KR20190036482A - 종양 표적 치료용 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트 - Google Patents

종양 표적 치료용 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트에 관한 것으로, 상기 컨쥬게이트는 신생혈관 억제를 통하여 종양의 생장을 억제할 수 있으므로 혈관생성에 의존적인 뇌종양, 피부암, 폐암 등의 치료에 활용될 수 있고, 고가의 항체 단백질 대신 저가의 다당체를 활용한 합성물이므로 약제 단가를 낮출 수 있게 되어 보건의료 비용을 절감시킬 수 있으며, 경구로 편리하게 투여할 수 있다.

Description

종양 표적 치료용 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트{Lactoferrin-glycyrrhizin conjugate for tumor targeting therapy}
본 발명은 종양 표적 치료에 사용될 수 있는 경구 흡수형 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트에 관한 것이다.
우리나라는 전세계에서 인구 고령화가 가장 빠르게 진행되고 있고, 이에 따라 퇴행성 뇌질환 및 노인성 질환의 치료제 수요가 급증하고 있다. 특히 두개골 내에 발생하는 모든 종양을 일컫는 뇌종양은 1년에 인구 10만 명당 10명 내지 15명에서 발병하고 있으며, 국내에서는 1년에 3,000여 명의 신규환자가 발생한다. 뇌종양 중에서 세계보건기구(WHO) 3/4 등급인 악성 뇌종양(malignant glioma)은 조직학적 형태가 다양한 침윤성 암으로, 수술요법 이외에 방사선 요법, 항암제 요법, 면역 요법 등을 병합하여 치료한다.
뇌종양에서 암세포의 성장을 위해서는 혈관신생(angiogenesis) 과정이 반드시 필요하고, 특히, 악성 뇌종양은 인간에 발생하는 암 중에서 가장 혈관형성이 많이 되는 것으로 알려지고 있다. 악성 뇌종양에서 분비되는 혈관형성 촉진 성장인자는 bFGF (basic firoblast growth factor), HGF/SF (hepatocyte growth factor/scatter factor), VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A) 및 HMGB1 (high-mobility group box-1) 등이 있다. 그중에서 HMGB1은 암세포의 급속한 성장으로 인해 암조직 내부가 저산소(hypoxia) 상태가 되면 분비되고, 혈관신생을 유도하여 암의 생장을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 다른 종류의 암을 치료하기 위해 HMGB1을 표적으로 하는 연구가 시도된바 있으나, 뇌종양과 HMGB1을 연관시킨 연구는 아직 부족한 실정이다.
본 발명자들은 HMGB1을 표적할 수 있는 글리시리진을 이용하여 뇌종양 치료제로 기능할 수 있는 물질을 개발하기 노력한 결과, 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
1. 대한민국 등록특허 제10-1271593호
본 발명의 일 목적은 공유결합으로 연결된 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트 (lactoferrin-glycyrrhizin conjugate)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 유효성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 공유결합으로 연결된 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, ‘락토페린(lactoferrin)’은 모유, 타액, 눈물 등에 존재하는 단백질로 초유(colostrums)에 가장 많이 함유되어 있으며, 항균 작용, 면역력 증가, 항염 작용 등의 활성을 나타낸다. 또한, 락토페린은 세포막 단백질의 하나인 LRP(Low-density lipoprotein receptor related protein) 수용체와 결합이 가능한 리간드이며, LRP 수용체(락토페린 수용체)는 소장 상피, 뇌혈관 내피세포 등에 다수 발현되어 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 상기 락토페린은 컨쥬게이트의 종양, 암 또는 뇌종양의 표적화, 글리시리진의 생체 이용률, 특히 경구 흡수율 향상 및 뇌-혈관 장벽(blood-brain barrier, BBB)을 극복하는 역할을 한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 락토페린은 고유의 특성을 유지하는 범위에서 개질될 수 있으며, 완충용액에 용해된 상태로 이용될 수 있다. 완충용액으로는 시트르산 완충용액(citrate buffered saline, CBS), 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS), 트리스 완충용액(tris buffered saline, TBS) 등이 이용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, '글리시리진(glycyrrhizin)'은 감초에서 추출된 성분으로 HMGB1의 A box domain에 직접적으로 결합하여 그 활성을 억제하며, 결과적으로 혈관신생을 유도하는 암세포의 신호를 저해할 수 있다. 