CN104478897A - 噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类新型的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物（ I ）以及它的制备方法和在防治血栓药物中的应用。药理实验结果表明，这类化合物与灯盏乙素相比，具有更好的溶解性以及抗氧化、抑制PC12细胞氧化损伤、抗凝血等药理作用。本发明提供的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物（ I ）可用于由于血栓而导致的一系列疾病，例如心肌梗死、老年痴呆症、脑梗塞等由缺血性损伤引起的其它各种疾病。

Description

噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术研究领域，具体涉及一类新型的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物(I)，以及它的制备方法和在防治血栓药物中的应用。

背景技术

灯盏花又名灯盏细辛，别称灯盏菊、土细辛、地顶草、细辛草、东菊等，灯盏花性寒、微苦、甘温辛，具有散寒解表、祛风除湿、活血化瘀、通经活络、消炎止痛的功效。灯盏花素是从天然植物灯盏花中提取的黄酮类活性成份，有灯盏甲素、灯盏乙素等，主要为灯盏乙素(含量在95％以上)(陈一岳,王胜涛,曾文珊,朱颖虹,傅咏梅,江涛.灯盏花素对大鼠主动脉肌环的松弛作用.中药新药与临床药理.1994,5(2),15-19)。上世纪从70年代起灯盏花素制剂就开始应用于临床，其独特的疗效和安全低毒的特点已得到社会认可，现代药理研究证明，灯盏花素具有增加血流量、改善微循环、扩张血管、降低血粘度、降血脂、促纤溶、抗血栓、抗血小板聚集等作用，其注射剂和片剂已成为临床常用药品，在治疗心脑血管疾病、风湿性关节炎和中风后遗症等方面有显著的疗效。

但灯盏花素临床应用生物利用度比较低，一方面是溶解性差，文献报道灯盏花素在水中的溶解度仅为0.16mg·mL^-1(张海燕,平其能,郭健新,操锋.灯盏花素及其β-环糊精包合物在大鼠体内的药代动力学.药学学报,2005,40(6),563-567)，其次灯盏花素脂溶性也很差，在pH4.2的PBS溶液中，其logP为-2.56(操锋,郭健新,平其能,邵云,梁静.灯盏乙素酯类前药的合成、理化性质及降解研究.药学学报,2006,41(7),595-602)。另外灯盏花素的主要成分灯盏乙素在体内很容易代谢，葛庆华等人研究发现灯盏乙素在动物体内代谢消除速度快，Beagle犬口服绝对生物利用度仅(0.40±0.19)％(葛庆华,周臻,支晓瑾,马丽丽,陈秀华.灯盏花素在犬体内的药动学和绝对生物利用度研究.中国医药工业杂志,2003,34(12),618-621)，而家犬静注消除半衰期短，为(52±29)min(蒋学华,李素华,兰轲,杨俊毅,周静.灯盏花素在家犬体内的药代动力学.药学学报.2003,38(5),371-373)。冯芳等人研究了人体口服60mg小剂量灯盏乙素滴丸后的药动学参数，发现灯盏乙素在体内消除很快，生物半衰期仅为(2.27±0.58)min(冯芳,沈于兰.人血浆中痕量灯盏乙素SPE-HPLC/MS/MS的建立及药动学研究.中国药学杂志.2006,41(6),457)，灯盏乙素因其溶解性差和生物利用度低大大限制了其临床应用。

国内一些科研人员希望借助于开发灯盏花素新剂型，以提高其口服生物利用度或延长其体内半衰期。近几年来，已公开的发明专利多达59项，涉及注射剂、脂质体、磷脂复合物、口腔速崩片、舌下片、缓释微丸、渗透泵控释制剂、环糊精包合物、滴丸、自乳化剂等。但目前上市的新剂型不多，这表明通过剂型的改变不能很好的改善灯盏花素溶解性差、吸收差、生物利用度低的问题。

