KR950007232B1

KR950007232B1 - 글리시리진을 유효성분으로 하는 암세포 분화 유도제

Info

Publication number: KR950007232B1
Application number: KR1019920007240A
Authority: KR
Inventors: 김규원; 정해영; 이호영; 이승기
Original assignee: 김규원; 정해영; 이승기; 정원근
Priority date: 1992-04-29
Filing date: 1992-04-29
Publication date: 1995-07-07
Also published as: KR930021211A

Abstract

내용 없음.

Description

글리시리진을 유효성분으로 하는 암세포 분화 유도제

제1도는 F9 세포가 분화된 상태를 보여주는 사진으로서, (a)는 레티노 인산을 처리한 경우, (b)는 글리시리진으로 처리한 경우.

제2도는 분화후 라미닌 B1 유전자의 발현을 분석한 전기영동 사진.

제3도는 분화후 베타-액틴 유전자의 발현을 분석한 전기영동 사진.

본 발명은 글리시리진을 유효성분으로 함유하는 암세포 분화유도제에 관한 것이다.

우리나라 사람의 질병에 의한 사망율의 상위를 차지하는 암은 그 예방 혹은 치료방법의 개발을 위해 국내외에서 대규모로 연구가 진행되고 있으며, 많은 항암제가 개발되어 임상에 사용되고 있다. 핵산합성을 저해하는 작용기작을 갖는 대부분의 항암제는 종양세포외에도 정상세포를 상해하는 경우가 많으며, 부작용을 경감시키기 위해 그 유도체들이 개발되었다.

종래의 항암제중에서 시스플라틴이나 카보플라스틴등 백조착화합물들은 난소암, 고환종양, 방광암, 신장암, 전립선암등의 난치성 고형암에 치료효과를 나타내지만, 신독성, 오심, 구토, 시각독성을 나타낸다. 메토트렉세이트, 아미놉테린, 렌코보림등의 엽산 길항제와 ; 5-불화 유라실, 5-불화-2-데옥시-유리딘, 테가풀등 피리미딘 길항제 ; 아라-C, 사이클로 시티딘등 아라비노당화 시토신 ; 6-머캅토 퓨린, 티오이노신등 퓨린 길항제등은 핵산합성에 필수적인 대사물질의 합성이나 이용을 저해시켜 세포주기 S기에 유효하다. 이들은 독성은 비교적 약한 편이지만, 주된 부작용은 설사를 일으킨다. 아드리아마이신, 다우노마이신, 블레오마이신, 마이토마이신, 악티노마이신 D등의 항생물질은 유방암, 육종등의 고형암 뿐만 아니라 조혈기종양에도 효과가 있으나, 골수억제, 탈모, 신장독성을 나타낸다.

에스트로젠 수용체에 친화성을 나타내고, 에스트로젠과 길항하는 삼페닐화 에틸렌 화합물 등 非스테로이드성 항에스트로젠제제들은 남성화, 여성화, 쿠싱(Cushing) 징후군, 부신부전등의 부작용을 초래한다. 종양에 대한 숙주의 면역증감, 조절, 회복등 생물학적 반응성을 조절하는 생물학적 반응조절제(biological response modifier ; BRM)들은 인터페론, 종양억제인자, 흉선호르몬, 사이토카인, 단일클론항체, 효과(effector) 세포등이 알려져 있으나, 암치료에 대한 유효성에 대해서는 의문이 많다.

여러가지 측면에서 검토해볼 때 많은 종류의 암들이 세포가 비정상적으로 분화되어 일어나는 질병이므로, 이러한 관점에서 연구한 아이삭과 두뤼베에 의하면, 레티노인산(retinoic acid : 이후 RA로 약함)은 상피조직의 정상적인 분화에 필수적이며(Isaac & Duruibe, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1354, 116-123, 1986), 전이성의 악성종양 세포에 대한 실험에서 세포의 증식을 억제시켰고, 나아가서 양성종양으로 성질을 변화시켰다(Strickland, Cancer Res., 24, 277-8, 1981) 따라서 암세포를 죽이는 것보다는 암세포의 악성형질을 정상으로 전환시키는 인자(분화 유도체)를 개발하는 연구결과에 따라, 레티노이드, 헥사메틸렌 비스아세타마이드(HMBA), 비타민 D등을 개발하였으나, 그 독성은 상당히 강하다.

본 발명자들은 글리시리진을 처리한 F9 세포가 분화된다는 사실로부터 글리시리진이 분화 유도체로서의 기능을 갖고 있음을 발견하였고, 분자레벨에서 라미닌 B1 유전자의 발현을 관찰하여 글리시리진의 분화효과를 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명하는데, 우선 이들 실험방법을 선택하는 이유는 다음과 같다.

