CN115322204B - 土甘草a及其衍生物的制备方法与应用 - Google Patents

土甘草a及其衍生物的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种土甘草A及其衍生物的制备方法，在惰性气体保护下，以醋酸酐为溶剂，2,2‑二甲基‑7‑羟基‑5‑甲氧基‑2H‑苯并吡喃‑6‑甲酸甲酯，对甲氧基苯乙酸或对甲基苯乙酸为原料，三乙胺为催化剂，加热回流搅拌反应，反应结束后，待反应液降至室温，加入水，乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析提纯，获得土甘草A及其衍生物；其中，土甘草A及其衍生物具有以下结构通式I：R为‑OCH3或者CH3。本发明还提供了一种土甘草A及其衍生物在制备抗氧化药物中的应用。本发明方法具有合成工艺路线简便可行，目标产物产率较高等特点。

Description

土甘草A及其衍生物的制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药化学领域。更具体地说，本发明涉及一种土甘草A及其衍生物的制备 方法与应用。
背景技术
人体正常细胞的代谢过程中，会产生自由基，如超氧阴离子(O2 -·)，羟自由基(·OH)，过氧化氢(H2O2)等。当人体正常的条件下，抗氧化系统会消除身体多余的自由 基，使体内自由基平衡，但在病理条件下，体内抗氧化系统失衡，致使自由基过剩，此时 过剩的自由基会引起氧化应激反应，与DNA、蛋白质、膜脂等生物大分子发生生物反应，引起细胞损伤，致细胞死亡或者凋亡。研究表明，氧化应激反应与100多种疾病相关，例 如癌症、心血管疾病、衰老、免疫等。因此，抗氧化剂在维持机体正常活动起着重要的作 用。
香豆素(Coumarin)，最基本的结构为苯并α-吡喃酮，香豆素类的化合物广泛的存在于众多天然的植物中，如伞形科、芸香科、豆科等。香豆素类化合物具有对植物和人体 都极为重要，在植物体内，低浓度时可作为一种良性的激素，促进植物生长。对人体而言， 香豆素具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗HIV等多种药理活性。研究表明，香豆素类化合物 大多具有极强的氧化作用，尤其是带有羟基的香豆素。临床证明，绝大多数香豆素类化合物的药理活性与其抗氧化性息息相关，抗氧化活性越强，药理作用越好，有望成为新一类 的抗氧化剂。
两粤黄檀(Dalbergia benthamii Prain)为豆科黄檀属植物，别名蕉藤麻，两粤檀，藤 本，主要分布在广东、广西等地，是广西壮族自治区民间常用的药材之一。主治妇女气血 淤滞所致的月经不调，跌打肿痛等疾病。从壮药两粤黄檀(Dalbergia benthamiiPrain)中 提取出一种直线型吡喃香豆素类化合物—土甘草A(1)，结构式如下，
实验证明，土甘草A(1)具有许多生物活性性质，如抗肿瘤。由于天然植物的资源有限，土甘草A(1)含量低等原因，提取分离操作复杂且难以重现，并且，国内外对土 甘草A的合成研究较少，限制了对土甘草A的进一步研究。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明提供一种土甘草A及其衍生物的制备方法，以2,4,6,-三羟基苯甲酸甲酯和3,3- 二甲基丙烯酸为原料，经PPA关环、磺酰化、甲基化、还原、脱水、迪克曼酯缩合反应 等设计合成土甘草A(1)，并且最后一步迪克曼酯缩合反应中，将对甲氧基苯乙酸乙酯 替换成对甲基苯乙酸乙酯获得另一土甘草A类似物(1c)，以在医药和科研中发挥一定的价值。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种土甘草A及其衍生物的制备方法， 在惰性气体保护下，以醋酸酐为溶剂，2,2-二甲基-7-羟基-5-甲氧基-2H-苯并吡喃-6- 甲酸甲酯，对甲氧基苯乙酸或对甲基苯乙酸为原料，三乙胺为催化剂，加热回流搅拌反应， 反应结束后，待反应液降至室温，加入水，乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥， 过滤，浓缩，柱层析提纯，获得土甘草A及其衍生物；
其中，土甘草A及其衍生物具有以下结构通式I：
R为-OCH3或者CH3。
优选的是，以甲醇为溶剂、2,2-二甲基-5-甲氧基-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2H-苯并吡 喃-6-甲酸甲酯为原料，在K2CO3作用下氢化脱去Ts，回流搅拌反应，反应结束后，倾入冰水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，无水乙醇重结晶，即得 2,2-二甲基-7-羟基-5-甲氧基-2H-苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
