KR20120057125A - 유효성분으로 진세노사이드 Ｒｄ를 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유효성분으로 진세노사이드(ginsenoside) Rd를 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 유효성분으로 진세노사이드(ginsenoside) Rd를 함유하는 간암 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유효성분으로 진세노사이드 Rd를 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유효성분으로 진세노사이드(ginsenoside) Rd를 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 간암 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.
간세포 암 (HCC, hepatocellular carcinoma)은 모든 간암 케이스의 약 83%를 차지하는 고전이성 암이고, 전 세계적으로 암 사망의 3 번째로 꼽히는 원인이다 (Parkin et al., 2002, A Cancer Journal for Clinicians 55, 74-108). HCC 는 종종 혈관에 대한 조기 침입뿐만 아니라, 간내(intrahepatic) 전이 및 이후의 간외(extrahepatic) 전이를 보인다 (Ozaki et al., 2000, Cancer Research 60, 6519-6525). 암 전이, 즉 원발성 종양으로부터 멀리 떨어진 부위로의 전파 및 상기 부위에서의 후속적인 생장은 다양한 암에서 사망을 포함하는 나쁜 임상 예후의 주된 원인이다 (Weiss 1990, Advances in Cancer Research 54, 159-211). 재발 및 전이는 HCC 에서의 치료 실패 및 높은 사망률의 주된 원인이다 (Mazzanti et al., 2008, Molecular Aspects of Medicine 29, 130-143). 암 세포의 전이는, 세포와 세포외 매트릭스 (ECM) 간의 변경된 유착 및 결함 있는 세포-세포 상호작용을 포함하는 다양한 세포생리학적 변화를 수반하는 다단계적 과정이고, 전이는 매트릭스 메탈로프로테이나아제 (MMP)의 과발현을 수반한다. 상기 효소들의 활성화는 종양 세포에 의한 ECM의 분해를 가능케 하여, 맥관 구조에 대한 상기 종양 세포의 접근, 표적 장기에 대한 이동 및 침입, 그리고 종양 전이의 발생을 야기한다 (Itoh and Nagase 2002, Essays in Biochemistry 38: 21-36). MMP 와 마찬가지로, 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 수퍼패밀리의 구성원은 증가된 분산성/운동성, 침입, 증식, 생존 및 형태형성과 연관되어 있다 (Trusolino and Comoglio 2002, Nature Reviews Cancer 2, 289-300). 주요 포유류 MAPK에는 ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1 및 2), JNK/SAPK (c-Jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase), 및 p38 MAPK가 포함되며, 상기 MAPK들은 MMP 발현, 그리고 이동 및 침입의 조절에서 중심적인 역할을 한다 (Kwon et al., 2009, The Journal of Nutritional Biochemistry 20, 663-676).
수많은 천연 생성물들이 약학적 응용성(특히, 화학예방)을 갖는다 (Graham et al., 2000, Journal of Ethnopharmacology 73, 347-377). 최근, 진세노사이드(ginsenoside)는 항암 활성을 갖는 것으로 발견되었다 (Yun et al., 2001, Journal of Korean Medical Science 16, S6-S5). 진세노사이드 Rb2, Rh2 및 Rg3와 같은 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)-형 사포닌은 종양 세포 증식 및 종양 성장을 억제하고, 분화 및 세포자살을 유도하며, 종양 세포 침입 및 전이를 억제하는 것으로 나타났다 (Kim et al., 2004, Archives of Pharmacal Research 27, 429-435). 진세노사이드 Rd는 다중 약학적 효과를 가진 프로토파낙사디올-형 진세노사이드이다. 진세노사이드 Rd 는 신경 줄기 세포의 별아교세포로의 분화를 촉진시키고 (Shi et al., 2005, Life Sciences 76, 983-995), 저산소증/재산소화에 의한 타이로신 키나아제 단백질의 활성화를 억제하고 (Dou et al., 2001, Planta Medica 67, 19-23), 노화-촉진 마우스에서 노화-연관성 산화 손상을 감소시키고 (Yokozawa et al., 2004, Journal of Pharmacy and Pharmacology 56, 107-113), 마우스에서 카인산(kainic acid)-유도 폐사를 감소시키고 (Lee et al., 2003, Planta Medica 69, 230-234), 혈관 평활근 세포에서의 수용체- 및 저장-작동적 Ca2 + 채널을 통한 칼슘 진입을 차단한다 (Guan et al., 2006, European Journal of Pharmacology 548, 129-136). 그러나, 암세포 유착 및 이동에 대한 상기 진세노사이드 Rd의 효과는 결정되어야 할 것으로 남아있다. 본 발명자들은 상기 진세노사이드 Rd가 MMP1, MMP2 및 MMP7의 발현을 감소시키고, ERK, JNK 및 p38 MAPK의 인산화를 억제함으로써 MAPK 신호전달을 차단하고, 국소 유착 형성을 유도하고, 빈쿨린(vinculin) 위치 및 발현을 조절함으로써, 침입 및 전이를 억제한다는 것을 나타내었다. 본 발명은 HepG2 세포에서 진세노사이드 Rd의 항암 효과를 나타내고, 진세노사이드 Rd의 몇몇 약학적 효과에 대한 설명을 제공할 것이다.
