CN107663188A - 一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及其制备方法和用途，是利用大孔吸附树脂技术并结合聚酰胺柱色谱制备得到地骨皮木脂素酰胺类生物碱提取物，并鉴定出地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物中含有11种木脂素酰胺类化合物。同时，本发明对地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及11种木脂素酰胺类化合物进行体外降血糖实验，结果表明，地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及11种木脂素酰胺类化合物均表现出极强的α‑葡萄糖苷酶抑制活性，其强度均超过阳性药物阿卡波糖。因此本发明地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及木脂素酰胺类化合物的研究为研制新的降血糖药物提供了新的先导化合物，具有很好的开发应用前景。

Description

一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及其制备方法和 用途
技术领域
本发明涉及一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及其制备方法和用途，属于医药领域。
背景技术
糖尿病是人体内胰岛素缺乏或者相对缺乏而引起的一种以慢性高血糖为特征的终身性代谢性疾病。糖尿病不仅是心血管疾病的危险因素，同时还会导致一系列并发性疾病。目前我国有1.139亿成年人患糖尿病，是世界上糖尿病患者最多的国家。目前临床上使用的Ⅱ型降糖类药物主要有磺酰脲类、双胍类和α-糖苷酶抑制剂三大类，但多数具有一定的毒副作用，限制了其临床应用。因此，积极开发更安全、有效的新型降糖药物是非常必要和紧迫的。
地骨皮(Lycium chinense Mil1.)为茄科(Solanaceae)枸杞属植物枸杞的干燥根皮，主产于东北、河北、山西、陕西、甘肃等地，资源丰富。地骨皮为我国常用中药，用药历史悠久，具有凉血除蒸、清肺降火之功效。临床上用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、肺热咳嗽、咳血、内热消渴等症。现代药理研究表明地骨皮在降血糖、降血压、降血脂、解热、抗病毒等方面具有显著的活性。化学成分研究表明该植物主要含有生物碱、黄酮类、木脂素类、甾体类、萜类和苷类等成分。木脂素酰胺类生物碱是自然界中一类特殊的生物碱，主要存在茄科植物中，具有复杂多样的分子结构。由于地骨皮中的木脂素酰胺类生物碱多具有酚羟基，同时由于酰基的存在使得其化学性质较为特殊，虽属于生物碱，但往往不具有碱性，难以采用一般的生物碱类成分的提取方法进行富集。尽管文献报道了通过系统溶剂萃取并结合正相和反相硅胶分离该类成分单体化合物的方法[J.X.Zhang,S.H.Guan,R.H.Feng,et al,Neolignanamides,lignanamides,and other phenolic compounds from the root barkof Lycium chinense,J.Nat.Prod.76(2013)51–58；H.Chen,Y.J Li,Y.J Sun,et al,lignanamides with potent antihyperliperlipidemic activities from the rootbark of Lycium chinense,Fitoterapia 122(2017)119-125]，但有关富集制备总木脂素酰胺类生物碱的方法尚无报道，也未发现含有木脂素酰胺类生物碱的地骨皮提取物或者木脂素酰胺类生物碱单体化合物具有降血糖作用的报道。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供了一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及其制备方法和用途，所述的地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物具有降血糖的作用。
本发明的技术方案是：
一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物，具体提取方法如下：
(1)取地骨皮，粉碎，用8倍地骨皮重量的体积分数95％乙醇回流提取3次，提取时间为2h；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至0.5g生药/ml，得到地骨皮提取液；
(2)将地骨皮提取液上样于AB-8大孔吸附树脂层析柱，然后依次用10BV的水，6BV的体积分数10％乙醇洗脱，再用6BV的体积分数30％乙醇洗脱，最后用6BV的体积分数50％乙醇洗脱，收集体积分数50％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到浓缩液；
(3)将浓缩液上样于聚酰胺树脂柱上，然后依次用5BV的水，3BV的体积分数70％乙醇洗脱，再用3BV的氨水洗脱，收集氨水洗脱液，减压浓缩，得到氨水洗脱物；
(4)将氨水洗脱物用甲醇超声溶解，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上样于Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱上，然后用甲醇洗脱，收集黄色条带部分，减压浓缩干燥，即得。
所述的氨水的质量分数为1％～20％；所述的离心的转速为3000r/min，时间为10min；所述的AB-8大孔吸附树脂为地骨皮提取液体积的3倍；所述的聚酰胺树脂为浓缩液体积的5倍；所述的Sephadex LH-20葡聚糖凝胶为滤液体积的20倍。
一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取地骨皮，粉碎，用8倍地骨皮重量的体积分数95％乙醇回流提取3次，提取时间为2h；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至0.5g生药/ml，得到地骨皮提取液；
(2)将地骨皮提取液上样于AB-8大孔吸附树脂层析柱，然后依次用10BV的水，6BV的体积分数10％乙醇洗脱，再用6BV的体积分数30％乙醇洗脱，最后用6BV的体积分数50％乙醇洗脱，收集体积分数50％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到浓缩液；
(3)将浓缩液上样于聚酰胺树脂柱上，然后依次用5BV的水，3BV的体积分数70％乙醇洗脱，再用3BV的氨水洗脱，收集氨水洗脱液，减压浓缩，得到氨水洗脱物；
