CN111333686B - 黄芩苷衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体说涉及黄芩苷衍生物及其制备方法和应用。该黄芩苷衍生物的分子式为：C31H29NO12，其针对肺癌、肝癌、乳腺癌的抗肿瘤活性均比黄芩苷有显著提高，该两种黄芩苷衍生物的制备以及纯化路线符合绿色化学特点，无污染，衍生物产率高。

Description

黄芩苷衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体说涉及黄芩苷衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
中药黄芩为唇形科草本植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，性寒，味苦，归肺、胆、胃、大肠等，是一味常用的传统中药，最早记载于《神农本草经》，并将其归为上品类植物药，具有清上焦湿热，凉血安胎，解毒等功效。中医临床常用于温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎动不安、高血压、痈肿疖疮等症。
黄芩苷(BA)作为黄芩中含量最高的主要有效成分，具有广泛的生物活性，如抑菌抗炎、清热解毒、螫合金属离子、镇静、降压、神经保护作用、抗变态反应、清除超氧阴离子自由基等药理作用，而且还具有很好的抗肿瘤作用。大量的研究表明黄芩苷口服给药后被肠道菌丛水解作用生成苷元黄芩素，从而被吸收；但大鼠口服给予黄芩素后，血中几乎检测不到黄芩素的原形，而迅速出现黄芩素7位羟基葡萄糖醛酸结合物-黄芩苷。由此可见黄芩苷在体内存在着广泛的生物转化。但是黄芩苷酯水分配系数低，机体不容易吸收，在体内容易被酶代谢，抗肿瘤活性较低是制约其作为新型抗肿瘤药物应用的主要因素，为了进一步提高黄芩苷的药理活性，通过绿色化学所合成黄芩苷的新型衍生物具有非常重要的临床意义和科学价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对肺癌、肝癌、乳腺癌的抗肿瘤活性优于黄芩苷的黄芩苷衍生物。
本发明的另一个目的是提供该黄芩苷衍生物的制备方法和应用。
本发明所述黄芩苷衍生物BAD，分子式为：C31H29NO12，结构式为：
Figure GDA0003933724220000021
本发明所述黄芩苷衍生物BAD的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、按黄芩苷︰1-羟基苯并三氮唑︰1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐︰D-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐＝0.2～0.8︰0.3～0.9︰0.6～1.2︰1.2～1.8的摩尔比秤取该四种物质，将黄芩苷、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐放入容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.2～3mmol/ml的溶液，将该溶液在20～30℃下搅拌4～8h得溶液M。
步骤二、将D-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐用N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.6～1.8mmol/ml的溶液N，用三乙胺调节溶液N的PH值至6.5～7.5，将溶液N加入溶液M中，并在8～12分钟内升温至45～55℃进行合成反应，自加入溶液N时开始计时，合成反应进行至45～53小时时终止合成反应，得反应液G。
步骤三、向反应液G中加入二氯甲烷，反应液G与二氯甲烷的体积比为1︰4～6，然后加入PH＝2.5～3.5的盐酸溶液洗2～3次，再加入pH＝7.8～8.8的碳酸氢钠溶液洗2～3次，最后用pH＝2.5～3.5的盐酸溶液还原，取二氯甲烷层和水层中间的黄色沉淀，离心水洗，过滤，25～35℃干燥得黄芩苷衍生物BAD粗品。
步骤四、将黄芩苷衍生物BAD粗品用N,N-二甲基甲酰胺溶解，采用薄层分离技术分离提纯，用乙醇洗脱，离心，上清液旋转蒸发挥干，得黄芩苷衍生物BAD纯品，纯度大于95％。
本发明所述的黄芩苷衍生物BAD在制备治疗肺癌、肝癌、乳腺癌药物中的应用。