태생기암(embryonal carcinoma) 세포들은 주변환경에 따라 암세포로 발전하거나 정상세포로 분화되는데, 배양중 자발적으로 분화를 일으키지 않는, 다시 말해서 안정한 세포주로 F9 세포가 있다(Grover and Adamson, Dev. Biol. 114, 492-503, 1986). 이 세포는 ATCC CRL 1970으로 기탁되어 있어, 구입하여 사용할 수 있다. 호슬러의 실험결과에 따르면(Hosier et al., Mol. Cell Biol. 9, 5623-9, 1989), 이 F9세포는 분화인자인 RA에 의하여 원내배엽으로 분화되며, 조건에 따라 내장 내배엽(visceral endoderm) 또는 벽측 내배엽(parietal endoderm)등으로 분화가 더욱 진행될 수 있다. 이 과정중에 라미닌, 타입4 콜라겐, 베타-레티노인산 수용체, 플라스미노젠 활성화인자, H-2 항원, 성장인자 수용체등 단백질의 합성이 현저하게 증가되며, c-myc등의 발암유전자(oncogene)들의 발현도 변화한다. 이러한 분화과정에서 F9 세포는 형태학적으로 변화하는데, 그 변화는 비가역적이다.

세포외기질(extracellular matrix ; ECM)은 세포 표면에 위치하여 다양한 수용체들의 이성체와 반응하는 단백질들의 집합체로써, 세포들의 움직임을 통합하여 조직으로의 기능을 나타내도록 조절한다. 정상적으로 분화된 조직에서는 그 대사가 안정하고 전환속도도 아주 느리다. 그러나 병적인 상태, 상처의 치유과정, 악성암에서 관찰되는 조직침투나 전이과정에서는 세포외기질내 단백질의 분해현상이 신속하고 광범위하게 일어나며, 발생단계의 형태 형성과정에서도 다양한 변화가 일어난다(Watt, TIBS, 482-5, 1986). 세포외기질 구성성분으로 코팅한 조직배양 용기에서 세포를 배양하면, 이들 세포는 생체내(in vivo) 표현형을 모방하게 되며, 이로써 세포외기질이 여러 종류의 세포분화에 관여함을 추정할 수 있다(Grant et al. Cell, 58, 933-43, 1989). 세포외기질의 표면 수용체를 경유하여 전달되는 신호는 세포외기질과 세포외기질 수용체와의 상호작용에 의해 관련 유전자의 합성, 유전자의 발현, 세포의 이동, 분화등 다양한 범위의 세포작용을 초래하며, 다른 세포들에도 영향을 미칠 수 있다(Mecham et al. J. Biol. Chem., 264, 16652-7, 1989).

세포외기질 구성성분중 주요성분인 라미닌은 당단백질로써, 모든 상피세포의 기저막에 배열되어 있고, 발생초기에 가장 많이 발현된다. 그리고 세포의 부착, 세포이동, 분화, 신경세포의 외적 성장, 암의 전이등 다양한 생물학적 활성에도 관여하는데, 혈관의 형성과정시에는 새로운 모세혈관의 말단에서 최초로 나타나며, 근육, 말단신경, 지방세포들을 둘러싸고 있다(Mafune et at., Cancer Res., 50, 3888-91, 1990).

레티노인산 수용체(retinoic acid recepter ; 이하 RAR로 약함)는 스테로이드호르몬, 타이로이드호르몬, 비타민 D3의 수용체와 구조적인 유사성이 매우 높으며, 이로써 이들 수용체의 작용기작은 유사할 것으로 블롬호프등은 추정하였다(Blomhoff et al., Science, 250, 399-403, 1990).

한편 세포내에서 유전자 발현의 정도를 확인하기 위하여, 세포골격 단백질의 하나인 베타-액틴을 선택하였다.

F9 세포 ATCC CRL 1970은 ATCC에서, 제한효소는 프로메가사로부터, 니트로셀룰로스 여과지는 아머샴사로부터, 동위원소인 [α-³²P]-dCTP는 뉴잉글란드사로부터, 실험에 사용한 다른 시약은 시그마사로부터 구입하였다.

감초(Glycyrrhizae uralensis)로부터 글리시리진을 정제하는 방법

감초를 세절하여 메탄올로 3회 추출하고 농축한 뒤, 물로 포화된 노르말-부탄올 용매에 녹이고, 여과하여 잔류물을 제거하였다. 노르말-부탄올 가용부를 감압 농축하고 소량의 메탄올에 현탁시기고, 에테르를 가하여 가용부를 제거하고 잔류물을 취하였다. 이를 메탄올로서 활성탄-셀라이트 컬럼을 통과하여 사포닌 혼합물을 얻었다.

