CN104000892A

CN104000892A - 一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法

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Publication number: CN104000892A
Application number: CN201410265773.2A
Authority: CN
Inventors: 刘普; 邓瑞雪; 易军鹏; 李小方; 高嘉屿; 尹卫平; 柴元武; 时清亮
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2014-06-16
Filing date: 2014-06-16
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2034-06-16
Also published as: CN104000892B

Abstract

本发明主要公开一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，包括采用乙醇溶液提取、牡丹花总黄酮粗品树脂富集、牡丹花总黄酮精制品沉淀富集和牡丹花总黄酮进一步纯化四大步骤，本发明通过先加醋酸铅沉淀，再加H₂S脱铅的方式，有效提高了产品纯度，达到96%以上，产率达到1.0%以上，所得到的黄酮组成明确，适合于工业化制备等优点，得到的黄酮类化合物活性测试显示出较好的活血化瘀作用。本方法可以用于从牡丹花中较大规模的提取牡丹花总黄酮类化合物，为牡丹花及其中所含黄酮类化合物在今后的研究开发奠定了基础。

Description

一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法

技术领域

本发明属于天然产物中有效成分提取及分离技术领域，具体涉及一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法。

背景技术

牡丹原产于中国西部秦岭和大巴山一带山区，为多年生落叶小灌木，是我国特有的木本名贵花卉，有数千年的自然生长和两千多年的人工栽培历史。牡丹全身是宝，其根、茎、叶、花、种子等均居有重要的价值。目前，在牡丹培育和研究方法做了很多工作，在牡丹花研究方面，吴龙奇等[吴龙奇,朱文学,易军鹏,等. 牡丹花红色素类型判定及提取工艺试验[J]. 农业机械学报, 2005,36(10): 77-80]研究确定了牡丹花色素为花青素类色素，提取牡丹花红色素适宜的条件为：浸取剂为盐酸体积分数为1 %的酸性无水乙醇，浸取温度50℃，浸取时间3 h。樊金玲等[樊金玲,朱文学,马海乐,等. 高效液相色谱-电喷雾质谱法分析牡丹花中花色苷类化合物[J]. 食品科学, 2007,28(8): 367-371]利用高效液相质谱－电喷雾质谱法分离检测了5 种花色苷，分别鉴定为矢车菊-3,5-O-二葡萄糖苷、矢车菊-3-O-葡萄糖苷、芍药-3,5-O-二葡萄糖苷、芍药-3-O-葡萄糖苷和天竺葵-3, 5-O-二葡萄糖苷。但是，在牡丹花黄酮类化合物制备分离，物质基础确认及活性研究方面，目前研究还相对较少。

发明内容

本发明的目的为针对现有技术中牡丹花黄酮类化合物提取技术不足的问题，提供了一种从牡丹花中提取高纯度牡丹花总黄酮的方法。

本发明实现上述目的采用的技术方案是：一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，包括以下步骤：

1）采用乙醇溶液提取

采摘牡丹花原料，除去花萼、花托，得到牡丹花瓣，将牡丹花瓣在室温下干燥后进行粉碎，然后加入到质量浓度为70-90%的乙醇溶液中浸泡6-48h，浸泡结束后进行超声提取20-40min，提取结束后进行过滤，收集滤液，并向得到的滤渣中加入质量浓度为70-90%的乙醇溶液，重复上述超声提取和过滤操作2次，合并所有滤液，减压浓缩至无溶剂，得提取浸膏，备用；

2）牡丹花总黄酮粗品树脂富集

将步骤1）得到的提取浸膏用蒸馏水溶解，过滤，将得到的滤液用树脂进行吸附，装柱，然后依次用体积浓度为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱馏分，减压浓缩至浸膏状物，并将浸膏状物在50-60℃下真空减压干燥，干燥完成即得牡丹花总黄酮粗品，备用；

3）牡丹花总黄酮精制品沉淀富集

将步骤2）得到的牡丹花总黄酮粗品用其重量20-30倍的体积浓度为95%的乙醇溶液溶解，溶解完全后加入醋酸铅溶液至不再有沉淀生成，过滤，将得到的沉淀用水洗涤2-3次，弃去滤液和洗涤液，得到沉淀物，备用；将沉淀物干燥后悬浮于其重量40-50倍的体积浓度为95%的乙醇溶液中，通入H₂S 脱铅，过滤，滤渣用体积浓度为95%的乙醇溶液洗涤2-3次，合并滤液和洗液，调节pH为6.5-7.0，减压浓缩回收乙醇，即得到牡丹花总黄酮精制品，备用；

