CN103002892B

CN103002892B - 含有大环内酯菌素a及其衍生物作为有效成分的具有抗血管生成效果的组合物

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Publication number: CN103002892B
Application number: CN201180035102.1A
Authority: CN
Inventors: 池龙勳; 金桐熙; 金贞爱; 姜在璿; 郑星旭; 黄星宇; 姜憬娈; 姜友拉
Original assignee: Daewoo Pharmaceutical Ind Co Ltd
Current assignee: Daewoo Pharmaceutical Ind Co Ltd
Priority date: 2010-07-16
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2031-02-23
Also published as: WO2012008674A1; EP2594268A4; EP2594268B1; JP2013531032A; CA2803999A1; CN103002892A; JP5728085B2; EP2594268A1; US20130303600A1; CA2803999C; KR20120008429A; KR101271593B1; US20130109745A1; US8940788B2

Abstract

本发明涉及一种具有抗血管生成效果的组合物，其含有大环内酯菌素A、7-O-丙二酰大环内酯菌素A及7-O-丁二酰大环内酯菌素A等大环内酯类化合物作为有效成分。本发明提供的所述大环内酯类化合物在活体内实验中强烈抑制新生血管的生成，可以用作预防或治疗由血管生成引起的疾病的药物组合物。

Description

含有大环内酯菌素A及其衍生物作为有效成分的具有抗血管生成效果的组合物

技术领域

本发明涉及一种具有抗血管生成效果的组合物，其含有具有抗血管生成作用的大环内酯菌素A（macrolactinA，以下称为MA）、7-O-丙二酰大环内酯菌素A（7-O-malonylmacrolactinA，以下称为MMA）及7-O-丁二酰大环内酯菌素A（7-O-succinylmacrolactinA，以下称为SMA）等大环内酯类化合物作为有效成分。利用本发明的具有抗血管生成效果的组合物，可以提供一种以预防或治疗由血管生成引起的疾病为目的的药物组合物。

背景技术

血管生成（angiogenesis）是指由现有的微血管生成新的毛细血管的过程。正常的血管生成发生在胚胎发育（embryonicdevelopment）、组织再生、伤口处理及作为女性生殖系统的周期性变化的黄体成熟时期，此时也被严格调节而进行（FolkmanJetal.，Int.Rev.Exp.Pathol.，16pp207-248，1976（FolkmanJ等人，国际实验病理学评论，16第207-248页，1976））。

在成人中，血管内皮细胞的生长非常缓慢，与其它类型的细胞相比，相对不易分裂。血管生成的过程如下。一般是依靠血管生成促进因子的刺激，通过依靠蛋白酶引起的血管基底膜的分解、血管内皮细胞的迁移、增殖，以及由血管内皮细胞分化引起的管形成使血管重建，从而生成新的毛细血管。

一些疾病是由于血管生成不能得到自我调节，导致血管异常生长而引起的。在病理条件下发生的与血管生成相关的疾病有血管瘤、血管纤维瘤、血管畸形，以及动脉硬化、血管粘附、硬肿症等心血管疾病；由血管生成引起的眼科疾病有角膜移植性血管生成、新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病变、新生血管性角膜疾病、斑点退化、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后纤维组织增生和颗粒性结膜炎等。关节炎等慢性炎症性疾病，牛皮癣、毛细血管扩张症、化脓性肉芽肿、脂溢性皮炎、痤疮等皮肤疾病，阿尔茨海默氏症和肥胖也与血管生成有关，此外，癌的生长和转移必须依赖于血管生成（D'Amato.RJetal.，Ophthalmology，102（9），pp1261-1262，1995；ArbiserJL，J.Am.Acad.Dermatol.，34（3），pp486-497，1996；O'BrienKDetal.Circulation，93（4），pp672-682，1996；HanahanDetal.，Cell，86，pp353-364，1996（D'Amato.RJ等人，眼科学，102（9），第1261-1262页，1995；ArbiserJL，美国皮肤病学会杂志，34（3），第486-497页，1996；O'BrienKD等人，循环杂志，93（4），第672-682页，1996；HanahanD等人，细胞，86，第353-364页，1996））。

