CN109316416A - 一种艾叶提取物及其在化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种艾叶提取物及其在化妆品中的应用。该艾叶提取物的制备方法包括：取艾叶，干燥，粉碎，与一定比例的乙醇溶液混合，回流加热一段时间后，过滤收集滤液；取滤液，减压浓缩，获得艾叶粗提物后，经大孔树脂纯化，减压回收溶剂，干燥既得艾叶提取物。实验表明，本发明提供的艾叶提取物具有较好的抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力，作用48h时抑制酪氨酸酶活性的IC₅₀值可达76.39μg/mL，优于经典美白剂熊果苷，体外对DPPH以及ABTS自由基清除的IC₅₀值分别可达60.26μg/mL和382.32μg/mL，可作为植物添加剂用于抗衰老和美白化妆品的开发，扩大了艾叶的应用范围。本发明提取工艺流程简单，易于操作，生产成本低，提高了艾叶的综合利用率。

Description

一种艾叶提取物及其在化妆品中的应用

技术领域

本发明属于植物应用以及化妆品领域，具体为一种艾叶提取物及其制备方法以及其在化妆品中的应用。

背景技术

随着生活压力的增大和环境污染的加剧，人们的皮肤承受了越来越多的压力，皮肤暗沉、色素沉着、提早衰老已成为了很多女性所面临的一种困扰，因此具有美白、抗衰老等功效的化妆品越来越受到人们的追捧。但是目前市面上大多数的美白、抗衰老原料都是化学合成，如具有增白作用的汞盐和祛斑作用的氢醌，这些化合物虽然有快速达到美白之功效，但对皮肤有毒副作用，长期使用会引起接触性皮炎或引起永久脱色等不良作用。因此，寻找开发高效且对人体无副作用或副作用小的天然美白、抗衰老活性成分已成为目前化妆品领域的一个趋势。

艾叶为菊科植物艾(Artemisia argyi Levl.et Vant.)的干燥叶，于每年夏季花未开时采摘，除去杂质，晒干或阴干而得。艾叶为我国传统中药，其味苦、辛、性温，具有温经止血、散寒止痛、祛湿止痒等功效。现代研究表明，艾叶在抗氧化、抗肿瘤、抗菌等领域具有显著的药理活性。艾叶的化学物质多而复杂，主要化学成分包括挥发油、黄酮类、鞣质类、桉叶烷类、多糖类、三萜类及微量元素类等。其中艾叶中研究应用较多的为挥发油成分，含有桉叶油醇、右旋龙脑、左旋樟脑和石竹烯等多种活性成分，具有显著的抗炎和抑菌作用，但艾叶中挥发油含量仅有0.5％，限制了艾叶挥发油的进一步开发利用。与挥发油相比，艾叶中含有丰富的黄酮类化合物，其黄酮类物质含量大约为4％左右，具有抗菌、抗溃疡、抗过敏、抗炎、抗氧化、抗衰老和降血脂等多种的活性，但目前对艾叶黄酮的研究和利用较少。

公开号为CN105616295B的专利公布了一种具有美白功能的艾叶组合物及其应用，它是将艾叶与其他中药材组合在一起，达到一种美白功效，但是艾叶起到功效的主要成分以及具体作用并不清楚；公开号为 CN105534796B专利公布了一种含有艾叶提取物的抗过敏爽肤水及其制备方法，其通过纤维素酶辅助乙醇提取法获得艾叶提取物，用于抗过敏爽肤水的原料添加剂，但所获得的艾叶提取物中黄酮的含量、成分和稳定性未做深入研究；公开号为CN107242983A的中国专利公开一种艾叶黄酮的漱口水及其制备方法，其通过超声波辅助乙醇水浸提发获得了艾叶黄酮提取物，用于牙膏中发挥抗菌消炎作用。综合现有专利和文献资料，现有的制备技术获得的艾叶提取物中黄酮的含量偏低，且缺乏关于其成分和质量标准的研究，艾叶提取物在美白、抗衰老等化妆品中的应用也未见相关的研究报道。

发明内容

为了克服现有艾叶提取物制备技术的不足，扩大艾叶的应用范围，本发明旨在提供一种艾叶提取物及其在化妆品中的应用，本发明的艾叶提取物制备工艺简单、成本低、易实现大规模生产，且具有较好的美白、抗氧化等功效，可广泛应用于水、乳、霜等化妆品中。