한국등록특허 제10-0485936호에는 진세노사이드 Rh2 및 Rg3를 포함하는 항암 조성물이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-0892764호에는 폐암 치료용 진세노사이드 조성물이 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 진세노사이드 Rd가 간암세포의 침입 또는 전이를 억제한다는 것을 HepG2 세포에서 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유효성분으로 진세노사이드(ginsenoside) Rd를 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 유효성분으로 진세노사이드(ginsenoside) Rd를 함유하는 간암 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 간암의 개선에 효과적이며, 천연물로부터 얻어진 물질을 이용하기 때문에 부작용을 유발하지 않고 안전성을 확보할 수 있다.
도 1은 HepG2 세포에서 진세노사이드 Rd의 세포독성 분석을 나타낸다. (A) 진세노사이드 Rd의 구조. (B) HepG2 세포에 대해 다양한 농도(0, 10, 50, 100 및 200 μM)의 Rd를 24 또는 48시간 동안 처리하였다. HepG2 세포에서 진세노사이드 Rd의 세포독성은 XTT 분석법으로 측정되었다. 미처리 대조군에 대하여 * p < 0.05, ** p < 0.01.
도 2는 HepG2 세포에서 상처 치유에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 멸균 마이크로피펫 팁으로 긁은 후, 다양한 농도의 진세노사이드 Rd(0, 10, 50 및 100 μM)로 0 내지 48시간 동안 처리되었다. 벗겨진 영역의 정량적 평가는 표시된 시간에 수행되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 3은 HepG2 세포에서 세포 유착에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 다양한 농도의 진세노사이드 Rd (0, 10, 50 및 100 μM)를 24시간 동안 처리하였고, 매트리겔(Matrigel)로 예비코팅된 폴리카보네이트 필터(구멍 크기, 8 ㎛)를 가지는 Boyden 챔버에 적용되었다. 침입 세포의 수는 도립 현미경을 이용하여 표시된 시점에 측정되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다. 미처리 대조군에 대하여 * p < 0.05, ** p < 0.01.
도 4는 HepG2 세포의 이동에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 다양한 농도의 진세노사이드 Rd (0, 10, 50 및 100 μM)를 24시간 동안 처리하였고, 세포 이동은 다공성 폴리카보네이트 막의 밑면으로 침입한 세포의 수를 현미경을 이용하여 계수하여 측정되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다. 미처리 대조군에 대하여, *** p < 0.001.
도 5는 HepG2 세포에서 MMP 및 TIMP의 발현에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. (A) HepG2 세포는 다양한 농도의 진세노사이드 Rd (0, 10, 50 및 100 μM)로 24시간 동안 처리되었다. 총 RNA는 추출되었고, 원-스텝 RT-PCR 에 의해 MMP-1 (B), MMP-2 (C), MMP-7 (D), TIMP-1 (E) 및 TIMP-2 (F) mRNA의 발현이 분석되었다. β-액틴은 내부 대조군으로 이용되었다. PCR 산물의 수준은 밀도를 측정하여, 미처리 대조군에 대한 진세노사이드 Rd-처리 세포의 상대적인 값으로 정량되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다. 미처리 대조군에 대해 * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.
도 6은 HepG2 세포에서 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7의 활성화에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 다양한 농도의 Rd로 24시간 동안 처리되었고, 용균되었으며, 항-MMP 항체를 이용하여 수행된 웨스턴 블롯으로 분석되었다. (A) 세포내 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7 수준은 세포 용균액의 분석을 통해 측정되었다. (B) 배지는 Amicon Ultra PL-50을 이용하여 농축되었고, 웨스턴 블롯에 의해 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7의 수준이 분석되었다. (C) 자이모그래피 (Zymography)는 MMP-2 활성화에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 3회의 독립적인 실험들은 유사한 결과를 나타내었다. 효소 활성은 밀도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 값으로 정량되었다(β-액틴에 대한 표준화 후, 겔 데이터 바로 아래에 나타냄).
도 7은 MAPK 인산화에 대한 진세노사이드 Rd의 억제 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 다양한 농도의 진세노사이드 Rd (0, 10, 50 및 100 μM)로 24시간 동안 처리되었다. 세포 용균액은 단리되어 SDS-PAGE로 분리되었고, 항-인산화-ERK1/2, -인산화-p38 MAPK, 및 -인산화-JNK1/2 항체를 이용하여 수행한 웨스턴 블롯으로 분석되었다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다. 3회의 독립적인 실험은 유사한 결과를 나타내었다. 단백질 수준은 밀도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 값으로 정량되었다 (β-액틴에 대한 표준화 후, 겔 데이터 바로 아래에 나타냄).
도 8은 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7의 활성에 대한 MAPK 억제제 및 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 PD98059 (PD, 50 μM), SB203580 (SB, 50 μM), U0126 (30 μM) 및 Rd (100 μM)로 1시간 동안 전처리된 6-웰 플레이트에 접종되었고, 그 후 PMA (0.1 ㎍/ml)의 존재 또는 부재하에 16시간 동안 배양되었다. 이어서, 세포 용균액은 항-MMP-1 및 -MMP-7 항체를 이용하여 수행한 웨스턴 블롯으로 분석되었고, 배양 배지는 젤라틴 자이모그래피로 MMP-2 활성에 대해 시험되었다. 3회의 독립적인 실험은 유사한 결과를 나타내었다. 단백질 활성은 밀도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 값으로 정량되었다 (β-액틴에 대한 표준화 후, 겔 데이터 바로 아래에 나타냄).
