CN117205261A - 花椒艾叶组合物及其涂剂 - Google Patents
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明提供了一种花椒艾叶组合物，由如下组份组成：花椒和艾叶质量比3:7的醇提物；所述醇提物为60～80％乙醇提取物。本发明研究发现，上述组合物或其涂剂具有良好的抑菌活性和抗氧化活性。
Description
技术领域
本发明属于植物化学、植物药物领域。
背景技术
花椒精油系从天然植物花椒果壳中提取出来的具有天然麻辣味的稠膏状流体。高纯度、高浓度的花椒精油浓缩品，具有香气浓郁、麻味纯正、使用方便等特点，既可做为食品添加剂和调味品使用，又是医药、化工不可或缺的高价值原料；加热至45"C以上为黄绿色液体，又叫花椒树脂，为含有多种成分的混合物。
艾叶，中药名。为菊科植物艾Artemisia argyi Levl.et Vant.的干燥叶。温经止血，散寒止痛；外用祛湿止痒。用于吐血，衄血，崩漏，月经过多，胎漏下血，少腹冷痛，经寒不调，宫冷不孕；外治皮肤瘙痒。醋艾炭温经止血，用于虚寒性出血。艾叶精油是一种植物精油，它是从多年生草本植物艾草中提取出的天然物质，它可以用来做香薰，也能直接涂抹肌肤，具有一定的保健和美容作用。艾叶精油的功效与作用艾叶精油有自然的香气，它能提神醒脑，也能温养经络，而且能益气活血，除此以外，它还能驱寒止痛，促进血液循环，更能增强人体免疫力，在日常生活中，人们出现关节疼痛和皮肤痛痒以及免疫力低下时，都能使用艾叶精油来调来，它能让人体出现的不良症状，尽快减轻或消失。
发明内容
花椒精油、艾叶精油，均具有较好的抑菌活性，但两者是否适合两两配伍使用、如何配合，是本发明所要解决的问题。
本发明研究发现，将花椒与艾叶3:7进行醇提后，可以大幅提高组合物的抑菌活性。
基于上述发现，本发明提供了一种花椒艾叶组合物，由如下组份组成：
花椒和艾叶质量比3:7的醇提物；所述醇提物为60～80％乙醇提取物。
其中，所述醇提物为65～70％乙醇提取物。
其中，本发明醇提物采用回流提取方式，料液比为1：15～20；提取时间为100～120min。
进一步地，本发明组合物可以调整pH至5.0。
其中，所述醇提物，是回流后，提取液浓缩至每10g药材对应3-4mL浓缩液。
本发明提供了一种花椒艾叶醇提物涂剂，每10mL涂剂中含有如下组分：
前述的组合物10g，66％乙醇5mL，PEG-400 0.05mL，余量为水。
本发明还提供了上述组合物或上述涂剂在制备抑菌活性产品中的用途。
本发明还提供了上述组合物或上述涂剂在制备清除自由基产品中的用途。
附图说明
图1抑菌圈直径随乙醇浓度的变化
图2抑菌圈直径随提取时间的变化
图3抑菌圈直径随料液比的变化
图4残差正态分布概率图
图5残差分布图
图6不同比例花椒-艾叶抑菌效果对比
图7花椒-艾叶对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
图8花椒-艾叶对大肠埃希氏菌的抑菌效果
图9花椒-艾叶对铜绿假单胞菌的抑菌效果
图10花椒-艾叶醇提物对红色毛癣菌的抑菌效果
图11花椒-艾叶醇提物对石膏样小孢子菌的抑菌效果
图12不同pH条件下抑菌效果
图13DPPH·自由基清除率
图14超氧阴离子(·O2-)清除能力
图15总还原能力
具体实施方式
实施例1
通过单因素法对花椒-艾叶醇提物提取条件进行了考察，分别对乙醇浓度，提取时间，花椒-艾叶与乙醇的料液比参数进行筛选，确定花椒-艾叶乙醇提取条件。进一步以抑菌圈直径为指标，在对乙醇浓度，提取时间，花椒-艾叶与乙醇的料液比进行单因素筛选的基础上，建立三因素三水平的响应面拟合模型，优化花椒-艾叶的提取工艺，得到抑菌效果最好的花椒-艾叶醇提物。
1.1材料与设备
1.2实验方法
通过前期研究发现：花椒-艾叶醇提物分别通过热回流法和超声法进行提取，进一步过滤浓缩，冷冻干燥得到冻干粉，复溶后进行抑菌实验。比较两种提取方法，热回流的花椒-艾叶总提取率比超声的相对较好。从艾叶-花椒醇提物对大肠埃希氏菌的抑菌效果来看，用热回流提取的醇提物抑菌效果较好，这可能是由于热回流提取的温度比较高，所提取出来的有效成分更多，抑菌效果更好。故采用热回流法对花椒-艾叶进行提取。
1.1提取方法