特别是癌症的情况下，血管生成在癌细胞的生长和转移中起着重要的作用。肿瘤通过新生血管得到生长和增殖所需的营养和氧气，此外，渗透到肿瘤的新生血管给转移的癌细胞提供进入血液循环系统的机会，使癌细胞转移（metastasis）（FolkmanandTyler，CancerInvasionandmetastasis，BiologicalmechanismandTherapy（S.B.Dayed.）Ravenpress,NewYork，pp94-103,1977；PolveriniPJ，Crit.Rev.Oral.Biol.Med.，6（3），pp230-247，1995（福克曼和泰勒，癌的侵袭及转移，生物学机制及治疗（S.B.Dayed.）Raven出版社，纽约，第94-103页，1977；PolveriniPJ，口腔生物医学与医学鉴定性评论，6（3），第230-247页，1995））。目前在临床上对癌症患者所使用的化学疗法或免疫疗法无法提高癌症患者的生存率的主要原因为癌症的转移。

关节炎作为典型的炎症性疾病，自身免疫失调是其主要原因，随着病情的发展，关节之间的滑膜囊内的慢性炎症会诱导血管生成并破坏软骨。即，借助于诱导炎症的细胞因子，滑膜细胞和血管内皮细胞在滑膜囊内增殖，随着血管生成的进行，在软骨部形成结缔组织层—关节翳后，对起到缓冲作用的软骨进行破坏（KochAEetal.，Arthritis.Rheum.，29，pp471-479，1986；StupackDGetal.，BrazJ.Med.Biol.Rcs.，32（5），pp578-581，1999；KochAE，Atrhritis.Rheum.，41（6），pp951-962，1998（KochAE等人，关节炎与风湿病，29，第471-479页，1986；StupackDG等人，巴西医学及生物学杂志，32（5），第578-581页，1999；KochAE，关节炎与风湿病，41（6），第951-962页，1998）。

每年使全世界数以百万计的人失明的眼科疾病，其原因也是血管生成（JeffreyMIetal.，J.Clin.Invest.，103，pp1231-1236，1999（JeffreyMI等人，临床研究杂志，103，第1231-1236页，1999））。具有代表性的例子有发生在老年人上的黄斑变性（maculardegeneration）、糖尿病性视网膜病变（diabeticretinopathy）、早熟儿的视网膜病、新生血管性青光眼、新生血管性角膜疾病等，这些疾病都是由血管生成引起的（AdamisAPetal.，Angiogenesis，3，pp9-14，1999（AdamisAP等人，血管生成，3，第9-14页，1999年））。其中，糖尿病性视网膜病变作为糖尿病的并发症，其是因视网膜中的毛细血管侵入到玻璃体而导致失明的疾病。

以红色斑点和鳞片状皮肤为特征的牛皮癣也是一种发生在皮肤上的慢性增生性疾病，其难以治愈且伴随疼痛和变形。与正常状态下的角质细胞每月增殖一次相比，牛皮癣患者至少每周增殖一次。对于这样的快速增殖，需要提供丰富的血液，因此无法避免活跃的血管生成（FolkmanJ，J.Invest.Dermatol.，59，pp40-48，1972（FolkmanJ，研究性皮肤病学杂志，59，第40-48页，1972））。

抗血管生成抑制剂可以适用于治疗这些各种血管生成相关的疾病。由于患者通常需要长期服用这些抗血管生成抑制剂，因此毒性低且能够口服的药物最为理想。因此，需要开发一种毒性低的抗血管生成抑制剂。

