CN101966194B

CN101966194B - 野黄芩苷及其衍生物的新用途

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Publication number: CN101966194B
Application number: CN2009100601337A
Authority: CN
Inventors: 张艺; 孟宪丽; 张静
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2009-07-28
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2029-07-28
Also published as: CN101966194A

Abstract

野黄芩苷及其衍生物在制备脑神经保护剂的药物中的用途。以野黄芩苷为原料结构修饰的野黄芩苷素和野黄芩苷乙酯均有明显脑神经保护活性，且野黄芩苷乙酯可透过血脑屏障，直接到达靶器官，是较理想的脑神经保护剂候选药物。

Description

野黄芩苷及其衍生物的新用途

技术领域

本发明涉及野黄芩苷及其衍生物的新用途。

背景技术

中风病又名卒中，是以突然昏仆、半身不遂、口舌歪斜、言语蹇涩或不语、偏身麻木为主症，并具有起病急、变化快的特点，好发于中老年的一种疾病，是中老年人的常见多发病，严重威胁着人类的生存和健康。本病相当于西医学的缺血性脑血管病(Ischemic Cerebral vascular Disease，ICVD)，亦称缺血性卒中，具有较高的病死率及致残率，严重威胁着人类的健康和生命安全(饶明俐，林世和.脑血管疾病.人民卫生出版社，2002.172)。作为一种常见病、多发病，ICVD尤其是局限性脑梗死已经与心脏病、恶性肿瘤并列多数国家的三大致死疾病。流行病学调查发现，我国属于该病高发地区之一(陈捷.缺血性脑卒中的流行病学.实用心脑肺血管病杂志.2000，8(3)：179～181)。祖国医学认为，中风病其病位在脑，与心、肾、肝、脾密切相关，为本虚标实之证，病因病机复杂，本虚在于肝肾不足，气虚血少；标实乃肝风内动，风火相煽，火热内郁，痰湿壅盛，最终导致痰瘀内阻，随气机上逆，扰乱清空，蒙蔽清窍，成上实下虚，阴阳不相维系之危急证候。其突然昏仆不省人事之症状，又可纳入窍闭神昏之范畴。据统计，在中风的证候分类中，血瘀证为主导地位，占中风病的73％以上(陶根鱼，杜晓泉.益气活血法在缺血性中风病中的地位[J].陕西中医学院学报，1998，21(3)：1)。缺血性中风的病机虽然复杂，但归结起来，主要矛盾在于瘀血阻滞。近10年来，中、西医界对活血化瘀法治疗缺血性中风进行了深入的临床及实验研究，活血化瘀法治疗缺血性中风病的疗效已基本得到肯定，其临床报道也较多。

在急性缺血性脑卒中(AIS)的治疗中，神经保护剂的作用在于减轻缺血后的细胞损害，延迟神经细胞死亡，争取时问恢复脑灌注，延长治疗时间窗。

灯盏花素是从灯盏细辛中提取出来的黄酮类成分，主要由灯盏乙素和灯盏甲素组成，其公认的有效化学成分是灯盏乙素，又名野黄芩苷(Scutellarin)，结构式为5，6，4’-三羟基黄酮-7-葡萄糖醛酸苷。

野黄芩苷

Scutellarin

分子式C₂₁H₁₈O₁₂分子量462

目前，对灯盏花素的药理学活性研究主要是围绕其有效成分野黄芩苷进行。研究结果表明，野黄芩苷具有扩张血管、减少血小板计数和抑制血小板凝集等作用。临床主要用于脑梗死、中风后偏瘫、冠心病心绞痛及防治急性心肌梗死再灌注损伤等。(崔建梅，吴淞.野黄芩苷的研究进展[J].天然产物研究与开发，2003，15(3)：255；万丽丽，等，野黄芩苷药动学研究进展，《中国药房》，2007年18卷30期)目前尚无野黄芩苷及其衍生物用于脑神经保护剂的相关报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供了野黄芩苷及其衍生物的新用途，具体地，是在制备脑神经保护剂的药物中的用途。