도 9는 진세노사이드 Rd-처리 HepG2 세포에서 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition) 마커의 발현을 나타낸다. HepG2 세포는 다양한 농도의 진세노사이드 Rd (0, 10, 50 및 100 μM)로 24시간 동안 처리되었다. 세포 용균액은 단리되어 SDS-PAGE로 분리되었고, 항-E-캐드헤린 및 -N-캐드헤린 항체를 이용하여 수행한 웨스턴 블롯으로 분석되었다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다. 3회의 독립적인 실험은 유사한 결과를 나타내었다. 단백질 활성은 밀도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 값으로 정량되었다 (β-액틴에 대한 표준화 후, 겔 데이터 바로 아래에 나타냄).
도 10은 진세노사이드 Rd-처리 세포에서 국소 유착 염색을 나타낸다. (A) HepG2 세포는 1시간 동안 진세노사이드 Rd (100 μM)로 전처리 되었거나 또는 미처리되었고, 그 후 PMA (0.1 ㎍/ml)로 16시간 동안 처리되었다. 국소 유착은 빈쿨린(적색) 및 팔로이딘을 포함하는 액틴 스트레스 섬유(녹색)의 면역형광 염색에 의해 가시화되었다. (B) 더 높은 배율에서 (A)의 영상을 합한 영상. (C) 세포는 상기 기재된 것과 같이 처리되었고, 용균되었으며, 항-빈쿨린 항체를 이용하여 수행된 웨스턴 블롯으로 분석되었다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다. 단백질 활성은 밀도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 값으로 정량되었다 (β-액틴에 대한 표준화 후, 겔 데이터 바로 아래에 나타냄).
도 2는 HepG2 세포에서 상처 치유에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 멸균 마이크로피펫 팁으로 긁은 후, 다양한 농도의 진세노사이드 Rd(0, 10, 50 및 100 μM)로 0 내지 48시간 동안 처리되었다. 벗겨진 영역의 정량적 평가는 표시된 시간에 수행되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 3은 HepG2 세포에서 세포 유착에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 다양한 농도의 진세노사이드 Rd (0, 10, 50 및 100 μM)를 24시간 동안 처리하였고, 매트리겔(Matrigel)로 예비코팅된 폴리카보네이트 필터(구멍 크기, 8 ㎛)를 가지는 Boyden 챔버에 적용되었다. 침입 세포의 수는 도립 현미경을 이용하여 표시된 시점에 측정되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다. 미처리 대조군에 대하여 * p < 0.05, ** p < 0.01.
도 4는 HepG2 세포의 이동에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 다양한 농도의 진세노사이드 Rd (0, 10, 50 및 100 μM)를 24시간 동안 처리하였고, 세포 이동은 다공성 폴리카보네이트 막의 밑면으로 침입한 세포의 수를 현미경을 이용하여 계수하여 측정되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다. 미처리 대조군에 대하여, *** p < 0.001.
도 5는 HepG2 세포에서 MMP 및 TIMP의 발현에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. (A) HepG2 세포는 다양한 농도의 진세노사이드 Rd (0, 10, 50 및 100 μM)로 24시간 동안 처리되었다. 총 RNA는 추출되었고, 원-스텝 RT-PCR 에 의해 MMP-1 (B), MMP-2 (C), MMP-7 (D), TIMP-1 (E) 및 TIMP-2 (F) mRNA의 발현이 분석되었다. β-액틴은 내부 대조군으로 이용되었다. PCR 산물의 수준은 밀도를 측정하여, 미처리 대조군에 대한 진세노사이드 Rd-처리 세포의 상대적인 값으로 정량되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다. 미처리 대조군에 대해 * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.
도 6은 HepG2 세포에서 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7의 활성화에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 다양한 농도의 Rd로 24시간 동안 처리되었고, 용균되었으며, 항-MMP 항체를 이용하여 수행된 웨스턴 블롯으로 분석되었다. (A) 세포내 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7 수준은 세포 용균액의 분석을 통해 측정되었다. (B) 배지는 Amicon Ultra PL-50을 이용하여 농축되었고, 웨스턴 블롯에 의해 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7의 수준이 분석되었다. (C) 자이모그래피 (Zymography)는 MMP-2 활성화에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 3회의 독립적인 실험들은 유사한 결과를 나타내었다. 효소 활성은 밀도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 값으로 정량되었다(β-액틴에 대한 표준화 후, 겔 데이터 바로 아래에 나타냄).
도 7은 MAPK 인산화에 대한 진세노사이드 Rd의 억제 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 다양한 농도의 진세노사이드 Rd (0, 10, 50 및 100 μM)로 24시간 동안 처리되었다. 세포 용균액은 단리되어 SDS-PAGE로 분리되었고, 항-인산화-ERK1/2, -인산화-p38 MAPK, 및 -인산화-JNK1/2 항체를 이용하여 수행한 웨스턴 블롯으로 분석되었다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다. 3회의 독립적인 실험은 유사한 결과를 나타내었다. 단백질 수준은 밀도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 값으로 정량되었다 (β-액틴에 대한 표준화 후, 겔 데이터 바로 아래에 나타냄).