本发明所述黄芩苷衍生物BAL，分子式为：C31H29NO12，结构式为：
Figure GDA0003933724220000031
本发明所述黄芩苷衍生物BAL的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、按黄芩苷︰1-羟基苯并三氮唑︰1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐︰L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐＝0.2～0.8︰0.3～0.9︰0.6～1.2︰1.2～1.8的摩尔比秤取该四种物质，将黄芩苷、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐放入容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.2～3mmol/ml的溶液，将该溶液在20～30℃下搅拌4～8h得溶液M。
步骤二、将L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐用N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.6～1.8mmol/ml的溶液H，用三乙胺调节溶液H的PH值至6.5～7.5，将溶液H加入溶液M中，并在8～12分钟内升温至45～55℃进行合成反应，自加入溶液H时开始计时，合成反应进行至45～53小时时终止合成反应，得反应液T。
步骤三、向反应液T中加入二氯甲烷，反应液T与二氯甲烷的体积比为1︰4～6，然后加入PH＝2.5～3.5的盐酸溶液洗2～3次，再加入pH＝7.8～8.8的碳酸氢钠溶液洗2～3次，最后用pH＝2.5～3.5的盐酸溶液还原，取二氯甲烷层和水层中间的黄色沉淀，离心水洗，过滤，25～35℃干燥得黄芩苷衍生物BAL粗品。
步骤四、将黄芩苷衍生物BAL粗品用N,N-二甲基甲酰胺溶解，采用薄层分离技术分离提纯，用乙醇洗脱，离心，上清液旋转蒸发挥干，得黄芩苷衍生物BAL纯品，纯度大于95％。
本发明所述的黄芩苷衍生物BAL在制备治疗肺癌、肝癌、乳腺癌药物中的应用。
黄芩苷衍生物BAD的表征
高效液相检测：
色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS-SP C18柱(4.6mm×250mm)，保护柱为Phenomenex C18(4.0mm×3.0mm)，流动相为：甲醇︰0.1％磷酸＝65︰35，流速为1ml/min，柱温30℃，进样量20μl，UV检测波长为280nm。由图1可以看出，黄芩苷衍生物BAD的出峰时间为11.13min，与黄芩苷(BA)的出峰时间为5.70min相比，出峰时间明显延长，表明黄芩苷衍生物BAD的极性小于黄芩苷(BA)，这与通过合成后羧基变为酰胺键的预计相同。
质谱：
ESI-MS(正离子模式)：m/z 608.40[M+H]+，分子量：MW＝607.40，分子式为C31H29NO12，核磁共振氢谱数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.18(s,1H),8.14(d,J＝7.1Hz,1H),7.65–7.55(m,2H),7.28(t,J＝7.2Hz,2H),7.24–7.20(m,1H),7.20–7.15(m,4H),7.07(dd,J＝10.0,4.7Hz,2H),5.05(d,J＝7.6Hz,1H),4.55(dd,J＝14.0,7.3Hz,1H),4.05(d,J＝9.7Hz,1H),3.65(dd,J＝13.4,6.7Hz,3H),3.53–3.46(m,3H),3.44(d,J＝9.1Hz,1H),3.39–3.31(m,2H),3.03(d,J＝7.6Hz,1H),1.19(d,J＝31.7Hz,3H)。
通过以上合成数据，表明所制备的化合物为黄芩苷衍生物BAD，纯度高于95％。
黄芩苷衍生物BAL的表征
高效液相检测：
色谱条件为：色谱柱为Inertsil ODS-SP C18柱(4.6mm×250mm)，保护柱为Phenomenex C18(4.0mm×3.0mm)，流动相为：甲醇︰0.1％磷酸＝65︰35。流速为1ml/min，柱温30℃，进样量20μl，UV检测波长为280nm。由图2可以看出，黄芩苷衍生物BAL的出峰时间为12.07min，与黄芩苷(BA)的出峰时间为5.70min相比，出峰时间明显延长，表明黄芩苷衍生物BAL的极性小于黄芩苷(BA)，这与通过合成后羧基变为酰胺键的预计相同。同时与黄芩苷衍生物BAD的出峰时间相比有0.94的不同，更说明了空间结构的不同导致了不一样。
