CN115192638B - 一种大花黄牡丹抗氧化活性部位及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大花黄牡丹抗氧化活性部位及其制备方法和应用，属于植物提取技术领域。大花黄牡丹抗氧化活性部位的制备方法包括以下步骤：(1)大花黄牡丹部位筛选：将大花黄牡丹部位与乙醇溶液混合，超声，过滤收集滤液；通过分光光度法检测提取液中黄酮的含量，以提取液的总黄酮含量为指标筛选大花黄牡丹的活性部位；(2)提取工艺：将步骤(1)中筛选出的有效部位与1,3‑丁二醇溶液混合加热回流，过滤收集滤液；制备得到的大花黄牡丹抗氧化活性部位用于清除DPPH自由基，清除率高达97％。

Description

一种大花黄牡丹抗氧化活性部位及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，涉及一种大花黄牡丹抗氧化活性部位及其制备方法和应用。
背景技术
黄酮类化合物是植物的一种次级代谢产物，主要存在于植物的花和叶中，在根中含量较低。广泛存在于植物界中，多以苷类形式存在。并且根据糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同可以组成各种各样黄酮苷类。组成黄酮苷的糖类包括单糖、双糖、三糖和酰化糖。黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂中；但难溶或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性。酚羟基数目、位置不同也使酸性强弱有差异。其抗氧化能力是维生素E的10倍。大量的研究表明黄酮类化合物具有抗炎、消除自由基、抗肿瘤、调节免疫力、降血压、降血糖等功效；还可有效改善血液循环，减少心脑血管发病率；亦可增强伤口愈合和止痛等。
酚类化合物被认为是天然抗氧化剂最丰富的来源，通常存在于不同的植物器官(叶、根等)、水果和蔬菜中。多酚是很强的抗氧化剂，它的抗氧化功能可以对慢性病起到预防作用，并且可以对其他抗氧化剂起促进作用，延长其他它们在人体内的作用时间；若高脂食物与富含多酚的食物同时食用，还可以有效地预防高脂食物对人体产生不利的影响。
黄酮类化合物和多酚类化合物是牡丹花主要的活性成分。文献记载，各类牡丹花中总黄酮、总酚含量和抗氧化能力的实验结果发现：总酚、总黄酮测定结果显示，深色花瓣的多酚含量高于浅色的花瓣，黄色花瓣也表现出较高的多酚含量；抗氧化能力测定结果显示，浅色花(白色花和绿色花)抗氧化能力较低，深色花和黄色花抗氧化能力较高。而大花黄牡丹属于黄色花范畴，又是新发现的物种，因此有必要对其展开研究。
文献1(濒危植物大花黄牡丹的研究进展[J].黑龙江农业科学,2022(01):94-99)公开了在大花黄牡丹的花朵中检测出山奈酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡糖苷、芹菜素-7-O-新橙皮3种类黄酮，Km3G7G的色素成分；文献2(大花黄牡丹营养器官形态解剖学观察[J].高原农业,2018,2(01):57-60)公开了丹皮酚是大花黄牡丹的主要药用成分，为次生代谢产物，主要存在于大花黄牡丹的根部。尽管以上文献均记载了大花黄牡丹中具备抗氧化作用的成分，但对于有效成分的提取以及提取物的抗氧化效果的研究却鲜有报道。
因此，有必要探索一种工艺简单、提取物有效成分含量高且抗氧化效果好的大花黄牡丹抗氧化活性部位的提取方法。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种工艺简单、提取物有效成分含量高且抗氧化效果好的大花黄牡丹抗氧化活性部位及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
提供了一种大花黄牡丹活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)大花黄牡丹有效部位筛选：将大花黄牡丹部位与乙醇溶液混合，超声，过滤收集滤液；通过分光光度法检测滤液中黄酮的含量；以滤液中总黄酮含量为指标筛选大花黄牡丹的活性部位；