优选的是，以甲苯溶剂，2,2-二甲基-4-羟基-5-甲氧基-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2，3- 二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯为原料，在对甲苯磺酸作用体系下反应，回流搅拌，反应结束后， 待反应液降至室温，加入适量水至絮状物溶解，无水硫酸钠干燥，过滤，甲醇重结晶，即 得2,2-二甲基-5-甲氧基-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2H-苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
优选的是，以甲醇为溶剂，2,2-二甲基-5-甲氧基-4-氧代-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2， 3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯为原料，升温溶解后，待温度降至室温，置于低温反应器中， 0℃-5℃下，以NaBH4为还原剂，1-3h内，分2-5次加完，搅拌反应，反应结束后，滴加9-10滴5％HCl终止反应，旋干部分甲醇后，乙酸乙酯萃取，合并有机层，依次用饱和 NaHCO3溶液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，甲醇重结晶，得2,2-二甲基-4- 羟基-5-甲氧基-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
优选的是，以丙酮为溶剂，2,2-二甲基-5-羟基-4-氧代-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2，3- 二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯为原料、K2CO3调节碱性，(Me)2SO4为甲基化剂依，回流搅拌反 应，反应结束后，过滤除去碳酸钾，旋干丙酮后，用甲醇重结晶，得2,2-二甲基-5-甲氧基-4-氧代-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯。。
优选的是，以丙酮为溶剂，2,2-二甲基-5,7-二羟基-4-氧代-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸 甲酯与对甲苯磺酰氯为原料，回流搅拌反应，反应结束后，过滤除去碳酸钾，柱层析分离 提纯,得到2,2-二甲基-5-羟基-4-氧代-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸 甲酯。
优选的是，以无水二噁烷为溶剂、2,4,6-三羟基苯甲酸甲酯与3,3-二甲基丙烯酸为原料， 加热搅拌反应，反应结束后，倾入冰水，饱和碳酸钾调节pH至中性，过滤，得粗产品， 丙酮重结晶，即得2,2-二甲基-5,7-二羟基-4-氧代-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
土甘草A及其衍生物的用途，如上所述的土甘草A及其衍生物在抗氧化药物中的应用。
优选的是，所述土甘草A及其衍生物与辅料组合制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
优选的是，所述辅料为乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甘醇、三乙酸甘油酯、甘油、糊精、聚维酮、十八醇、硬脂酸、微晶纤维素、淀粉、乳糖、甘露醇、碳酸氢钠、碳酸钙、 低取代羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、滑石粉中的一种或几种。
本发明至少包括以下有益效果：本发明提供的土甘草A及其衍生物，经体外抗氧化实 验表明，该化合物具有强的抗氧化活性；在制备抗氧化药物中应用，其能够制成药学上的 常见剂型，包括制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明 的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实 施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述 试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
土甘草A及其衍生物的合成技术路线：
本发明提供了一种土甘草A及其衍生物的制备方法，在惰性气体保护下，以醋酸酐(50-500mmol)为溶剂，2,2-二甲基-7-羟基-5-甲氧基-2H-苯并吡喃-6-甲酸甲酯 (0.1-50mmol)，对甲氧基苯乙酸或对甲基苯乙酸(0.1-50mmol)为原料，三乙胺 (0.1-10mmol)为催化剂，加热回流搅拌反应，反应结束后，待反应液降至室温，加入水， 乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析提纯，获得土甘草A 及其衍生物；