(4)将氨水洗脱物用甲醇超声溶解，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上样于Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱上，然后用甲醇洗脱，收集黄色条带部分，减压浓缩干燥，即得。
所述的氨水的质量分数为1％～20％；所述的离心的转速为3000r/min，时间为10min；所述的AB-8大孔吸附树脂为地骨皮提取液体积的3倍；所述的聚酰胺树脂为浓缩液体积的5倍；所述的Sephadex LH-20葡聚糖凝胶为滤液体积的20倍。
一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用。
所述的地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物中包括枸杞酰胺D、枸杞酰胺E、枸杞酰胺G、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-氮-(4-羟基苯乙基)丙烯酰胺、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-氮-(4-羟基苯乙基)丙烯酰胺、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-氮-(4-乙酰氨基丁基)丙烯酰胺、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-氮-(4-乙酰氨基丁基)丙烯酰胺、枸杞酰胺J、(1,2-反式)-氮3-(4-乙酰氨基丁基)-1-(3,4-二羟基苯乙基)-7-羟基-二氮-(4-羟基苯乙基)-6,8-二甲氧基-1,2-二氢化萘-2,3-二甲酰胺、1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,4-二羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺和1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺。
所述的地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物具体提取方法如下：
(1)取地骨皮，粉碎，用8倍地骨皮重量的体积分数95％乙醇回流提取3次，提取时间为2h；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至0.5g生药/ml，得到地骨皮提取液；
(2)将地骨皮提取液上样于AB-8大孔吸附树脂层析柱，按6BV/h的流速进行吸附，然后依次用10BV的水，6BV的体积分数10％乙醇洗脱，再用6BV的体积分数30％乙醇洗脱，最后用6BV的体积分数50％乙醇洗脱，收集体积分数50％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到浓缩液；
(3)将浓缩液上样于聚酰胺树脂柱上，按2BV/h的流速进行吸附，然后依次用5BV的水，3BV的体积分数70％乙醇洗脱，再用3BV的氨水洗脱，收集氨水洗脱液，减压浓缩，得到氨水洗脱物；
(4)将氨水洗脱物用甲醇超声溶解，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上样于Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱上，按1mL/min的流速进行吸附，然后用甲醇洗脱，收集黄色条带部分，减压浓缩干燥，即得。
所述的氨水的质量分数为1％～20％；所述的离心的转速为3000r/min，时间为10min；所述的AB-8大孔吸附树脂为地骨皮提取液体积的3倍；所述的聚酰胺树脂为浓缩液体积的5倍；所述的Sephadex LH-20葡聚糖凝胶为滤液体积的20倍。
一种地骨皮木脂素酰胺类生物碱提取物在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用。
所得的地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物经制备型高效液相分离，分别收集流份，减压浓缩，检测得到11种木脂素酰胺类化合物，根据NMR数据与文献比较，鉴定它们的结构分别为：枸杞酰胺D(1)、枸杞酰胺E(2)、枸杞酰胺G(3)、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-氮-(4-羟基苯乙基)丙烯酰胺(4)、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-氮-(4-羟基苯乙基)丙烯酰胺(5)、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-氮-(4-乙酰氨基丁基)丙烯酰胺(6)、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-氮-(4-乙酰氨基丁基)丙烯酰胺(7)、枸杞酰胺J(8)、(1,2-反式)-氮3-(4-乙酰氨基丁基)-1-(3,4-二羟基苯乙基)-7-羟基-二氮-(4-羟基苯乙基)-6,8-二甲氧基-1,2-二氢化萘-2,3-二甲酰胺(9)1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,4-二羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺(10)和1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺(11)，具体结构如下：
本发明首次利用大孔吸附树脂技术并结合聚酰胺柱色谱制备得到地骨皮木脂素酰胺类生物碱提取物，并鉴定出地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物中含有11种木脂素酰胺类化合物。同时，本发明对地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及11种木脂素酰胺类化合物进行体外降血糖实验，结果表明，地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及11种木脂素酰胺类化合物均表现出极强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其强度均超过阳性药物阿卡波糖。因此本发明地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物及木脂素酰胺类化合物的研究为研制新的降血糖药物提供了新的先导化合物，具有很好的开发应用前景。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取地骨皮，粉碎，用8倍地骨皮重量的体积分数95％乙醇回流提取3次，提取时间为2h；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至0.5g生药/ml，得到地骨皮提取液；