도 8은 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7의 활성에 대한 MAPK 억제제 및 진세노사이드 Rd의 효과를 나타낸다. HepG2 세포는 PD98059 (PD, 50 μM), SB203580 (SB, 50 μM), U0126 (30 μM) 및 Rd (100 μM)로 1시간 동안 전처리된 6-웰 플레이트에 접종되었고, 그 후 PMA (0.1 ㎍/ml)의 존재 또는 부재하에 16시간 동안 배양되었다. 이어서, 세포 용균액은 항-MMP-1 및 -MMP-7 항체를 이용하여 수행한 웨스턴 블롯으로 분석되었고, 배양 배지는 젤라틴 자이모그래피로 MMP-2 활성에 대해 시험되었다. 3회의 독립적인 실험은 유사한 결과를 나타내었다. 단백질 활성은 밀도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 값으로 정량되었다 (β-액틴에 대한 표준화 후, 겔 데이터 바로 아래에 나타냄).
도 9는 진세노사이드 Rd-처리 HepG2 세포에서 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition) 마커의 발현을 나타낸다. HepG2 세포는 다양한 농도의 진세노사이드 Rd (0, 10, 50 및 100 μM)로 24시간 동안 처리되었다. 세포 용균액은 단리되어 SDS-PAGE로 분리되었고, 항-E-캐드헤린 및 -N-캐드헤린 항체를 이용하여 수행한 웨스턴 블롯으로 분석되었다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다. 3회의 독립적인 실험은 유사한 결과를 나타내었다. 단백질 활성은 밀도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 값으로 정량되었다 (β-액틴에 대한 표준화 후, 겔 데이터 바로 아래에 나타냄).
도 10은 진세노사이드 Rd-처리 세포에서 국소 유착 염색을 나타낸다. (A) HepG2 세포는 1시간 동안 진세노사이드 Rd (100 μM)로 전처리 되었거나 또는 미처리되었고, 그 후 PMA (0.1 ㎍/ml)로 16시간 동안 처리되었다. 국소 유착은 빈쿨린(적색) 및 팔로이딘을 포함하는 액틴 스트레스 섬유(녹색)의 면역형광 염색에 의해 가시화되었다. (B) 더 높은 배율에서 (A)의 영상을 합한 영상. (C) 세포는 상기 기재된 것과 같이 처리되었고, 용균되었으며, 항-빈쿨린 항체를 이용하여 수행된 웨스턴 블롯으로 분석되었다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다. 단백질 활성은 밀도를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 값으로 정량되었다 (β-액틴에 대한 표준화 후, 겔 데이터 바로 아래에 나타냄).
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유효성분으로 진세노사이드(ginsenoside) Rd를 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 진세노사이드 Rd는 간암세포에서 빈쿨린(vinculin)의 발현을 증가시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 진세노사이드 Rd는 MMP(matrix metalloproteinase)-1, MMP-2 또는 MMP-7의 발현을 감소시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 진세노사이드 Rd는 ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 인산화를 억제시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 유효성분으로 진세노사이드(ginsenoside) Rd를 함유하는 간암 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제공한다. 바람직하게는, 상기 진세노사이드 Rd는 간암세포에서 빈쿨린(vinculin)의 발현을 증가시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 진세노사이드 Rd는 MMP(matrix metalloproteinase)-1, MMP-2 또는 MMP-7의 발현을 감소시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 진세노사이드 Rd는 ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 인산화를 억제시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제할 수 있으나, 이제 제한되지는 않는다.
상기 간암 예방 또는 개선용 진세노사이드(ginsenoside) Rd를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 진세노사이드 Rd를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 진세노사이드 Rd는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 진세노사이드(ginsenoside) Rd를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 기능성 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 간암 예방 또는 개선용 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 간암 예방 또는 개선용 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
재료
진세노사이드 Rd (순도 >98%)를 Ambo Institute (대전, 한국)로부터 구입했다. 디메틸술폭시드 (DMSO), 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF), 젤라틴 및 류펩틴(leupeptin)을 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입하고, SB203580 및 PD98059 를 Calbiochem (Darmstadt, 독일) 로부터 구입하고, 단백질 정량 키트를 Bio-Rad Labs (Hercules, CA) 로부터 구입하였다. DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 소태아 혈청 (FBS) 을 PAA Laboratories (Pasching, Austria) 로부터 구입하였다. 매트리겔 (Matrigel) 은 BD Biosciences (Bedford, MA)로부터 구입하였다. U0126 및, ERK1/2, JNK/SAPK 및 p38 MAPK 에 대한 항체는 Cell Signaling Technologies (Danvers, MA)로부터 구입하였다. 항-빈쿨린 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다. 팔로이딘 (Phalloidin) 및 Alexa 546-conjugated anti-rabbit 항체는 Molecular Probes (Carlsbad, CA)로부터 구입하였다. ECL (enhanced chemiluminescence) 키트는 Amersham Life Science (Amersham, UK) 로부터 구입하였다.