其中，土甘草A及其衍生物具有以下结构通式I：
R为-OCH3或者CH3。
在一种技术方案中，以甲醇为溶剂、2,2-二甲基-5-甲氧基-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2H- 苯并吡喃-6-甲酸甲酯(0.1-10mmol)为原料，在K2CO3(5-50mmol)作用下氢化脱去Ts， 回流搅拌反应，反应结束后，倾入冰水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，无水乙醇重结晶，即得2,2-二甲基-7-羟基-5-甲氧基-2H-苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
在一种技术方案中，以甲苯溶剂，2,2-二甲基-4-羟基-5-甲氧基-7-(对甲基苯磺酰氧 基)-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯(1-100mmol)为原料，在对甲苯磺酸(0.1-10mmol) 作用体系下反应，回流搅拌，反应结束后，待反应液降至室温，加入适量水至絮状物溶解，无水硫酸钠干燥，过滤，甲醇重结晶，即得2,2-二甲基-5-甲氧基-7-(对甲基苯磺酰氧基) -2H-苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
在一种技术方案中，以将甲醇为溶剂，2,2-二甲基-5-甲氧基-4-氧代-7-(对甲基苯磺 酰氧基)-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯(1-50mmol)为原料，升温溶解后，待温度降至室温，置于低温反应器中，0℃-5℃下，以NaBH4(10-100mmol)为还原剂，1-3h内， 分2-5次加完，搅拌反应，反应结束后，滴加盐酸或硫酸等酸溶液终止反应，旋干部分甲 醇后，乙酸乙酯萃取，合并有机层，依次用饱和NaHCO3溶液，饱和食盐水洗涤，无水硫 酸钠干燥，过滤，甲醇重结晶，得2,2-二甲基-4-羟基-5-甲氧基-7-(对甲基苯磺酰氧基) -2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
在一种技术方案中，以丙酮为溶剂，2,2-二甲基-5-羟基-4-氧代-7-(对甲基苯磺酰氧 基)-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯(0.1-10mmol)为原料、K2CO3(1-50mmol)调节碱性，(Me)2SO4(100-1000μL)为甲基化剂依，回流搅拌反应，反应结束后，过滤除去碳 酸钾，旋干丙酮后，用甲醇重结晶，得2,2-二甲基-5-甲氧基-4-氧代-7-(对甲基苯磺酰氧 基)-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯。。
在一种技术方案中，以丙酮为溶剂，2,2-二甲基-5,7-二羟基-4-氧代-2，3-二氢苯并吡 喃-6-甲酸甲酯(0.1-100mmol)与对甲苯磺酰氯(0.1-100mmol)为原料，回流搅拌反应， 反应结束后，过滤除去碳酸钾，柱层析分离提纯,得到2,2-二甲基-5-羟基-4-氧代-7-(对甲 基苯磺酰氧基)-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
在一种技术方案中，以无水二噁烷为溶剂、2,4,6-三羟基苯甲酸甲酯(1-100mmol)与3,3-二甲基丙烯酸(1-100mmol)为原料，加热搅拌反应，反应结束后，倾入冰水，饱 和碳酸钾调节pH至中性，过滤，得粗产品，丙酮重结晶，即得2,2-二甲基-5,7-二羟基-4- 氧代-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
<实施例1>
一种土甘草A及其衍生物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、以无水二噁烷为溶剂、2,4,6-三羟基苯甲酸甲酯(10mmol)与3,3-二甲基丙 烯酸(22mmol)为原料，加热搅拌反应，TLC跟踪反应，反应结束后，倾入冰水，饱和 碳酸钾调节pH至中性，过滤，得粗产品，丙酮重结晶得到淡黄色晶体中间体16。