사포닌 혼합물은 실리카 컬럼 크로마토그라피에서 클로로포름-메탄올-물(65 : 35 : 10) 혼합용매로 분리한뒤, 클로로포름-메탄올-물(7 : 5 : 0.5) 혼합용매로 재차 분리하였다. 정제된 글리시리진은 메탄올로 수차 재결정 하였다.

표준품 글리시리진(미노파겐 제약회사, 일본)과 분리한 검체를 4N 염산으로 처리하고 30분간 가열하여 산가수분해하고, 얻어지는 글리시레틴산(glycyrrhetinic acid)를 HPLC를 사용하여 정량한 뒤 글리시리진의 양으로 환산하였다(최등, Kor J. Pharmacogn., 20, 227-32, 1989) HPLC는 워터스사의 모델 244이며, 컬럼은 마이크로-본다팍 C18(내경 3.9mm×길이 30cm), 검출은 자외선 254mm 검출기를, 이동상으로는 메탄올 : 물 : 초산(78 : 19 : 3v/v)을 사용하였다. 정량은 글리시리진 표준품으로 미리 작성한 검량곡선을 이용하였다.

글리시리진은 물, 초산, 메탄올, 에탄올, 디메틸설폭사이드(DMSO)에 잘 녹으며, 에테르에는 녹지 않았다. 용매의 세포독성실험은 용매의 최종농도를 0.1%로 하여 염료배제법(Freshney ed., Animal Cell Culture, pp. 183-215, IRL Press, Oxford, 1986)을 이용하여 생활성 실험(viability test)을 실시하였을 때, 초산은 독성을 나타내었고, DMSO는 분화를 유도하였다. 따라서 글리시리진의 용매로는 물과 에탄올이 적합하였다.

세포분화를 관찰하기 위해서는, 둘베코가 변형한 이글배양액(Dulbecco's modified Eagle's Medium : DMEM)과 10%의 송아지 혈청과 항생제를 첨가한 배양액에서 배양한 F9 세포에 5×10^-4M 디부티릴 환상 아데노신일인산(AMP), 2.5×10^-4M 테오필린에 트랜스-레티노인산을 에탄올에 10^-3M로 녹인 후 1×10^-6M 되도록 첨가하였다. 배양배지는 매 3일마다 교환하며, 그때마다 동일 농도의 분화유도제를 첨가하여 8일간 배양한 뒤, 위상차 현미경으로 형태변화를 관찰하였다(Wang et al., Dev. Biol. 107, 75-86, 1985).

상기 조건에서 글리시리진의 농도를 1×10^-4M부터 증가시켰을 때 분화유도효과도 비례적으로 증가되었고, 1×10^-3M에서도 독성을 나타내지 않았다.

본 발명에 따른 암세포 분화유도제는 글리시리진을 1×10^-4M∼1×10^-2M의 농도로 함유한다.

본 발명에 따른 글리시리진을 함유하는 암세포 분화유도제는 항암의 목적으로 경구투여 또는 정맥주사의 방법으로 투여될 수 있으며, 투여량은 글리시리진으로 환산하여, 경구투여의 경우 100~1,000mg/kg.1일, 바람직하게는 300∼600mg/kg.1일이고, 정맥주사의 경우 10∼500mg/kg.1일, 바람직하게는 100~200mg/kg.1일이다.

본 발명에 따른 글리시리진을 함유하는 암세포 분화유도제는 제약학적으로 허용되는 통상의 담체를 함유하며, 나아가 통상의 제제화 방법으로 각종 제형, 예를 들면 정제, 연질캡슐, 경질캡슐 등의 경구용 제형, 연고제 같은 외약용 약 또는 주사제 같은 비경구용 약으로 제제화할 수 있다.

본 발명에 사용하는 탐침은 다음과 같이 제조하였다.

라미닌 B1, 베타-액틴의 cDNA를 대장균 HB101에 형질전환시키고, 앰피실린을 포함하는 엘비(LB)배지에서 배양한 뒤, 알칼리 분해법(Birnboim & Doly, Nucleic acids Res., 7, 1513-23, 1979)으로 플라스미드를 분리하였다. 플라스미드를 적당한 제한효소로 절단하여, 예를 들어 464bp인 라미닌 B1은 Eco RI으로, 600bp인 베타-액틴은 Pst I으로 절단하여, 각 유전자 조각을 얻었다.