本发明的发明人对以大环内酯菌素A为首的大环内酯衍生物的药理活性进行了长期研究，它们为含有24-环内酯环的大环内酯类抗菌素物质。大环内酯类化合物是从未分类的海洋细菌、放线菌和芽孢杆菌菌株中产生（WillamFenicaletal.，JAmChemSoc.，111，pp7519-7524，1989；IkDongYooetal.，JMicrobiolBiotechnol.，7，pp429-434，1997；GabriellaMolinarietal.，AntimicrobAgentsChemother.，50，pp1701-1709，2006（WillamFenical等人，美国化学学会志，111，第7519-7524页，1989；IkDongYoo等人，微生物学与生物技术杂志，7，第429-434页，1997；GabriellaMolinari等人，抗微生物剂与化疗，50，第1701-1709页，2006））。到目前为止已有23种化合物在结构上得到确认。现有的针对大环内酯类化合物药理活性的研究如下。

在1989年首次分离出的MA具有以下作用，其抑制小鼠黑素瘤癌细胞（murinemelanomacancercell）和单纯性疱疹病毒（Herpessimplexvirus）的增殖，保护因艾滋病毒（HIV）而受损的T-淋巴母细胞（WillamFenicaletal.，JAmChemSoc.，111，pp7519-7524，1989（WillamFenical等人，美国化学学会志，111，第7519-7524页，1989））。此外，还具有抑制鲨烯合酶（squalenesynthase）（SungWonChoietal.,CanJMicrobiol.,49,pp663-668,2003（SungWonChoi等人，加拿大微生物杂志，49，第663-668页，2003）），保护因谷氨酸盐（glutamate）而受损的脑细胞（IkDongYooetal.，JMicrobiolBiotechnol.，7，pp429-434，1997（IkDongYoo等人，微生物学与生物技术杂志，7，第429-434，1997））的作用，还对包括超级细菌在内的各种病原菌表现出了抗菌活性（GabriellaMolinarietal.，AntimicrobAgentsChemother.，50，pp1701-1709，2006（GabriellaMolinari等人，抗微生物剂与化疗，50，第1701-1709，2006）。此外，本发明人确认了MA及其衍生物具有以下作用，其可抑制由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症介质的形成，并对此申请了专利（PCT申请号：PCT/KR2010/003239）。

本发明人确认了从聚酵素芽孢杆菌KJS-2（BacilluspolyfermenticusKJS-2，KCCM10769P，以下简称“BP2”）菌株的发酵液或培养液中可以产出作为主要产物的MA、MMA和SMA，并确定了它们的结构。并且，通过液相色谱-质谱联用（LC/Mass），确认了从上述菌的发酵液或培养液的粗提物中还生产出了上述三种大环内酯类化合物以外的物质，即，被推定为大环内酯菌素B（macrolactinB）、大环内酯菌素C（macrolactinC）、大环内酯菌素D（macrolactinD）、大环内酯菌素E（macrolactinE）、大环内酯菌素F（macrolactinF）、大环内酯菌素G（macrolactinG）、大环内酯菌素H（macrolactinH）、大环内酯菌素I（macrolactinI）、大环内酯菌素J（macrolactinJ）、大环内酯菌素K（macrolactinK）、大环内酯菌素L（macrolactinL）、大环内酯菌素M（macrolactinM）、大环内酯菌素N（macrolactinN）、异大环内酯酸（isomacrolactinicacid）及大环内酯酸（macrolactinicacid）（韩国专利授权号：10-0895908）。但本发明人没有证实大环内酯菌素O（macrolactinO）、大环内酯菌素P（macrolactinP）、大环内酯菌素Q（macrolactinQ）、大环内酯菌素R（macrolactinR）及大环内酯菌素S（macrolactinS）产自BP2菌。