质谱：
ESI-MS(正离子模式)：m/z 608.40[M+H]+，分子量：MW＝607.40，分子式为C31H29NO12，核磁共振氢谱数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.18(s,1H),8.14(d,J＝7.0Hz,1H),7.64–7.52(m,2H),7.29(t,J＝7.2Hz,2H),7.22(t,J＝7.3Hz,1H),7.21–7.11(m,4H),7.07(s,1H),6.91(t,J＝7.3Hz,1H),6.84(t,J＝7.3Hz,1H),5.02(d,J＝7.2Hz,1H),4.52(td,J＝8.6,5.0Hz,1H),4.04(d,J＝9.7Hz,1H),3.79–3.67(m,1H),3.59(s,3H),3.55–3.48(m,1H),3.45–3.30(m,2H),3.03(dd,J＝13.6,4.8Hz,1H),2.93–2.87(m,1H),1.20(d,J＝28.7Hz,3H)。
通过以上合成数据，表明所制备的化合物为黄芩苷衍生物BAL，纯度高于95％。
黄芩苷衍生物BAL和黄芩苷衍生物BAD的毒理学评价
实验细胞株：
A549、NCI-H460、SMMC-7721、BEL-BEL-7402、HepG2、MRC-5等细胞株均购自中国科学院细胞库，Calu-1细胞株购自西南医科大学附属医院基础医学实验中心，A549耐药株购自西南医科大学附属医院肿瘤科，MDA-MB-435、T74D、MCF-7等细胞株购自西南医科大学基础医学实验中心。
实验药物：
黄芩苷、黄芩苷衍生物BAL、黄芩苷衍生物BAD
实验步骤：
将各种细胞均培养在37℃、5％CO2细胞培养箱中，取对数生长期细胞用于MTT增殖实验，并计算24小时、48小时各个药物的半数致死量IC50。
实验结果：
黄芩苷、黄芩苷衍生物BAL、黄芩苷衍生物BAD在24小时、48小时对各个肿瘤细胞的半数致死量结果如表1、表2所示。
表1黄芩苷、黄芩苷衍生物BAL、黄芩苷衍生物BAD在体外对肿瘤细胞的增殖抑制作用(24h)
Figure GDA0003933724220000051
*与黄芩苷(BA)的IC50值比较，P<0.05，有显著性差异，表示没有抑制效果或没有测出。
表2黄芩苷、黄芩苷衍生物BAL、黄芩苷衍生物BAD在体外对肿瘤细胞的增殖抑制作用(48h)
Figure GDA0003933724220000061
*与黄芩苷(BA)的IC50值比较，P<0.05，有显著性差异，表示没有抑制效果或没有测出。
以黄芩苷衍生物BAL或黄芩苷衍生物BAD为原料所制备的剂型如片剂、颗粒剂、纳米粒、注射剂等。
实验结果表明，黄芩苷衍生物BAL、黄芩苷衍生物BAD相比于黄芩苷对肺癌、肝癌、乳腺癌的细胞抑制作用均有明显增加，不同的细胞株其抗肿瘤活性也有所不同。
黄芩苷衍生物BAL和黄芩苷衍生物BAD针对肺癌、肝癌、乳腺癌的抗肿瘤活性均比黄芩苷有显著提高，该两种黄芩苷衍生物的制备以及纯化路线符合绿色化学特点，无污染，衍生物产率高。
附图说明
图1为本发明所述黄芩苷衍生物BAD的HPLC色谱图。
图2为本发明所述黄芩苷衍生物BAL的HPLC色谱图。
图3为两种反应溶剂N,N-二甲基甲酰胺和CH2CL2的单因素考察图。
图4为两个反应温度25℃和50℃的单因素考察图。
图5为空白组肿瘤块的HE染色病理切片图。
图6为黄芩苷(BA)组肿瘤块的HE染色病理切片图。
图7为黄芩苷衍生物BAD组肿瘤块的HE染色病理切片图。
图8为黄芩苷衍生物BAL组肿瘤块的HE染色病理切片图。
具体实施方式
实施例1：黄芩苷衍生物BAD的制备
黄芩苷衍生物BAD，其分子式为：C31H29NO12，结构式为：
Figure GDA0003933724220000071
包括以下步骤：
步骤一、按黄芩苷︰1-羟基苯并三氮唑︰1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐︰D-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐＝0.5︰0.6︰0.9︰1.5的摩尔比秤取该四种物质，将黄芩苷、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐放入容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为1.5mmol/ml的溶液，将该溶液在25℃下搅拌6h得溶液M。