4）牡丹花总黄酮进一步纯化

将步骤3）得到的牡丹花总黄酮精制品用其重量30-50倍的甲醇溶解，甲醇的温度为50-60℃，然后趁热用牡丹花总黄酮精制品重量10-20倍的活性炭过滤，收集滤液，减压回收甲醇，即得到经过进一步纯化的牡丹花总黄酮。

所述的步骤1）中浸泡牡丹花瓣时采用的质量浓度为70-90%的乙醇溶液的添加量为干燥牡丹花瓣重量的10-20倍，超声提取滤渣时乙醇溶液的添加量为滤渣重量的10-20倍。

所述的步骤2）中溶解提取浸膏时蒸馏水的用量为提取浸膏重量的200-400倍。

所述的步骤2）中的树脂为D101或AB-8型大孔吸附树脂，或者聚酰胺树脂。

所述的步骤2）中树脂的用量为提取浸膏重量的200-400倍。

所述的步骤2）中不同浓度的乙醇水溶液的洗脱体积均为柱体积的3-5倍。

本发明的有益效果

本发明提供的提取方法与现有技术相比，方法简便、快捷，通过先加醋酸铅沉淀，再加H₂S 脱铅的方式，有效提高了产品纯度，达到96%以上，产率达到1.0%以上，所得到的黄酮组成明确，适合于工业化制备等优点，得到的黄酮类化合物活性测试显示出较好的活血化瘀作用。本方法可以用于从牡丹花中较大规模的提取牡丹花总黄酮类化合物，为牡丹花及其中所含黄酮类化合物在今后的研究开发奠定了基础。

附图说明

图1为芦丁的紫外吸收光谱图；

图2为芦丁的吸光度标准曲线；

图3为化合物的核磁共振氢谱图；

图4为化合物的核磁共振碳谱图；

图5为化合物Ⅱ的核磁共振氢谱图；

图6为化合物Ⅱ的核磁共振碳谱图；

图7为化合物Ⅲ的核磁共振氢谱图；

图8为化合物Ⅲ的核磁共振碳谱图；

图9为化合物Ⅳ的核磁共振氢谱图；

图10为化合物Ⅳ的核磁共振碳谱图；

图11为化合物Ⅴ的核磁共振氢谱图。

具体实施方式

一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，包括以下步骤：

1）采用乙醇溶液提取

2）牡丹花总黄酮粗品树脂富集

3）牡丹花总黄酮精制品沉淀富集

4）牡丹花总黄酮进一步纯化

所述的步骤2）中树脂的用量为提取浸膏重量的200-400倍。

一、总黄酮含量的计算方法：

（1）最大波长扫描

取少量芦丁，加入70%乙醇溶解，然后移取2 mL溶液至10 mL容量瓶中，继续加入70%乙醇使溶液体积为5 mL，加入5%的NaNO₂溶液 0.3 mL，人工震摇均匀，在室温下放置6 min之后向容量瓶中加入10%的Al(NO₃)₃溶液0.3 mL，人工震摇均匀，室温下反应6 min之后再加入4%的NaOH溶液4 mL，再次摇匀，用70%的乙醇溶液加入容量瓶中定容至刻度^[37]。室温放置 15 min 之后，于紫外分光光度仪中扫描最大吸收波长，扫描范围为800-400 nm，如图1所示，芦丁液最大吸收波长为510 nm。

标准曲线的绘制

采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法对牡丹花提取液中黄酮的含量进行检测。

配制质量浓度为0.5 mg.mL^-1的芦丁溶液：用电子天平精确称取0.0100 g芦丁标准品，向其中加入体积分数为70%的乙醇溶液溶解，然后再用70%的乙醇溶液定容至50 mL，人工震摇均匀备用。分别向10 mL容量瓶中各取上述标准液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，再分别加入70%乙醇溶液使每个容量瓶中溶液体积为5 mL，然后分别加入5%的NaNO₂溶液 0.3 mL，人工震摇均匀，在室温下放置6 min之后向容量瓶中加入10%的Al(NO₃)₃溶液0.3 mL，人工震摇均匀，室温下反应6 min之后再加入4%的NaOH溶液4 mL，再次摇匀，用70%的乙醇溶液加入容量瓶中定容至刻度，室温放置 15 min 之后，用紫外分光光度仪在510 nm处测定芦丁溶液吸光度，对照组为不加入芦丁标准品。以吸光度A在510 nm作为纵坐标，芦丁对照品的质量(mg)为横坐标，以此来作标准曲线，如图2所示，通过Excel得到回归方程为：M＝0.992A+0.0012 (M为芦丁标准品的质量/mg，A 为吸光度)，相关系数R²＝0.998。