(1)取地骨皮，粉碎，用8倍地骨皮重量的体积分数95％乙醇回流提取3次，提取时间为2h；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至0.5g生药/ml，得到地骨皮提取液；
(2)将地骨皮提取液上样于AB-8大孔吸附树脂层析柱，按6BV/h的流速进行吸附，然后依次用10BV的水，6BV的体积分数10％乙醇洗脱，再用6BV的体积分数30％乙醇洗脱，最后用6BV的体积分数50％乙醇洗脱，收集体积分数50％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到浓缩液；
(3)将浓缩液上样于聚酰胺树脂柱上，按2BV/h的流速进行吸附，然后依次用5BV的水，3BV的体积分数70％乙醇洗脱，再用3BV的质量分数10％氨水洗脱，收集氨水洗脱液，减压浓缩，得到氨水洗脱物；
(4)将氨水洗脱物用甲醇超声溶解，3000r/min离心10min，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上样于Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱上，按1mL/min的流速进行吸附，然后用甲醇洗脱，收集黄色条带部分，减压浓缩干燥，即得。
所述的AB-8大孔吸附树脂为地骨皮提取液体积的3倍；所述的聚酰胺树脂为浓缩液体积的5倍；所述的Sephadex LH-20葡聚糖凝胶为滤液体积的20倍。
以上得到的地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物经制备型高效液相分离，分别收集流份，减压浓缩，得到11种木脂素酰胺类化合物，根据NMR数据与文献比较，鉴定它们的结构分别为：枸杞酰胺D(1)、枸杞酰胺E(2)、枸杞酰胺G(3)、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-氮-(4-羟基苯乙基)丙烯酰胺(4)、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-氮-(4-羟基苯乙基)丙烯酰胺(5)、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-氮-(4-乙酰氨基丁基)丙烯酰胺(6)、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-氮-(4-乙酰氨基丁基)丙烯酰胺(7)、枸杞酰胺J(8)、(1,2-反式)-氮3-(4-乙酰氨基丁基)-1-(3,4-二羟基苯乙基)-7-羟基-二氮-(4-羟基苯乙基)-6,8-二甲氧基-1,2-二氢化萘-2,3-二甲酰胺(9)1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,4-二羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺(10)和1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺(11)，具体结构如下：
化合物1-11的NMR数据如下：
化合物1：1H-NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:6.81(1H,d,J＝1.5Hz,H-2),6.83(1H,d,J＝8.5Hz,H-5),6.72(1H,dd,J＝8.5,1.5Hz,H-6),2.80(2H,t,J＝7.5Hz,H-7),2.40(2H,t,J＝7.5Hz,H-8),6.80(1H,d,J＝1.5Hz,H-2′),6.75(1H,d,J＝1.5Hz,H-5′),6.69(1H,overlap,H-6′),4.92(1H,d,J＝6.5Hz,H-7′),4.40(1H,d,J＝6.5Hz,H-8′),6.83(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″,6″),6.65(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″,5″),2.61(2H,t,J＝7.5Hz,H-7″),3.29(2H,overlap,H-8″),6.95(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″′,6″′),6.68(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″′,5″′),2.50(1H,m,H-7″′a),2.42(1H,m,H-7″′b),3.29(1H,overlap,H-8″′a),3.16(1H,m,H-8″′b)；13C-NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:135.8(C-1),117.9(C-2),143.2(C-3),143.4(C-4),118.2(C-5),122.9(C-6),32.3(C-7),39.0(C-8),175.2(C-9),128.4(C-1′),115.7(C-2′),147.2(C-3′),146.5(C-4′),116.2(C-5′),120.3(C-6′),77.7(C-7′),79.6(C-8′),169.4(C-9′),131.3(C-1″),130.8(C-2″,6″),116.3(C-3″,5″),156.9(C-4″),35.5(C-7″),42.3(C-8″),131.0(C-1″′),130.7(C-2″′,6″′),116.2(C-3″′,5″′),156.9(C-4″′),35.7(C-7″′),42.3(C-8″′)。