精确称取比例为3：7的花椒-艾叶共10.000g，置于磨口三角瓶中。通过热回流法用乙醇进行提取，提取时间从沸腾的那一刻进行计时。冷却过滤，蒸发浓缩至无醇味，得到花椒-艾叶醇提物浸膏。加5％的二甲亚砜(DMSO)进行复溶，得到生药浓度为1g/mL的花椒-艾叶醇提物溶液。
1.2抑菌实验方法
1.2.1菌种的活化
将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌菌种接种至营养琼脂斜面培养基中，37℃培养24h，进行菌种复壮。挑取培养基中长势茁壮的单一菌落接种至新的培养基中，重复此步骤2-3次，从而完成菌种的活化。
1.2.2菌悬液的制备
在无菌条件下，用接种环将分离纯化后的供试菌取至装有0.9％氯化钠的无菌溶液待测管中，混合摇匀后稀释至0.5比浊管标准管浓度，得到浓度为1.5×108CFU/mL的供试菌菌悬液。
1.2.3抑菌圈测定
抑菌圈的测定采用琼脂扩散法。将培养基冷却至60℃左右，倒培养皿(15～20m L培养基)，水平静置至完全凝固，取供试菌悬液0.1m L于平板上，用涂布棒涂抹均匀。用6mm无菌打孔器在培养皿上均匀打4个孔。吸取20μL花椒-艾叶醇提物溶液至孔中。将培养皿正置于37℃恒温培养箱培养24h后测定抑菌圈直径，设置5％DMSO作阴性对照，并以青霉素(10μg)在抑菌试验作阳性对照，市售中药洗液作为对比。
1.3提取工艺优化
1.3.1乙醇浓度
对影响花椒-艾叶醇提物抑菌效果的乙醇浓度进行考察，保持提取时间，花椒-艾叶与乙醇的料液比不变，选择乙醇浓度分别为50％，60％，70％，80％，90％进行花椒-艾叶的提取，采用打孔法和涂布法分别对金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌的抑菌圈直径大小进行考察，筛选乙醇浓度。
1.3.2提取时间
对影响花椒-艾叶醇提物抑菌效果的提取时间进行考察，保持乙醇浓度，花椒-艾叶与乙醇的料液比不变，选择提取时间分别为60min，90min，120min，150min，180min进行花椒-艾叶的提取，采用打孔法和涂布法分别对金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌的抑菌圈直径大小进行考察，筛选提取时间。
1.3.3花椒-艾叶与乙醇的料液比
对影响花椒-艾叶醇提物抑菌效果的花椒-艾叶与乙醇的料液比进行考察，保持提取时间，乙醇浓度不变，选择花椒-艾叶与乙醇的料液比分别为1；10，1:15，1:20，1:25，1:30进行花椒-艾叶的提取，采用打孔法和涂布法分别对金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌的抑菌圈直径大小进行考察，筛选花椒-艾叶与乙醇的料液比。
1.3.4响应曲面试验
在上述试验的基础上，进行Box-Behnken试验，将花椒-艾叶与乙醇的料液比、提取温度、乙醇浓度作为的3因素3水平，抑菌圈直径(Y)作为衡量指标，以得出花椒-艾叶乙醇提取物的较佳提取工艺条件。
表1响应面因素水平表
2结果与讨论
2.1乙醇浓度
从图1中可以看到，乙醇浓度对三种细菌的抑菌作用有较大的影响，随着乙醇浓度的增大，其抑菌圈逐渐慢慢增大，当乙醇浓度达到70％左右时，其抑菌圈达到了最大，然而随着乙醇浓度的再次增大，其抑菌圈迅速减小。该结果表明，乙醇浓度过低时一些亲脂性有效成分不能完全提取出来，而乙醇浓度过高可能会使一些亲水性有效成分不能完全提出，从而影响了抑菌圈的效果。
2.2提取时间
从图2中可以看出，三种细菌的抑菌圈随提取时间变化呈先增大后减小的趋势。总体来看，随着提取时间的逐渐增长，其影响效果也是显著的。提取是一个传质的过程，提取时间过短，提取不充分，其有效成分不能完全浸提出来，随着回流时间的增加，有效成分在溶剂中的富集会增多，这样能够使抑菌效果更好，但是随着加热时间的持续增长，部分热不稳定成分可能会慢慢失活或者分解从而使过长的提取时间下抑菌率会有所下降。综合考虑考虑到生产效率和成本问题，花椒-艾叶提取的时间在120min时对金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌都有最佳的抑菌效果。
2.3花椒-艾叶与乙醇的料液比