(2)提取工艺：将步骤(1)中筛选出的有效部位与1,3-丁二醇溶液混合加热回流，过滤收集滤液；
步骤(1)中所述大花黄牡丹部位、乙醇溶液的用量比为1-1.2g：20-22mL；
步骤(2)中所述有效部位、1,3-丁二醇溶液的用量比为1-1.3g：50-55mL。
进一步地，步骤(1)中所述大花黄牡丹部位为花、叶、茎、枝、根的任意一种，步骤(2)中所述有效部位为花或叶。
进一步地，步骤(1)中所述乙醇溶液的浓度为70-80％(体积分数)；所述超声温度为55-65℃，超声时间为0.8-1.2h。
进一步地，步骤(2)中所述1,3-丁二醇溶液的浓度为25-35％(体积分数)；所述加热回流温度为100℃，时间为2-3h；
进一步地，步骤(2)中所述过滤所用的滤板尺寸为0.4-0.5μm。
其次，提供了一种所述的制备方法得到的大花黄牡丹活性部位。
进一步地，所述的大花黄牡丹活性部位包括黄酮和多酚两种成分。
最后，提供了一种所述的制备方法得到的大花黄牡丹活性部位或所述的大花黄牡丹活性部位在清除DPPH自由基中的应用。
进一步地，所述大花黄牡丹活性部位在清除DPPH自由基功效中的质量分数为2-5％。
在具体的实施方式中：
筛选植物部位：
1. 75％醇提法：
称取3.0g大花黄牡丹的花放入烧杯中，按照料液比1:20加入60mL 75％乙醇溶液，用封口膜封口，放入超声仪，在60℃、功率80％条件下超声1h。然后用滤纸粗滤，收集滤液，用样品瓶常温保存。其他植物部位仿照花的操作方法进行实验。
2.分光光度法测定总黄酮含量：
各取1mL提取液(或不同浓度的芦丁标准品溶液)于EP管中，每管加入4mL去离子水，再加入0.3mL 5％(质量分数)NaNO2溶液，混匀，静置5min后每管再加入0.3mL 10％(质量分数)Al(NO3)3溶液，静置6min后加入2mL 1.0mol/L的NaOH溶液和2.4mL去离子水，10min后用酶标仪在510nm条件下测定吸光度。
3.根据实验结果筛选出黄酮含量最高的植物部位为大花黄牡丹的叶，其次是花。
提取工艺：
1.水提复配法：
各称取1.0g大花黄牡丹的花和叶分别放入两个三口蒸馏烧瓶中，按照料液比1:50的比例向两个三口烧瓶中分别加入50.0g去离子水，100℃热回流2.5h。静置冷却后用滤纸粗滤，再按照7:3(w/w)的比例将提取液与30％1,3-丁二醇溶液进行复配，用0.45μm的滤板精滤得样品H1和Y1。
2. 75％醇提复配法：
各称取1.0g大花黄牡丹的花和叶分别放入两个烧杯中，按照料液比1:50的比例向两个烧杯中各加入50.0g 75％的乙醇溶液，在60℃、功率80％条件下超声1h。然后用滤纸粗滤，记录滤液体积，将滤液5倍浓缩后，加入滤液总体积30％的30％1,3-丁二醇溶液，剩余体积用去离子水补足。将复配后的溶液用0.45μm的滤板精滤得样品H2和Y2。
3. 1,3-丁二醇提法：各取1.0g大花黄牡丹的花和叶分别放入两个三口烧瓶中，按照料液比1:50的比例向两个三口烧瓶中各加入50mL 30％1,3-丁二醇溶液，100℃热回流2.5h。静置冷却后用浸泡过去离子水的0.45μm的滤板精滤，收集滤液得样品H3和Y3。
4.用分光光度法测定三种提取工艺的样品的总黄酮含量，记录数据。
5.福林酚比色法测定总酚含量：
将1mL样品(或不同浓度的没食子酸标准品溶液)放入10mL EP管中，分别加入5mL10％(质量分数)福林酚试剂，混匀，7min后加入4mL 7.5％(质量分数)碳酸钠溶液，1h后在765nm下测定吸光值；去离子水作为空白对照。
6.DPPH自由基清除实验测定抗氧化：
称取20.0mg DPPH，加入无水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，DPPH浓度配制为2×10-4mol/L；1.0mg/mL的Vc溶液作为阳性对照。
取1.0mL的待测液(或阳性对照)与1.0mL的2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A管)；取1.0mL的无水乙醇与1.0mL的2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(B管)；取1.0mL的无水乙醇与1.0mL的待测液(或阳性对照)混匀(C管)；