本发明提供了一种艾叶提取物，其总黄酮含量为20～70％，其中绿原酸的浓度不低于1％。

本发明提供的艾叶提取物的制备方法包括以下步骤：

步骤1：取艾叶，干燥粉碎，与一定浓度的乙醇水溶液混合，加热至一定温度，持续浸提一定时间后，获得提取液；

步骤2：取提取液，减压回收溶剂，获得艾叶粗提物；

步骤3：取艾叶粗提物，经大孔树脂纯化后，减压回收溶剂，干燥获得艾叶提取物。

作为优选，本发明提供的艾叶提取物的制备方法中，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为30～80％；艾叶干燥粉末与所述的乙醇水溶液的质量-体积比为1:5～1:50，所述的加热温度为40～80℃，提取时间为0.5～2h，提取次数为1～4。

优选的，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60％，艾叶干燥粉末与所述的乙醇水溶液的质量-体积比为1:20，所述的加热温度为70℃，提取时间为 1.0h。

作为优选，本发明提供的艾叶提取物的制备方法中，提取次数为2次；

作为优选，本发明提供的艾叶提取物的制备方法中，所述的步骤2具体为将获得的提取液在45～60℃旋转蒸发，去除经过步骤1得到的提取液中的乙醇，得到艾叶的粗提取。

作为优选，本发明提供的艾叶提取物的制备方法中，所述的大孔树脂为中等极性或弱极性大孔树脂，所述的步骤3具体为将步骤2获得的艾叶粗提物用水溶解后，将滤液通过大孔吸附树脂吸附，先后用水和低浓度乙醇洗脱到无色后，依次用30～85％浓度的乙醇梯度洗脱，收集30～80％的乙醇洗脱液。

优选的，乙醇的洗脱浓度为50％，收集50％的乙醇洗脱液。

作为优选，本发明提供的艾叶提取物的制备方法中，所述的步骤3的减压干燥步骤具体为，将获得的提取液在45～60℃旋转蒸发，去除经过步骤 3得到的洗脱液中的乙醇，经真空干燥或低温冷冻干燥后，得到艾叶提取物。

优选的，艾叶提取物的干燥方法为真空干燥。

本发明还提供了艾叶提取物作为抗氧化剂剂和酪氨酸酶抑制剂在抗衰老和美白化妆品中的应用。

本发明提供的实验数据表明，本发明提供的艾叶提取物对酪氨酸酶有着良好的抑制作用，作用48h时抑制酪氨酸酶活性的IC₅₀值仅为76.39ug/mL，显著优于阳性对照品熊果苷；体外抗氧化数据表明，艾叶提取物的DPPH 和ABTS自由基清除能力的IC₅₀值分别为60.26μg/mL和382.32μg/mL。

本发明的优点和有益效果如下：

1.本发明以艾的干燥叶为原料，通过乙醇加热浸提法和大孔树脂纯化法获得艾叶提取物，建立了群体化学特征整体性的HPLC指纹图谱质量评价方法，以保证艾叶提取物的质量稳定性。本发明所述的艾叶提取物的制备工艺合理，简便易行，生产成本低，可用于大批量的工业化生产，具有广阔的市场应用前景，提高了艾叶的综合利用率。

2.本发明制得的艾叶提取物对酪氨酸酶有着良好的抑制作用，作用48h 时抑制酪氨酸酶活性的IC₅₀值仅为76.39ug/mL，显著优于阳性对照品熊果苷；体外抗氧化数据表明，艾叶提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力的IC₅₀值分别为60.26μg/mL和382.32μg/mL，与对照物Trolox的抗氧化能力相当。本发明提供的艾叶提取物可用于制备美白抗衰老的化妆品。

附图说明

图1艾叶提取物的HPLC指纹图谱，其中含量高、分离度好的特征峰共10个，分别以阿拉伯数字1-10表示，以绿原酸作为对照品，在图中为峰 2。

图2艾叶提取物对DPPH自由基清除能力的影响，阳性对照物Trolox 的浓度为15μg/mL。

图3艾叶提取物对ABTS自由基清除能力的影响，阳性对照物Trolox 的浓度为100μg/mL。

图4艾叶提取物对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖活性的影响，阳性对照物熊果苷的浓度为320μg/mL。