从图3中可以看出，三种细菌的抑菌圈随提取时间变化呈先增大后减小的趋势。总体来看，随着料液比的增大，其影响效果较为显著。溶剂量过小提取不充分，其有效成分不能完全浸提出来，随液料比的增加抑菌率呈上升趋势，液料比到1:15后抑菌效果减小后续有所升高，但其抑菌圈直径也未超过最大值，故考虑到生产效率和成本问题，花椒-艾叶与乙醇料液比为1：15时对金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌都有最佳的抑菌效果。
2.4响应面法实验设计结果
每组参数平行进行五次实验，抑菌结果按平均值±标准差(Mean±SD)的方法计算表示，结果如表2所示。从表2中数据分析可知，抑菌实验的稳定性较好，平均值数据(Mean)导入Design Expert V12.0中进行数学模型拟合比较，结果显示二次多项式函数拟合效果最好。
表2响应面实验条件及结果
2.5响应面法建模与显著性分析
处理数据的软件:Design Expert V12.0。采用二项式拟合方程，对数据进行回归分析，得到抑菌圈直径方程：Y＝14.5-0.4777A+0.4456B-0.2164C+0.3525AB+0.4020AC+0.3183BC-0.5251A2-0.5344B2-0.3464C2(R2＝0.9830)。回归方程的相关系数R2＝0.9830，说明实验误差小，该模型充分拟合实验数据，且模型p＜0.0001，表示模型拟合极其显著，说明该回归模型能够很好表征因子与指标间的关系，因此，该拟合方程受未知因素影响较小，模型可信度高，该模型可以较好地描述自变量与响应值之间的关系。模型因素分析可知，该模型中的A，B，A2，B2对模型的影响极其显著C，AB，AC，BC，C2对模型的影响显著，表明选取的三个因素对抑菌圈直径均有显著的影响。故以此方程作为花椒-艾叶提取工艺模型的分析和预测，响应面实验条件及结果如表3所示。
表3响应面方差分析
*p<0.05为显著，**p<0.0001为极其显著
通过软件中学生化外残差(external studentized residuals)进行可靠性分析，残差分析结果如图4、5所示，残差正态分布概率如图4所示。从图4中观察发现正态概率分布图近似为一条直线，遵从标准分布，从图5中可知所有数据点遵从标准正态分布。模型的预测值离散程度大(图5)，且与实际值趋于同一条直线(图4)，进一步说明模型拟合程度高，。因此，所有数据点均可靠，没有出现明显异常点。
2.6模型预测结果分析
根据所得的回归方程，在软件中绘制A：乙醇浓度(％)、B：料液比(g.mL-1)和C：提取时间(min)对金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌的抑菌圈直径(y)的响应面曲面图。为了能直观的观察各影响因素对抑菌圈直径的影响，绘制等高线图和三维图。保持一个因素为零水平，考察其他两个因素的相互关系。在等高线图中，颜色越深表明抑菌圈直径越大，拟合模型预测的最优工艺参数落在等高线中心颜色深处。在三维图中，曲面陡峭，表明在该因素变化时，抑菌圈直径也发生明显的改变。观察三维图可知乙醇浓度对抑菌圈直径的影响较大，料液比的影响次之，提取时间影响较小。根据模型方程及响应面结果，在软件预测中结合实际条件得到最优工艺条件为：乙醇浓度66.14％，料液比1：17.37，提取时间为104.47min。
实施例2
在最佳工艺条件下，花椒-艾叶醇提物通过琼脂扩散法对金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌的抑菌效果研究，确定花椒-艾叶最佳比例。对比最佳比例花椒-艾叶的水提物和醇提物的抑菌效果。在不同pH条件下花椒-艾叶醇提物的抑菌活性。进一步研究花椒-艾叶真菌的抑菌活性。
1实验方法
1.2花椒-艾叶的提取
精确称取不同比例(0：10，1：9，2：8，3：7，4：6，5：5，6：4，7：3，8：2，9：1，10：0)的花椒-艾叶共10.000g，置于磨口三角瓶中。通过热回流法用浓度为66％的乙醇进行提取，提取时间从沸腾的那一刻进行计时提取105min，每组平行三次，合并溶液。冷却过滤，蒸发浓缩至无醇味，得到花椒-艾叶醇提物浸膏。加5％的二甲亚砜(DMSO)进行复溶，得到生药浓度为1g/mL的花椒-艾叶醇提物溶液。