中间体16，即2,2-二甲基-5,7-二羟基-4-氧代-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯，淡黄 色晶体，产率90％，m.p.140.6-144.1℃；ESI-MS m/z:267.32[M+H]+.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ14.02(s,1H,7-OH),12.67(s,1H,5-OH),5.99(s,1H),3.99(s,3H,-OCH3),2.74(s,2H),1.48(s,6H,2-2×CH3).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ198.07,168.46,166.17,165.85,164.67,98.03,82.75,82.62,81.02,51.11,48.33,27.96。
步骤二、以丙酮为溶剂，中间体16(2mmol)与对甲苯磺酰氯(3mmol)为原料， 回流搅拌反应，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤除去碳酸钾，柱层析分离提纯，得到中 间体17。
中间体17，即2,2-二甲基-5-羟基-4-氧代-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2，3-二氢苯并吡 喃-6-甲酸甲酯，白色晶体，产率78％,m.p.134.6-136.0℃；ESI-MS m/z:421.41[M+H]+.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.90-7.74(m,2H),7.38(d,J＝8.1Hz,2H),6.80(s,1H),3.81(s,3H,-OCH3),2.70(s,2H),2.49(s,3H),1.47(s,6H,2-2×CH3).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ198.42,164.69,163.48,163.07,155.51,147.37,133.85,131.33,129.88,109.66,106.92,104.05, 81.73,53.79,49.16,27.90,23.18。
步骤三、以丙酮为溶剂，中间体17(2.3mmol)为原料、K2CO3(12mmol)调节碱 性，(Me)2SO4(570μL)为甲基化剂，TLC跟踪反应，回流搅拌反应。反应结束后，过滤 除去碳酸钾，旋干丙酮后，用甲醇重结晶，得中间体18。
中间体18，即2,2-二甲基-5-甲氧基-4-氧代-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2，3-二氢苯并 吡喃-6-甲酸甲酯，白色针晶，产率90％；m.p.142.6-143.6℃；ESI-MS m/z:435.47[M+H]+.1H NMR(600MHz,CDCl3),δ7.82(d,J＝8.3Hz,2H),7.38(d,J＝8.1Hz,2H),6.80(s,1H),3.88(s,3H,-OCH3),3.75(s,3H,-OCH3),2.70(s,2H),2.49(s,3H),1.47(s,6H,2-2×CH3).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ190.47,165.17,164.14,161.31,152.80,147.37,133.86, 131.32,129.86,117.82,114.22,109.12,81.32,65.11,53.90,51.18,27.73,23.18。
步骤四、以甲醇为溶剂，中间体18(8mmol)为原料，升温溶解后，待温度降至室 温，置于低温反应器中，0℃-5℃下，以NaBH4(50mmol)还原剂，1.5h内，分3次加 完，搅拌反应，TLC跟踪反应，反应结束后，滴加9-10滴5％HCl终止反应，旋干部分甲醇后，乙酸乙酯萃取，合并有机层，依次用饱和NaHCO3溶液，饱和食盐水洗涤，无水硫 酸钠干燥，过滤，甲醇重结晶，得中间体19。
中间体19，即2,2-二甲基-4-羟基-5-甲氧基-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2，3-二氢苯并 吡喃-6-甲酸甲酯，白色晶体，产率83％；m.p 101.3-102.5℃；HR-MS(ESI)m/z:calculated for C21H25O8SNa[M+Na]+:459.1081,found:459.1081.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84-7.76 (m,2H),7.36(d,J＝8.0Hz,2H),6.46(s,1H),4.97(td,J＝5.7,1.8Hz,1H),3.90(s,3H, 6-OCH3),3.81(s,3H,5-OCH3),2.48(s,3H,4'-CH3),2.11-1.99(m,2H),1.41(s,3H,2-CH3), 1.36(s,3H,2-CH3).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.88,160.13,157.48,149.18,146.97, 134.14,131.23,129.86,118.09,117.57,109.19,77.49,63.54),61.62,53.95,41.44,28.88,23.15。