그러나 글리시리진으로 HMGB1을 표적하여 뇌종양 치료에 이용하는 약물은 아직까지 알려지지 않은 실정이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 글리시리진은 고유의 특성을 잃지 않는 범위에서 개질될 수 있으며, 예를 들어 산화된(oxidized) 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 산화된 형태의 글리시리진은 도 1에 나타낸 바와 같이, 말단의 글루쿠론산 고리의 2번 탄소 및 3번 탄소 사이의 결합이 산화에 의해 열려(opened) 카르보닐 그룹을 형성할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 락토페린과 글리시리진은 공유결합으로 연결되어 있으며, 상기 공유결합은 아마이드 결합(amide bond), 카보닐 결합(carbonyl bond), 에스터 결합(ester bond), 황화 에스터 결합(thioester bond), 설폰 아마이드 결합(sulfonamide bond)일 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 공유결합은 과요오드산 나트륨 등의 처리에 의해 산화된 글리시리진의 카르보닐기와 락토페린의 아민기가 반응하여 형성된 아마이드 결합일 수 있다.
또한, 공유결합시 상기 락토페린과 글리시리진의 결합비, 즉 락토페린 분자와 글리시리진 분자가 결합하는 비율은 1:2 내지 1:20일 수 있고, 보다 바람직하게는 1:3 내지 1:16일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1:3 내지 1:5, 1:8 내지 1:12 및 1:14 내지 1:16일 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에서, 상기 락토페린 및 글리시리진의 컨쥬게이트는 소장 상피세포에 존재하는 LRP 수용체를 통하여 흡수되므로 경구 투여용으로 사용될 수 있으며, 따라서 환자의 약물 섭취를 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 유효성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, '종양'은 체내의 세포가 자율성을 가지고 과잉으로 발육한 상태를 말하며, 세균 감염, 바이러스 감염, 유전자 변이 등에 의하여 발생할 수 있다. 일반적으로 더 이상 세포분열(크기 증가)을 하지 않거나 천천히 성장하는 양성 종양과 세포분열이 빠르게 진행되고, 주변부에 파고 들거나 혈액 또는 림프관을 타고 이동하여 다른 곳에서도 성장하는 악성 종양으로 분류하며, 악성종양을 암으로 부르기도 한다.
본 발명에서 상기 종양은 혈관신생에 의해 매개되는 종양일 수 있으며, 암, 혈관종, 혈관섬유종, 화농성 육아종 또는 뇌종양일 수 있고, 바람직하게는 뇌종양일 수 있다. 상기 뇌종양은 뇌세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고, 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병의 총칭을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 ⅰ) 글리시리진과 HMGB1의 결합에 의한 HMGB1 활성 억제, 이에 따른 혈관 신생 및 뇌종양 성장 저해, ⅱ) EPR(enhanced permeability and retention) 효과를 통한 글리시리진의 수동적 표적화(passive targeting), ⅲ) 락토페린 매개 LRP 수용체와의 특이적 결합을 통한 경구 흡수, 뇌-혈관 장벽 통과 및 뇌종양 표적화 기능, 및 ⅳ) 락토페린 자체에 의한 혈관형성 촉진 성장인자의 활성 억제 등의 효과를 나타내므로 뇌질환 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 다만, 본 발명의 조성물은 소장 내피세포에 발현되어 있는 LRP 수용체와의 상호작용에 의한 흡수가 용이한 바, 가장 바람직하게는 경구 투여할 수 있으며, 경구 투여의 목적으로 본 발명의 유효성분을 정제, 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제, 현탁제 등의 제제로 제형화하는 경우, 아라비아 고무, 옥 수수 전분, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 인산이칼슘 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 스테아르산마그네슘과 같은 활택제, 슈크로스 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제가 포함될 수 있다. 단위 투여형이 캅셀제인 경우에는 상기 성분 외에도 폴리에틸렌글리콜 또는 지방유와 같은 액상 담체가 포함될 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따르면, 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트는 신생혈관 억제를 통하여 종양의 생장을 억제할 수 있으므로 혈관 생성을 많이 하고 혈관 의존적인 뇌종양, 피부암이나 폐암 등의 치료에 활용될 수 있고, 고가의 항체 단백질 대신 저가의 다당체를 활용한 합성물이므로 약제 단가를 낮출 수 있게 되어 보건의료 비용을 절감시킬 수 있으며, 경구로 편리하게 투여할 수 있다.