1.3抑菌圈的测定
在无菌条件下，用接种环将分离纯化后的供试菌取至装有0.9％氯化钠的无菌溶液待测管中，混合摇匀后稀释至0.5比浊管标准管浓度，得到浓度为1.5×108CFU/mL的供试菌菌悬液。
抑菌圈的测定采用琼脂扩散法。将培养基冷却至60℃左右，倒培养皿(15～20m L培养基)，水平静置至完全凝固，取供试菌悬液0.1m L于平板上，用涂布棒涂抹均匀。用6mm无菌打孔器在培养皿上均匀打4个孔。将不同比例花椒-艾叶醇提物溶液吸取20μL至孔中。将培养皿正置于37℃恒温培养箱培养12h后测定抑菌圈直径，设置5％DMSO作阴性对照，并以青霉素(10μg)在抑菌试验作阳性对照，市售中药洗液作为对比。用游标卡尺(精确到0.1mm)测量抑菌圈直径，比较抑菌效果。每组试验重复5次，取其平均值。
1.3花椒-艾叶水提物和醇提物对比
按照1.2中的方法对花椒-艾叶最佳比例进行不同溶剂提取，分别设置为水和乙醇，每组平行三次。然后按照1.3中方法对花椒-艾叶的水提物和醇提物对金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌，红色毛癣菌，石膏样小孢子菌进行抑菌圈直径测定。
1.4不同pH对花椒-艾叶醇提物抑菌效果影响
用浓度为0.1mol.L-1的氢氧化钠和盐酸将提取好的花椒-艾叶醇提物溶液用pH计精确调整为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，并设置空白对照。然后按照1.3中方法对不同pH的条件下花椒-艾叶的醇提物进行抑菌圈直径测定。
1.5最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定
制备含菌肉汤培养基(各菌悬液制成浓度相当于0.5麦氏比浊标准菌悬液，取100μL到MH肉汤培养基(比例1:1000稀释)菌浓度为105CFU/mL)。采用二倍稀释法，将花椒-艾叶醇提物样品溶液分别稀释为1000mg/mL、500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、31.25mg/mL、15.62mg/mL、7.81mg/mL。在96孔培养板进行最低抑菌浓度试验，第1列分别加入无菌MH肉汤培养基100μL和100μL不同浓度样品溶液，作为阳性对照；第2-4列分别上样100μL含大肠埃希氏菌肉汤培养基和100μL不同浓度样品溶液，第5-7列分别上样100μL含金黄色葡萄球菌肉汤培养基和100μL不同浓度样品溶液，第8-10列分别上样100μL含铜绿假单胞菌肉汤培养基和100μL不同浓度样品溶液，第12列每三孔分别上样100μL含菌肉汤培养基，做阴性对照。最终花椒-艾叶醇提物的浓度变为500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、31.25mg/mL、15.62mg/mL、7.81mg/mL、3.90mg/mL。将96孔培养板放入37℃恒温培养箱内，培养24h，观察结果。阴性对照孔细菌生长，呈浑浊状，阳性对照孔无细菌生长，呈澄清、透明状。肉眼观察其他各孔情况，如果孔内澄清、透明，肉眼观察不到菌落的最低稀释度即为最低抑菌浓度。
以MIC测定结果为基础，从大于最低抑菌浓度起取各孔100μL分别涂布于营养琼脂培养基上，37℃恒温培养24h观察结果，菌落少于5个视为最低杀菌浓度。平行三次实验。
2实验结果与分析
2.1花椒-艾叶最佳比例的确定
图6可以直观了解不同比例花椒-艾叶醇提物对于金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌的抑菌效果。从图看出花椒-艾叶3：7的比例对金黄色葡萄球菌抑菌活性最强，花椒-艾叶2：8的比例对大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性最强。从表4可知花椒-艾叶3：7的比例对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径达到16.315±0.683mm，对大肠埃希氏菌的抑菌圈直径为菌11.948±1.122mm，对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径为12.171±0.599mm。由于花椒-艾叶3：7的比例对金黄色葡萄球菌的抑菌效果突出，故虑成本问题和综合抑菌效果选用花椒-艾叶3：7的比例作为最佳比例。