步骤二、将D-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐用N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为1.2mmol/ml的溶液N，用三乙胺调节溶液N的PH值至7，将溶液N加入溶液M中，并在10分钟内升温至50℃进行合成反应，自加入溶液N时开始计时，合成反应进行至48小时时终止合成反应，得反应液G。
步骤三、向反应液G中加入二氯甲烷，反应液G与二氯甲烷的体积比为1︰5，然后加入PH＝3的盐酸溶液洗2次，再加入pH＝8.3的碳酸氢钠溶液洗2次，最后用pH＝3的盐酸溶液还原，取二氯甲烷层和水层中间的黄色沉淀，离心水洗，过滤，30℃干燥得黄芩苷衍生物BAD粗品。
步骤四、将黄芩苷衍生物BAD粗品用N,N-二甲基甲酰胺溶解，采用薄层分离技术分离提纯，用乙醇洗脱，离心，上清液旋转蒸发挥干，得黄芩苷衍生物BAD纯品，纯度大于95％。
实施例2：黄芩苷衍生物BAD的制备
黄芩苷衍生物BAD，其分子式为：C31H29NO12，结构式为：
Figure GDA0003933724220000081
包括以下步骤：
步骤一、按黄芩苷︰1-羟基苯并三氮唑︰1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐︰D-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐＝0.2︰0.9︰1.2︰1.8的摩尔比秤取该四种物质，将黄芩苷、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐放入容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.2mmol/ml的溶液，将该溶液在30℃下搅拌4h得溶液M。
步骤二、将D-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐用N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.6mmol/ml的溶液N，用三乙胺调节溶液N的PH值至6.5，将溶液N加入溶液M中，并在8分钟内升温至55℃进行合成反应，自加入溶液N时开始计时，合成反应进行至53小时时终止合成反应，得反应液G。
步骤三、向反应液G中加入二氯甲烷，反应液G与二氯甲烷的体积比为1︰4，然后加入PH＝2.5的盐酸溶液洗2次，再加入pH＝7.8的碳酸氢钠溶液洗2次，最后用pH＝2.5的盐酸溶液还原，取二氯甲烷层和水层中间的黄色沉淀，离心水洗，过滤，25℃干燥得黄芩苷衍生物BAD粗品。
步骤四、将黄芩苷衍生物BAD粗品用N,N-二甲基甲酰胺溶解，采用薄层分离技术分离提纯，用乙醇洗脱，离心，上清液旋转蒸发挥干，得黄芩苷衍生物BAD纯品，纯度大于95％。
实施例3：黄芩苷衍生物BAD的制备
黄芩苷衍生物BAD，其分子式为：C31H29NO12，结构式为：
Figure GDA0003933724220000091
包括以下步骤：
步骤一、按黄芩苷︰1-羟基苯并三氮唑︰1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐︰D-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐＝0.8︰0.3︰0.6︰1.2的摩尔比秤取该四种物质，将黄芩苷、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐放入容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为3mmol/ml的溶液，将该溶液在20℃下搅拌8h得溶液M。
步骤二、将D-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐用N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为1.8mmol/ml的溶液N，用三乙胺调节溶液N的PH值至7.5，将溶液N加入溶液M中，并在12分钟内升温至45℃进行合成反应，自加入溶液N时开始计时，合成反应进行至45小时时终止合成反应，得反应液G。