도 1은 글리시리진의 카르보닐 그룹(carbonyl group)과 락토페린의 아민기(amine)를 반응시켜 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 합성하는 과정에 대한 개략적인 모식도이다.
도 2는 합성된 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 분자량 및 결합 비율을 MALDI-TOF로 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 1H-NMR을 이용하여 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 피크(peak)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(Lf-GL)에 대하여 자외선-가시 분광광도계로 파장별 흡광도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 농도별로 Caco-2 세포에 처리하여 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 농도별로 인간 제대정맥 세포(HUVEC)에 처리하여 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 비아코어 표면 플라스몬 공명 시스템으로 HMGB1(high mobility group protein B1)과 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 친화도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8의 A는 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트와 펩신을 반응시킨 후, 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 가수분해 정도를 SDS-PAGE로 확인한 결과이고, B는 반응 후 남아 있는 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트 밴드를 그래프로 표시한 결과를 나타낸다.
도 9는 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 뇌종양 세포(U87MG)의 증식 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 10의 A는 교모세포종 스페로이드에 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 처리한 후 시간 경과에 따른 스페로이드의 생장 정도를 확인한 결과이고, B는 교모세포종 스페로이드의 크기를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 교모세포종 스페로이드에 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 처리한 후 라이브/데드 세포 생존율 실험을 수행한 결과를 나타낸다.
도 12의 A는 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트가 Caco-2 세포 단일층을 트랜스사이토시스로 통과하는지 여부를 확인하는 실험의 모식도이고, B는 TEER(trans epithelial electrical resistance)로 확인한 실험 결과를 나타낸다.
도 13의 A는 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 처리한 복대동맥 링에서 혈관 신생 여부를 관찰한 결과이고, B는 혈관 신생 여부 관찰 결과를 정량적으로 표시한 그래프이며, C는 복대동맥 링의 혈관 신생 여부를 고배율로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 14의 A는 뇌종양 동물모델에 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 투여한 후 뇌 조직 절편을 락토페린 항체로 염색한 결과이고, B는 염색 결과를 정량적으로 표시한 그래프를 나타낸다.
도 15의 A는 뇌종양 동물모델에 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 투여한 후 뇌 조직 절편을 CD34 항체로 염색한 결과이고, B는 염색 결과를 정량적으로 표시한 그래프를 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 특성 확인
1-1. 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트 합성
글리시리진(glycyrrhizin)을 pH 9.5의 CBS(Citrate-buffered saline) 1.5 ㎖에 세 가지 농도(25 mM, 50 mM 및 100 mM)로 용해시키고, 50 mM의 과요오드산 나트륨(sodium periodate) 용액 1.5 ㎖을 첨가한 후 4℃에서 1시간 30분 동안 반응시켜 글리시리진의 카르보닐기(>C=O)를 활성화시켰다. 락토페린을 pH 9.5의 CBS에 10 ㎎/㎖ 농도로 녹이고, 상기 글리시리진 용액에 락토페린 용액 1.5 ㎖을 한방울씩 천천히 첨가하였다. 이후 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 락토페린의 아민기와 글리시리진의 카르보닐기 사이에 시프 염기 결합 (schiff base bond)을 생성시켰다. 이후 여기에 5M 농도의 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)를 용액 부피 1 ㎖당 10 ㎕씩 첨가하고, 24시간 동안 반응시켜 시프 염기 결합을 안정적인 2차 아민 결합(secondary amine bond)으로 변환시켰다. 최종 반응액을 4℃에서 2일 이상 투석(dialysis)한 후 동결건조시켜 파우더 타입의 합성물을 수득하였다. 이하에서는 합성물을 '락토페린-글리시리진 컨쥬게이트'로 기재한다.