化合物2：1H-NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:6.78(1H,d,J＝2.0Hz,H-2),6.85(1H,d,J＝8.5Hz,H-5),6.71(1H,dd,J＝8.5,2.0Hz,H-6),2.80(2H,t,J＝7.5Hz,H-7),2.40(2H,t,J＝7.5Hz,H-8),6.80(1H,d,J＝1.5Hz,H-2′),6.75(1H,d,J＝1.5Hz,H-5′),6.67(1H,overlap,H-6′),4.92(1H,d,J＝7.0Hz,H-7′),4.38(1H,d,J＝7.9Hz,H-8′),6.83(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″,6″),6.65(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″,5″),2.61(2H,t,J＝7.5Hz,H-7″),3.29(2H,overlap,H-8″),6.95(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″′,6″′),6.68(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″′,5″′),2.50(1H,m,H-7″′a),2.42(1H,m,H-7″′b),3.30(1H,overlap,H-8″′a),3.16(1H,m,H-8″′b)；13C-NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:136.0(C-1),118.1(C-2),144.6(C-3),142.0(C-4),117.9(C-5),122.7(C-6),32.3(C-7),39.0(C-8),175.1(C-9),128.4(C-1′),115.7(C-2′),147.2(C-3′),146.5(C-4′),116.2(C-5′),120.3(C-6′),77.8(C-7′),79.5(C-8′),169.4(C-9′),131.3(C-1″),130.8(C-2″,6″),116.3(C-3″,5″),156.9(C-4″),35.7(C-7″),42.3(C-8″),131.0(C-1″′),130.7(C-2″′,6″′),116.2(C-3″′,5″′),156.9(C-4″′),35.5(C-7″′),42.3(C-8″′)。
化合物3：1H-NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:6.52(1H,d,J＝1.5Hz,H-2),6.55(1H,d,J＝8.0Hz,H-5),6.45(1H,dd,J＝8.0,1.5Hz,H-6),7.52(1H,s,H-7),6.49(1H,s,H-3′),6.76(1H,s,H-6′),2.50(1H,m,H-7′a),2.39(1H,m,H-7′b),2.10(2H,m,H-8′),6.88(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″,6″),6.67(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″,5″),2.64(2H,m,H-7″),3.39(2H,m,H-8″),6.94(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″′,6″′),6.66(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″′,5″′),2.57(2H,m,H-7″′),3.21(2H,m,H-8″′)；13C-NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:128.4(C-1),118.0(C-2),146.0(C-3),148.1(C-4),116.1(C-5),124.7(C-6),138.4(C-7),131.4(C-8),170.7(C-9),132.2(C-1′),126.9(C-2′),118.3(C-3′),146.0(C-4′),147.1(C-5′),118.2(C-6′),30.0(C-7′),37.8(C-8′),175.1(C-9′),130.9(C-1″),130.7(C-2″,6″),116.2(C-3″,5″),156.9(C-4″),35.4(C-7″),42.7(C-8″),131.3(C-1″′),130.7(C-2″′,6″′),116.4(C-3″′,5″′),156.8(C-4″′),35.7(C-7″′),42.3(C-8″′)。
化合物4：1H-NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:6.39(1H,d,J＝1.5Hz,H-2),6.65(1H,d,J＝8.5Hz,H-5),6.73(1H,dd,J＝8.5,1.5Hz,H-6),7.57(1H,s,H-7),6.54(1H,s,H-3′),6.81(1H,s,H-6′),2.47(2H,m,H-7′),2.14(2H,m,H-8′),6.90(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″,6″),6.67(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″,5″),2.68(2H,m,H-7″),3.41(2H,m,H-8″),6.93(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″′,6″′),6.66(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″′,5″′),2.57(2H,t,J＝7.5Hz,H-7″′),3.21(2H,m,H-8″′),3.43(3H,s,3-OCH3)；13C-NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:127.1(C-1),113.1(C-2),149.1(C-3),148.5(C-4),115.9(C-5),127.0(C-6),138.2(C-7),131.6(C-8),170.5(C-9),132.5(C-1′),118.2(C-2′),118.2(C-3′),146.2(C-4′),147.3(C-5′),128.3(C-6′),29.8(C-7′),37.7(C-8′),175.0(C-9′),131.3(C-1″),130.7(C-2″,6″),116.2(C-3″,5″),156.9(C-4″),35.5(C-7″),42.8(C-8″),131.3(C-1″′),130.7(C-2″′,6″′),116.4(C-3″′,5″′),156.9(C-4″′),35.6(C-7″′),42.3(C-8″′),55.7(3-OCH3)。