步骤三、向反应液G中加入二氯甲烷，反应液G与二氯甲烷的体积比为1︰6，然后加入PH＝3.5的盐酸溶液洗3次，再加入pH＝8.8的碳酸氢钠溶液洗3次，最后用pH＝3.5的盐酸溶液还原，取二氯甲烷层和水层中间的黄色沉淀，离心水洗，过滤，35℃干燥得黄芩苷衍生物BAD粗品。
步骤四、将黄芩苷衍生物BAD粗品用N,N-二甲基甲酰胺溶解，采用薄层分离技术分离提纯，用乙醇洗脱，离心，上清液旋转蒸发挥干，得黄芩苷衍生物BAD纯品，纯度大于95％。
实施例4：黄芩苷衍生物BAL的制备
黄芩苷衍生物BAL，其特征在于，分子式为：C31H29NO12，结构式为：
Figure GDA0003933724220000101
包括以下步骤：
步骤一、按黄芩苷︰1-羟基苯并三氮唑︰1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐︰L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐＝0.5︰0.6︰0.9︰1.5的摩尔比秤取该四种物质，将黄芩苷、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐放入容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为1.5mmol/ml的溶液，将该溶液在25℃下搅拌6h得溶液M。
步骤二、将L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐用N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为1.2mmol/ml的溶液H，用三乙胺调节溶液H的PH值至7，将溶液H加入溶液M中，并在10分钟内升温至50℃进行合成反应，自加入溶液H时开始计时，合成反应进行至48小时时终止合成反应，得反应液T。
步骤三、向反应液T中加入二氯甲烷，反应液T与二氯甲烷的体积比为1︰5，然后加入PH＝3的盐酸溶液洗2次，再加入pH＝8.3的碳酸氢钠溶液洗2次，最后用pH＝3的盐酸溶液还原，取二氯甲烷层和水层中间的黄色沉淀，离心水洗，过滤，30℃干燥得黄芩苷衍生物BAL粗品。
步骤四、将黄芩苷衍生物BAL粗品用N,N-二甲基甲酰胺溶解，采用薄层分离技术分离提纯，用乙醇洗脱，离心，上清液旋转蒸发挥干，得黄芩苷衍生物BAL纯品，纯度大于95％。
实施例5：黄芩苷衍生物BAL的制备
黄芩苷衍生物BAL，其特征在于，分子式为：C31H29NO12，结构式为：
Figure GDA0003933724220000111
包括以下步骤：
步骤一、按黄芩苷︰1-羟基苯并三氮唑︰1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐︰L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐＝0.2︰0.9︰1.2︰1.8的摩尔比秤取该四种物质，将黄芩苷、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐放入容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.2mmol/ml的溶液，将该溶液在30℃下搅拌4h得溶液M。
步骤二、将L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐用N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.6mmol/ml的溶液H，用三乙胺调节溶液H的PH值至6.5，将溶液H加入溶液M中，并在8分钟内升温至55℃进行合成反应，自加入溶液H时开始计时，合成反应进行至53小时时终止合成反应，得反应液T。
步骤三、向反应液T中加入二氯甲烷，反应液T与二氯甲烷的体积比为1︰4，然后加入PH＝2.5的盐酸溶液洗2次，再加入pH＝7.8的碳酸氢钠溶液洗2次，最后用pH＝2.5的盐酸溶液还原，取二氯甲烷层和水层中间的黄色沉淀，离心水洗，过滤，25℃干燥得黄芩苷衍生物BAL粗品。
步骤四、将黄芩苷衍生物BAL粗品用N,N-二甲基甲酰胺溶解，采用薄层分离技术分离提纯，用乙醇洗脱，离心，上清液旋转蒸发挥干，得黄芩苷衍生物BAL纯品，纯度大于95％。
实施例6：黄芩苷衍生物BAL的制备