도 1에 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 합성 과정을 개략적으로 도시하였다.
1-2. 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 분자량 및 결합 비율 확인
MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)로 소 락토페린(bovine lactoferrin; 이하, 락토페린으로 기재함), 상기 실시예 1-1에서 합성한 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 분자량을 측정하였다.
그 결과, 도 2 및 하기 표 1에 나타난 바와 같이 합성된 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 분자량이 각각 84061.860 g/mol, 88919.115 g/mol 및 93050.144 g/mol로 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 락토페린의 분자량이 80,000 Da이고, 글리시리진의 분자량이 822.93 Da이므로, 상기 결과는 락토페린과 글리시리진이 각각 1:4, 1:10, 1:15의 비율로 결합하고 있음을 의미한다.
Figure pat00001
1-3. 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 결합 여부 확인
글리시리진, 락토페린 및 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:4, 1:10, 1:15)에 대하여 1H 핵자기공명(NMR, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 500 MHz)으로 피크(peak)를 측정하였다.
측정 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 1:4, 1:10 및 1:15의 비율로 결합된 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트 각각에서 글리시리진에 포함되어 있는 사이클로파라핀 프로톤(cycloparaffin proton), 하이드록시드 라디칼 프로톤(hydroxide radical proton) 및 알켄 프로톤(alkene proton)에 대한 피크를 확인할 수 있었다. 또한, 락토페린과 결합한 글리시리진의 양에 따라 피크의 k 크기가 증가하는 것을 알 수 있었다(cycloparaffin proton: 0.819-0.820 ppm, hydroxide radical proton: 3.386 ppm, alkene proton: 5.694-5.695 ppm). 이 결과를 통하여 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 분자량 증가는 락토페린에 부착된 글리시리진에 의한 것임을 알 수 있었다.
1-4. 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 흡광도 확인
글리시리진, 락토페린 및 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:4, 1:10 및 1:15)에 대하여 자외선-가시 분광광도계(UV-visible spectroscopy)로 파장별 흡광도를 측정하였다. 구체적으로, 이미 분자량을 알고 있는 물질을 사용하여 농도(100 μM, 50 μM, 25 μM 및 12.5 μM)에 따른 흡광도를 측정하여 값의 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 글리시리진은 256-257 ㎚, 락토페린은 198-203 ㎚에서 흡광도가 측정되었고, 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(Lf-GL; 1:4, 1:10, 1:15)는 256 ㎚ 및 197-202 ㎚ 모두에서 흡광도가 측정되었으며, 농도가 낮아짐에 따라 흡광도의 값 또한 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 농도가 동일한 경우 글리시리진의 비율이 높을수록 256 ㎚ 파장대에서 높은 흡광도 값을 가지는 것을 알 수 있었다.
실시예 2: 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 세포 독성 확인
2-1. Caco -2 세포에 대한 세포 독성(cell cytotoxicity ) 확인
락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:4, 1:10, 1:15)는 경구 투여 후 소장에서 흡수되므로 소장 내피세포에 대하여 세포 독성을 나타내는지 확인하였다.
세포 배양용 96 웰 플레이트(well plate)에 1x104 세포/웰 농도로 Caco-2 세포를 시딩(seeding)하여 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 세 가지 비율(1:4, 1:10 및 1:15)의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 각각 0(대조군), 50, 100, 150 및 200 ㎍/㎖ 농도로 24시간 동안 처리하였다. 이때 대조군은 배양 24시간 동안 세포 증식에 의한 효과를 확인할 수 있도록 약물을 처리하지 않고 각각 0시간, 24시간 배양한 두 개 그룹을 설정하였다. 24시간 동안 배양한 것은 Caco-2 세포의 배가 시간(doubling time)이 62시간이므로 세포 주기가 한 사이클을 수행하기 전의 시간 동안 실험을 수행하여 세포 증식 효과가 아닌 락토페린-글리시리진의 세포 독성 자체만을 확인하기 위함이다. 24시간 후 배지를 교체하고, CCK-8 약물을 처리하여 450 ㎚에서 OD 값을 측정하고, 대조군 대비 세포 독성을 계산하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 1:15 비율로 결합된 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 세포 생존율이 유의하게 감소하는 것을 알 수 있었다. 그러나 OD 값이 대조군(control) 0h의 OD 값과 대조군 24h의 OD 값 사이에 위치하는 것으로 보아, 상기 세포 생존율 감소는 세포 독성 효과가 아니라 세포 증식 억제로 인한 것으로 판단된다.