灯盏乙素在体内被水解掉葡萄糖醛酸基，形成灯盏乙素苷元是限制其生物利用度的主要原因。居文政等人测定灯盏乙素血药浓度及其临床药代动力学，受试者口服给药360mg灯盏乙素，在1、3、5、8h取血测灯盏乙素，但只有在5h时检测到20ng·mL^-1，而在血浆和尿中发现大量苷元，提示大量灯盏乙素在体内被水解为苷元(LiuY,HuM.Absorption and metabolismof flavonoids in the Caco-2 cell culture model and a perfused rat intestinal model.Drug MetabDispos,2002,30(4),370-377)。因此，如果在灯盏乙素苷元分子中引入不容易被代谢的特征官能团，将有利于提高其生物利用度。专利CN 102731459B(唐于平，李念光，段金廒.灯盏乙素苷元Mannich衍生物及其制备方法和应用)在灯盏乙素苷元8位通过Mannich反应引入烷胺基，既提高了水溶性，又因为此类化合物难以水解代谢，从而可以提高其体内生物利用度。另外在7位羟基以及8位碳引入噁嗪环，同样可以提高衍生物的水溶性及其代谢稳定性，在心脑血管疾病药物研究方面，将具有非常重大的意义。

发明内容：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，以灯盏乙素苷为原料经过苷水解、Mannich反应从而合成系列具有药用价值且溶解性好、生物利用度高、不良反应低、用药安全的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物，本发明另一个目的是提供噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法和其在制备防治血栓疾病药物中的应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明提供的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的通式(Ⅰ)如下：

其中R₁代表1～7个碳原子的烷基；

或者R₁代表苯基、苄基、苯乙基、芳香杂环基、取代苯基、取代苄基、取代苯乙基、取代芳香杂环基；

作为优选方案，以上所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物，所述的烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环己基或取代环己基；

所述的取代苯基、取代苄基、取代苯乙基和取代芳香杂环基的取代基为甲基、乙基、甲氧基、羟基、氟、氯或硝基。

本发明提供的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法，具体包括以下步骤：

a、取灯盏乙素(1)为起始原料，在浓硫酸的催化下，于95％乙醇溶液中加热水解，得到灯盏乙素苷元(2)，备用；

b、取步骤a得到的灯盏乙素苷元(2)在1,4-二氧六环溶液中，与伯胺中间体和36％的甲醛水溶液反应得到噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物(I)；

作为优选方案，以上所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法，步骤a中所用的浓硫酸的摩尔浓度为0.1～3mol/L，作为更优的方案，浓硫酸的摩尔浓度为3mol/L，灯盏乙素(1)与95％乙醇的质量体积用量比为5g/100ml～10g/100ml，反应温度为70～90℃；反应时间为3～6小时。

作为优选方案，以上所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法，步骤b中所用的甲醛与灯盏乙素(1)摩尔当量为1：1～2，伯胺类中间体与灯盏乙素(1)的摩尔当量为1：1～2，反应温度为30～108℃，反应溶剂为1,4-二氧六环、甲醇、乙醇等溶剂，反应时间为1小时～24小时。

作为优选方案，以上所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法，步骤b中所述的甲醛的体积浓度为35％～40％。

作为优选方案，以上所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法，步骤b中所述的伯胺中间体为取代基为1～7个碳原子的烷基、苯基、苄基、苯乙基、芳香杂环基、取代苯基、取代苄基、取代苯乙基或取代芳香杂环基的伯胺。

本发明提供的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物在制备防治权利要求1所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物在制备防治心肌梗死、缺血性损伤等血栓性疾病药物中的应用，作为优选方案，噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物分子结构中存在多个羟基，从而显示一定的酸性，可以把噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物和碱金属、碱土金属氢氧化物、碱金属碳酸盐或碱土金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐或碱土金属碳酸氢盐反应形成盐。

作为进一步优选方案，将噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物盐和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。

本发明提供的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物盐制成片剂时，把噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物盐和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

本发明提供的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物盐制成胶囊剂时把噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物盐和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

本发明提供的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物盐制成颗粒剂时，把组合物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

把本发明提供的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物盐制成注射液时，取噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物盐加入增溶剂，搅拌均匀，80℃加热30分钟，过滤，调节PH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。

有益效果：本发明提供的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物和现有技术现比具有以下优点：

1、本发明提供的系列噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物，通过在噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物选择性的连接酯溶性和水溶性官能团，得到的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物溶解性好，可提高人体服用后生物利用度，增强抗血栓药理活性，且不良反应低，用药更安全，且噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物可以和多种碱反应制备得到盐化物，并可制成多种药物剂型，方便临床用药。