大环内酯类化合物具有与它们的各种结构相对应的各种药理活性。然而，目前还没有关于大环内酯类化合物抑制血管生成方面的研究报道。为此，本发明人使用中压液相色谱（middlepressureliquidchromatography，MPLC）对含有各种大环内酯类化合物的BP2菌的发酵液或培养液中产出的粗提物进行分别提取，并对各流分的血管生成抑制活性进行研究。结果发现含有大环内酯类化合物的流分具有抑制血管生成的作用，特别是含有MA、MMA、SMA的流分可强烈抑制新生血管的形成。由此，本发明人通过对含有上述三种大环内酯化合物的中压液相色谱流分进行精制，获得高纯度的各物质（PCT申请号：PCT/KR2010/003239），并分别对精制获得的三种大环内酯化合物的血管生成抑制活性进行了研究。

发明内容

要解决的技术问题

本发明人通过确认MA、MMA及SMA具有强烈抑制血管生成的作用，从而完成了本发明。因此，本发明以预防或治疗由血管生成引起的疾病为目的，旨在提供一种含有上述大环内酯类化合物作为有效成分的药物组合物。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供一种用于抑制血管生成的组合物，其含有化学式1~化学式3所示的化合物作为有效成分。此外，为了实现本发明的另一个目的，本发明提供一种用于预防或治疗与血管生成相关的疾病的组合物，其含有化学式1~化学式3所示的化合物中的任意一种作为有效成分。

化学式1

化学式2

化学式3

已知的由上述血管生成引起的疾病有类风湿性关节炎、骨关节炎、脓毒性关节炎、牛皮癣、角膜溃疡、老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、增殖性玻璃体视网膜病变、未成熟视网膜病变、眼科炎症、圆锥形角膜、干燥综合征、近视眼肿瘤、角膜移植排斥、异常伤口粘连、骨病、蛋白尿、腹主动脉瘤、外伤性关节损伤导致的退行性软骨损失、神经系统的脱髓鞘疾病、肝硬化、肾小球疾病、未成熟胚胎胎膜破裂、炎症性肠病、牙周疾病、动脉硬化症、再狭窄、中枢神经系统的炎症性疾病、阿尔茨海默氏病、皮肤衰老和癌的浸润及转移等。

下面，对本发明进行详细的说明。

本发明的化合物可以使用本发明人已申请的专利（PCT/KR2010/003239）中公开的方法得到。

即，为了得到与化学式1、化学式2及化学式3对应的化合物MA、MMA及SMA，使用由本发明人分离出的聚酵素芽孢杆菌KJS-2（BacilluspolyfermenticusKJS-2，KCCM10769P）菌株，按照PCT/KR2010/003239所公开的方法，经过发酵、提取及分离精制过程得到。

在作为活体内实验的鸡的绒毛尿囊膜模型中，通过使用血管内皮生长因子（VEGF，vascularendothelialgrowthfactor）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，tumornecrosisfactor-α）和白细胞介素8（IL-8，interleukin-8）等新生血管生成诱导因子进行处理后，引起新生血管生成，按照上述方法得到的本发明的化合物可强烈抑制新生血管生成和因血管生成而导致的癌转移。由此证实，本发明的化合物可有效用作预防及治疗血管生成引起的疾病的药物组合物。

有益效果

本发明提供的MA、MMA及SMA通过在作为活体内实验的鸡的绒毛尿囊膜模型中，强烈抑制新生血管生成，因此含有这些作为有效成分的药物组合物可以有效地用于治疗及预防血管生成引起的疾病。