2-2. 인간 제대정맥 세포( HUVEC )에 대한 세포 독성 확인
락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:4, 1:10, 1:15)가 혈관 내피세포에 독성을 갖는지 확인하였다. 세포 배양용 96 웰 플레이트에 1x104 세포/웰 농도로 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)을 시딩하여 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 실시예 2-1과 동일한 조건으로 세포에 25, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 농도의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 각각 처리하고, 흡광도를 측정하여 세포 독성 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 1:10 비율의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트 200 ㎍/㎖, 1:15 비율의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 100 또는 200 ㎍/㎖ 처리한 경우 세포 독성이 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 1:10 비율인 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 200 ㎍/㎖ 처리한 경우의 OD 값이 대조군(control) 0h의 OD 값과 유사한 것으로 보아, 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트가 HUVEC의 증식을 억제할 수 있고, 결과적으로 신생혈관 억제가 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 특성 확인
3-1. 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트와 HMGB1의 친화도 확인
합성된 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트는 HMGM1(high-mobility group box-1)을 포획하여 암세포의 혈관신생을 억제할 것으로 예상된다. 따라서 비아코어 표면 플라스몬 공명 시스템(biacore surface plasmon resonance system)으로 HMGB1과 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 친화도(affinity)를 확인하였다.
HMGB1 단백질을 칩에 고정시키고, HMGB1 항체, 글리시리진, 락토페린 및 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트와 반응시킨 후 분석하였다. HMGB1 단백질과 결합하는 것으로 알려진 HMGB1 항체와 글리시리진을 대조군으로 사용하여 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 친화도와 비교하였다.
그 결과, 도 7 및 표 2에 나타난 바와 같이 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 KD(dissociation constant) 값이 글리시리진의 KD 값보다 낮은 것을 확인할 수 있었으며, 이는 글리시리진과 비교하여 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 HMGB1에 대한 친화도가 우수한 것을 의미한다.
또한, 락토페린의 경우 HMGB1에 친화도를 나타내는 것을 새롭게 확인할 수 있었으며, HMGB1에 대한 글리시리진의 친화도와 락토페린 친화도의 시너지 효과로 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 친화도 값이 향상된 것으로 추정된다(친화도: 1:10 > 1:15 > 락토페린 > 1:4).
Figure pat00002
3-2. 강산/단백질 가수분해 효소에 대한 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 안정성 확인
락토페린-글리시리진 컨쥬게이트는 경구 투여로 체내에 들어와서 흡수된 후 뇌의 암 발병 부위로 전달된다. 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트가 소장에 도달하는 과정 중 위에서 산성 pH 환경과 단백질 분해효소 등을 만나게 되므로 이러한 환경에 대한 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 안정성을 평가하였다.
먼저, 10 mM의 염산에 최종 농도가 0.5 ㎎/㎖이 되도록 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 용해시키고, 용액의 pH는 3.2 정도가 되도록 조정하였다. 상기 용액에 최종 농도가 20 ng/㎖이 되도록 펩신(pepsin)을 첨가하고, 서로 다른 시간(0, 10, 20, 30, 60, 120 및 240분) 동안 반응시켰다. 해당 시간이 경과하면 염기성 용액을 첨가하여 반응을 종료시키고, 반응이 종료된 샘플은 50℃에서 5분 동안 끓여준 뒤 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 펩신과의 반응 시간이 길어짐에 따라 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트 밴드는 서서히 흐려지고, 끌리는 양상을 나타내나 반응 2시간이 경과한 후에도 밴드가 존재하는 것을 알 수 있었다. 또한, 펩신과 2시간 반응시킨 경우 1:4 비율보다 1:10 및 1:15 비율의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트에서 더욱 선명한 밴드가 남아있는 것을 확인할 수 있었다. 상기 실험 결과는 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트가 산성 환경 및 단백질 분해효소의 작용을 일정 수준 견딜 수 있음을 의미한다.