黄芩苷衍生物BAL，其特征在于，分子式为：C31H29NO12，结构式为：
Figure GDA0003933724220000121
包括以下步骤：
步骤一、按黄芩苷︰1-羟基苯并三氮唑︰1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐︰L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐＝0.8︰0.3︰0.6︰1.2的摩尔比秤取该四种物质，将黄芩苷、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐放入容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为3mmol/ml的溶液，将该溶液在20℃下搅拌8h得溶液M。
步骤二、将L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐用N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为1.8mmol/ml的溶液H，用三乙胺调节溶液H的PH值至7.5，将溶液H加入溶液M中，并在12分钟内升温至45℃进行合成反应，自加入溶液H时开始计时，合成反应进行至45小时时终止合成反应，得反应液T。
步骤三、向反应液T中加入二氯甲烷，反应液T与二氯甲烷的体积比为1︰6，然后加入PH＝3.5的盐酸溶液洗3次，再加入pH＝8.8的碳酸氢钠溶液洗3次，最后用pH＝3.5的盐酸溶液还原，取二氯甲烷层和水层中间的黄色沉淀，离心水洗，过滤，35℃干燥得黄芩苷衍生物BAL粗品。
步骤四、将黄芩苷衍生物BAL粗品用N,N-二甲基甲酰胺溶解，采用薄层分离技术分离提纯，用乙醇洗脱，离心，上清液旋转蒸发挥干，得黄芩苷衍生物BAL纯品，纯度大于95％。
实施例7：合成工艺优化溶剂因素
考虑到黄芩苷(BA)的溶解性，因此选用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或CH2CL2作为反应溶剂，以黄芩苷衍生物BAL为标准。
实验步骤：称取黄芩苷(BA)0.5mmol、1-羟基苯并三氮唑0.6mmol、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐0.9mmol于洁净的圆底烧瓶中，加入3mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或CH2CL2溶解，置于恒温磁力搅拌器上，常温(20～30℃)下搅拌6h。随后称取1.5mmolL-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐(LBMS)用1.5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加入0.45mL三乙胺超声后滴加入反应烧瓶中，从加入L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐(LBMS)时开始计时，在48h时停止反应，通过高效液相(HPLC)检测各物质的相对面积，结果如图3所示。
由图3可知，当反应溶剂选择为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)时，黄芩苷(BA)反应更彻底，黄芩苷衍生物BAL生成量更多，因此选择N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为最佳反应溶剂。
实施例8：合成工艺优化温度因素
为探究最佳反应，选择N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，由于是利用1-羟基苯并三氮唑作为催化剂，以及避免酰胺反应过程中的副反应，考察反应温度在25℃和50℃时的影响。
实验步骤：称取黄芩苷(BA)0.5mmol、1-羟基苯并三氮唑0.6mmol、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐0.9mmol于洁净的圆底烧瓶中，加入3mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，置于恒温磁力搅拌器上，常温(20～30℃)下搅拌6h。随后称取1.5mmol L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐(LBMS)用1.5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加入0.45mL三乙胺超声后滴加入反应烧瓶中，分别在25℃或50℃反应48h停止反应，通过以相对峰面积表示结果，如图4所示。