本发明提供了涉及野黄芩苷及其衍生物在制备脑神经保护剂的药物中的用途。

其中，所述的药物是治疗缺血性中风的药物。

其中，所述的野黄芩苷衍生物为野黄芩苷乙酯。

本发明还提供了一种脑神经保护剂，它是由有效量的野黄芩苷及其衍生物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药剂。

其中，所述的药剂是注射制剂或口服制剂。

以野黄芩苷为原料结构修饰的野黄芩苷素和野黄芩苷乙酯均有明显脑神经保护活性，且野黄芩苷乙酯可透过血脑屏障，直接到达靶器官，是较理想的脑神经保护剂候选药物。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1本发明药物的制备

同时对野黄芩苷进行了简单的结构修饰，得野黄芩苷苷元(野黄芩素)、野黄芩苷乙酯。

材料与仪器：野黄芩苷(玉溪万方天然药物有限公司提供，自制纯化，主要含野黄芩苷，含量大于95％)

GC/MS-QP5050A气质联用仪(岛津公司)、SOR37傅里叶红外光谱仪(BRUKER公司)，核磁共振仪同第二章，XW-80A旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)，数显恒温水浴锅(金坛市金城国胜实验仪器厂)，R-124旋转蒸发仪(BUCHI)，SHZ-D循环水式真空泵(巩义市予华仪器厂)，YP202N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)等。

试剂无水甲醇、无水乙醇、磷酸、乙酸酐、浓硫酸、乙酸乙酯、碳酸钙、正辛醇、碳酸氢钠等(均为分析纯，重庆川东化工有限公司化学试剂厂)，柱层析硅胶(100~200目，青岛海洋化工厂)

1野黄芩苷水解成野黄芩素

1.1合成原理

对于黄酮苷类成分，采用酸水解的方法，野黄芩苷在硫酸催化条件下水解，再对反应物进行分离精制的直接水解法。合成原理如下：

野黄芩苷苷元结构式

1.2实验步骤

称取野黄芩苷3g，置于250mL圆底烧瓶中，加20％硫酸溶液100mL，100℃回流18小时后，冷却至室温，用正丁醇萃取三次(100mL×3)，水洗正丁醇层至中性，减压回收正丁醇至干，残留物用乙醇重结晶，得淡黄色产物0.73g，收得率为39.60％。结构鉴定数据：m.p.353-360℃；UV：λ_max(acetonitrile)282.1、335.8nm；IR(KBr)cm^-1：3442(υ_OH)、1664~1560(υ_C＝O+υ_C＝C)、1180(υ_C-O)、833(δ_＝CH)；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：6.74(1H，s，H-8)、6.58(1H，s，H-3)、7.91(2H，d，J＝8.8Hz，H-2’，6’)、6.92(2H，d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)；MS m/z：286[M⁺]、168、140、69。纯度检测：用HPLC法。条件：C₁₈柱、柱温30℃、流速1mL·min^-1、波长330nm、流动相：乙腈-0.4％甲酸(30∶70)。用归一法测得野黄芩苷苷元含量大于98％。

2野黄芩苷羧基上乙酯化制备野黄芩苷乙酯

2.1合成原理

由于野黄芩苷在乙醇中溶解度较小，难和乙醇直接反应。野黄芩苷可溶解在热的NaHCO₃碱液中，使之反应成钠盐。钠盐与溴乙烷在催化条件下反应得到其乙酯化产物^[。合成原理如下：