2、本发明提供的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法，以灯盏乙素苷为原料经过苷水解、Mannich反应从而合成系列具有药用价值且溶解性好，生物利用度高的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的新化合物，本发明提供的制备方法，可操作性强，生产效率高，成本低，且成品得率高、纯度高。

附图说明

图1为本发明所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物(Ⅰ)的结构示意图。

图2为本发明所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物(Ⅰ)制备方法的反应流程图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1  5,6,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-4H-色酮(2)的制备

取灯盏乙素(1)(5g，10.82mmol)加入到3mol·L^-1的90％的浓硫酸乙醇溶液50mL中，120℃以N₂保护反应48h，反应结束后冷却，反应液倒入8倍量的水中，抽滤，滤饼水洗至中性，50℃干燥。滤饼以50％的乙醇反复重结晶得到产物2.63g。黄色粉末，产率85.5％。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:6.78(s,1H,C₃-H),6.73(s,1H,C₈-H),6.92(d,J＝8.8Hz,2H,C_3′,C_5′-H),7.92(d,J＝8.8Hz,2H,C_2′,C_6′-H),8.71(s,1H,C₆-OH),10.30(s,1H,C_4′-OH),10.44(s,1H,C₇-OH),12.79(s,1H,C₅-OH).ESI-MS:m/z 285[M-H]^-。

实施例2  I-17,8-(3″-甲基-4″-2H)-m-噁嗪-5,6,4′-三羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的合成

取甲胺(23mg,0.74mmol)，甲醛水溶液0.11mL(37％,1.48mmol)，20mL1,4-二氧六环，加入到100mL单颈烧瓶中，然后加入灯盏乙素苷元2(100mg,0.37mmol)，保持磁力搅拌反应，加热至回流反应4h，TLC控制反应时间。反应结束后，通过柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝40:1，可得黄色固体产物I-1107mg，收率85％。

I-1结构解析为：¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:2.18(s,3H,CH₃),4.54(s,2H,-CH₂-),5.65(s,2H,-CH₂-),6.84(s,1H,C₃-H),6.93(d,J＝8.7Hz,2H,C_3′,C_5′-H),7.92(d,J＝8.7Hz,2H,C_2′,C_6′-H),12.78(s,1H,C₅-OH).ESI-MS:m/z 342[M+H]⁺。

实施例3  I-27,8-(3″-苯基-4″-2H)-m-噁嗪-5,6,4′-三羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的合成

取苯胺(69mg,0.74mmol)，甲醛水溶液0.11mL(37％,1.48mmol)，20mL1,4-二氧六环，加入到100mL单颈烧瓶中，然后加入灯盏乙素苷元2(100mg,0.37mmol)，保持磁力搅拌反应，加热至回流反应14h，TLC控制反应时间。反应结束后，通过柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝40:1，可得黄色固体产物I-2 129mg，收率87％。

I-2的结构解析为：¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:4.59(s,2H,-CH₂-),5.62(s,2H,-CH₂-),6.78(s,1H,C₃-H),6.88-6.93(m,3H),7.14(d,J＝9.0Hz,2H,C_3′,C_5′-H),7.24-7.29(m,2H),7.98(d,J＝9.0Hz,2H,C_2′,C_6′-H),8.87(s,1H,C₆-OH),10.33(s,1H,C_4′-OH),12.70(s,1H,C₅-OH).ESI-MS:m/z 404[M+H]⁺。

实施例4  I-37,8-(3″-苄基-4″-2H)-m-噁嗪-5,6,4′-三羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的合成

取苯乙胺(90mg,0.74mmol)，甲醛水溶液0.11mL(37％,1.48mmol)，20mL1,4-二氧六环，加入到100mL单颈烧瓶中，然后加入灯盏乙素苷元2(100mg,0.37mmol)，保持磁力搅拌反应，加热至回流反应14h，TLC控制反应时间。反应结束后，通过柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝40:1，可得黄色固体产物I-3 136mg，收率88％。