表4不同比例花椒-艾叶抑菌圈直径
2.2不同溶剂提取对比
最佳比例花椒-艾叶3：7水提物和醇提物的抑菌效果对比得出在相同提取工艺条件下，花椒-艾叶3：7醇提物比水提物抑菌效果好。如图所示可以看出花椒-艾叶醇提物的抑菌圈明显大于提物。花椒-艾叶醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为14.284±0.630mm，对大肠埃希氏菌的抑菌圈直径为13.99±0.674mm，对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径为13.872±0.532mm，对于红色毛癣菌和石膏样小孢子菌的抑菌圈直径分别为17.726±1.228mm，17.32±2.234mm，花椒-艾叶醇提物抑菌效果比水提物好是由于乙醇提取出了更多脂溶性成分，增强了抑菌效果。
表5水提物和醇提物对比
2.3不同pH花椒-艾叶抑菌结果
pH计精确调整花椒-艾叶醇提物的pH值，测得原始pH值为4.6。设置不同pH(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，)无菌水做空白照。在所设pH范围内对三种菌均无抑菌效果。从图3-7直观看到pH对抑菌效果是影响较大的，当pH为5时对三种菌的抑菌效果最强。从表6可知在pH为5时，花椒-艾叶3：7的醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为16.52±0.346mm，对大肠埃希氏菌的抑菌圈直径为11.265±0.446mm，对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径为13.253±0.560mm。
表6不同pH条件下对抑菌圈直径的影响
2.4最低抑菌浓度(MIC)和最低抑菌浓度(MBC)
花椒-艾叶3：7醇提物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌最低抑菌浓度MIC见表7和8可知花椒-艾叶3：7醇提物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的MIC为15.26mg/mL、31.25mg/mL、31.25mg/mL。从大于最低抑菌浓度起取各浓度进行最低杀菌浓度试验，结果表明：花椒-艾叶3：7醇提物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的MBC为31.25mg/mL、62.5mg/mL、500mg/mL。
表7花椒-艾叶3：7醇提物最低抑菌浓度
注:-表示抑菌；+表示细菌生长；++表示细菌生长旺盛
表8花椒-艾叶3：7醇提物最低杀菌浓度
注:-表示抑菌；+表示细菌生长；++表示细菌生长旺盛
实施例3
1实验方法
1.1花椒-艾叶涂剂的处方及工艺研究
花椒-艾叶在不同溶液中溶解性的初步探讨：
本研究中溶质即为花椒-艾叶提取物冻干粉，根据试验目的和药物的性质，待选择的溶剂分别为95％乙醇、丙二醇、甘油和PEG-400。参照2020版《中国药典》，室温下，分别向一定量待选择的溶剂中加入称量好的花椒-艾叶提取物冻干粉，每隔5分钟强力振摇30秒钟，观察30分钟内的溶解情况。
1.1.1增溶剂的筛选
由于花椒-艾叶提取物中主要含有醇提浸膏、水和少量乙醇，将其混合后形成的热力学不稳定体系，易分层和产生沉淀，且在水中的溶解度较差，为提高其溶解性，选择添加增溶剂。根据常用的增溶剂剂的种类，待选择的有Tween-80、RH40、Poloxamer188、PEG-400。
1.1.2助溶剂的筛选
但根据花椒-艾叶提取物的性质，若只加入表面活性剂，花椒-艾叶提取物与水不能完全溶解，所以选择适当的助溶剂。根据处方前研究的花椒-艾叶提取物在各溶液中的溶解度数据，选择的助溶剂为乙醇。
1.1.3pH调节剂及pH值的选择