反应30min后，在517nm下测A、B、C管吸光度值。
清除率计算公式为：
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的制备方法简单、原料来源广泛，成本低；
(2)本发明提供的制备方法得到的提取物进行DPPH自由基清除实验测定，清除率高达97％。
附图说明
图1为75％乙醇超声提取测定各部位总黄酮和总多酚含量；
图2为三种提取工艺总黄酮和总多酚含量测定：H1、Y1为水提复配法，H2、Y2为75％乙醇提取复配法，H3、Y3为1,3-丁二醇提取法；
图3为三种提取工艺DPPH清除自由基抗氧化能力测定：H1、Y1为水提复配法，H2、Y2为75％乙醇提取复配法，H3、Y3为1,3-丁二醇提取法；
图4为对比例1中提取物的总黄酮和总多酚含量；
图5为对比例2中提取物的总黄酮和总多酚含量；
图6为对比例2中提取物DPPH清除自由基抗氧化能力测定。
具体实施方式
值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定。
以下试剂来源，为示例性说明：芦丁对照品来自Solarbio life sciences，福林酚来自北京酷来搏科技有限公司，没食子酸对照品来自上海麦克林生化试剂有限公司，VC对照品来自北京百灵威科技有限公司。
实施例1大花黄牡丹部位筛选
75％乙醇超声提法：75％乙醇超声提法：称取3.0g大花黄牡丹的花放入烧杯中，按照料液比1:20加入60mL 75％乙醇溶液，用封口膜封口，放入超声仪，在60℃、功率80％条件下超声1h。然后用滤纸粗滤，收集滤液得CH1。其他植物部位(叶、茎、枝和根)仿照花的操作方法进行实验，分别得CY1，CJ1，CZ1和CG1。
分光光度法测定总黄酮含量：各取1mL花的提取样品于3个10mL EP管中，每管加入4mL去离子水，再加入0.3mL 5％NaNO2溶液，混匀，静置5min后每管再加入0.3mL 10％Al(NO3)3溶液，静置6min后加入2mL 1mol/L的NaOH溶液和2.4mL去离子水，10min后用酶标仪在510nm条件下测定吸光度，代入标曲计算样品总黄酮含量。
福林酚比色法测定总酚含量：
配制10％的福林酚溶液，将1mL样品放入10mL EP管中，分别加入5mL 10％福林酚试剂，混匀，7min后加入4mL 7.5％碳酸钠溶液，1h后在765nm下测定吸光值；去离子水作为空白对照。
通过测定大花黄牡丹各个部位的总黄酮和总多酚含量，筛选出最佳的部位，结果如图1所示。
通过图1实验结果得知，大花黄牡丹75％乙醇超声提法总黄酮含量最高的部位是花，其次是叶，其总黄酮含量显著高于茎、枝、根等部位；总多酚含量最高的是叶，其次是花，其总多酚含量显著高于茎、枝、根等部位。
从图1综合总黄酮和总多酚含量测定的结果来看，75％乙醇超声提法筛选出的最佳部位是花，其次是叶。故将花与叶同时作为最佳部位筛选出来，进行后续实验。
实施例2提取工艺
1.水提复配法：
各称取1.0g大花黄牡丹的花和叶分别放入烧瓶中，按照料液比1:50的比例向两个三口烧瓶中分别加入50.0g去离子水，100℃热回流2.5h。静置冷却后用滤纸粗滤，再按照7:3(w/w)的比例将提取液与30％1,3-丁二醇溶液进行复配，用0.45μm的滤板精滤得样品H1和Y1。
2. 75％醇提复配法：
各称取1.0g大花黄牡丹的花和叶分别放入两个烧杯中，按照料液比1:50的比例向两个烧杯中各加入50.0g 75％的乙醇溶液，在60℃、功率80％条件下超声1h。然后用滤纸粗滤，记录滤液体积，将滤液5倍浓缩后，加入滤液总体积30％的30％1,3-丁二醇溶液，剩余体积用去离子水补足。将复配后的溶液用0.45μm的滤板精滤得样品H2和Y2。
3. 1,3-丁二醇提取法：
各取1.0g大花黄牡丹的花和叶分别放入两个三口烧瓶中，按照料液比1:50的比例向两个三口烧瓶中各加入50mL 30％1,3-丁二醇溶液，100℃热回流2.5h。静置冷却后用浸泡过去离子水的0.45μm的滤板精滤，收集滤液得样品H3和Y3。
4.用分光光度法测定三种提取工艺的样品的总黄酮含量，记录数据。