I-3的结构解析为：¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:3.90(s,2H,-CH₂-),4.20(s,2H,-CH₂-),5.02(s,2H,-CH₂-),6.75(s,1H,C₃-H),6.94(d,J＝8.9Hz,2H,C_3′,C_5′-H),7.18-7.37(m,5H),7.82(d,J＝8.9Hz,2H,C_2′,C_6′-H),8.71(s,1H,C₆-OH),10.25(s,1H,C_4′-OH),12.72(s,1H,C₅-OH).ESI-MS:m/z 418[M+H]⁺。

实施例5  I-47,8-(3″-间甲氧基苯基-4″-2H)-m-噁嗪-5,6,4′-三羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的合成

取3-甲氧基苯胺(91mg,0.74mmol)，甲醛水溶液0.11mL(37％,1.48mmol)，20mL1,4-二氧六环，加入到100mL单颈烧瓶中，然后加入灯盏乙素苷元2(100mg,0.37mmol)，保持磁力搅拌反应，加热至回流反应16h，TLC控制反应时间。反应结束后，通过柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝40:1，可得黄色固体产物I-4 139mg，收率87％。

I-4的结构解析：¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:3.57(s,3H,CH₃),4.32(s,2H,-CH₂-),5.74(s,2H,-CH₂-),6.27(s,1H,C₃-H),6.58-6.61(m,1H),6.72-7.75(m,1H),6.83-6.86(m,1H),6.91(d,J＝8.4Hz,2H,C_3′,C_5′-H),7.93(d,J＝8.4Hz,2H,C_2′,C_6′-H),7.99-8.03(m,1H),8.70(s,1H,C₆-OH),10.29(s,1H,C_4′-OH),12.77(s,1H,C₅-OH).ESI-MS:m/z 434[M+H]⁺。

实施例6  I-57,8-(3″-邻甲氧基苯基-4″-2H)-m-噁嗪-5,6,4′-三羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的合成

取2-甲氧基苯胺(91mg,0.74mmol)，甲醛水溶液0.11mL(37％,1.48mmol)，20mL1,4-二氧六环，加入到100mL单颈烧瓶中，然后加入灯盏乙素苷元2(100mg,0.37mmol)，保持磁力搅拌反应，加热至回流反应16h，TLC控制反应时间。反应结束后，通过柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝40:1，可得黄色固体产物I-5 138mg，收率86％。

I-5的结构解析：¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:3.57(s,3H,CH₃),4.29(s,2H,-CH₂-),5.45(s,2H,-CH₂-),6.51-6.54(m,2H),6.58-6.62(m,2H),6.78-6.93(m,3H),8.02(d,J＝8.7Hz,2H,C_2′,C_6′-H),10.27(s,1H,C_4′-OH),12.65(s,1H,C₅-OH).ESI-MS:m/z 434[M+H]⁺。

实施例7  I-67,8-(3″-对甲氧基苯基-4″-2H)-m-噁嗪-5,6,4′-三羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的合成

取4-甲氧基苯胺(91mg,0.74mmol)，甲醛水溶液0.11mL(37％,1.48mmol)，20mL1,4-二氧六环，加入到100mL单颈烧瓶中，然后加入灯盏乙素苷元2(100mg,0.37mmol)，保持磁力搅拌反应，加热至回流反应16h，TLC控制反应时间。反应结束后，通过柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝40:1，可得黄色固体产物I-6 139mg，收率87％。

I-6的结构解析：¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:3.66(s,3H,CH₃),4.51(s,2H,-CH₂-),5.53(s,2H,-CH₂-),6.77(s,1H,C₃-H),6.83(d,J＝8.4Hz,2H,C_3′,C_5′-H),6.92(d,J＝9.0Hz,2H),7.06(d,J＝9.0Hz,2H),7.98(d,J＝8.4Hz,2H,C_2′,C_6′-H),8.87(s,1H,C₆-OH),10.34(s,1H,C_4′-OH),12.68(s,1H,C₅-OH).ESI-MS:m/z 434[M+H]⁺。

实施例8  I-77,8-(3″-对氯基苯基-4″-2H)-m-噁嗪-5,6,4′-三羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的合成