正常情况下健康皮肤正常pH值为4.5～6.5，预实验发现本品在不加pH调节剂的情况下，pH值为4.8～5.0，制剂偏酸性，与正常皮肤pH值接近。基于药用辅料最小用量原则，故本制剂不需添加pH调节剂。
1.1.4防腐剂的选择
本制剂中所含的花椒和艾叶中酚酸类等活性成分均有不同程度的抑菌作用；对于大多数细菌来说，最适合生长的p H值范围是接近中性6.0～7.5的，而本制剂pH值为4.8～5.0，制剂偏酸性不利于细菌的生长繁殖。基于药用辅料最小用量原则，故本制剂不需添加防腐剂。
1.1.5处方设计
处方A：将Tween-80溶解于95％乙醇中，再将含有Tween-80的95％乙醇加入将花椒-艾叶提取物浓缩液中，加无菌水至10mL。分别考察1％、3％、5％、7％、9％的Tween-80在95％乙醇为20％、25％、30％、35％、40％时制成10mL的涂剂。
处方B：将RH40溶解于95％乙醇中，再将含有RH40的95％乙醇加入将花椒-艾叶提取物浓缩液中，加无菌水至10mL。分别考察1％、3％、5％、7％、9％的RH40在95％乙醇为20％、25％、30％、35％、40％时制成10mL的涂剂。
处方C：将Poloxamer188溶解于95％乙醇中，再将含有Poloxamer188的95％乙醇加入将花椒-艾叶提取物浓缩液中，加无菌水至10mL。分别考察1％、3％、5％、7％、9％的Poloxamer188在95％乙醇为20％、25％、30％、35％、40％时制成10mL的涂剂。
处方D：分别考察将40％乙醇、50％乙醇、66％乙醇加入花椒-艾叶提取物浓缩液，共制成10mL的涂剂。
处方E：分别考察将0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％的PEG-400和5mL的66％乙醇加入花椒-艾叶提取物浓缩液，再加入无菌水共制成10mL的涂剂。1.1.6花椒-艾叶涂剂制备结果的初评价标准
1)是否能够溶解，静置无浮油、沉油、沉淀或分层现象
2)对于三种细菌的抑菌效果
1.2花椒-艾叶涂剂抗菌研究
1.2.1抑菌圈测定
抑菌圈的测定采用打孔法。将培养基冷却至60℃左右，取20mL营养琼脂倒入培养皿中；取33mL沙氏琼脂倒入培养皿中，水平静置至完全凝固。采用涂布法，吸取108CFU/mL金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌菌悬液100μL于营养琼脂培养基中，吸取108CFU/mL红色毛癣菌和石膏样小孢子菌孢子悬液100μL于沙氏琼脂培养基中，用无菌涂布棒将各菌悬液分别均匀的涂布在培养基内，然后用6mm无菌打孔器垂直打孔。将培养皿正置于37℃恒温培养箱培养12h后测定对细菌的抑菌圈直径，28℃恒温培养箱培养4d后测定对真菌的抑菌圈直径。设置无菌生理盐水作阴性对照，并以10μg青霉素作阳性对照，市售中药洗液做对比。
1.2.2最低抑菌浓度测定
采用二倍稀释法，分别上样无菌MH肉汤培养基100μL和200μL不同样品溶液，吸取第一个孔200μL于第二个孔，依次直到第八个孔弃掉200μL，再每孔加入100μL菌液，最后得到共8个浓度梯度(精油含量333、222、148、98、65、43、29、19mg/mL)。阳性对照孔细菌生长，呈浑浊状，阴性对照孔无细菌生长，呈澄清、透明状。肉眼观察其他各孔情况，如果孔内澄清、透明，则没有细菌生长。没有细菌生长的最低稀释度即为最低抑菌浓度。每组实验平行3次。
采用二倍稀释法，将培养基和花椒-艾叶涂剂提取液均匀混合，制作含药培养基共得到8个浓度梯度分别为400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL，凝固后分别取100.00μL菌悬液注入固体培养基表面，用无菌涂布棒涂布均匀，放置5min，然后放入培养箱中进行真菌培养14d-21d。
1.3花椒-艾叶涂剂抗氧化研究
1.3.1DPPH·自由基清除率测定
量取1mg/mL花椒-艾叶涂剂用65％乙醇分别稀释成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的样品溶液2.0mL于试管中，加入0.1mmol/L的DPPH 65％乙醇溶液2.0mL，摇匀后避光反应30min，517nm处测吸光度A1。A2为65％乙醇溶液代替DPPH无水乙醇溶液。A0为65％乙醇代替样品溶液。以槲皮素为对照，每组平行三次，取平均值。按下述公式计算花椒-艾叶涂剂DPPH·清除率：DPPH·清除率(％)＝(A0-A1+A2)/A0×100％