由图4可知，当反应温度为50℃时黄芩苷(BA)反应更彻底，黄芩苷衍生物BAL生成量更多，因此选择50℃为最佳反应时间。
实施例9：黄芩苷衍生物BAL、黄芩苷衍生物BAD裸鼠体内抗肿瘤实验
实验动物：SPF级四周龄裸鼠(由成都达硕生物科技有限公司提供)，动物合格证号：SCXK(川)2013-24。
实验药物：黄芩苷购自成都贝斯特试剂有限公司，纯度大于98％，黄芩苷衍生物BAL和黄芩苷衍生物BAD采用本专利申请技术方案制得。
实验细胞株：人肺癌细胞株A549购于中国科学院细胞库。
实验步骤：
1、肿瘤细胞液的制备
取对数生长期A549肺癌细胞，消化，吹打，离心，去上清液，用PBS缓冲液洗涤2次，将PBS缓冲液和基质胶按照1:1的比例混合后加入细胞中配成细胞浓度为1.0×108个/mL。
2、肿瘤动物模型的构建与分组
将肺癌癌细胞株A549细胞(浓度为1.0×108个/mL)，用1mL注射器抽取0.1mL(细胞个数为1.0×107个)瘤细胞悬液在超净工作台上接种于经75％酒精消毒后的裸小鼠右臀部皮下，置于SPF动物房中喂养。
3、给药剂量及方式
对荷瘤鼠每天灌胃给药1次，体积0.1mL,空白对照组给予生理盐水，其余三组分别给予黄芩苷(BA)、黄芩苷衍生物BAD和黄芩苷衍生物BAL剂量为100mg/kg。
每3日定时测量各组小鼠体重，瘤块体积。游标卡尺测量皮下瘤的长径a(mm)，横径b(mm)，计算公式：肿瘤体积＝π/6*(ab2)计算肿瘤体积。
在连续用药18日后，将模型鼠于超净工作台上，处死小鼠，切开荷瘤小鼠皮肤，游离瘤旁组织，完整暴露瘤体并整体剥离瘤组织，除去瘤组织上的附着的非瘤组织，电子天平称重，计算其抑瘤率，抑瘤率＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。
表3黄芩苷(BA)、黄芩苷衍生物BAD、黄芩苷衍生物BAL各组裸鼠皮下瘤体积变化
Figure GDA0003933724220000141
Figure GDA0003933724220000142
表4黄芩苷(BA)、黄芩苷衍生物BAD、黄芩苷衍生物BAL对裸小鼠皮下瘤的抑瘤率
Figure GDA0003933724220000143
实验结果：从表3、表4可以看出黄芩苷(BA)、黄芩苷衍生物BAL、黄芩苷衍生物BAD与空白对照相比均抑制了肿瘤的增长(P<0.05)。相比于黄芩苷(BA)，黄芩苷衍生物BAL、黄芩苷衍生物BAD的抗肿瘤活性均有明显提升(P<0.05),表明我们所合成的两种衍生物具有高效的抗肿瘤活性。同时可以看出黄芩苷衍生物BAL的抗肿瘤效果要好于BAD(P<0.05)。
实施例10：裸鼠荷植瘤HE染色实验
实验动物：SPF级四周龄裸鼠(由成都达硕生物科技有限公司提供)，动物合格证号：SCXK(川)2013-24。
实验药物：黄芩苷(BA)购自成都贝斯特试剂有限公司，纯度大于98％，黄芩苷衍生物BAL和黄芩苷衍生物BAD采用本专利申请技术方案制得。
实验细胞株：人肺癌细胞株A549购于中国科学院细胞库
实验步骤：按实例7的方法移植肿瘤并进行给药，18天后处死裸鼠，分离出肿瘤。瘤块称重后，用0.9％生理盐水冲洗后，吸水纸除去多余水分，再用10％甲醛固定肿瘤块，甲醛固定24h以上，取出进行石蜡包埋，将所选石蜡包埋标本进行3～5μm连续切片，HE染色制片，观察形态学上是否存在差异。
实验结果：如图5至图8所示，空白组的肿瘤细胞生长旺盛，微血管丰富，给药组的肿瘤细胞虽未见明显的形态学改变，但可以看出，其微血管丰富程度为：空白组≥BA组＞BAD组＞BAL组。
实施例11：黄芩苷衍生物BAL或黄芩苷衍生物BAD片剂的制备
以黄芩苷衍生物BAL或黄芩苷衍生物BAD为主药，按公知片剂的制备方法，加入淀粉、糊精、硬酯酸镁，混合制成湿粒，机器冲压成片，每片含200mg。用法用量：口服，每日2～3次，每次250～600mg。该药片用于治疗肺癌、肝癌、乳腺癌。

Claims (6)

1.一种黄芩苷衍生物BAD，其特征在于，分子式为：C31H29NO12，结构式为：
Figure FDA0004045435520000011