세포 생존율(
viability
)의 분석
HepG2 세포를 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 보충한 DMEM에서 습도 처리된 5% CO2, 37℃ 조건으로 유지하였다. 세포 (1×105 세포/ml)를 배양 디쉬에 접종하고, 조직 배양 인큐베이터에서 유지하였다. 유착 세포들을 0.05% 트립신/0.02% EDTA 를 이용해 배양 플레이트로부터 떼어내고, 세포 현탁액을 제조하였다. 진세노사이드 Rd 를 메탄올에 용해시키고, 0.2 ㎛ 디스크 필터를 통한 여과로 멸균시켰다. 적절한 양의 상기 진세노사이드 Rd 저장 용액(2 mg/ml)을 배양 배지에, 표시된 최종 농도로 첨가하였다(최종 메탄올 농도 < 0.2%). 그 후, 세포를 표시된 기간 동안 배양하였다. 유착 세포의 증식을 XTT(2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazxolium-5-carboxanilide inner salt)를 이용하여 비색 분석법(WelGene, 한국)으로 결정하였다. 간단히 기술하면, XTT 라벨링 시약 1 ml 및 전자 커플링 시약 페나진 메토설페이트(PMS) 20 ㎕를 혼합하고, 상기 혼합물을 96-웰 플레이트에서 배양 중인 세포에 웰 당 20 ㎕씩 적용하였다. 그 후, 플레이트를 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후, 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450 nm 및 690 nm 에서 측정하였다(각 웰에서, 450 nm 에서의 흡광도에서 690 nm 에서의 흡광도를 차감). 각 실험은 3 회 이상 반복하였다.
상처 치유 분석법
세포 운동성을 평가하기 위해, HepG2 세포(2.5×105 세포/ml)를 6-웰 플레이트에 접종하였고, 80 내지 90%까지 세포가 배양되게 하였다. 생장 배지의 흡입 후, 벗겨진 영역(모든 웰에서 일정한 폭)을 만들기 위해 각 세포 단층의 중심을 멸균한 마이크로피펫 팁으로 스크래핑 하였다. 이어서, 세포 찌꺼기들을 PBS로 세척하여 제거하였고, HepG2 세포를 다양한 농도의 진세노사이드 Rd 에 노출시켰다. Zeiss Axiovert 40C 도립 현미경에 부착된 Olympus E-410 카메라를 이용하여 0, 12, 24, 36 및 48 시간째에 각 웰을 촬영하여 상처 폐쇄(wound closure)를 모니터링 하였다. 세포 이동을 정량하기 위해, 최초의 상처처리된 단층의 영상을 후속 시점에서의 세포의 해당 도면과 비교하였다. 각각의 본래 세포 상처의 모서리에 맞춘 인위적인 선들은 동일 배양물의 후속 영상에서 중첩시켰다. 6 개의 무작위적 영역에서 이동된 세포들을 각각 측정하였다. 분석은 3 회씩 수행하였다.
매트리겔
침입 분석법
매트리겔-코팅된 필터를 통과하는 HepG2 세포의 능력은 보이든(Boyden) 챔버 침입 분석법으로 측정하였다. 매트리겔은 폴리카보네이트 필터(구멍 크기, 8 ㎛)의 상단에 적용하였다. 세포 침입 분석법은 Matrigel invasion assay kit (BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행되었다. 간단히 기술하면, HepG2 세포를 다양한 농도의 진세노사이드 Rd가 보충된 무혈청 배지 500 ㎕에 2.5×104 세포/웰의 밀도로 상단 챔버에 접종하였고, 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 각 막의 하단 표면에 침입한 세포들은 메탄올로 고정되었고, 헤마톡실린으로 10 내지 15분 동안 염색되었다. 각 막 필터의 하단 표면에 대한 침입 세포들은 무작위로 선택된 영역에서 광학 현미경을 이용하여 측정되었다. 각 실험은 3 회씩 수행되었다.
세포 이동 분석법
세포 이동을 측정하기 위해, HepG2 세포를 다양한 농도의 진세노사이드 Rd가 보충된 무혈청 배지 200 ㎕에 2.5×104 세포/웰의 밀도로 트랜스웰에 접종하였고, 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하였다. 세포를 2분 동안 메탄올로 처리하여 고정한 후, 헤마톡실린을 이용해 10 내지 15분 동안 염색하였다. 멤브레인을 각 챔버에서 잘라내고, 무작위로 선택된 영역에서 이동된 세포들을 유착 분석법에 대해 기재한 바와 같이 측정하였다. 각 실험은 3 회씩 수행하였다.
자이모그래피
분석
MMP-2의 활성은 이전에 기재된 바와 같이 젤라틴 자이모그래피로 분석되었다. 간단히 기술하면, 혈청의 부재 하에 24시간 동안 배양된 세포로부터의 조건 배지(conditioned medium)를 수집하였다. 샘플을 로딩 완충액과 혼합하였고, 0.1% 젤라틴을 포함하는 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하였다. 겔을 실온에서 자이모그래피 세척 완충액(Triton X-100을 2.5% 수준으로 첨가한 2차 증류수)으로 2회 세척하여 SDS를 제거하고, 그 후 자이모그래피 반응 완충액(40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM CaCl2, 0.02% NaN3)으로 12 내지 16시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후, 1시간 동안 Coomassie Brilliant Blue R-250 용액(R-250을 0.125% 수준으로 첨가한 50% 메탄올, 아미노 블랙을 0.1% 수준으로 첨가한 10% 아세트산)으로 염색하였고, 탈색 용액(20% 메탄올, 10% 아세트산, 70% 2차 증류수)에서 탈색시켰다. 잠재 형태의 MMP-2의 존재로 인한 비-염색 밴드는 디지털 영상 시스템을 이용해 촬영되었다.