1.3.2超氧阴离子(·O2-)清除能力测定
称取花椒-艾叶涂剂用65％乙醇分别稀释成浓度为0.6、0.7、0.8、0.9、1mg/mL的样品溶液2.0mL于试管中。把浓度为50mmol/L的Tris-HCl(pH＝8.2)缓冲溶液在25℃水浴锅中加热20min，把Tris-HCl(pH＝8.2)缓冲溶液分别加入不同浓度样品试管中3mL，加入1.00mL浓度为3mmol/L的邻苯三酚溶液，摇匀，25℃水浴锅中反应8min，加入1.00mL浓度为10mmol/L的HCl溶液，终止反应后于320nm处测吸光度A1。A2为蒸馏水代替邻苯三酚溶液。A0为65％乙醇代替样品溶液。以槲皮素为对照，每组平行三次，取平均值。按以下公式计算清除率：清除率(％)＝[(A0－A1+A2)/A0]×100％
1.3.3总还原能力测定
量量取1mg/mL花椒-艾叶涂剂用65％乙醇分别稀释成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的样品溶液2.0mL于试管中，分别取不同浓度的样品溶液2.00mL于试管中，加入2.00mL浓度为0.20mol/mL的磷酸缓冲溶液(pH＝6.86)，加1％的铁氰化钾溶液2.00mL，混匀，置于50℃水浴锅中加热20min。然后加10％的三氯乙酸溶液2.00mL，转速为3000r/min离心10min后，取上清液2.00mL，再加0.1％的氯化铁溶液0.50mL，在50℃水浴锅中加热10min后于700nm处测得吸光度A1。为65％乙醇代替样品溶液，测得吸光度A0。以槲皮素为对照，按以下公式计算各个样品总还原能力：总还原能力＝A1-A02实验结果
2.1花椒-艾叶涂剂处方评价结果
1)通过处方研究发现：加入增溶剂Tween-80、RH40、Poloxamer188时当95％乙醇的量增多时，更易做成无沉淀、沉油的液体制剂，原因为花椒-艾叶提取物在95％乙醇中的溶解效果好，但随着增溶剂的增加，做成液体制剂时所需要的95％乙醇就会减少。因为增溶剂不仅在制剂使用过程中起到了增溶的作用，而且在制剂的制备中也起到了助溶的作用。由表可知：7％的Tween-80+40％的95％乙醇、9％的Tween-80+35％的95％乙醇、9％的Tween-80+40％的95％乙醇、7％的RH40+40％的95％乙醇、9％的RH40+30％的95％乙醇、9％的RH40+35％的95％乙醇、9％的RH40+40％的95％乙醇均可制成符合外观要求无沉淀无、沉油的溶液剂；而Poloxamer188的增溶效果较差，在9％的Poloxamer188+40％的95％乙醇时还是会有少量沉油。由于95％乙醇易燃易爆，考虑药品生产安全性，选择95％乙醇用量较少的符合外观无沉油的涂剂进行抑菌效果测定。最终选择9％的Tween-80+35％的95％乙醇、9％的RH40+30％的95％乙醇进行抑菌实验，发现抑菌效果减弱，原因可能是Tween-80、RH40中的聚氧乙烯基与酚轻基之间形成混合物，将抑菌剂包入胶团中而使之不活化。提取物中含酚羟基的抑菌成分与Tween-80、RH40配伍后形成增溶剂胶团中使溶出受阻，进而使其抑菌力减小。
考查40％乙醇、50％乙醇、66％乙醇制成10mL的花椒-艾叶涂剂，66％乙醇能够制成符合外观要求无沉淀无、沉油的溶液剂，对比5％DMSO溶解的花椒-艾叶提取物的抑菌效果有所增加，可能是66％乙醇溶解的有效成分含量更多。40％乙醇、50％乙醇能够溶解但放置有析出，所以50％乙醇的抑菌效果减小，40％乙醇的无抑菌效果。
为进一步减少涂剂中乙醇含量，查阅《药剂大全》考虑加入PEG-400作为增溶剂。考察发现乙醇溶度为66％时加入最少的量是50％，所以考察0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％的PEG-400和5mL的66％乙醇加入花椒-艾叶提取物浓缩液，再加入无菌水制成的10mL涂剂。发现外观均符合要求，无沉淀无、沉油；抑菌结果显示当0.5％的PEG-400和5mL的66％乙醇制成的花椒-艾叶涂剂抑菌效果最好，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌的抑菌圈直径分别为11.395±1.456、14.025±0.989、10.468±1.144mm。