（3）总黄酮含量的计算

取适量的牡丹花黄酮样品待测液按照以上的方法进行对总黄酮进行测定，由回归方程确定样品中总黄酮的含量。

式中：M 为一定体积测试液中总黄酮含量/mg；V为测定时所吸取样品试液的体积；V₀ 为离心后定容的总体积；10³为质量换算因数。

二、黄酮单体的分离

将得到的总黄酮先采用凝胶柱色谱分离，然后再用制备HPLC纯化，分离得到5个黄酮单体，经核磁共振氢谱和核磁共振碳谱等手段鉴定结构，分别为：二氢山奈酚( Dihydrokaempferol,)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(apigenin-7-O-β-D-glucoside,)、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷(4"-hydroxyl-albiflorin,)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-7-O-β-葡萄吡喃糖(kaempferol-3-O-β-D- glucopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranoside,)、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷(kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside, )。

这些黄酮类化合物为牡丹花中主要黄酮类化合物，构成了牡丹花具有良好生物活性及应用的物质基础，其结构式分别如下：

化合物的结构

三、以下结合具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1：

一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，包括以下步骤：

1）采用乙醇溶液提取

采摘牡丹花原料，除去花萼、花托，得到牡丹花瓣，将牡丹花瓣在室温下干燥后进行粉碎，称取100 g粉碎后的牡丹花瓣，然后加入到其重量20倍的质量浓度为90%的乙醇溶液中浸泡6h，浸泡结束后进行超声提取40min，提取结束后进行过滤，收集滤液，并向得到的滤渣中加入其重量15倍的质量浓度为70%的乙醇溶液，重复超声提取和过滤操作2次，每次超声40min，合并所有滤液，减压浓缩至无溶剂，得提取浸膏，备用；

2）牡丹花总黄酮粗品树脂富集

将步骤1）得到的提取浸膏用其重量400倍的蒸馏水溶解，过滤，将得到的滤液用D101型大孔吸附树脂进行吸附，装柱，树脂的用量为提取浸膏重量的400倍，然后依次用体积浓度为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱体积均为柱体积的5倍，采用紫外分光广度法测定馏分中黄酮类化合物的含量，收集体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱馏分，减压浓缩至浸膏状物，并将浸膏状物在50-60℃下真空减压干燥，干燥完成即得牡丹花总黄酮粗品，共4.3g，备用；

3）牡丹花总黄酮精制品沉淀富集

将步骤2）得到的牡丹花总黄酮粗品用其重量30倍的体积浓度为95%的乙醇溶液溶解，溶解完全后加入醋酸铅溶液至不再有沉淀生成，过滤，将得到的沉淀用水洗涤3次，弃去滤液和洗涤液，得到沉淀物，备用；将沉淀物干燥后悬浮于其重量50倍的体积浓度为95%的乙醇溶液中，通入H₂S 脱铅，过滤，滤渣用体积浓度为95%的乙醇溶液洗涤3次，合并滤液和洗液，调节pH为7.0，减压浓缩回收乙醇，即得到牡丹花总黄酮精制品，共1.4g，备用；

4）牡丹花总黄酮进一步纯化

将步骤3）得到的牡丹花总黄酮精制品用其重量50倍的甲醇溶解，甲醇的温度为60℃，然后趁热用牡丹花总黄酮精制品重量20倍的活性炭过滤，收集滤液，减压回收甲醇，即得到经过进一步纯化的牡丹花总黄酮，共1.045g。

经计算，得到的最终产品中牡丹花总黄酮的含量为96.6%，产率大于1.0%。

实施例2：

一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，包括以下步骤：

1）采用乙醇溶液提取

采摘牡丹花原料，除去花萼、花托，得到牡丹花瓣，将牡丹花瓣在室温下干燥后进行粉碎，称取200 g粉碎后的牡丹花瓣，然后加入到其重量10倍的质量浓度为70%的乙醇溶液中浸泡48h，浸泡结束后进行超声提取20min，提取结束后进行过滤，收集滤液，并向得到的滤渣中加入滤渣重量10-20倍的质量浓度为90%的乙醇溶液，重复超声提取和过滤操作2次，每次超声20min，合并所有滤液，减压浓缩至无溶剂，得提取浸膏，共32.6g，备用；