실시예 4: 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 효과 확인
4-1. 뇌종양 세포 생장 억제 효과 확인
세포 배양용 96 웰 플레이트에 5x103 세포/웰 농도로 교모세포종 세포주인 U87MG를 시딩한 후 세포가 바닥에 부착하도록 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 실시예 2-1과 동일한 방법으로 세포에 50, 100, 150 및 200 ㎍/㎖ 농도의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 각각 처리하고, 흡광도를 측정하여 세포 증식 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 1:10 비율의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 처리한 경우 세포 생장 억제 효과가 가장 우수하고, 1:15 비율의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 처리한 경우에도 처리 농도가 증가할수록 세포 생장 억제 효과가 현저하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
4-2. 교모세포종 스페로이드의 생장 억제 효과 확인
고형암인 교모세포종(glioblastom; 이하, GBM으로 기재함)은 구 형태로 존재하므로 GBM 스페로이드(spheroid)에 대한 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 효과를 확인하였다.
3D 세포 배양 접시에 U87MG 세포 5x103 개를 시딩하여 배양하고, GBM 스페로이드의 지름이 100 ㎛가 되면 1% 아가로스 젤로 코팅한 24 웰 플레이트에 스페로이드를 이동시켰다. 이후 1:4, 1:10 및 1:15 비율의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고, 2일 마다 배지를 교체하면서 GBM 스페로이드를 6일 동안 배양하여 관찰하였다. GBM 스페로이드의 부피는 3.14x장축x단축2/6의 식에 따라 산출하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 대조군과 비교하여 배양 5일차부터 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 처리한 실험군에서 스페로이드 생장이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
4-3. GBM 스페로이드의 생장 억제 원인 확인
락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 GBM 스페로이드 생장 억제 효과가 세포 독성이 아닌 세포 증식 억제로 인한 것인지 확인하기 위하여 라이브/데드 세포 생존율 실험(live/dead cell viability assay)을 수행하였다.
GBM 스페로이드를 배양한 후 배지를 제거하고, D-PBS로 2회 세척하였다. GBM 스페로이드에 일반 D-PBS와 염색약이 첨가된 D-PBS를 3:1로 혼합하여 처리하였다. 염색약이 첨가된 D-PBS는 D-PBS 4 ㎖, 칼세인(calcein) 1 ㎕ 및 이티디움 호모다이머(ethidium homodimer) 2 ㎕를 혼합하여 제조하였다. 이후, 30분 동안 반응시키고, 형광 현미경으로 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 모든 GBM 스페로이드에서 사멸 신호를 나타내는 붉은색 형광 신호를 확인할 수 없었다. 따라서, 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 GBM 스페로이드 생장 억제 효과는 세포 독성이 아니라 세포 증식 억제에 의한 효과임을 알 수 있었다.
실시예 5: 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 경구 흡수 여부 확인
경구 흡수형 제제가 체내로 흡수되기 위해서는 소장에서 세포막을 지나 혈중으로 운반되어야 한다. 이를 확인하기 위하여 락토페린이 결합할 수 있는 수용체인 LRP(LDL related protein receptor)를 발현하는 Caco-2 세포를 이용하였다.