원-스텝
RT
-
PCR
총 RNA를 TRI 시약(MRC, Cincinnati, OH)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 분리하였고, NanoDrop (Wilmington, DE)을 이용해 정량하였다. 총 RNA (20 ng)를 역전사시키고, One-step RT-PCR Premix (ELPIS, 대전, 한국)를 이용한 PCR로 증폭하였다. 간단히 기술하면, 5× RT-PCR Premix 및 각 프라이머 당 5 pmol을 포함하는 20 ㎕ 반응물을 단일-주기 역전사(45℃에서 30 분, 이어서 94℃에서 5 분)에 적용시키고, 그 후 상기 생성물을 35 주기(94℃에서 30초 동안의 변성, 60℃에서 30초 동안의 어닐링, 및 72℃에서 45초 동안의 신장)의 PCR을 통해 즉시 증폭하였다.
웨스턴
블롯
세포를 얼음으로 냉각한 RIPA 완충액(1% NP-40, 50 mM Tris-base, 0.1% SDS, 0.5% 데옥시콜산, 150 mM NaCl, pH 7.5)으로 용균시키고, 이어서 10 mg/ml PMSF 및 17 mg/ml 류펩틴(leupeptin)과 혼합하였다. 30분 동안 얼음에서 볼텍싱한 후, 샘플을 원심분리하였고(12,000×g, 10분), 그 후 상등액을 수집하여 변성시키고, SDS-PAGE를 실시한 다음, ERK, p38 MAPK 및 JNK의 인산화된 형태에 대한 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 샘플의 단백질 함량은 BSA를 표준으로 하여 Bio-Rad 단백질 정량 시약을 이용해 결정되었다. 동일한 단백질 로딩 양은 항-β-액틴 항체를 이용해 확인되었다.
형태 분석 및
면역형광
염색
HepG2 세포를 12 mm 조직 배양 인서트 (Nunc, Rochester, NY)에 접종하였고, 진세노사이드 Rd (100 μM)로 1시간 동안 예비처리한 후, 12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트 (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, PMA) (0.1 ㎍/ml)로 16시간 동안 처리하였다. 4% 포름알데히드에 고정시킨 세포를 토끼 항-빈쿨린 항체를 이용해 24시간 동안 4℃에서 반응하였다. 그 후, 상기 세포를 PBS로 헹구었고, 블로킹 완충액으로 반응하였으며, Alexa 546-conjugated 항-토끼 항체로 2시간 동안 실온에서 처리하였다. 최종적으로, 세포내 F-액틴을 팔로이딘 (1:300로 희석)으로 3시간 동안 염색하였다. 염색된 세포를 마운팅하고, 공초점 레이저 주사 현미경(Leica, Heidelberg, 독일)을 이용하여 영상화하였다.
통계적 분석
모든 실험들은 3회씩 수행되었다. 통계적 분석은 Origin software(ver. 5.0; OriginLab, MA, USA)를 이용하여 수행되었다. 통계적으로 유의한 차이는 Student's t-검정을 이용하여 확인하였다. p 값 < 0.05 을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 데이터는, 각각 3회씩 수행한, 3가지 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
실시예
1:
HepG2
세포의 생존율에 대한
진세노사이드
Rd
의 효과
먼저, 진세노사이드 Rd의 세포독성을 분석하기 위해, HepG2 세포를 다양한 농도(0, 10, 50, 100, 200 μM)의 Rd로 24 및 48시간 동안 처리하고, 그 후 상기 처리된 세포로 XTT 분석을 수행하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rd는 100 μM까지의 농도에서는 세포독성 효과를 나타내지 않았다. 대조군 세포 (DMSO 단독 처리)에 비해, 24 또는 48시간 동안 진세노사이드 Rd를 10 내지 100 μM의 농도로 처리한 세포는 현저하게 변화되지 않았으며, 이는 진세노사이드 Rd가 상기 투여량에서 HepG2 세포에 대해 독성이 없다는 것을 나타낸다. 세포를 200 μM 진세노사이드 Rd로 24 및 48시간 동안 처리시, 세포 생존율은 현저하게 감소되었다. 상기 결과는 HepG2 세포를 100 μM 이상의 진세노사이드 Rd로 24 또는 48시간 동안 처리하는 것은 투여량- 및 시간-의존적인 세포 생존율의 감소를 야기한다는 것을 나타낸 반면, 100 μM 또는 그 이하로 처리하는 것은 상기 세포독성을 야기하지 않는다는 것을 나타내었다. 상기 결과를 근거로 하여, 본 발명자들은 모든 후속 실험에서 100 μM 이하의 농도로 진세노사이드 Rd 를 사용하였다.