取4-氯苯胺(94mg,0.74mmol)，甲醛水溶液0.11mL(37％,1.48mmol)，20mL1,4-二氧六环，加入到100mL单颈烧瓶中，然后加入灯盏乙素苷元2(100mg,0.37mmol)，保持磁力搅拌反应，加热至回流反应18h，TLC控制反应时间。反应结束后，通过柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝40:1，可得黄色固体产物I-7 137mg，收率85％。

I-7的结构解析：¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:4.56(s,2H,-CH₂-),5.58(s,2H,-CH₂-),6.73(s,1H,C₃-H),6.96(d,J＝8.7Hz,2H,C_3′,C_5′-H),7.17(d,J＝9.0Hz,2H),8.06(d,J＝9.0Hz,2H),7.98(d,J＝8.7Hz,2H,C_2′,C_6′-H),9.18(s,1H,C₆-OH),10.37(s,1H,C_4′-OH),12.71(s,1H,C₅-OH).ESI-MS:m/z 438[M+H]⁺。

实施例9  I-8 7,8-(3″-间氯基苯基-4″-2H)-m-噁嗪-5,6,4′-三羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的合成

取3-氯苯胺(94mg,0.74mmol)，甲醛水溶液0.11mL(37％,1.48mmol)，20mL1,4-二氧六环，加入到100mL单颈烧瓶中，然后加入灯盏乙素苷元2(100mg,0.37mmol)，保持磁力搅拌反应，加热至回流反应18h，TLC控制反应时间。反应结束后，通过柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝40:1，可得黄色固体产物I-8 135mg，收率83％。

I-8的结构解析：¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:4.61(s,2H,-CH₂-),5.64(s,2H,-CH₂-),6.78(s,1H,C₃-H),6.91-6.95(m,3H),7.11(m,1H),7.24-7.31(m,2H),8.02(d,J＝8.7Hz,2H,C_2′,C_6′-H),8.92(s,1H,C₆-OH),10.34(s,1H,C_4′-OH),12.73(s,1H,C₅-OH).ESI-MS:m/z 438[M+H]⁺。

实施例10  I-9 7,8-(3″-邻氯基苯基-4″-2H)-m-噁嗪-5,6,4′-三羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的合成

取2-氯苯胺(94mg,0.74mmol)，甲醛水溶液0.11mL(37％,1.48mmol)，20mL1,4-二氧六环，加入到100mL单颈烧瓶中，然后加入灯盏乙素苷元2(100mg,0.37mmol)，保持磁力搅拌反应，加热至回流反应18h，TLC控制反应时间。反应结束后，通过柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝40:1，可得黄色固体产物I-9 136mg，收率84％。

I-9的结构解析：¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:4.38(s,2H,-CH₂-),5.65(s,2H,-CH₂-),6.52-6.54(m,2H),6.62-6.66(m,2H),6.71-6.85(m,3H),8.00(d,J＝8.7Hz,2H,C_2′,C_6′-H),10.32(s,1H,C_4′-OH),12.69(s,1H,C₅-OH).ESI-MS:m/z 434[M+H]⁺。

实施例11  噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物溶解性测定

药物溶解性等理化性质可以影响药物的吸收及其生物利用度，灯盏乙素主要在具有弱碱性的肠道内吸收，但是由于其水溶性酯溶性差、体内容易代谢而影响了其生物利用度，为了考查噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物在弱碱性溶液中的溶解度，采用紫外分光光度法测定。

取灯盏乙素及其实施例2制备得到的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物I-1至I-9各1mg，用少量甲醇溶解，然后加甲醇定容至100ml容量瓶中，即得化合物10μg/ml的标准溶液。

各取对照品标准溶液3、4、5、6、7、8ml，分别置于25ml容量瓶中，加甲醇至刻度，配制浓度为1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2μg/ml的对照品工作溶液6份，用UV分光光度计测定333nm处的吸光度，然后讲吸光度与对照品溶液浓度进行线性回归，得到标准曲线方程。

取待测化合物分别置于10ml容量瓶中，分别加入0.15mol/L NaHCO₃溶液2ml，20℃下分别加入正丁醇4ml,密闭，涡旋10min，进行离心处理，转速为30000r/min，分别吸取上层(正丁醇)和下层水溶液，测定吸收度方法同上，通过得到的吸光度计算化合物在各相中的浓度。