附图说明

1.图1a是实施例中的绒毛尿囊膜的立体显微镜照片，其表示本发明的化合物对VEGF诱导的新生血管生成的抑制效果。

2.图1b是用图表表示本发明的化合物对VEGF诱导的新生血管生成的抑制效果的图。

3.图2a是实施例中的绒毛尿囊膜的立体显微镜照片，其表示本发明的化合物对TNF-α诱导的新生血管生成的抑制效果。

4.图2b是用图表表示本发明的化合物对TNF-a诱导的新生血管生成的抑制效果的图。

5.图3a是实施例中的绒毛尿囊膜的立体显微镜照片，其表示本发明的化合物对IL-8诱导的新生血管生成的抑制效果。

6.图3b是用图表表示本发明的化合物对IL-8诱导的新生血管生成的抑制效果的图。

7.图4a是表示本发明的化合物对5%FBS诱导的纤维肉瘤细胞转移的抑制效果的照片。

8.图4b是用图表表示本发明的化合物对5%FBS诱导的纤维肉瘤细胞转移的抑制效果的图。

具体实施方式

本发明提供一种药物组合物，其含有MA、MMA、SMA作为有效成分，含有药学上可接受的载体或赋形剂，用于预防或治疗由血管生成引起的疾病。

在此，血管生成引起的疾病可以为选自类风湿性关节炎、骨关节炎、脓毒性关节炎、牛皮癣、角膜溃疡、老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、增殖性玻璃体视网膜病变、未成熟视网膜病变、眼科炎症、圆锥形角膜、干燥综合征、近视眼肿瘤、角膜移植排斥、异常伤口粘连、骨病、蛋白尿、腹主动脉瘤、外伤性关节损伤导致的退行性软骨损失、神经系统的脱髓鞘疾病、肝硬化、肾小球疾病、未成熟胚胎胎膜破裂、炎症性肠病、牙周疾病、动脉硬化症、再狭窄、中枢神经系统的炎症性疾病、阿尔茨海默氏病、皮肤衰老和癌症的浸润和转移中的一种以上。

下面对本发明的用于预防或治疗由血管生成引起的疾病的药物组合物进行说明。

所述药物组合物含有作为大环内酯类化合物的MA、MMA、SMA中的一种以上作为有效成分，所述大环内酯类化合物产自BP2等聚酵素芽孢杆菌的培养液或发酵液，并且含有药学上可接受的载体或赋形剂。

此外，本发明的用于预防或治疗由血管生成引起的疾病的药物组合物，可以进一步含有通常在制备药物组合物时适合使用的载体、赋形剂或稀释剂。

可以包含在本发明的用于预防或治疗由血管生成引起的疾病的药物组合物的载体、赋形剂或稀释剂，可以例举如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻朊酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钾、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油。

根据本发明的含有MA、MMA和SMA中的至少一个以上的物质作为有效成分的药物组合物，根据常规的制备方法可配制成以下剂型使用，如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服剂型，外用制剂，栓剂，滴眼剂，滴耳剂和灭菌注射溶液。

在制备剂型时，可以使用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂等稀释剂或赋形剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，而这些固体制剂通过混合至少一种以上的赋形剂来制备，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶等。此外，除了简单的赋形剂之外，还使用硬脂酸镁和滑石等润滑剂。用于口服的液体制剂有悬浮液、凝胶溶液、乳剂和糖浆剂等，除了常规使用的简单的稀释剂，例如水和液体石蜡以外，还可以包括各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂等。用于非口服给药的制剂包括灭菌的凝胶溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂、冻干制剂、栓剂、滴眼剂和滴耳剂。对于非水溶液和悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油，油酸乙酯等可注射的酯等。对于栓剂基质可以使用witepsol（商品名）、聚乙二醇、吐温61、可可脂、三月桂酸甘油酯（laurinum）、甘油明胶等。滴眼剂、滴耳剂可以使用磷酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等缓冲剂和盐酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾等pH调节剂。

MA、MMA和SMA中的一种以上或各自的使用量根据患者的年龄、性别或体重会有所不同，但可以以0.01~100mg/kg的量每天给药一次或数次。此外，MA、MMA和SMA中的一种以上或各自的给药量可以根据给药途径、疾病的严重程度、性别、体重及年龄等进行增减。因此，上述给药量不应限制本发明的范围。

上述药物组合物可以通过多种途径对大鼠、小鼠、家畜和人等哺乳动物进行给药。可以想到所有的给药方式，例如可以通过口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内膜或脑血管内（intracerebroventricular）注射进行给药。