化合物5：1H-NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:6.33(2H,s,H-2,6),7.57(1H,s,H-7),6.54(1H,s,H-3′),6.81(1H,s,H-6′),2.52(1H,m,H-7′a),2.43(1H,m,H-7′b),2.14(2H,m,H-8′),6.92(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″,6″),6.66(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″,5″),2.65(2H,m,H-7″),3.41(2H,m,H-8″),6.93(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″′,6″′),6.67(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″′,5″′),2.56(2H,t,J＝7.5Hz,H-7″′),3.25(1H,m,H-8″′a),3.17(1H,m,H-8″′b),3.56(6H,s,3,5-OCH3)；13C-NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:127.0(C-1),108.9(C-2,6),148.6(C-3,5),137.9(C-4),138.4(C-7),131.2(C-8),170.2(C-9),132.5(C-1′),126.9(C-2′),118.2(C-3′),146.2(C-4′),147.2(C-5′),118.2(C-6′),29.7(C-7′),37.6(C-8′),174.9(C-9′),130.9(C-1″),130.9(C-2″,6″),116.2(C-3″,5″),156.8(C-4″),35.4(C-7″),42.7(C-8″),131.2(C-1″′),130.7(C-2″′,6″′),116.4(C-3″′,5″′),156.9(C-4″′),35.5(C-7″′),42.2(C-8″′),56.3(3,5-OCH3)。
化合物6：1H-NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:6.33(2H,s,H-2,6),7.57(1H,s,H-7),6.54(1H,s,H-3′),6.84(1H,s,H-2′),6.59(1H,s,H-5′),2.49(2H,m,H-7′),2.23(2H,m,H-8′),6.93(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″,6″),6.67(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″,5″),2.59(2H,m,H-7″),3.21(2H,m,H-8″),3.13(2H,m,H-1″′),1.47(4H,m,H-2″′,3″′),3.25(2H,m,H-4″′),1.91(N-COCH3),3.57(6H,s,3,5-OCH3)；13C-NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:127.1(C-1),109.0(C-2,6),148.7(C-3,5),137.9(C-4),138.4(C-7),132.3(C-8),170.6(C-9),132.3(C-1′),118.2(C-2′),147.3(C-3′),146.2(C-4′),118.3(C-5′),127.2(C-6′),29.8(C-7′),37.6(C-8′),175.0(C-9′),131.2(C-1″),130.7(C-2″,6″),116.2(C-3″,5″),156.8(C-4″),35.6(C-7″),42.3(C-8″),40.1(C-1″′),27.7(C-2″′),28.0(C-3″′),40.6(C-4″′),173.2(N-COCH3),22.6(N-COCH3),56.3(3,5-OCH3)。
化合物7：1H-NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:6.37(1H,d,J＝1.5Hz,H-2),6.65(1H,d,J＝8.3Hz,H-5),6.73(1H,dd,J＝8.3,1.5Hz,H-6),7.58(1H,s,H-7),6.83(1H,s,H-2′),6.58(1H,s,H-5′),2.63(1H,m,H-7′a),2.49(2H,m,H-7′b),2.23(2H,m,H-8′),6.94(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″,6″),6.67(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″,5″),2.58(2H,m,H-7″),3.19(2H,m,H-8″),3.13(2H,m,H-1″′),1.47(4H,m,H-2″′,3″′),3.25(2H,m,H-4″′),1.90(N-COCH3),3.44(3H,s,3-OCH3)；13C-NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:128.3(C-1),113.0(C-2),148.5(C-3),149.0(C-4),130.7(C-5),127.0(C-6),138.3(C-7),131.7(C-8),170.7(C-9),132.6(C-1′),118.2(C-2′),147.3(C-3′),146.2(C-4′),118.3(C-5′),127.2(C-6′),29.9(C-7′),37.7(C-8′),175.0(C-9′),131.2(C-1″),130.7(C-2″,6″),116.2(C-3″,5″),156.8(C-4″),35.6(C-7″),42.3(C-8″),40.2(C-1″′),27.7(C-2″′),28.0(C-3″′),40.6(C-4″′),173.3(N-COCH3),22.6(N-COCH3),55.7(3-OCH3)。
化合物8：1H-NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:6.79(1H,s,H-6),7.33(1H,s,H-7),6.33(2H,s,H-2′,6′),4.84(1H,overlap,H-7′),3.72(1H,d,J＝1.0Hz,H-8′),6.83(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″,6″),6.63(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″,5″),2.54(2H,td,J＝6.5,1.5Hz,H-7″),3.32(1H,overlap,H-8″a),3.21(1H,t,J＝6.5Hz,H-8″b),3.14(2H,t,J＝6.5Hz,H-1″′),1.49(4H,m,H-2″′,3″′),3.21(2H,t,J＝6.5Hz,H-4″′),1.89(3H,s,N-COCH3),3.57(3H,s,3-OCH3),3.92(3H,s,5-OCH3),3.