실시예
2:
HepG2
세포의 침입 및 이동을 억제하는
진세노사이드
Rd
HepG2 세포에서 진세노사이드 Rd의 항-전이 효과를 연구하기 위해, 상처 치유, 세포 매트릭스 유착 및 이동 분석을 수행하였다. 스크래치 상처 분석에서, HepG2 세포의 연속적인 신속한 움직임이 관찰되었다. 세포가 없는 "스크래치" 영역으로 점차 이동하는 고도로 컨플루언트(90 내지 100%)된 세포 단층에 의해 야기된, 분명한 HepG2 세포 이동 전면이 24시간째에 관찰되었다(도 2). 이동은 진세노사이드 Rd와 12시간 동안 인큐베이션한 세포에서 현저하게 더 느렸다. 게다가, 50 및 100 μM 농도의 진세노사이드 Rd의 처리는 24시간째에 세포 이동을 각각 48 및 66%로 억제했고, 48시간째에는 각각 53 및 70%로 억제했다. 상기 결과는 100 μM의 진세노사이드 Rd 농도가 48시간째에 세포 운동성에 대한 더 큰 억제 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, 비처리 세포에 비해, 100 μM 진세노사이드 Rd 로 48시간 동안 처리한 것은 이동된 HepG2 세포 수를 거의 0.3배 감소시켰다. 상기 결과들은 진세노사이드 Rd가 HepG2 세포 운동성을 현저하게 억제한다는 것을 나타낸다.
세포 유착이 진세노사이드 Rd에 의해 유사하게 억제되는지 여부를 조사하기 위해, HepG2 세포를 침입 챔버에 적용하고, 진세노사이드 Rd 의 존재 또는 부재 하에 유착 세포의 수를 확인하였다. 상기 세포-매트릭스 유착 분석을 이용하여, 본 발명자들은 24시간 동안 진세노사이드 Rd의 처리가 투여량-의존적으로 HepG2 세포의 유착을 감소시킨다는 것을 나타내었다(도 3). 50 및 100 μM 농도의 진세노사이드 Rd 처리는 세포 유착을 각각 약 27 및 50%로 억제하였다. 추가로, 진세노사이드 Rd는 다른 간세포암 세포주(Hep3B, SNU-398 및 SNU-878)의 유착을 억제하였다(데이타 미제시). 상기 데이터는 진세노사이드 Rd 가 세포 유착을 억제할 수 있고, 상기 항-유착 효과가 세포 유형-독립적이라는 것을 나타낸다. 50 및 100 μM 진세노사이드 Rd 처리는 HepG2 세포의 이동을 진세노사이드 Rd 비처리 세포에서 관찰되는 것의 45 및 58%로 각각 감소시켰다 (도 4). 상기 결과는 진세노사이드 Rd 가 고전이성 HepG2 세포의 유착 및 이동을 현저하게 억제한다는 것을 나타낸다.
실시예
3:
진세노사이드
Rd
에 의한
MMF
발현의 억제
MMP-1, MMP-2 및 MMP-7뿐만 아니라 TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinase)-1 및 TIMP-2의 발현에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 분석하기 위해, HepG2 세포를 다양한 농도의 진세노사이드 Rd로 처리하고, RT-PCR 분석을 수행하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rd는 투여량-의존적으로 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7 mRNA 발현을 감소시켰다. MMP-1 발현은 100 μM로 처리한 세포에서 빠르게 감소한 반면, MMP-2 및 MMP-7 mRNA의 수준은 10 μM의 낮은 농도로 처리한 진세노사이드 Rd에 의해 감소되었다. TIMP-1 및 TIMP-2 mRNA의 발현은 진세노사이드 Rd를 10 μM로 처리한 세포에서는 감소했지만, 100 μM로 처리한 세포에서는 감소하지 않았다.
본 발명자들은 또한, 진세노사이드 Rd로 처리한 세포에서 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7 단백질 수준을 분석했다. 도 6A에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rd는 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7의 세포내 수준 및 활성화를 투여량 의존적으로 감소시켰다. 진세노사이드 Rd는 100 μM의 농도에서 MMP 단백질 발현을 가장 강력하게 억제했다. MMP-1, MMP-2 및 MMP-7 발현에 대한 진세노사이드 Rd의 효과는 RNA 발현에 대한 효과와 유사했다. 분비된 MMP의 수준을 분석하기 위해, 진세노사이드 Rd-처리 배지를 농축하고, 항-MMP 항체를 이용해 분석했다(도 6B). 100 μM의 농도에서, 진세노사이드 Rd는 분비된 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7 수준을 현저하게 감소시켰다. MMP-2 활성에 대한 Rd의 억제 효과는 자이모그래피로 확인되었다(도 6C). 진세노사이드 Rd는 MMP-2 활성을 억제하였다. 상기 결과는 효소 분해 과정의 억제가 진세노사이드 Rd의 항-전이 효과에 기여를 한다는 것을 나타낸다.
실시예
4:
HepG2
세포에서
ERK
,
p38
MAPK
및
JNK
의 인산화를 억제하는
진세노사이드
Rd
진세노사이드 Rd를 이용한 HepG2 세포의 처리가 전이 및 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7 의 활성화를 억제한다는 것을 나타낸 다음, 본 발명자들은 관련된 기초 메커니즘을 조사하였다. 몇 가지 연구들은 ERK1/2, p38 MAPK 및 JNK1/2가 다른 세포 유형에서 MMP-1, MMP-2 및 MMP-7 활성을 조절한다는 것을 나타내었다(Turner et al., 2007, Journal of Molecular and Cellular Cardiology 43, 168-176). 진세노사이드 Rd가 ERK1/2, p38 MAPK 및 JNK1/2의 활성화를 매개 및/또는 억제하는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 HepG2 세포에서 상기 MAP 키나아제의 인산화에 대한 다양한 농도의 진세노사이드 Rd의 효과를 측정하였다. 도 7은 진세노사이드 Rd를 이용한 처리가 p38 MAPK 및 JNK1/2의 인산화-활성화를 현저하게 억제하고, p38 MAPK 및 JNK1/2의 전반적인 수준을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 처리는 ERK1/2의 인산화에는 영향을 주지만, 전반적인 ERK1/2 단백질 수준에는 영향을 주지 않았다.