24 웰 인서트(polyester membrane) 플레이트에 Caco-2 세포를 2×104 세포/인서트 농도로 시딩한 후, 소장 내피세포에서 발현되는 밀착 결합(tight junction)이 충분히 형성되도록 28일 동안 세포를 배양하였다. 세포에 밀착 결합을 형성시키는 것은 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트가 세포 사이 공간을 통과하는 수동 흡수(passive uptake)가 아니라, LRP와 결합하여 흡수되는 것을 확인하기 위해서이다. 28일 이후 인서트에 Caco-2 세포 단일층이 충분히 형성되면 상피세포(epithelial cell)의 저항 변화를 미세하게 측정할 수 있는 TEER(trans epithelial electrical resistance) 장비로 저항값을 측정하고, 저항값이 900 Ω/㎠ 이상이 되면 다음 실험을 진행하였다. 저항값을 확인한 후 인서트의 Caco-2 세포 단일층에 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(200 ㎍/㎖)를 처리하고, 저항값을 측정하여 락토페린-글리시리진이 LRP와의 결합을 통한 트랜스사이토시스(transcytosis)로 인서트의 반대면으로 이동하는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 12의 B에 나타난 바와 같이 Caco-2 세포 단일층에 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 처리한 경우, 처리 15분만에 TEER이 약 11% 이상 감소하고, 1:15>1:10 >1:4 순으로 락토페린-글리시리진의 투과율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. TEER의 감소는 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트가 Caco-2 세포 단일층을 투과하여 이동하므로 플레이트 내부의 인서트를 경계로 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트의 농도 차이가 감소한 것을 의미한다.
상기 결과를 통하여 락토페린과 글리시리진을 결합시킨 경우 락토페린에 의한 수용체-매개 트랜스사이토시스(receptor-mediated transcytosis)에 영향이 없는 것을 알 수 있었다.
지금까지의 실험 결과를 종합하면, 1:10 비율의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트가 가장 우수한 효과를 갖는 것으로 판단되므로, 이후 실험은 1:10 비율의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트로 진행하였다. 다른 비율로 접합된 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트와 혼동을 피하기 위하여 이후에서는 1:10 비율의 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트를 '락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10)'으로 기재한다.
실시예 6: 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10)의 혈관 신생 억제 효과 확인
5 내지 7 주령의 수컷 SD 랫트(rat)를 개복한 후 척추 바로 옆에 붙어있는 복대동맥을 분리하고, HBSS 버퍼와 PBS에 담근 상태에서 복대동맥에 붙어있는 주변 조직들을 제거하였다. 분리한 복대동맥을 1 내지 1.5 ㎜ 두께의 링(ring) 형태가 되도록 자르고, 매트리겔(matri gel)로 코팅된 48 웰 플레이트에 시딩하였다. 대동맥 링을 매트리겔로 다시 덮어 고정시키고, 그 위에 세포 배양 배지를 처리하였다. 음성 대조군은 결핍 (starvation) 상태를 만들어야 하므로 배지에 1% 페니실린-스트렙토마이신과 2% FBS를 처리하고, 양성 대조군은 VEGF(vascular endothelial growth factor)를 25 ng/㎖ 농도가 되도록 추가로 처리하였다. 실험군은 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10)를 각각 100, 200 및 400 ㎍/㎖ 농도로 처리하고, 락토페린과 글리시리진은 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10) 200 ㎍/㎖에 상응하는 농도(equivalent concentration)로 처리하였다. 복대동맥 링에서 혈관 신생(sprouting)이 충분히 일어나도록 2주 정도 관찰하고, 2일마다 배지를 교체하였다.
그 결과, 도 13의 A 내지 C에 나타난 바와 같이 복대동맥 링에 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10)(Lf-GL comp.)를 처리한 경우 모든 처리 농도에서 현저히 우수한 혈관 신생 억제 효과를 보였으며, 특히 200 ㎍/㎖ 농도부터 혈관이 퇴행(regression)되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 뇌종양 동물모델에서 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10)의 효과 확인
7-1. 뇌종양 동물모델 확립
면역체계가 존재하지 않는 누드 balb/c 마우스에 교모세포종 세포주인 U87MG 세포를 주입하여 뇌종양 동물모델을 제작하였다.