69(6H,s,3′,5′-COCH3)；13C-NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:127.2(C-1),125.2(C-2),147.0(C-3),143.3(C-4),149.3(C-5),109.1(C-6),135.3(C-7),131.1(C-8),170.1(C-9),135.4(C-1′),106.1(C-2′,6′),149.0(C-3′,5′),135.1(C-4′),41.6(C-7′),50.2(C-8′),174.0(C-9′),124.3(C-1″),130.8(C-2″,6″),116.3(C-3″,5″),156.8(C-4″),35.5(C-7″),42.4(C-8″),40.1(C-1″′),27.8(C-2″′,3″′),40.5(C-4″′),173.3(N-COCH3),22.6(N-COCH3),60.8(3-OCH3),56.8(5-OCH3),56.7(3′,5′-COCH3)。
化合物9：1H-NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:6.77(1H,s,H-6),7.31(1H,s,H-7),6.44(1H,brs,H-2′),6.57(1H,d,J＝8.0Hz,H-5′),6.38(1H,dd,J＝8.0,1.0Hz,H-6′),4.84(1H,s,H-7′),3.67(1H,brs,H-8′),6.81(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″,6″),6.63(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″,5″),2.54(2H,td,J＝6.5,1.5Hz,H-7″),3.31(2H,overlap,H-8″),3.15(2H,t,J＝6.5Hz,H-1″′),1.48(4H,m,H-2″′,3″′),3.20(2H,t,J＝6.5Hz,H-4″′),1.89(3H,s,N-COCH3),3.54(3H,s,3-OCH3),3.89(3H,s,5-OCH3)；13C-NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:126.9(C-1),125.5(C-2),146.9(C-3),143.1(C-4),149.1(C-5),109.2(C-6),135.2(C-7),131.1(C-8),170.2(C-9),136.1(C-1′),115.9(C-2′),145.9(C-3′),144.8(C-4′),116.1(C-5′),119.9(C-6′),41.0(C-7′),50.3(C-8′),174.1(C-9′),124.3(C-1″),130.7(C-2″,6″),116.2(C-3″,5″),156.7(C-4″),35.5(C-7″),42.4(C-8″),40.1(C-1″′),27.7(C-2″′,3″′),40.4(C-4″′),173.3(N-COCH3),22.6(N-COCH3),60.8(3-OCH3),56.8(5-OCH3)。
化合物10：1H-NMR(500MHz,Acetone-d6)δ:4.97(1H,brs,H-1),3.66(1H,overlap,H-2),7.20(1H,brs,H-4),6.70(1H,brs,H-5),6.50(1H,brs,H-2′),6.32(1H,d,J＝8.0Hz,H-5′),6.41(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz,H-6′),6.91(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″,6″),6.70(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″,5″),3.37(2H,m,,H-α),3.24(1H,m,H-α′),2.69(2H,t,J＝6.5Hz,H-α),2.55(2H,t,J＝6.5Hz,H-β),6.98(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″′,6″′),6.72(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″′,5″′),3.67(3H,s,6-OCH3),3.85(3H,s,5-OCH3)；13C-NMR(125MHz,Acetone-d6)δ:41.9(C-1),49.3(C-2),127.9(C-3),136.3(C-4),108.3(C-5),148.0(C-6),142.3(C-7),146.3(C-8),123.8(C-4a),126.3(C-8a),171.6(C-2a),169.4(C-3a),136.3(C-1′),116.0(C-2′),144.1(C-3′),145.3(C-4′),115.7(C-5′),119.7(C-6′),131.1(C-1″),130.5(C-2″,6″),116.0(C-3″,5″),156.6(C-4″),42.4(C-α),35.5(C-β),132.7(C-1″′),130.5(C-2″′,6″′),115.9(C-3″′,5″′),56.5(6-OCH3),60.2(8-OCH3)。
化合物11：1H-NMR(500MHz,Acetone-d6)δ:5.02(1H,brs,H-1),3.67(1H,overlap,H-2),7.22(1H,brs,H-4),6.70(1H,brs,H-5),6.39(1H,brs,H-2′,6′),6.98(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″,6″),6.72(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″,5″),3.43(1H,m,H-α),3.28(1H,m,H-α),2.70(2H,t,J＝6.5Hz,H-β),3.43(1H,m,H-α′),3.19(1H,m,H-α′),2.55(2H,t,J＝6.5Hz,H-β′),6.93(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″′,6″′),6.70(2H,d,J＝8.5Hz,H-3″′,5″′),3.67(6H,s,3′,5′-OCH3),3.84(3H,s,6-OCH3),3.68(3H,s,8-OCH3)；13C-NMR(125MHz,Acetone-d6)δ:42.0(C-1),49.1(C-2),128.3(C-3),135.1(C-4),108.3(C-5),148.1(C-6),142.4(C-7),146.4(C-8),123.8(C-4a),126.4(C-8a),171.4(C-2a),169.6(C-3a),135.4(C-1′),106.3(C-2′,6′),148.3(C-3′,5′),145.1(C-4′),131.1(C-1″),130.5(C-2″,6″),116.0(C-3″,5″),156.7(C-4″),42.4(C-α),35.6(C-β),131.1(C-1″′),130.5(C-2″′,6″′),116.0(C-3″′,5″′),56.6(3′,6′-OCH3),56.5(6-OCH3),60.2(8-OCH3)。