步骤五、以甲苯溶剂，中间体19(11.5mmol)为原料，在对甲苯磺酸(3.15mmol) 作用体系下反应，回流搅拌，TLC跟踪反应，反应结束后，待反应液降至室温，加入适量 水至絮状物溶解，无水硫酸钠干燥，过滤，甲醇重结晶，得到中间体20。
中间体20，即2,2-二甲基-5-甲氧基-7-(对甲基苯磺酰氧基)-2H-苯并吡喃-6-甲酸甲 酯，粉白色晶体，产率98％；m.p.106.6-108.2℃；HR-MS(ESI)m/z:calculated forC21H23O7S[M+H]+:419.1162,found:419.1162.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83-7.75(m, 2H),7.35(d,J＝8.0Hz,2H),6.57-6.43(m,2H),5.67(d,J＝10.0Hz,1H),3.79(s,6H, 5,6-OCH3),2.48(s,3H),1.43(s,6H,2-2×CH3).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.76, 157.16,156.45,148.44,146.90,134.10,132.22,131.17,129.91,117.36,115.32,108.59,78.68,64.61,53.75,29.32,23.14。
步骤六、以甲醇为溶剂，中间体20(3.0mmol)原料，在K2CO3(18.5mmol)作用 下氢化脱去Ts，回流搅拌反应，TLC跟踪反应，反应结束后，倾入冰水中，用乙酸乙酯 萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，无水乙醇重结晶得到中间体21。
中间体21，即2,2-二甲基-7-羟基-5-甲氧基-2H-苯并吡喃-6-甲酸甲酯，白色晶体，产 率98％；m.p.45.5-48.1℃；HR-MS(ESI)m/z:calculated for C14H17O5[M+H]+:265.1089, found:265.1069.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.63(s,1H,7-OH),6.54(d,J＝10.1Hz, 1H),6.23(s,1H),5.55(d,J＝10.0Hz,1H),3.97(s,3H,6-OCH3),3.77(s,3H,5-OCH3),1.44(s, 6H,2-2×CH3).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.26,165.85,161.26,159.12,129.54, 117.75,109.87,102.44,99.80,98.79,64.24,53.78,29.66。
步骤七、在N2保护下，以醋酸酐为溶剂，中间体21(2mmol)，对甲氧基苯乙酸(2mmol) 为原料，三乙胺(1.5mmol)为催化剂，加热回流搅拌反应，TLC跟踪反应，反应结束后， 待反应液降至室温，加入水，乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析提纯，获得土甘草A(1)。
土甘草A(1)，白色固体，产率40％；m.p.208-209℃；HR-MS(ESI)m/z:calculatedfor C22H20O6[M+Na]+:403.1157,found:403.1157.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.97(s,1H, 4-OH),7.46(dd,2H,J＝11.4Hz,2.9Hz),6.97(dd,2H,J＝8.7Hz,2.9Hz),6.63(s,1H),6.50(d,1H,J＝10.0Hz),5.77(d,1H,J＝10.0Hz),3.96(s,3H,4'-OCH3),3.77(s,3H,5-OCH3),1.48(s,6H,-CH3)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ162.07,160.96,158.83,157.97,153.65),152.11,131.78,131.43),124.92,123.21,115.03,113.71,110.67,103.83,101.50,78.33,65.19,55.42,27.96。
<实施例2>
一种土甘草A及其衍生物的制备方法，
与<实施例1>的不同之处在于，步骤七中在N2保护下，以醋酸酐为溶剂，中间体21(2mmol)，对甲基苯乙酸(2mmol)为原料，三乙胺(1.5mmol)为催化剂，加热回流 搅拌反应，TLC跟踪反应，反应结束后，待反应液降至室温，加入水，乙酸乙酯萃取，合 并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析提纯，获得土甘草A类似物(1c)。