图5艾叶提取物对小鼠黑色素瘤B16细胞酪氨酸酶活性的影响，阳性对照物熊果苷的浓度为320μg/mL。

具体实施方式

本发明下述实施例所指的艾叶提取物中总黄酮的测定方法参照《中国药典》2015版一部附录的山楂叶总黄酮检测的具体方法，以芦丁为对照品，采用NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH法进行检测。多糖含量检测参照SN/T 4260-2015，采用苯酚硫酸法进行检测，其主要的实验步骤如下：精密吸取样品溶液0.2mL，置于10mL具塞试管中，加水补至1.0mL，精密加入1.0mL5％的苯酚溶液，摇匀，然后快速加入浓硫酸5mL(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，静置10min后，使用旋涡振荡器反应充分混合均匀，然后放置于30℃水浴中反应20min，用紫外可见分光光度计在488nm下进行检测。

本发明采用的试剂均为普通市售品。

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1：艾叶提取物的制备

取干燥粉碎后的艾叶粉末60g，置于2000mL圆底烧瓶中，加入70％的乙醇溶液1.5L，在65℃条件下，加热回流提取45min，冷却至室温后，过滤，收集滤液，滤渣再重复提取一次，合并两次滤液，得到艾叶提取液，所得艾叶提取液中黄酮含量为11.20mg/g，多糖含量为52.11mg/g。

将艾叶提取液在45℃条件下真空浓缩至无醇味，再用去离子水溶解稀释成黄酮含量为3mg/mL，过滤，以2mL/min的流速上AB-8大孔吸附树脂，用1％FeCl₃溶液检查流出液，直至反应呈阳性(检测显色)时，表明有黄酮流出，树脂吸附达到饱和，停止上样；吸附1小时后，先用去离子水洗脱至无色，再用50％的乙醇溶液进行洗脱，流速控制为3BV/h，洗脱剂用量为5BV，收集洗脱液。经计算，艾叶提取物中黄酮的回收率为62.12％。将洗脱液减压浓缩至粘稠状，再于45℃真空干燥箱中干燥即得艾叶提取物，最终得到干燥粉末2.10g，得率有3.5％。所得的艾叶提取物中黄酮含量为 45.35％，是纯化之前的5倍。

实施例2：艾叶提取物的质量检测

(1)指纹图谱

精密称取干燥至衡重的提取物粉末20mg，置于10mL容量瓶中，用10％的乙腈水溶解后定容至刻度，配成2mg/mL的供试品溶液，取上清液，过 0.22μm微孔滤膜后上高效液相色谱仪进行检测，其中流动相A为0.1％的磷酸水(超纯水)溶液；流动相B为乙腈；色谱柱为Aglient Poroshell 120EC-C18 (4.6*100mm，2.7μm)；流速为0.8mL/min，波长325nm，柱温35℃，进样量20μL，以绿原酸作为表征物质。

色谱图见图1，由图可知共得到了10个色谱峰，其中含量高、分离度较好的色谱峰有7个，分别在图中标记为阿拉伯数字1-7，上述色谱峰可用于艾叶提取物的质量控制。以绿原酸(在图中峰为2)作为对照品，其理论塔板数为11000，分离度为10，对称因子为0.52，含量为1.87％。

(2)感官性状

启开试样后，立即嗅其味；取适量样品置于白色瓷盘或透明塑料瓶中，在自然光照下，观察其色泽、状态，并检查有无异物。结果表明艾叶提取物具有植物特有气味，呈黄色至黄褐色粉末。

(3)基本理化指标

基本理化指标包括干燥粉末的水分、灰分、黄酮含量以及复溶液的折光率、相对密度、以及pH等指标。

其中水分检测参照《中国药典》2015年版第四部(通则0832)，灰分检测参照照《中国药典》2015年版第四部(通则0841)炽灼残渣检查法。将干燥粉末，用50％丁二醇进行溶解，浓度为0.2％，分别用阿贝折光仪、比重瓶以及精密pH检测复溶液的折光率、相对密度以及pH，结果见表1。

表1艾叶提取物基本理化指标

实施例3：DPPH自由基清除实验

DPPH自由基清除能力常用来表示物质的抗氧化能力，其原理是DPPH 自由基溶液呈紫色，最大吸收波长为517nm，当有自由基清除剂存在时，由于其与DPPH中电子配对使DPPH液吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成一定关系，因而可用紫外分光光度法进行定量分析。