以1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,4-二羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺(化合物10)(自制，HPLC检测其纯度＞95％)为标准品绘制标准曲线，将标准品溶于丙酮-水溶液(体积比85:15)配成系列浓度，在10mL容量瓶中，加入8mL标准品溶液，加入Folin-Ciocalteau试剂0.5mL，摇匀，放置1min。再加入质量分数20％Na2SO4溶液1.5mL，摇匀，放置1h，于分光光度计在750nm处测定吸收度，绘制标准曲线。精确称取地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物，按上述方法，在750nm处测定吸收度。按标准曲线计算，地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物中，以1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,4-二羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺(10)计，总木脂素酰胺类生物碱的质量百分含量＞50％。
实施例2
为进一步说明本发明在医药领域中的作用，下面通过体外降血糖实验来说明。
(一)、溶液的配制
磷酸盐缓冲液的配制：将Na2HPO4与KH2PO4固体粉末分别配制成浓度0.1mol/L的溶液。用此两种溶液混匀用pH计互调pH值至6.7，得0.1mol/L磷酸盐缓冲液。
对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)溶液的配制：用DMSO溶解PNPG粉末，配制成浓度10mmol/L的PNPG溶液。
α-葡萄糖苷酶溶液的配制：用磷酸盐缓冲液溶解α-葡萄糖苷酶粉末，配制成浓度2U/L的溶液。
阿卡波糖溶液的配制：称取阿卡波糖粉末1.03296mg，溶于DMSO中，配制成浓度80μmol/L的溶液(可根据需要调整溶液浓度)。
Na2CO3溶液的配制：称取无水Na2CO3固体粉末9.9216g，用超纯水溶解，配制成浓度1mol/L的溶液。
样品的配制：称取各样品(地骨皮总木脂素酰胺类生物碱、化合物1-11)1mg，分别溶于DMSO配制成浓度2mol/L的溶液，再稀释成80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L等浓度的溶液。
(二)、实验步骤
样品组：将20μL不同浓度的样品和30μL的α-葡萄糖苷酶溶液在0.1mol/L磷酸盐缓冲液中(800μL)混合于振荡器上振30s，然后置于37℃水浴锅中5min。再加入150μL 10mmol/L的PNPG溶液，并在37℃下孵育30min，加入650μL 1mol/L Na2CO3溶液，混匀，将混合溶液加到96孔板内，每一浓度3个复孔。于405nm波长下测定其吸光度。
阳性样品对照组：将以上各浓度样品换成相同浓度的阿卡波糖溶液，其他条件不变。
空白对照组：将以上样品换成磷酸盐缓冲溶液，其他条件不变。
阴性对照组：只加磷酸盐缓冲液和α-葡萄糖苷酶溶液。
将三组数据OD值取平均值，依据抑制率＝(阴性对照OD-样品OD)/(阴性对照OD-空白对照OD)×100％。
对实验数据统计分析，使用IC50软件计算各供试样品的IC50值，结果如表1所示：
表1各样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性测试结果
样品 IC50值(μM)
地骨皮总木脂素酰胺类生物碱 38.24±0.47
化合物1 12.63±0.17
化合物2 17.05±0.08
化合物3 73.39±0.22
化合物4 109.41±0.18
化合物5 163.82±0.43
化合物6 7.03±0.12
化合物7 9.37±0.04
化合物8 11.52±0.11
化合物9 44.19±0.55
化合物10 217.61±0.09
化合物11 235.08±0.32
阿卡波糖 262.19±0.96
从以上活性测试结果可以看出，地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物和11种均表现出极强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其强度均超过阳性药物阿卡波糖。以上结果表明本发明为研制新的降血糖药物提供了新的先导化合物，具有很好的开发应用前景。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物，其特征在于，具体提取方法如下：
(1)取地骨皮，粉碎，用8倍地骨皮重量的体积分数95％乙醇回流提取3次，提取时间为2h；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至0.5g生药/ml，得到地骨皮提取液；
(2)将地骨皮提取液上样于AB-8大孔吸附树脂层析柱，然后依次用10BV的水，6BV的体积分数10％乙醇洗脱，再用6BV的体积分数30％乙醇洗脱，最后用6BV的体积分数50％乙醇洗脱，收集体积分数50％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到浓缩液；
(3)将浓缩液上样于聚酰胺树脂柱上，然后依次用5BV的水，3BV的体积分数70％乙醇洗脱，再用3BV的氨水洗脱，收集氨水洗脱液，减压浓缩，得到氨水洗脱物；
(4)将氨水洗脱物用甲醇超声溶解，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上样于Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱上，然后用甲醇洗脱，收集黄色条带部分，减压浓缩干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物，其特征在于，所述的氨水的质量分数为1％～20％；所述的离心的转速为3000r/min，时间为10min；所述的AB-8大孔吸附树脂为地骨皮提取液体积的3倍；所述的聚酰胺树脂为浓缩液体积的5倍；所述的Sephadex LH-20葡聚糖凝胶为滤液体积的20倍。