2）牡丹花总黄酮粗品树脂富集

将步骤1）得到的提取浸膏用其重量200倍的蒸馏水溶解，过滤，将得到的滤液用AB-8型大孔吸附树脂进行吸附，装柱，树脂的用量为提取浸膏重量的200倍，然后依次用体积浓度为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱体积均为柱体积的3倍，收集体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱馏分，减压浓缩至浸膏状物，并将浸膏状物在50-60℃下真空减压干燥，干燥完成即得牡丹花总黄酮粗品，共7.5g，备用；

3）牡丹花总黄酮精制品沉淀富集

将步骤2）得到的牡丹花总黄酮粗品用其重量20倍的体积浓度为95%的乙醇溶液溶解，溶解完全后加入醋酸铅溶液至不再有沉淀生成，过滤，将得到的沉淀用水洗涤2次，弃去滤液和洗涤液，得到沉淀物，备用；将沉淀物干燥后悬浮于其重量40倍的体积浓度为95%的乙醇溶液中，通入H₂S 脱铅，过滤，滤渣用体积浓度为95%的乙醇溶液洗涤2次，合并滤液和洗液，调节pH为6.5，减压浓缩回收乙醇，即得到牡丹花总黄酮精制品，共2.58g，备用；

4）牡丹花总黄酮进一步纯化

将步骤3）得到的牡丹花总黄酮精制品用其重量30倍的甲醇溶解，甲醇的温度为50℃，然后趁热用牡丹花总黄酮精制品重量10倍的活性炭过滤，收集滤液，减压回收甲醇，即得到经过进一步纯化的牡丹花总黄酮，共2.014g。

经计算，得到的最终产品中牡丹花总黄酮的含量为97.1%，产率大于1.0%。

实施例3：

一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，包括以下步骤：

1）采用乙醇溶液提取

采摘牡丹花原料，除去花萼、花托，得到牡丹花瓣，将牡丹花瓣在室温下干燥后进行粉碎，称取1000 g粉碎后的牡丹花瓣，然后加入到其重量15倍的质量浓度为80%的乙醇溶液中浸泡24h，浸泡结束后进行超声提取30min，提取结束后进行过滤，收集滤液，并向得到的滤渣中加入滤渣重量15倍的质量浓度为80%的乙醇溶液，重复超声提取和过滤操作2次，每次超声30min，合并所有滤液，减压浓缩至无溶剂，得提取浸膏170g，备用；

2）牡丹花总黄酮粗品树脂富集

将步骤1）得到的提取浸膏用其重量300倍的蒸馏水溶解，过滤，将得到的滤液用聚酰胺树脂进行吸附，装柱，树脂的用量为提取浸膏重量的300倍，然后依次用体积浓度为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱体积均为柱体积的4倍，收集体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱馏分，减压浓缩至浸膏状物，并将浸膏状物在50-60℃下真空减压干燥，干燥完成即得牡丹花总黄酮粗品，共53.2g，备用；

3）牡丹花总黄酮精制品沉淀富集

将步骤2）得到的牡丹花总黄酮粗品用其重量25倍的体积浓度为95%的乙醇溶液溶解，溶解完全后加入醋酸铅溶液至不再有沉淀生成，过滤，将得到的沉淀用水洗涤3次，弃去滤液和洗涤液，得到沉淀物，备用；将沉淀物干燥后悬浮于其重量45倍的体积浓度为95%的乙醇溶液中，通入H₂S 脱铅，过滤，滤渣用体积浓度为95%的乙醇溶液洗涤3次，合并滤液和洗液，调节pH为6.8，减压浓缩回收乙醇，即得到牡丹花总黄酮精制品，共17.1g，备用；

4）牡丹花总黄酮进一步纯化

将步骤3）得到的牡丹花总黄酮精制品用其重量40倍的甲醇溶解，甲醇的温度为50-60℃，然后趁热用牡丹花总黄酮精制品重量15倍的活性炭过滤，收集滤液，减压回收甲醇，即得到经过进一步纯化的牡丹花总黄酮，共13.5g。

经计算，得到的最终产品中牡丹花总黄酮的含量为97.3%，产率大于1.0%。

四、单体黄酮化合物的分离和鉴定

取实施例3中最终得到的牡丹花总黄酮15g，加入甲醇100 mL，加热溶解，冷却至室温，过滤，滤液用凝胶柱色谱分离，用甲醇洗脱，用20 mL试管收集馏分段，得到6个馏分段。每个馏分段采用制备HPLC分离，得到化合物-。采用核磁共振等波谱解析手段鉴定了分离得到的化合物的结构。波谱数据如下：