진세노사이드 Rd (100 μM)의 억제 효과가 MAPK 신호전달의 억제로부터 주로 기인하는 것인지를 추가로 조사하기 위해, HepG2 세포는 1시간 동안 p38 MAPK 억제제(SB203580) 및 MEK 억제제(PD98059 및 U0126)로 전처리되었고, 그 후 0.1 ㎍/L PMA로 16시간 동안 처리되었다. PMA는 일반적으로 발암 메커니즘 연구에 이용된다. PMA 처리는 MMP-1 및 MMP-7 단백질의 발현을 유도하였다(도 8). 진세노사이드 Rd 또는 MEK 억제제 - PD98059 (50 μM) 및 U0126 (30 μM) - 를 이용한 처리는 MMP-1 및 MMP-7의 활성화를 감소시켰다. 대조적으로, SB203580 (50 μM)를 이용한 처리는 MMP-1 또는 MMP-7의 활성화를 억제하지 않았다. 젤라틴 자이모그래피 분석 결과는 MAPK 억제제 (SB203580, PD98059, U0126) 및 진세노사이드 Rd를 이용한 각각의 처리가 MMP-2 활성을 현저하게 감소시켰다는 것을 나타낸다.
실시예
5:
HepG2
세포에서
EMT
(
epithelial
-
to
-
mesenchymal
transition
)를 감소시키는
진세노사이드
Rd
EMT에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 조사하기 위해, 웨스턴 블롯으로 EMT 마커의 발현을 평가하였다(도 9). 상피 마커인 E-캐드헤린(cadherin)의 발현이 100 μM 진세노사이드 Rd로 처리한 HepG2 세포에서 3배 이상 상향조절된 반면, 중간엽 마커인 N-캐드린의 발현은 0.37배 하향조절되었다.
실시예
6:
진세노사이드
Rd
-처리
HepG2
세포에서의 국소 유착(
focal
adhesion
)
세포 이동에 관련된 과정에 대한 진세노사이드 Rd의 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 진세노사이드 Rd-처리 HepG2 세포에서 세포 형태, 스트레스 섬유 조직화 및 국소 유착 형성을 조사하기 위해, 액틴 세포골격 및 세포 유착의 면역형광 이중-염색을 이용하였다 (도 10A). 면역형광 염색은 PMA 처리가 HepG2 세포에서 분산된, 소행성형(asteroid) 또는 섬유아세포형 세포 형태를 야기한다는 것을 나타내었다 (도 10B). 대조적으로, 진세노사이드 Rd 처리는 분극된, 더 직사각형 형태의, 더 단단히 채워진 세포로의 형질전환을 유도하였다. 웨스턴 블롯 분석은 1 또는 12시간 동안의 진세노사이드 Rd 처리가 PMA의 존재 또는 부재 하에 빈쿨린 발현을 유도한다는 것을 나타내었다(도 10C). 진세노사이드 Rd-처리 세포에서의 빈쿨린 발현은 24시간째에 대조군 수준으로 감소하였다.
Claims (8)
- 유효성분으로 진세노사이드(ginsenoside) Rd를 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rd는 간암세포에서 빈쿨린(vinculin)의 발현을 증가시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rd는 MMP(matrix metalloproteinase)-1, MMP-2 또는 MMP-7의 발현을 감소시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rd는 ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 인산화를 억제시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 유효성분으로 진세노사이드(ginsenoside) Rd를 함유하는 간암 예방 또는 개선용 기능성 식품.
- 제5항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rd는 간암세포에서 빈쿨린(vinculin)의 발현을 증가시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 개선용 기능성 식품.
- 제5항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rd는 MMP(matrix metalloproteinase)-1, MMP-2 또는 MMP-7의 발현을 감소시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 개선용 기능성 식품.
- 제5항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rd는 ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 인산화를 억제시켜 간암세포의 침입 또는 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 개선용 기능성 식품.
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| KR1020100118722A KR20120057125A (ko) | 2010-11-26 | 2010-11-26 | 유효성분으로 진세노사이드 Ｒｄ를 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100118722A KR20120057125A (ko) | 2010-11-26 | 2010-11-26 | 유효성분으로 진세노사이드 Ｒｄ를 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
Publications (1)
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| KR20120057125A true KR20120057125A (ko) | 2012-06-05 |
Family
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| KR1020100118722A KR20120057125A (ko) | 2010-11-26 | 2010-11-26 | 유효성분으로 진세노사이드 Ｒｄ를 함유하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
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| Country | Link |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2017201862A1 (en) * | 2016-08-05 | 2018-02-22 | Intelligent Synthetic Biology Center | Composition for preventing or treating liver cancer containing ginsenoside F2 |
-
2010
- 2010-11-26 KR KR1020100118722A patent/KR20120057125A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
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