3.一种如权利要求1所述的地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取地骨皮，粉碎，用8倍地骨皮重量的体积分数95％乙醇回流提取3次，提取时间为2h；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至0.5g生药/ml，得到地骨皮提取液；
(2)将地骨皮提取液上样于AB-8大孔吸附树脂层析柱，然后依次用10BV的水，6BV的体积分数10％乙醇洗脱，再用6BV的体积分数30％乙醇洗脱，最后用6BV的体积分数50％乙醇洗脱，收集体积分数50％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到浓缩液；
(3)将浓缩液上样于聚酰胺树脂柱上，然后依次用5BV的水，3BV的体积分数70％乙醇洗脱，再用3BV的氨水洗脱，收集氨水洗脱液，减压浓缩，得到氨水洗脱物；
(4)将氨水洗脱物用甲醇超声溶解，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上样于Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱上，然后用甲醇洗脱，收集黄色条带部分，减压浓缩干燥，即得。
4.根据权利要求3所述的地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物的制备方法，其特征在于，所述的氨水的质量分数为1％～20％；所述的离心的转速为3000r/min，时间为10min；所述的AB-8大孔吸附树脂为地骨皮提取液体积的3倍；所述的聚酰胺树脂为浓缩液体积的5倍；所述的Sephadex LH-20葡聚糖凝胶为滤液体积的20倍。
5.一种地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物中包括枸杞酰胺D、枸杞酰胺E、枸杞酰胺G、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-氮-(4-羟基苯乙基)丙烯酰胺、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-氮-(4-羟基苯乙基)丙烯酰胺、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-氮-(4-乙酰氨基丁基)丙烯酰胺、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-氮-(4-乙酰氨基丁基)丙烯酰胺、枸杞酰胺J、(1,2-反式)-氮3-(4-乙酰氨基丁基)-1-(3,4-二羟基苯乙基)-7-羟基-二氮-(4-羟基苯乙基)-6,8-二甲氧基-1,2-二氢化萘-2,3-二甲酰胺、1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,4-二羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺和1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物具体提取方法如下：
(1)取地骨皮，粉碎，用8倍地骨皮重量的体积分数95％乙醇回流提取3次，提取时间为2h；合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至0.5g生药/ml，得到地骨皮提取液；
(2)将地骨皮提取液上样于AB-8大孔吸附树脂层析柱，按6BV/h的流速进行吸附，然后依次用10BV的水，6BV的体积分数10％乙醇洗脱，再用6BV的体积分数30％乙醇洗脱，最后用6BV的体积分数50％乙醇洗脱，收集体积分数50％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到浓缩液；
(3)将浓缩液上样于聚酰胺树脂柱上，按2BV/h的流速进行吸附，然后依次用5BV的水，3BV的体积分数70％乙醇洗脱，再用3BV的氨水洗脱，收集氨水洗脱液，减压浓缩，得到氨水洗脱物；
(4)将氨水洗脱物用甲醇超声溶解，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上样于Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱上，按1mL/min的流速进行吸附，然后用甲醇洗脱，收集黄色条带部分，减压浓缩干燥，即得。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的氨水的质量分数为1％～20％；所述的离心的转速为3000r/min，时间为10min；所述的AB-8大孔吸附树脂为地骨皮提取液体积的3倍；所述的聚酰胺树脂为浓缩液体积的5倍；所述的Sephadex LH-20葡聚糖凝胶为滤液体积的20倍。
9.一种地骨皮木脂素酰胺类生物碱提取物在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的地骨皮总木脂素酰胺类生物碱提取物为枸杞酰胺D、枸杞酰胺E、枸杞酰胺G、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-氮-(4-羟基苯乙基)丙烯酰胺、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-氮-(4-羟基苯乙基)丙烯酰胺、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-氮-(4-乙酰氨基丁基)丙烯酰胺、(E)-2-(4,5-二羟基-2-{3-[(4-羟基苯乙基)氨基]-3-含氧丙基}苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-氮-(4-乙酰氨基丁基)丙烯酰胺、枸杞酰胺J、(1,2-反式)-氮3-(4-乙酰氨基丁基)-1-(3,4-二羟基苯乙基)-7-羟基-二氮-(4-羟基苯乙基)-6,8-二甲氧基-1,2-二氢化萘-2,3-二甲酰胺、1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,4-二羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺，或，1,2-二氢-6,8-二甲氧基-7-羟基-1-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯基)-氮1,氮2-二-[2-(4-羟基苯基)乙基]-2,3-萘二甲基酰胺。
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