表1  噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物在0.15mol/L NaHCO₃溶液溶解度数据

通过表1可以看出，灯盏乙素在0.15mol/LNaHCO₃溶液中和在正辛醇中的溶解度分别为2.9922mg/ml和0.2138mg/ml，而本发明制备得到的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的水溶性和酯溶性比灯盏乙素得到了明显的提高，因此具有更好的溶解性，可大大改善生物利用度，取得了很好的技术效果。

实施例12  噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物体外清除DPPH自由基活性研究

医学研究表明自由基通过损伤细胞膜的结构和功能从而引起各种疾病的发生，如衰老、肿瘤、炎症及脑缺血等。体外检测抗氧化剂清除自由基方法中以清除DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)自由基最为常用。DPPH溶液在517nm处具有较强吸收，当有供氢能力的抗氧化剂存在时，与DPPH耦合使DPPH紫色消退或减弱(如下图)，且吸光度与自由基被清除的程度呈线性关系，通过加入抗氧化剂前后吸光度的线性变化计算自由基清除率。

如果受试药能够清除DPPH自由基，则提示该药物具有降低体内羟自由基、烷自由基或过氧自由基等自由基的有效浓度，打断脂质过氧化链反应的作用。研究认为黄酮类化合物抗氧化能力主要受酚羟基的取代模式及数目是影响，黄酮类化合物的酚羟基H所带正电荷越大，接受电子能力越强越易与自由基结合。黄酮类化合物与自由基反应后形成半醌式自由基结构，在一定程度上增加酚羟基的数目可以提高黄酮类化合物的抗氧化活性。邻酚羟基形成半醌式自由基后可产生分子内氢键，分子内氢键能明显降低体系能量使半醌式自由基更稳定，能够形成分子内氢键越多，化合物抗氧化活性越高。研究比较灯盏乙素苷元-7-位糖基衍生物对自由基的清除作用，对于防治缺血性脑血管病和开发新药具有重要的意义。

材料与方法

采取微孔板法，在517nm处测定灯盏乙素及其噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物对DPPH自由基的清除率，比较评价灯盏乙素及其噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的体外抗氧化活性。

实验方法：将受试药物与DPPH用无水乙醇溶解。分别把100μL受试物(最高浓度为500μmol·L^-1)加到96孔板中，然后加入100μL DPPH溶液(最终浓度为80μmol·L^-1)，振摇均匀，避光反应30分钟，在517nm处测定吸光值。按照以下公式计算自由基清除率：

A₀：溶剂与DPPH作用后的吸光度；A₁：受试物与DPPH作用后的吸光度；A₂：未加DPPH时的吸光度。

表2  噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物抗氧化活性数据

从表2可以看出，有些化合物如噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物I-4、I-5、I-6的抗DPPH氧化活性要强于灯盏乙素，其IC₅₀值分别为24.57μM、22.58μM、23.67μM，而灯盏乙素抗DPPH氧化活性的IC₅₀值为26.78μM。

实施例13  噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物体外PC12细胞氧化损伤模型的保护活性实验

实验原理：灯盏乙素对心脑缺血再灌注后损伤保护作用机制目前尚不清楚。有研究认为是心脑组织缺血再灌注后，组织中的氧化自由基(ROS)大量产生，从而造成细胞的氧化损伤。分化的PC12细胞在形态和功能上具有典型的神经内分泌细胞的特征，被广泛用于研究神经元细胞死亡机制、神经生长因子的作用机制、神经用药的疗效和毒理作用等。H₂O₂是氧化自由基(ROS)的主要成分之一，是一种常用的细胞氧化应激诱导剂，广泛用于诱导细胞凋亡模型的研究。

研究发现灯盏乙素对过氧化氢(H₂O₂)和谷氨酸诱导的PC12细胞氧化损伤有显著的保护作用，能显著改善PC12细胞氧化还原能力、抑制H₂O₂诱导的细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻、抑制H2O2诱导的DNA氧化断裂、抑制caspase-3活性、促进Bcl-2基因的mRNA表达、降低细胞内活性氧自由基(ROS)和Ca²⁺的浓度、稳定线粒体膜电位等。研究广泛认为灯盏乙素可以提高脑缺血病理状态下神经细胞氧化还原的能力，防治脑缺血神经细胞损伤。在灯盏乙素的活性评价体系中常以PC12细胞为体外模型，以H₂O₂与PC12细胞作用模拟细胞的氧化损伤，研究灯盏乙素对PC12细胞拟缺血性损伤的保护作用。