下面，通过下述实验及实施例更加详细地说明本发明，但本发明的权利范围并不限定于下述实施例等。

实验材料及试剂

受精鸡蛋购自Baekja韩国土鸡（青松，韩国）。2-吡啶甲醛（2-Pyridinecarboxaldehyde）和2-乙酰基呋喃（2-acetylfuran）及醋酸可的松（cortisoneacetate）购自奥德里奇公司（美国密苏里州圣路易斯市AldrichChemical公司）、血管内皮生长因子（VEGF）和白细胞介素-8（IL-8）购自安迪生物科技公司（美国明尼苏达州明尼阿波利斯市R&Dsystems）、肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α）购自英杰公司（InvitrogenLifeTech.）、沃特曼滤片（whatmanfilterdisc）购自沃特曼公司（英国Whatman）、巴马司他购自Tocris公司（美国密苏里州巴温）。

<制备例1>实验物质的生产及分离精制

根据本发明人已申请的专利（PCT/KR2010/003239）中公开的方法获得实验物质MA、MMA及SMA。

<实施例1>通过CAM分析的血管生成抑制效果

为了证实在活体内（invivo）的大环内酯类化合物的抗血管新生效果，实施绒毛尿囊膜（chorioallantoicmembrane，CAM）分析（NguyenM.etal.，MicrovascularRes.，47，pp.31-40，1994（NguyenM等人，微血管研究，47，第31-40页，1994））。每组（group）使用6±1个受精鸡蛋。

培养受精鸡蛋，使温度维持在37℃且相对湿度为55%。在第十天利用皮下注射针（hypodermicneedle，绿十字医疗公司，韩国）在气囊（airsac）部位上钻出第一个小孔，在将要开窗（window）的受精鸡蛋的平坦的部位上钻出第二个孔。

通过作为第一个孔的气囊部位的孔抽取空气，使绒毛尿囊膜从受精鸡蛋的蛋壳上分离，再用磨砂轮（gridingwheel，Multipro395JA，达美电磨（Dremel），墨西哥）切割该部位，制作窗口。

然后，用3mg/ml的醋酸可的松对沃特曼滤片（whatmanfilterdisc#1，沃特曼公司，美国）进行处理并干燥后，用分别为10μl的血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子-α或白细胞介素-8对滤片进行处理（20ng/CAM）。

通过已制作的窗口，将滤片盖在血管上，用二甲基亚砜（DMSO）将MA或MMA或SMA化合物溶解，用磷酸缓冲溶液（PBS）稀释，然后用不同浓度进行处理。

在用药物处理3天后，撕下盖有滤片的CAM部分，用磷酸缓冲溶液清洗后，利用立体显微镜（德国韦茨拉尔市徕卡公司）和专业图像分析软件（Image-ProPlussoftware）（美国密苏里州银泉市MediaCybernetics）拍摄影像，测定血管分支的数量，分析数据。

所有的数据用平均（Mean）±平均标准误差（standarderrorofmean）来表示，使用医学绘图软件（GraphPadPrism4）（美国加利福尼亚州圣地亚哥市GraphPadSoftware），通过单因素方差分析（one-wayANOVA）进行统计分析，使用NK（检验（Newman-Keuls））的方法对各组之间的差异进行多重比较（multiplecomparison）。当P值小于0.05时，视为在统计学上具有显著性。

上述的实验结果示于图1、图2及图3。

图1、图2及图3是表示从各实验组中观察的新生血管的照片及各实验组的血管分支个数的图表。

参见图1a和图1b可知，在表示仅用PBS处理的实验组（PBS）、仅用血管内皮生长因子处理的实验组（只使用VEGF），以及分别使用不同浓度的血管内皮生长因子和大环内酯化合物进行处理的实验组的照片中，MA、MMA及SMA抑制由血管内皮生长因子引起的新生血管的生成。特别是SMA随着浓度的增加强烈抑制新生血管的生成。