구체적으로, 세포 배양 접시에서 U87MG 세포를 70% 내지 80% 정도까지 배양한 후 회수하여 튜브에 보관하고, 마우스 한 마리당 1×106/8 ㎕/N의 세포가 필요하므로 계산된 부피의 차가운 PBS로 세포 펠렛을 풀어주었다. 세포는 아이스에 보관한 후, 호흡 마취기와 산소, 질소압이 적정 수준으로 유지되도록 스테레오택식 장치(stereotaxic instrument, 뇌고정장치)의 설정을 조정하였다. 케이지에서 호흡 마취시킨 마우스를 두개골이 흔들리지 않도록 스테레오택식 장치에 고정시키고, 수술을 진행하는 동안 지속적으로 마취 상태가 유지되어야 하므로 호흡 마취기는 계속 작동되도록 하였다. 마우스의 두피를 머리와 귀 중앙에서부터 1 ㎝ 앞 정도로 길게 절개하고, 두개골을 덮는 얇은 보호막을 핀셋으로 찢은 후 마른 면봉으로 밀어내어 두개골이 마른상태가 되도록 하였다. 두개골이 마르면 두개골 중심인 브레그마(bragma)가 보이게 된다. 주사기를 기기에 고정시킨 후, 바늘 끝이 브레그마의 정중앙에 오도록 니들 위치를 고정시켰다. 암세포가 뇌 우측 반구의 중앙에 시딩되는 것이 암이 잘 생성되므로 브레그마를 기준으로 우측, 하측 각 2 ㎜의 위치를 펜으로 표시한 후, 이곳에 바늘 끝이 위치하도록 다시 조정하였다. 이후, 주사기를 최대한 위로 올리고, 의학용 드릴로 두개골에만 구멍이 나도록 표시한 곳을 뚫어주었다. 주사기에 PBS를 5 ㎕ 넣고, 뇌의 3 ㎜ 정도 깊이에 주입하여 나중에 세포가 주입될 공간을 확보하였다. 바늘을 빼고 지혈한 후, 주사기에 세포가 현탁된 PBS 5 ㎕를 넣어 천천히 시딩하였다. 이후, 구멍난 두개골을 의학용 왁스로 덮고, 두피를 봉합하였다.
7-2. 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10)의 뇌 전달 유무 확인
상기 실시예 7-1에서 제작한 뇌종양 동물모델에 3주 동안 2일 간격으로 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10)(60 ㎎/㎏), 이에 상응하는 농도의 락토페린과 글리시리진을 각각 경구투여하였다. 3주 후 쥐를 희생시켜 뇌를 분리하고, 파라핀으로 고정하여 뇌 조직 절편을 제작하였다. 상기 뇌 조직 절편과 락토페린 항체를 반응시켜 뇌 조직 내에 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10)의 존재 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 14의 A 및 B에 나타난 바와 같이 락토페린 투여군 또는 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10) 투여군(Lf-GL complex)에서 적색 신호(락토페린 항체)를 확인할 수 있었고, 대조군 및 글리시리진 투여군에서는 적색 신호를 확인할 수 없었다. 또한, 락토페린 투여군보다 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10) 투여군에서 적색 신호의 세기가 더 강한 것을 알 수 있었으며, 이는 락토페린과 글리시리진의 결합에 의하여 반감기가 증가하고, LRP와 락토페린의 결합을 통한 뇌 전달에 대한 효과라고 판단된다.
7-3. 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10)의 뇌종양 증식 억제 효과 확인
상기 실시예 7-2에서 제작한 뇌 조직 절편에 증식된 혈관을 염색하는 지표인 CD34 항체를 처리하여 실험군에 따른 혈관 형성 억제 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 15의 A 및 B에 나타난 바와 같이 대조군, 락토페린 투여군 및 글리시리진 투여군과 비교하여 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(1:10) 투여군(Lf-GL complex)에서 가장 낮은 녹색 신호가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트가 뇌 혈관 신생을 억제하여 뇌종양 증식을 효과적으로 저해할 수 있음을 의미한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

  1. 공유결합으로 연결된 락토페린-글리시리진 컨쥬게이트(lactoferrin-glycyrrhizin conjugate).
  2. 제1항에 있어서, 상기 글리시리진은 산화된(oxidized) 형태인 것인 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 공유결합은 아마이드 결합(amide bond), 카보닐 결합(carbonyl bond), 에스터 결합(ester bond), 황화 에스터 결합(thioester bond) 및 설폰 아마이드 결합(sulfonamide bond)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 컨쥬게이트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 락토페린과 글리시리진의 결합비가 1:2 내지 1:20인 것인 컨쥬게이트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 경구 투여용인 것인 컨쥬게이트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트를 유효성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 종양은 뇌종양인 것인 약학적 조성물.
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