准确吸取1mL样品溶液，加入5mL DPPH溶液，混匀后在室温下(25℃) 避光静置30min，测定517nm处的吸光值，计算清除率，以清除率为y、 Trolox溶液浓度(μg/mL)为x制作标准曲线。

y＝(A₀-A₁-A₂)/A₀*100％

y—清除率，％

A₀—1mL蒸馏水+5mL DPPH溶液的吸光度

A₁—1mL样品/Trolox标准液+5mL DPPH溶液的吸光度

A₂—1mL样品/Trolox标准液+乙醇溶液的吸光度(消除不同样品之间颜色的误差)

以Trolox标准工作液为阳性对照，以无水乙醇为空白对照。

艾叶提取物的DPPH自由基清除能力随浓度的变化如图2所示，由图可知，当艾叶提取物浓度为20μg/mL时，其对DPPH自由基的清除率为19.9％，当浓度为100μg/mL，清除率为74.87％，因此，在20～100μg/mL范围内，艾叶提取物对DPPH自由基的清除率随着浓度的增加而增加。用Origin作拟合曲线，可得艾叶提取物对DPPH自由基清除率为50％时的浓度(IC₅₀)值为60.26μg/mL，阳性对照物Trolox的IC₅₀值为14.94μg/mL，由此可见艾叶提取物具有一定的抗氧化能力。

实施例4：ABTS自由基清除实验

ABTS自由基清除能力也常用来表示抗氧化能力，其原理是与过硫酸钾反应生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS·+，抗氧化活性物质与该离子反应，单个电子从抗氧化剂分子转移到氧化剂分子上，使反应体系中的蓝色褪去，可在紫外分光光度计下测定734nm处的吸光度变化值从而来评价其清除自由基的能力。

准确吸取0.2mL样品溶液，加入7.8mL ABTS自由基工作液，混匀后在室温下(25℃)避光静置10min，测定734nm处的吸光值，计算清除率，以清除率为y、Trolox溶液浓度(μg/mL)为x制作标准曲线。

y＝(A₀-A₁-A₂)/A₀*100％

y—清除率，％

A₀—0.2mL蒸馏水+7.8mL ABTS自由基工作液的吸光度

A₁—0.2mL样品/Trolox标准液+ABTS自由基工作液的吸光度

A₂—0.2mL样品/Trolox标准液+乙醇溶液的吸光度(消除不同样品之间颜色的误差)

以Trolox标准工作液为阳性对照，以无水乙醇为空白对照。

艾叶提取物的ABTS自由基清除能力随浓度的变化如图3所示，由图可知，当艾叶提取物的浓度为80μg/mL时，其对ABTS自由基的清除率为 11.69％，当浓度为500μg/mL时，清除率为64.17％，因此，在80～500μg/mL 范围内，艾叶提取物对ABTS自由基的清除率随着浓度的增加而增加。用 Origin作拟合曲线，可得艾叶提取物对DPPH自由基清除率为50％时的浓度(IC₅₀)值为382.32μg/mL，阳性对照物Trolox的IC₅₀值为113.12μg/mL，由此可见艾叶提取物具有一定的抗氧化能力。

实施例5：艾叶提取物对小鼠B16黑素瘤细胞存活率的影响

本发明采用噻唑蓝(MTT)法检测艾草提取物对小鼠B16细胞增殖的影响，目的在于找出一个合适的安全剂量范围。

将本发明提供的艾叶提取物用培养基配制成1000μg/mL的母液冻存备用。取对数生长期的细胞，用培养基调节成细胞密度至3.5×10⁴个/mL，将细胞接种于96孔板中，每孔100μL，37℃，5％CO₂饱和湿度环境下孵育 24h。向检测组的培养孔中加入不同终浓度的本发明提供的艾叶提取物，使每孔中艾叶提取物的终浓度分别为：50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400 μg/mL，并设立对照组：单纯培养基组、阳性药对照组(熊果苷，浓度：320 μg/mL)，和空白对照组(培养基)，置于孵箱中作用48h。向每孔加20μL 浓度为5mg/mL MTT溶液，在孵箱中作用4h后.小心吸除培养孔内的上清，再向每孔加入100μL DMSO，震荡10min，使结晶完全溶解后，放置于酶标仪上，选取检测波长为492nm，测定吸光度值，并计算细胞存活率，细胞存活率的计算公式如下：

测试结果如图4所示，由图可知，本发明提供的艾叶提取物在浓度为 50、100、200、400μg/mL时，使B16黑素瘤细胞的存活率分别为95.20％、 80.12％、58.42％、5.80％。用Graphpad Prism 5.0计算艾叶提取物导致细胞存活率下降50％的抑制浓度(IC₅₀)为190.8μg/mL。其中化妆品中常用美白剂熊果苷在浓度为320μg/mL时，细胞存活率为75.81％。说明本发明的艾叶提取物可以添加到化妆品中使用。