化合物：淡黄色晶体，UV254下有强烈的紫外吸收，ESI-MS m/z: 289[M+H]⁺ (分子式C₁₅H₁₂O₆)。化合物的¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 4.54 (1H, d, J =11.6 Hz, H-3), 4.97 (1H, d, J = 11.6 Hz, H-2), 5.87 (1H, d, J = 1.59 Hz, H-6), 5.91 (1H, d, J = 1.59 Hz, H-8), 7.35 (2H, d, J=8.56 Hz, H-2', 6'), 6.82 (2H, d, J=8.56 Hz, H-3', 5'), ¹³C-NMR (100Hz, CD₃OD) δ: 85.0 (C-2), 73.7 (C-3), 198.5 (C-4), 165.3 (C-5), 97.3 (C-6), 168.8 (C-7), 96.3 (C-8), 164.6 (C-9), 101.9 (C-10), 129.3 (C-1'), 130.4 (C-2'), 116.1 (C-3'), 159.3 (C-4'), 116.1 (C-5'), 130.4 (C-6')。以上光谱数据与文献[李寅珊，李冬梅，蒋凌云，等．云南松松塔的化学成分[J]．中国实验方剂学杂志，2012，18(2)：119-120]报道的波谱数据一致，因此，鉴定该化合物为二氢山奈酚，其核磁共振氢谱如图3所示，核磁共振碳谱如图4所示。

化合物Ⅱ：黄色晶体。UV254下有强烈的紫外吸收。ESI-MS m/z: 433 [M+H]⁺ (分子式C₂₁H₂₀O₁₀)。化合物¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ: 6.88 (1H, s, H -3), 6.45 (1H, d, J = 1.59 Hz, H-6), 6.83 (1H, d, J = 1.59 Hz, H-8), 7.96 (2H, d, J =8.8 Hz, H-2',6'), 6.97 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3',5'); ¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ: 164.2 (C-2), 103.1 (C-3), 182.0 (C-4), 156.9 (C-5), 94.8 (C-6), 162.9 (C-7), 99.5 (C-8), 161.4 (C-9), 105.3 (C-10), 121.0 (C-1'), 128.6 (C-2'), 116.0 (C-3'), 161.1 (C-4'), 116.0 (C-5'), 128.6 (C-6'), 99.9 (C-1"), 73.1 (C-2"), 76.4 (C-3"), 69.5 (C-4"), 77.1 (C-5")。以上光谱数据与文献[谭兴起，郭良军，陈海生，等．络石藤中黄酮类化合物成分研究[J]．中药材，2010，33(1)：58-60]报道的波谱数据一致，因此鉴定该化合物为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（apigenin-7-O-β-D-glucoside），其核磁共振氢谱如图5所示，核磁共振碳谱如图6所示。

化合物Ⅲ：淡黄色无定型粉末，UV254下有强烈的紫外吸收，ESI-MS m/z: 579[M+H]⁺ (分子式为C₂₇H₃₀O₁₄)。化合物的¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 6.60 (1H, s, H-3), 6.40 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-6), 6.71 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-8),7.82 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-2',6'), 6.89 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-3',5'); ¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ: 166.7 (C-2), 104.1 (C-3), 184.0 (C-4), 162.9 (C-5), 101.0 (C-6), 164.3 (C-7), 95.9 (C-8), 158.9 (C-9), 107.0 (C-10), 123.0 (C- 1'), 129.7 (C-2'), 117.0 (C-3'), 162.9 (C-4'), 117.0 (C-5'), 129.6 (C-6'), 99.8 (C-1"), 79.0 (C-2"), 79.0 (C-3"), 71.4 (C-4"), 78.3 (C-5"), 62.4 (C-6"), 102.5 (C-1"'), 72.2 (C-2"'), 72.2 (C-3'"), 74.0 (C-4'"), 70.0 (C-5"'), 18.3 (C-6"')。以上光谱数据与文献[李云秋，雷心心，杨士林，等．锐尖山香圆叶化学成分的研究[J]．中国药学杂志，2012，47(4)：261-264]报道的波谱数据一致，因此，鉴定该化合物为芹菜素-7-O-新橙皮糖苷(4"-hydroxyl-albiflorin)，其核磁共振氢谱如图7所示，核磁共振碳谱如图8所示。