野黄芩苷乙酯结构式

2.2实验步骤

称取野黄芩苷5.0g，置于100mL圆底烧瓶中，加水50mL，搅拌下缓慢地加入NaHCO₃0.89g，室温搅拌0.5h后，在50℃反应0.5小时，冷却至室温，滤过，滤液减压回收溶剂至干得钠盐。将钠盐5.55g混悬于DMF(二甲基甲酰胺)35mL中，加入溴乙烷3mL和催化剂KI 0.1g，搅拌，升温到120℃，TLC检测反应(甲醇-水＝15∶1)，约4小时后停止反应。将反应物倒入100mL的冰水混合物中，用乙酸乙酯萃取(4×50mL)，合并乙酸乙酯层，依次用2％ NaS₂O₃30mL，饱和的NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压回收乙酸乙酯层得油状物，用少量乙酸乙酯研磨油状物后，于冰箱中冷藏过夜，过滤所得黄色固体用甲醇重结晶，得到产物0.68g，收得率为12.79％。结构鉴定数据：m.p.257-260.2℃；UV：λ_max(acetonitrile)282.2、335.7nm；IR(KBr)cm^-1：3423(υ_OH)、1572-1730(υ_C＝O+υ_C＝C)、1180(υ_C-O)、837(δ_＝CH)；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：7.93(2H，d，J＝8.8Hz，H-2’，H-6’)、7.00(1H，s，H-8)、6.94(2H，d，J＝8.8Hz，H-3’，H-5’)、6.82(1H，s，H-3)，5.26(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″)、4.14(2H，m，-CH2-)、3.46～3.33(4H，m，H-2″～H-5″)、1.21(3H，t，J＝7.2Hz，-CH3-)；FAB-MS(m/z)：490[M⁺]、285、163、88；纯度检测：采用HPLC法。条件：C₁₈柱、柱温30℃、流速1mL·min^-1、波长330nm、流动相：乙腈-0.4％甲酸(1∶3)。用归一法测得野黄芩苷乙酯含量大于98％。

以下通过药效试验证明本发明的有益效果。

1、材料与仪器

1.1药品与试剂

野黄芩素、野黄芩苷乙酯等均为自制。

胰蛋白酶，II型胶原酶，胎牛血清(Gibco公司)，多聚赖氨酸，DMEM高糖培养基，四甲基偶氮唑盐(Sigma公司)，其余试剂均为国产分析纯。

1.2试验动物

SD乳鼠(出生1d内)，由成都中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(川)2004-11。实验观察室：成都医学院药理实验室。

1.3主要仪器

酶标仪(Multiskan MK3)，CO₂孵箱(Thermo)，倒置相差显微镜(Nikon)，超纯水器(Sartorius)，LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)，LDZX-40BI型自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)等。

2、方法

2.1实验步骤

铺板：取96孔板，每孔加入0.1mg·mL^-1多聚赖氨酸50μL，振荡均匀，室温静置过夜，备用。

制备细胞悬液：将乳鼠断颈处死，75％酒精浸泡消毒，无菌条件分离大脑皮层组织，尽量除去脑血管膜，置入冰Hanks液中漂洗3次。将所获组织剪成1mm3组织块，用0.25％的胰蛋白酶+0.05％ II型胶原酶37℃下消化，30min后加入培养液终止消化，用75μm细胞筛网滤过。将滤液1000r·min^-1离心8min，弃上清液。加入完全培养液(900mL·L^-1 DMEM高糖培养基，100mL·L^-1胎牛血清，L-谷氨酰胺0.45g·L^-1，NaHCO₃3g·L^-1，HEPES 4.5g·L^-1，青霉素1×10⁵U·L^-1，链霉素1×10⁵U·L^-1)，吸管吹打使之分散均匀制成单细胞悬液。计数并调整培养液量使每mL含1×10⁶个细胞。

接种培养和药物加入方法：将细胞悬液接种于经包被的96孔板中，每孔100μL培养24h后换液，72h后加入阿糖胞苷以抑制非神经细胞生长，以后每2d半量换液，第7d换液后根据实验要求，分别加入各种质量浓度梯度的各受试药物(设5个剂量组，按一定比例稀释)，每孔总体积200μL，同时加入培养液作为空白对照组继续培养。

2.2MTT微量自动比色法

加入药物作用1d后，每孔加入MTT液(四甲基偶氮唑盐，5mg·mL^-1)，继续培养4h后，去上清液，PBS液漂洗2次，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，充分振荡，室温静置10min，用酶标仪于492nm波长处测定吸收值。

3、结果

1、本发明化合物对大脑皮层神经细胞存活的影响

从表1-2中的黄酮类成分的统计结果可看出，与空白对照组比较，野黄芩苷高浓度时能明显促进大脑皮层神经细胞存活的作用(P＜0.01)，野黄芩素在中浓度和低浓度有促进大脑皮层神经细胞存活的作用(P＜0.05)。

表1野黄芩素对体外培养大脑皮层神经细胞存活的影响(X，n＝6)