实施例6：艾叶提取物对小鼠B16细胞酪氨酸酶活性的影响

酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，通过抑制酪氨酸酶的活性，可以减少黑素的合成。美白功效评价的评价方法有：生物化学法，细胞生物学法和人体试用试验。本发明采用细胞生物学法评价艾草提取物的美白功效。本发明采用多巴氧化法测定小鼠B16细胞酪氨酸酶活性。

将本发明提供的艾叶提取物用培养基配制成1000μg/mL的母液冻存备用。取对数生长期的细胞，用培养基调节成细胞密度至3.5×10⁴个/mL，将细胞接种于96孔板中，每孔100μL，于37℃，5％CO₂饱和湿度环境下孵育24h。向检测组的培养孔中加入不同终浓度的本发明提供的艾叶提取物，使每孔中艾叶提取物的终浓度分别为：50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、 400μg/mL、600μg/mL，并设立对照组：单纯培养基组、阳性药对照组(熊果苷，浓度：320μg/mL)，和空白对照组(培养基)，置于孵箱中作用48h。吸去药液，用PBS洗2次后，每孔加1％TritonX-100溶液100μL，迅速放入-80℃冰箱冻存1h，随后移至室温下融化使细胞完全破裂、分解，在37℃预温后每孔加入0.1％L-DOPA 100μL，于37℃水浴2h，后置酶标仪下测A₄₉₂，测定吸光度值，并计算酪氨酸酶活性，酪氨酸酶活性的计算公式如下：实验重复三次。

测试结果如图5所示，本发明提供的艾叶提取物浓度在50μg/mL、100 μg/mL、200μg/mL、400μg/mL时使B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶的活性分别降低为63.67％，41.91％，20.41％，5.42％，3.47％，5.33％，用Graphpad Prism 5.0计算艾叶提取物导致酪氨酸酶活性下降50％的抑制浓度(IC₅₀)为 76.39μg/mL。而具有较高美白活性的熊果苷在浓度为320μg/mL时，B16 黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性降低为41.68％。说明本发明提供的艾叶提取物具有优异的美白作用，可以作为添加到化妆品中。

Claims (8)

1.一种艾叶提取物，其特征在于，所述艾叶提取物中黄酮的含量为20～70％，其中绿原酸的浓度不低于1％。

2.根据权利要求1中所述的艾叶提取物，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

步骤1：取艾叶，干燥、粉碎，与一定比例的乙醇溶液混合，回流加热一段时间后，过滤收集滤液；

步骤2：将滤液减压浓缩，获得艾叶粗提物；

步骤3：取艾叶粗提物，经大孔树脂纯化后，减压回收溶剂，干燥获得艾叶提取物。

3.根据权利要求2所述的艾叶提取物，其特征在于，所述乙醇水溶液中，乙醇的浓度为30～80％，艾叶干燥粉末与乙醇的质量-体积比为1:5～1:50，加热温度为40～80℃，加热时间为0.5～3小时。

4.根据权利要求2或3所述的艾叶提取物，其特征在于，所述的步骤2具体为将获得的提取液在45～60℃旋转浓缩，得到艾叶粗提物。

5.根据权利要求4所述的艾叶提取物，其特征在于，所述的大孔树脂为中等极性或弱极性大孔树脂，所述的步骤3具体为将步骤2获得的艾叶粗提物利用去离子水溶解后，将滤液通过大孔吸附树脂吸附，先后用水洗脱到无色后，再用30～80％浓度的乙醇梯度洗脱，收集30～80％的乙醇洗脱液。

6.根据权利要求5所述的艾叶提取物，其特征在于，所述的步骤3的减压干燥步骤具体为：将获得的提取液在45～60℃旋转蒸发，去除经过步骤3得到的洗脱液中的乙醇，经真空干燥或低温冷冻干燥后，得到艾叶提取物。

7.根据权利要求1所述的艾叶提取物在化妆品中的应用，其特征在于，艾叶提取物在抗衰老和美白化妆品中能够作为抗氧化剂剂和酪氨酸酶抑制剂，即艾叶提取物可作为制作美白、抗衰老化妆品的原料。

8.根据权利要求7所述的艾叶提取物在化妆品中的应用，其特征在于，所述化妆品剂型包括膏霜、乳液和水剂。