5.福林酚比色法测定总酚含量：
配制10％的福林酚溶液，将1mL样品放入10mL EP管中，分别加入5mL 10％福林酚试剂，混匀，7min后加入4mL 7.5％碳酸钠溶液，1h后在765nm下测定吸光值；去离子水作为空白对照。
6.DPPH自由基清除实验测定抗氧化：
称取20.0mg DPPH，加入无水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，DPPH浓度配制为2×10-4mol/L；1.0mg/mL的Vc溶液作为阳性对照。
取1.0mL的待测液(或阳性对照)与1.0mL的2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A管)；取1.0mL的无水乙醇与1.0mL的2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(B管)；取1.0mL的无水乙醇与1.0mL的待测液(或阳性对照)混匀(C管)；反应30min后，在517nm下测A、B、C管吸光度值。
清除率计算公式为：
通过图2的实验结果可以看出，水提复配法的总黄酮含量最低；75％乙醇提取复配法的总多酚含量最低；而1,3-丁二醇提取法中，花比叶总黄酮和总多酚含量均高于其他两种方法。同时，1,3-丁二醇提取的样品中，花的总黄酮和总多酚含量均高于叶。
通过图3的实验结果可知，三种提取工艺的提取物均具有良好的DPPH自由基清除能力，并且在一定浓度范围内具有浓度依赖性。其中1,3-丁二醇提取的样品抗氧化能力最强，水提复配法提取的样品的抗氧化能力最弱。故从总体来看，最佳提取工艺为1,3-丁二醇提取法。
对比例1
大花黄牡丹花筛选的步骤如下：称取2.0g大花黄牡丹的花放入烧杯中，按1:30的料液比加入60mL 60％乙醇溶液，用封口膜封口，放入超声仪，在60℃、功率80％条件下超声1h。然后用滤纸粗滤，收集滤液得样品CH2。其他植物部位(叶、茎、枝和根)仿照花的操作方法进行实验，分别得CY2，CJ2，CZ2和CG2。测定总黄酮和总多酚的方法同实施例1。最终得到的该提取方法下测定各个部位总黄酮和总多酚的含量见图4。
对比例2
1,3-丁二醇提法：直接选取1.0g大花黄牡丹的花和叶分别放入两个三口烧瓶中，向两个三口烧瓶中各加入100mL 20％1,3-丁二醇溶液，100℃热回流2.5h。静置冷却后用浸泡过去离子水的0.45μm的滤板精滤，收集滤液于样品瓶中，分别得H4和Y4。总黄酮、总酚含量的测定及DPPH自由基清除实验测定同实施例2，测得的总黄酮和总多酚含量见图5；DPPH自由基清除实验测定见图6。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种大花黄牡丹活性部位的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)大花黄牡丹有效部位筛选：将大花黄牡丹部位与乙醇溶液混合，超声，过滤收集滤液；检测滤液中黄酮的含量；
(2)提取工艺：将步骤(1)中筛选出的有效部位与1,3-丁二醇溶液混合加热回流，过滤收集滤液；
步骤(1)中所述大花黄牡丹部位、乙醇溶液的用量比为1-1.2g：20-22mL；
步骤(2)中所述有效部位、1,3-丁二醇溶液的用量比为1-1.3g：50-55mL；
步骤(1)中所述大花黄牡丹部位为花、叶、茎、枝、根的任意一种，步骤(2)中所述有效部位为花或叶；
步骤(1)中所述乙醇溶液的浓度为70-80％；所述超声温度为55-65℃，超声时间为0.8-1.2h；
步骤(2)中所述1,3-丁二醇溶液的浓度为25-35％；
步骤(2)中所述加热回流温度为100℃，时间为2-3h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述过滤所用的滤板尺寸为0.4-0.5μm。
3.权利要求1或2所述的制备方法得到的大花黄牡丹活性部位。
4.根据权利要求3所述的大花黄牡丹活性部位，其特征在于，包括黄酮和多酚两种成分。
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