土甘草A类似物(1c)，即2”,2”-二甲基-4-羟基-5-甲氧基-3-(4-甲基苯基)-2H，8H- 吡喃并[3,2-g]色烯-2-酮，白色固体，产率35％，m.p.195-198℃；HR-MS(ESI m/z:calculated for C22H20O5[M+Na]+:387.1203,found:387.1209.1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.95(s,1H, 4-OH),7.43(dd,2H,J＝11.2Hz,3.3Hz'),6.97(dd,2H,J＝8.8Hz,2.9Hz),6.62(s,1H),6.48(d, 1H,J＝10Hz),5.74(d,1H,J＝10Hz),3.77(3H,s,5-OCH3),2.41(s,3H,4'-CH3),1.48(s,6H, -CH3)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ162.03,161.06,158.79,157.95,153.63,152.13,131.79, 131.42,124.90,123.20,115.02,113.69,110.63,103.81,101.48,78.33,62.69,28.20,21.30。
<实施例3>
实施例1或实施例2制备的所述土甘草A及其衍生物与辅料组合制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂，土甘草A及其衍生物的化学性质、化学结构保持稳定。
<实施例4>
实施例1或实施例2制备的所述土甘草A及其衍生物与所述辅料为乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甘醇、三乙酸甘油酯、甘油、糊精、聚维酮、十八醇、硬脂酸、微晶纤维素、 淀粉、乳糖、甘露醇、碳酸氢钠、碳酸钙、低取代羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、滑石粉 中的一种或几种组合，制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂中的一种，所述土甘草A及其衍生物的化学性质、化学结构保持稳定。
<体外抗氧化活性实验>
一、清除DPPH˙自由基的能力测定
用无水乙醇将土甘草A及其衍生物配制成浓度为1mg/mL的样品溶液，在样品溶液中按1:1比例加入0.0004％(w/v)DPPH˙溶液100uL，混匀，室温下避光放置，在最大吸 收波长517nm处采用酶标仪测其吸光度(A1)，每隔15min测一次，直到吸光度达平衡， 各测三次取平均值。以不加目标化合物的DPPH˙溶液为空白对照(A0)，同时以BHT作 为对比。最后根据下列公式计算各目标化合物及BHT对DPPH˙自由基的清除率：
清除率(SC％)＝[1－A1/A0]×100％
式中，A1为加样品或BHT后DPPH˙溶液的吸光度；A0为未加样品时DPPH˙溶液 的吸光度。
二、清除ABTS+˙自由基能力的测定
ABTS+˙储备液(7.0mmol/L)的制备：取ABTS19.20 mg，加蒸馏水均匀定容于5mL 容量瓶内，溶解均匀。K2S2O8储备液(2.45mmol/L)的制备：取K2S2O8 3.31mg，加蒸馏 水均匀定容于5mL容量瓶内，溶解均匀。ABTS+˙溶液制备：取2mLABTS+˙储备液(7.0 mmol/L)与2mLK2S2O8水溶液(2.45mmol/L)混合均匀，于室温避光放置2天备用，反 应产生ABTS+˙自由基。为了测定抗氧化性，将ABTS+˙溶液用无水乙醇稀释，使其在 734nm下测得吸光度在0.700±0.030范围内。
用无水乙醇将土甘草A及其衍生物配置成浓度为500ug/mL的样品溶液，准确移取20 μL，加入ABTS+˙工作液180μL，混合均匀。同时以抗氧化剂BHT为阳性对照，无水乙 醇溶液为空白对照。在室温下放置5min后测其吸光度。于室温下避光静置1min后，在波长734nm下采用酶标仪测定吸光度。样品ABTS自由基的清除率用以下公式计算：
清除率(SC％)＝[1－A1/A0]×100％
式中，A1为加样品或BHT后ABTS+˙溶液的吸光度；A0为未加样品时ABTS+˙溶 液的吸光度
表1土甘草A及其衍生物对DPPH˙自由基的清除率
表2土甘草A及其衍生物对ABTS+˙自由基的清除率
从表1，2结果可以看出，本发明的土甘草A及其衍生物经体外抗氧化实验表明， 该化合物对DPPH，ABTS+˙自由基具有强的抗氧化活性。本发明为研究开发新的抗氧化 药物提供了新的思路。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现 另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (7)