MTT法是利用活细胞线粒体中存在的与NADP相关的脱氢酶能使外源性的溴化四氮唑蓝(MTT)还原，生成成难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中，死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)或三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/L HCl)能够溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其吸光值间接反映其活细胞数量。

操作方法：取同一代PC12细胞，消化后按5×10⁴·mL^-1接种于96孔板中，每孔100μL，放入培养箱继续培养24h。将实验分为空白对照组和H₂O₂损伤模型，每组设5个复孔。空白对照组为无血清的DMEM培养液。H₂O₂损伤模型组为选取400μmol·L^-1的H₂O₂损伤时间1小时后，加入100μL受试药物，考察受试药物浓度分别为400μmol·L^-1(高)、200μmol·L^-1(中)、100μmol·L^-1(低)时对PC12细胞氧化损伤模型的保护活性。

MTT法检测细胞活力：加入20μL MTT(5mg·mL^-1)，置培养箱中孵育4h后避光加入150μL DMSO，轻轻振摇10分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪检测在570nm处的吸光度(OD值)。

样品以DMSO溶解，培养液稀释至2.5％，受试药的终浓度为100μmol·L^-1，灯盏乙素作为阳性对照；数据均以表示，组间用t检验，实验结果见表3。

表3：噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物体外H₂O₂诱导的PC12细胞氧化损伤模型的保护活性

从以上活性数据可以看出，噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物，尤其是I-4、I-5、I-6化合物对H₂O₂诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用比灯盏乙素更强，显示出了很好的活性。

实施例14  噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物对大鼠凝血酶时间的影响

目前，抗血栓化合物的筛选常规方法是考察化合物抑制血小板聚集的活性和对凝血酶时间的影响，本发明通过测定化合物对凝血酶时间的影响来考察各化合物抗血栓活性。

具体方法：取健康雄性家兔，30mg/kg家兔体重的戊巴比妥钠生理盐水溶液耳缘静脉注射麻醉，手术分离颈总动脉取血，收集于塑料离心管中，3.8％枸橼酸钠水溶液抗凝(血与抗凝剂体积比为9:1)。800r/min离心10min，制备富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)，3000r/min离心10min，制备贫血小板血浆(Platelet-poor plasma，PPP)。

将灯盏乙素苷作为对照组，噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物作为实验组，将样品溶于80％乙醇中，配成初始浓度分别约为1.2mg/ml、0.6mg/ml、0.3mg/ml、0.15mg/ml、0.075mg/ml的溶液。

PT(凝血酶原时间)的测定：

原理：凝血活酶与钙离子混合物能使凝血酶原转变为凝血酶，凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白凝块，凝块形成的时间与血浆中的外源性凝血因子含量呈负相关。

方法：测试杯中加入溶媒或受试样品10μL、PPP50μL，在37℃预温孔内预温3min，将测试杯转入测试通道，加入37℃预温的诱导剂PT试剂100μL，记录PPP凝固的时间。

APTT(活化部分凝血活酶时间)的测定：

原理：待测血浆加入活化部分凝血活酶溶液，纤维蛋白原转变为纤维蛋白，测定凝固所需的时间，即为待测血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)。如果内源性途径有缺陷，凝固时间即延长，并与单因子缺乏的程度成正比。同样也与内源性途径所需因子的累积缺乏成正比。

方法：测试杯中溶媒或受试样品10μL、加入PPP 50μL和预温的APTT试剂50μL，在37℃预温孔内预温5min，将测试杯转入测试通道，加入37℃预温的诱导剂CaCl₂试剂50μL，记录PPP凝固的时间。

TT(凝血酶时间)的测定：

原理：待测血浆加入标定的凝血酶溶液，纤维蛋白原转变为纤维蛋白，测定凝固所需的时间，即为待测血浆凝血酶时间(TT)。

方法：测试杯中加入溶媒或受试样品10μL、PPP 50μL，在37℃预温孔内预温3min，将测试杯转入测试通道，加入室温的诱导剂TT试剂50μL，记录PPP凝固的时间。