1% 아가로스(low melting point) 젤에서 얻어진 유전자 조각을 100도씨에서 7분간 끓이고, 화인버그와 보겔스타인의 방법(Feinberg & Vogelstein, Anal. Biochem., 137, 255-67, 1084)에 따라 [α-³²P]-dCTP를 첨가해 라벨링한뒤, 20mM 소금, 20mM 트리스 염산(pH 7.5), 2mM EDTA, 0 2% 도데실 황산나트륨(pH 7.5)를 첨가하여 반응을 종결시키고, 라벨되지 않은 동위원소는 바이오래드 P60 컬럼으로 제거하였다.

이하 본 발명을 실시예로서 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명이 실시예로서 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

분말상태의 둘베코가 변형한 이글배양액(Dulbecco's modified Eagle's Medium : DMEM)을 물에 녹인 후 탄산나트륨들 첨가하여 pH를 7.0에서 7.2로 조정하고 밀리포어 여과지로 여과하여, 0.3% 젤라틴으로 2시간 이상 표면처리한 배양플라스크에 옮긴 뒤, 10%의 송아지 혈청과 항생제를 첨가한 배양액을 사용하여 F9 세포를 탄산가스를 5%로 유지하는 37도씨 배양기에서 배양하였다. T75 배양플라스크로 계대하여 하루동안 배양한 뒤, 2.5×10^-4M 글리시리진, 5×10^-4M 디부티릴 환상 아데노신일인산(AMP), 2.5×10^-4M 테오필린을 함께 처리하여 분화를 유도하였다. 대조군으로 글리시리진 대신에 대표적인 암세포 분화인자로 알려진 트랜스-레티노인산을 에탄올에 10^-3M로 녹인 후 1×10^-6M 되도록 첨가하였다. 배양배지는 매 3일마다 교환하며, 그때마다 동일 농도의 분화유도제를 첨가하여 8일간 배양한 뒤, 형태변화를 위상차 현미경으로 관찰하였다.

그 결과는 제1도와 같다.

미처리 F9 세포는 세포들의 간격없이 빽빽하게 자랐으나, 글리시리진으로 분화시킨 배양(제1(b)도)의 경우에는 세포모양이 등글게 변하고 세포간격이 넓어졌으며, 이는 대표적인 분화인자인 레티노인산으로 처리한 제1(a)도의 대조군의 경우와 일치하였다.

[실시예 2]

실시예 1에서 얻은 분화된 F9 세포를 모은 후 산-구아니디늄-페놀-클로로포름 추출방법(Chomzcynski & Sacchi, Anal. Biochem , 162, 156-9, 1987)으로 총 RNA를 분리하고, 30마이크로그램의 RNA를 1% 아가로스-포름알데히드 젤상에서 전기영동한 뒤, 니트로셀룰로스 여과지로 옮겨 자외선으로 3분간 고정하였다. 방사능으로 표지된 라미닌 B1 탐침과 노던반응(Northern blot analysis)시켰을 때, 글리시리진과 레티노이산-처리대조군은 모두 라미닌 유전자의 발현은 증가되었으며, 발현정도는 대조군이 더욱 높았다. 결과는 제2도에 나타내었다. 제2도에서, 레인 1은 F9 간세포(stem cell), 레인 2는 레티노인산으로 처리한 F9 세포 및 레인 3은 글리시리진을 처리한 F9 세포이다.

[실시예 3]

실시예 1에서와 같은 방법으로 베타-액틴에 의한 발현정도를 비교하였을 때, 분화하지 않은 세포와 분화된 세포들에서 모두 동일한 발현을 나타냈다. 이로써 세포내 유전자 발현정도가 정상임을 확인하였다. 결과는 제3도에서 나타내었다. 제3도에서, 레인 1은 F9 간세포, 레인 2는 레티노인산으로 처리한 F9 세포 및 레인 3은 글리시리진을 처리한 F9 세포이다.

이상으로 감초에서 추출한 글리시리진은 F9 세포를 현미경 관찰시 벽측 내배엽 세포형태로 분화시켰으며, 라미닌 유전자들의 발현도 촉진되어 분자레벨에서도 분화를 증명하였다.

Claims

글리시리진을 유효성분으로 함유하는 암세포 분화유도제.
제1항에 있어서, 글리시리진을 1×10^-4M 내지 1×10^-2M의 농도로 함유함을 특징으로 하는 암세포 분화유도제.
제1항에 있어서, 글리시리진의 용매로서 물 또는 에탄올을 함유하는 것을 특징으로 하는 암세포 분화유도제.