1.土甘草A及其衍生物的制备方法，其特征在于，在惰性气体保护下，以醋酸酐为溶剂，2,2-二甲基-7-羟基-5-甲氧基-2H-苯并吡喃-6-甲酸甲酯，对甲氧基苯乙酸或对甲基苯乙酸为原料，三乙胺为催化剂，加热回流搅拌反应，反应结束后，待反应液降至室温，加入水，乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析提纯，获得土甘草A及其衍生物；
其中，土甘草A及其衍生物具有以下结构通式I：
R为-OCH3或者CH3。
2.根据权利要求1所述的土甘草A及其衍生物的制备方法，其特征在于，以甲醇为溶剂、2,2-二甲基-5-甲氧基-7-对甲基苯磺酰氧基-2H-苯并吡喃-6-甲酸甲酯为原料，在K2CO3作用下氢化脱去Ts，回流搅拌反应，反应结束后，倾入冰水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，无水乙醇重结晶，即得2,2-二甲基-7-羟基-5-甲氧基-2H-苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
3.根据权利要求2所述的土甘草A及其衍生物的制备方法，其特征在于，以甲苯溶剂，2,2-二甲基-4-羟基-5-甲氧基-7-对甲基苯磺酰氧基-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯为原料，在对甲苯磺酸作用体系下反应，回流搅拌，反应结束后，待反应液降至室温，加入适量水至絮状物溶解，无水硫酸钠干燥，过滤，甲醇重结晶，即得2,2-二甲基-5-甲氧基-7-对甲基苯磺酰氧基-2H-苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
4.根据权利要求3所述的土甘草A及其衍生物的制备方法，其特征在于，以甲醇为溶剂，2,2-二甲基-5-甲氧基-4-氧代-7-对甲基苯磺酰氧基-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯为原料，升温溶解后，待温度降至室温，置于低温反应器中，0℃-5℃下，以NaBH4为还原剂，1-3h内，分2-5次加完，搅拌反应，反应结束后，滴加酸溶液终止反应，旋干部分甲醇后，乙酸乙酯萃取，合并有机层，依次用饱和NaHCO3溶液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，甲醇重结晶，得2,2-二甲基-4-羟基-5-甲氧基-7-对甲基苯磺酰氧基-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
5.根据权利要求4所述的土甘草A及其衍生物的制备方法，其特征在于，以丙酮为溶剂，2,2-二甲基-5-羟基-4-氧代-7-对甲基苯磺酰氧基-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯为原料、K2CO3调节碱性，(Me)2SO4为甲基化剂依，回流搅拌反应，反应结束后，过滤除去碳酸钾，旋干丙酮后，用甲醇重结晶，得2,2-二甲基-5-甲氧基-4-氧代-7-对甲基苯磺酰氧基-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
6.根据权利要求5所述的土甘草A及其衍生物的制备方法，其特征在于，以丙酮为溶剂，2,2-二甲基-5,7-二羟基-4-氧代-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯与对甲苯磺酰氯为原料，回流搅拌反应，反应结束后，过滤除去碳酸钾，柱层析分离提纯,得到2,2-二甲基-5-羟基-4-氧代-7-对甲基苯磺酰氧基-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
7.根据权利要求6所述的土甘草A及其衍生物的制备方法，其特征在于，以无水二噁烷为溶剂、2,4,6-三羟基苯甲酸甲酯与3,3-二甲基丙烯酸为原料，加热搅拌反应，反应结束后，倾入冰水，饱和碳酸钾调节pH至中性，过滤，得粗产品，丙酮重结晶，即得2,2-二甲基-5,7-二羟基-4-氧代-2，3-二氢苯并吡喃-6-甲酸甲酯。
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Aryllead-mediated synthesis of linear 3-arylpyranocoumarins: synthesis of robustin and robustic acid;Dervilla M. X. Donnelly等;J. CHEM. SOC.;第1卷;第2531-2534页，sheme 1 *
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