化合物Ⅳ：黄色无定型粉末，UV254下有强烈的紫外吸收，ESI-MS m/z: 611 [M+H]⁺ (分子式C₂₇H₃₀O₁₆)。化合物¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 6.45 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 6.79 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 8.07 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2',6'), 6.91 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-3',5'); ¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ:155.97 (C-2), 133.41(C-3), 177.60 (C-4), 160.8 (C-5), 99.3 (C-6), 162.8 (C-7), 94.6 (C-8), 156.0 (C-9), 105.6 (C-10), 120.7 (C-1'), 130.6 (C-2'), 115.1 (C-3'), 160.1 (C-4'), 115.1 (C-5'), 130.6 (C-6'), 99.6 (C-1"), 73.0 (C-2"), 76.4 (C-3"), 69.5 (C-4"), 77.1 (C-5"), 60.8 (C-6"), 100.6 (C-1"'), 74.2 (C-2"'), 76.6 (C-3'"), 69.9 (C-4'"), 77.5 (C-5"'), 60.6 (C-6"')。以上光谱数据与文献[于敏荣，李铣，张海军，等．小花棘豆化学成分的研究[J]．植物学报 1992，34(5)：369-377]报道的波谱数据一致，因此鉴定该化合物为山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-7-O-β-D葡萄吡喃糖，其核磁共振氢谱如图9所示，核磁共振碳谱如图10所示。

化合物Ⅴ：黄色无定形粉末(DMSO)，UV254下有强烈的紫外吸收，ESI-MS m/z: 449[M+H]⁺ (分子式为C₂₁H₂₀O₁₁)。化合物¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ: 6.79 (1H, d, J =2.2 Hz, H-8), 6.44 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-6), 8.06 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2', 6'), 6.89 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-3', 5')；¹³C-NMR (100Hz, DMSO) δ: 147.3 (C-2), 135.9 (C-3), 175.9 (C-4), 162.1 (C-5), 98.7 (C-6), 162.5(C-7), 94.3 (C-8), 155.6 (C-9), 104.6 (C-10), 121.4 (C-1'), 129.5 (C-2',6'), 78.0 (C-3', 5'), 159.2 (C-4')。以上光谱数据与文献[邱鹰昆，窦德强，陈英杰，等．仙人掌的化学成分研究[J]．中国药科大学学报，2005, 36 (3)：213-215]报道的波谱数据一致，因此，鉴定该化合物为山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷(kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside)，其核磁共振氢谱如图11所示。

五、活性测试

1．试验材料

牡丹花总黄酮(实施例3得到)；盐酸肾上腺注射液，天津药业集团新郑股份有限公司。0.9%氯化钠和10%水合氯醛由河南科技大学第一附属医院提供。

实验方法

将40只大鼠随机分组，每组10只，分为：（1）正常组：腹腔注射生理盐水；（2）模型组：腹腔注射生理盐水；（3）剂量组：腹腔注射牡丹花黄酮高剂量100mg/kg/天和低剂量50mg/kg/天。每天给药一次。第三天给药后30min，将模型组和不同剂量组皮下注射盐酸肾上腺注射液制造大鼠急性血瘀症模型，正常组注射生理盐水，后停食。第二天一早采用10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，枸橼酸钠抗凝，采用血液流变仪测定不同切变率全血黏度和血浆黏度等指标。

结果

表牡丹花黄酮对急性大鼠血液流变性影响

与正常组比较#p<0.01, *p<0.05; 与模型组比较##p<0.01。表明牡丹花黄酮具有一定的干预急性大鼠血瘀证异常血液流变性的作用。

Claims

1.一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）采用乙醇溶液提取

2）牡丹花总黄酮粗品树脂富集

3）牡丹花总黄酮精制品沉淀富集

4）牡丹花总黄酮进一步纯化

2.如权利要求1所述的一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于：所述的步骤1）中浸泡牡丹花瓣时采用的质量浓度为70-90%的乙醇溶液的添加量为干燥牡丹花瓣重量的10-20倍，超声提取滤渣时乙醇溶液的添加量为滤渣重量的10-20倍。

3.如权利要求1所述的一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于：所述的步骤2）中溶解提取浸膏时蒸馏水的用量为提取浸膏重量的200-400倍。

4.如权利要求1所述的一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于：所述的步骤2）中的树脂为D101或AB-8型大孔吸附树脂，或者聚酰胺树脂。

5.如权利要求1所述的一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于：所述的步骤2）中树脂的用量为提取浸膏重量的200-400倍。

6.如权利要求1所述的一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于：所述的步骤2）中不同浓度的乙醇水溶液的洗脱体积均为柱体积的3-5倍。