2.根据权利要求1所述黄芩苷衍生物BAD的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、按黄芩苷︰1-羟基苯并三氮唑︰1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐︰D-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐＝0.2～0.8︰0.3～0.9︰0.6～1.2︰1.2～1.8的摩尔比秤取该四种物质，将黄芩苷、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐放入容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.2～3mmol/ml的溶液，将该溶液在20～30℃下搅拌4～8h得溶液M；
步骤二、将D-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐用N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.6～1.8mmol/ml的溶液N，用三乙胺调节溶液N的PH值至6.5～7.5，将溶液N加入溶液M中，并在8～12分钟内升温至45～55℃进行合成反应，自加入溶液N时开始计时，合成反应进行至45～53小时时终止合成反应，得反应液G；
步骤三、向反应液G中加入二氯甲烷，反应液G与二氯甲烷的体积比为1︰4～6，然后加入PH＝2.5～3.5的盐酸溶液洗2～3次，再加入pH＝7.8～8.8的碳酸氢钠溶液洗2～3次，最后用pH＝2.5～3.5的盐酸溶液还原，取二氯甲烷层和水层中间的黄色沉淀，离心水洗，过滤，25～35℃干燥得黄芩苷衍生物BAD粗品；
步骤四、将黄芩苷衍生物BAD粗品用N,N-二甲基甲酰胺溶解，采用薄层分离技术分离提纯，用乙醇洗脱，离心，上清液旋转蒸发挥干，得黄芩苷衍生物BAD纯品，纯度大于95％。
3.如权利要求1所述的黄芩苷衍生物BAD或者由权利要求2制得的黄芩苷衍生物BAD在制备治疗肺癌、肝癌、乳腺癌药物中的应用。
4.一种黄芩苷衍生物BAL，其特征在于，分子式为：C31H29NO12，结构式为：
Figure FDA0004045435520000021
5.根据权利要求4所述黄芩苷衍生物BAL的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、按黄芩苷︰1-羟基苯并三氮唑︰1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐︰L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐＝0.2～0.8︰0.3～0.9︰0.6～1.2︰1.2～1.8的摩尔比秤取该四种物质，将黄芩苷、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐放入容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.2～3mmol/ml的溶液，将该溶液在20～30℃下搅拌4～8h得溶液M；
步骤二、将L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐用N,N-二甲基甲酰胺溶解，得浓度为0.6～1.8mmol/ml的溶液H，用三乙胺调节溶液H的PH值至6.5～7.5，将溶液H加入溶液M中，并在8～12分钟内升温至45～55℃进行合成反应，自加入溶液H时开始计时，合成反应进行至45～53小时时终止合成反应，得反应液T；
步骤三、向反应液T中加入二氯甲烷，反应液T与二氯甲烷的体积比为1︰4～6，然后加入PH＝2.5～3.5的盐酸溶液洗2～3次，再加入pH＝7.8～8.8的碳酸氢钠溶液洗2～3次，最后用pH＝2.5～3.5的盐酸溶液还原，取二氯甲烷层和水层中间的黄色沉淀，离心水洗，过滤，25～35℃干燥得黄芩苷衍生物BAL粗品；
步骤四、将黄芩苷衍生物BAL粗品用N,N-二甲基甲酰胺溶解，采用薄层分离技术分离提纯，用乙醇洗脱，离心，上清液旋转蒸发挥干，得黄芩苷衍生物BAL纯品，纯度大于95％。
6.如权利要求4所述的黄芩苷衍生物BAL或者由权利要求5制得的黄芩苷衍生物BAL在制备治疗肺癌、肝癌、乳腺癌药物中的应用。
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