. 사이토크롬 bc1 복합체 (cytochrome bc1 complex)의 저해제를 포함하는 평활근 경련-관련 질환의 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제는 스트로빌루린 (strobilurin) 유사체 또는 하이드록시나프토퀴논 (hydroxynaphthoquinone) 유사체이고,
    상기 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 스트로빌루린 유사체가 플루아크리피림 (fluacrypyrim, FAPM), 아족시스트로빈 (azoxystrobin), 트리플록시스트로빈 (trifloxystrobin), 크레스옥심-메틸 (kresoxim-methyl), 피라클로스트로빈 (pyraclostrobin), 피콕시스트로빈 (picoxystrobin), 디목시스트로빈 (dimoxystrobin), 플루옥사스트로빈 (fluoxastrobin) 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 사이토크롬 bc1 복합체의 저해제로서 하이드록시나프토퀴논 유사체가 아토바쿠온 (atovaquone), 파르바쿠온 (parvaquone), 부파르바쿠온 (buparvaquone), 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 평활근 경련-관련 질환이 월경통인, 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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