参见图2a和图2b可知，在表示仅用PBS处理的实验组（PBS）、仅用肿瘤坏死因子-α处理的实验组（只使用TNF-α），以及分别使用不同浓度的肿瘤坏死因子-α和大环内酯化合物进行处理的实验组的照片中，MA及SMA抑制由肿瘤坏死因子-α引起的新生血管的生成。特别是SMA在使用20μg/CAM进行处理的组中，以与对照组具有相似的血管分支数量，强烈抑制新生血管生成。

参见图3a和图3b可知，在表示仅用PBS处理的实验组（PBS）、仅用白细胞介素-8处理的实验组（只使用IL-8），以及分别使用不同浓度的白细胞介素-8和大环内酯化合物进行处理的实验组的照片中，MA及SMA抑制由白细胞介素-8引起的新生血管的生成。特别是SMA在使用20μg/CAM进行处理的组中，以与对照组具有相似的血管分支数量，强烈抑制新生血管生成。

由上述内容可知，通过使用本发明的大环内酯化合物进行处理，可显著减少由血管内皮生长因子或肿瘤坏死因子-α或白细胞介素-8等新生血管生成诱导因子的处理而引起的新生血管生成的增加。

<实施例2>癌症转移的抑制效果实验

-细胞培养

用含有10%的胎牛血清（FBS）及1%的青霉素/链霉素（PS）的细胞培养基，在37℃、5%的CO₂的条件下，对人纤维肉瘤细胞HT-1080进行培养，当细胞在培养烧瓶中生长至装满80%的烧瓶时，以1:3的比例进行继代培养，用于本实验。

-癌症转移的抑制效果实验

为了证实在活体外的大环内酯化合物对癌症转移的抑制效果，利用带有8mm孔径大小的聚碳酸酯过滤器的24-孔细胞小室（transwell）进行纤维肉瘤细胞的渗透性实验。首先利用胶原蛋白Ι型（0.5mg/ml）对过滤器的底面进行涂布，再用基质胶（1.5mg/ml）对过滤器的上面进行涂布。在进行完涂布后，插入部位的下侧部分用含有5%FBS的培养基进行填充，而上侧部分填充无血清培养基，并在培养基上接种人纤维肉瘤细胞HT-1080，并在细胞培养箱中培养18小时。将从滤片底面浸润出的人纤维肉瘤细胞用甲醇进行固定后，用苏木精和曙红进行染色。然后用显微镜观察浸润出的细胞，从各过滤器中随机选出三个部分进行拍照后，测定细胞个数（Kim，M.S.etal.，CancerRes.，63，pp.5454-5461，2003；Park，B.C.etal.，Eur.J.Pharm.，567，pp.193-197，2007（Kim，M.S.等人，癌症研究，63，第5454-5461页，2003；Park，B.C.等人，Eur.J.Pharm.，567，第193-197页，2007））。

上述的实验结果示于图4。

参见图4a和图4b可知，为了比较大环内酯化合物的癌症转移抑制效果，将作为癌症转移中必需的基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，以下称为MMP）的抑制剂的巴马司他（batimastat）用于对照组。使用5%FBS诱导的纤维肉瘤细胞的浸润得到增加，使用作为MMP抑制剂的巴马司他5浓度进行处理的对照组显著性地得到抑制。MA和SMA对使用5%的FBS诱导浸润的纤维肉瘤细胞的细胞转移的抑制方面依赖于MA和SMA的浓度。特别是，SMA1在转移抑制效果方面表现出显著性，SMA5表现出与巴马司他相似水平的优异的癌症转移抑制效果。

如此，虽然通过限定的实施例和附图对本发明进行了说明，但本发明并不限定于这些内容，本领域技术人员在本发明的技术思想及与本发明权利要求的同等范围内，显然可以进行多种修改及变形。

Claims

1.选自大环内酯菌素A及7-O-丁二酰大环内酯菌素A中的至少一种大环内酯化合物在制备通过抑制血管生成来抑制癌的浸润及转移的组合物中的应用，其中所述癌是纤维肉瘤。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大环内酯化合物是大环内酯菌素A。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大环内酯化合物是7-O-丁二酰大环内酯菌素A。