FIB(纤维蛋白原)的测定：

原理：定量测定纤维蛋白原是普遍使用的经典方法，这种方法是在加入凝血酶后测定稀释血浆的凝集时间。

方法：①：标准曲线的制备：将复溶后的定值血浆分别制成1:5、1:10、1:15、1:20、1:30的稀释血浆。取不同浓度的稀释血浆各200μL，37℃预温3分钟，然后分别加入FIB试剂100μL，测定凝固时间，由血凝仪自动生成曲线并保存。②：测试杯中加入溶媒或受试样品10μL、PPP 50μL，在37℃预温孔内预温3min，将测试杯转入测试通道，加入室温的凝血酶(FIB)50μL，记录PPP凝固的时间或浓度。

以上所有实验数据以表示，组间均数比较采用t检验，具体实验结果如表4所示。

表4  部分化合物对凝血酶时间和血小板聚集活性的影响情况

从以上表4的实验结果表明，噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物I-1、I-4、I-5与I-6的抗凝血活性比灯盏乙素更强，其TT、PT、APTT比灯盏乙素长，而FIB比灯盏乙素低。噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物I-2抗凝血活性与灯盏乙素活性相当。

由以上表实验结果表明，和对照组灯盏乙素相比，本发明提供的具有通式Ⅰ的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物，能显著提高水溶性、酯溶性、DPPH抗氧化活性、PC12细胞氧化损伤保护活性以及抗凝血活性，尤其是化合物I-4、I-5与I-6，在水溶性好与灯盏乙素的同时，具有比灯盏乙素更加优越的DPPH抗氧化活性、PC12细胞氧化损伤保护活性以及抗凝血活性，取得了非常好的技术效果。

并且，本发明可以把噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物和碱反应制备得到系列盐化物，以进一步改善水溶性，从而制备成不同剂型，因此本发明提供的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物及其盐化物有望进一步开发成为治疗心肌梗塞、缺血性损伤、中风等血栓性疾病的药物。

Claims (8)

1.噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物，其特征在于，它们是具有通式(Ⅰ)所示的化合物：

其中R₁代表1～7个碳原子的烷基；

或者R₁代表苯基、苄基、苯乙基、芳香杂环基、取代苯基、取代苄基、取代苯乙基、取代芳香杂环基。

2.根据权利要求1所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物，其特征在于，所述的烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环己基或取代环己基；

所述的取代苯基、取代苄基、取代苯乙基和取代芳香杂环基的取代基为甲基、乙基、甲氧基、羟基、氟、氯或硝基。

3.权利要求1或2所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a、取灯盏乙素(1)为起始原料，在浓盐酸的催化下，在体积难度为95％乙醇溶液中加热水解，得到灯盏乙素苷元(2)，备用；

b、取步骤a得到的灯盏乙素苷元(2)与伯胺中间体和甲醛水溶液反应得到噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物(I)

4.根据权利要求3所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法，其特征在于，步骤a中所用的浓盐酸的摩尔浓度为0.1～3mol/L，灯盏乙素(1)与95％乙醇的质量体积比为5g/100ml～10g/100ml，反应温度为70～90℃；反应时间为3～6小时。

5.根据权利要求3所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法，其特征在于，步骤b中所述的甲醛的体积浓度为35％～40％。

6.根据权利要求3所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法，其特征在于，步骤b中所述的伯胺中间体为取代基为1～7个碳原子的烷基、苯基、苄基、苯乙基、芳香杂环基、取代苯基、取代苄基、取代苯乙基或取代芳香杂环基的伯胺。

7.根据权利要求3所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物的制备方法，其特征在于，步骤b中所用的甲醛与灯盏乙素苷元(2)的摩尔当量为1：1～2，伯胺类中间体与灯盏乙素苷元(2)的摩尔当量为1：1～2，反应温度为30～108℃，反应溶剂为1,4-二氧六环、甲醇或乙醇，反应时间为1～24小时。

8.权利要求1或2所述的噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物在制备防治心肌梗死、缺血性损伤的血栓性疾病药物中的应用。