Tab.1 Eeffect of Scutellarin and Apigenin on rat cerebral cortexnerve cells in vitro(X，n＝6)

表2野黄芩苷乙酯对体外培养大脑皮层神经细胞存活的影响(X，n＝6)

Tab.2 Eeffect of glycolamide ester of scutel larin on rat cerebralcortex nerve cells in vitro(X，n＝6)

4小结与讨论

研究结果表明：野黄芩苷结构修饰的化合物野黄芩素和野黄芩苷乙酯在中浓度均有促进大脑皮层神经细胞存活的作用，具有脑神经保护活性，可进一步进行透BBBM实验。

试验例2体外血脑屏障模型建立及透血脑屏障

由于血脑屏障的存在，几乎所有大分子药物和98％的小分子药物都不能进入大脑及中枢神经系统，而药物能否跨越血脑屏障并达到有效的治疗浓度是至关重要的。为寻找和进一步分析灯盏细辛脑靶向神经保护的药效物质基础，本实验采用原代脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞共培养模型体外模拟血脑屏障。用高效液相色谱分析，在8h内不同时间点测定灯盏细辛中脑神经保护有效成分的透过率。

1、材料与仪器

日本岛津LC-10A高效液相色谱仪，SPD-10AV紫外检测器；SCL-10A系统控制器；CBL恒温箱，N2000色谱数据工作站。氮吹仪(KL-512，北京康林科技有限责任公司)：高速离心机(centrifuge 5417c，eppendorf公司)：超声波清洗仪(AS10200，天津奥特赛恩斯仪器有限公司)

甲醇、乙腈(Fisher公司，色谱纯)，野黄芩苷自制，以AC培养液溶解，0.22μm滤膜过滤后备用，制成0.2mg·mL^-1野黄芩苷。

2、方法与结果

2.1样品制备

选择试漏实验阳性的孔进行通透性实验，向供池中加入野黄芩素(0.2mg·mL^-1)、野黄芩苷乙酯(0.2mg·mL^-1)受池中加600μL AC培养液。在第0、1、2、4、8小时分别从受池中小心收集滤液各100μL、50μL、50μL、50μL、50μL于-20℃保存，待所有取样结束后做样品处理。其中0小时为空白对照，向供池内加入的药液为供池的起始浓度(参见图5-1)。将各样品氮气吹干(37℃)，分别向其中加入甲醇，超声处理20min，离心(5000r·min-1×10min)，取上清液，作HPLC分析供试品溶液。

2.2HPLC分析

色谱条件：岛津LC-10A高效液相色谱仪；色谱柱：为十八烷基硅烷键合硅胶柱，依利特SinoChrom ODS-BP 5μm(250×4.6mm)柱号：E1817666，流速：1mL·min^-1；柱温：室温；流动相：乙腈：0.6％甲酸。检测波长为330nm。

分别精密吸取20μL供试品溶液注入高效液相色谱仪，进行检测。

2.3透过率计算

根据HPLC测定结果，取以下公式计算透过率。

其中A_受池为受池样品的峰面积，A_供池为供池峰面积，V_受池为受池体积，V_供池为供池体积。计算结果见表3。

表3透体外BBBM成分透过率

Tab.3 The permeability of compounds on the in vitro BBB model

编号	化合物	供池峰面积	供池体积(μl)	8h受池峰面积	受池体积(μl)	透过率(％)
							7	野黄芩素	5624.88	300	-	650	-
8	野黄芩苷乙酯	7478.89		3000.5	650	86.93

3 小结与讨论

野黄芩苷不能透过BBBM。结构修饰后产物油水分配系数提高了10³~10⁵倍以上，更利于透过血脑屏障。野黄芩苷乙酯可透过BBBM。而野黄芩素不能透过BBBM，野黄芩素可能由于羟基太多，容易形成氢键，不易透过血脑屏障，但其有较好的脑神经保护作用，可进一步进行结构修饰。野黄芩苷乙酯既有明显的脑神经保护活性，又可以透过血脑屏障，为新的透血脑屏障的脑神经保护有效成分。

Claims

1.野黄芩苷乙酯在制备脑神经保护剂的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗缺血性中风的药物。