表9
表10
表11
表12
表13
2.2花椒-艾叶提取物涂剂处方的确定
根据试验的探索，将符合初步筛选条件的花椒-艾叶提取物涂剂的处方进行比较，最终筛选出的花椒-艾叶提取物涂剂的处方如下：
2.3花椒-艾叶提取物涂剂的制备工艺
1)准确称取、量取处方中的各原辅料，备用。
2)将花椒、艾叶药材按3：7的比例进行热回流提取，提取时间110min，料液比1：17，乙醇浓度66％，进而浓缩成少量液体。
3)在浓缩液中加入0.5％的PEG-400和50％的66％乙醇，然后超声促进溶解。
4)待完全溶解后转移至量瓶中加纯化水至10mL，超声混合均匀。
5)检半成品符合规定后，封口，贴签。
6)检成品符合规定后包装。
2.4花椒-艾叶提取物涂剂的抑菌结果
2.4.1花椒-艾叶提取物涂剂抑菌圈直径
花椒-艾叶提取物涂剂对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为12.314±1.257mm，对大肠埃希氏菌的抑菌圈直径为14.135±1.039mm，对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径为11.435±1.124mm，对于红色毛癣菌和石膏样小孢子菌的抑菌圈直径分别为22.338±0.629mm，29.129±1.709mm，空白对照均无抑菌效果。花椒-艾叶提取物涂剂的抑菌效果比花椒-艾叶醇提物抑菌效果强，是因为溶解效果增强，使更多有效物质可以溶出扩散，所以增强了抑菌效果。相比于市售中药洗液，花椒-艾叶提取物涂剂对于两种真菌的抑菌效果更强。
表14花椒-艾叶提取物涂剂抑菌圈直径
2.4.2花椒-艾叶提取物涂剂最低抑菌浓度
花椒-艾叶提取物涂剂对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的MIC为12.66mg/mL、29mg/mL、29mg/mL，对石膏样小孢子菌和红色毛癣菌最低抑菌浓度分别为3.125mg/mL、6.25mg/mL。
表15花椒-艾叶涂剂最低抑菌浓度
注:-表示抑菌；+表示细菌生长；++表示细菌生长旺盛
表16
2.5花椒-艾叶提取物涂剂的抗氧化结果
2.5.1DPPH·自由基清除率
如图2所示，浓度为0.1mg/mL，花椒-艾叶提取物涂剂的DPPH·清除率为75.68±0.15％，超过槲皮素的DPPH·清除率69.02±0.34％。花椒-艾叶提取物涂和槲皮素DPPH·清除率的IC50分别为0.09988、143.8mg/mL，花椒-艾叶提取物涂剂的DPPH·清除率呈浓度依赖性关系，随着花椒-艾叶提取物涂剂浓度的增加，清除自由基能力呈逐渐上升趋势。花椒-艾叶提取物涂剂相比于槲皮素的DPPH·自由基清除率更强，具有较强的抗氧化能力。
2.5.2超氧阴离子(·O2-)清除能力
从图3可以看出，浓度在0.6～1.0mg/mL时，花椒-艾叶提取物涂剂的清除率为21.54～31.64％，槲皮素的清除率为97.76～99.71％。花椒-艾叶提取物涂剂和槲皮素对超氧阴离子的清除率的IC50值分别为2.72、2.77mg/mL。
2.5.3总还原能力
随着花椒-艾叶提取物涂剂浓度不断增大总还原能力也逐渐增大。
Claims (8)
1.一种花椒艾叶组合物，其特征在于，由如下组份组成：
花椒和艾叶质量比3:7的醇提物；所述醇提物为60～80％乙醇提取物。
2.根据权利要求1所述的花椒艾叶组合物，其特征在于，所述醇提物为65～70％乙醇提取物。
3.根据权利要求1所述的花椒艾叶组合物，其特征在于，所述醇提物采用回流提取方式制备，料液比为1：15～20；提取时间为100～120min。
4.根据权利要求1所述的花椒艾叶组合物，其特征在于，所述组合物调整pH至5.0。
5.根据权利要求1所述的花椒艾叶组合物，其特征在于，所述醇提物的浓度为10g药材对应3-4mL浓缩液。
6.一种花椒艾叶醇提物涂剂，其特征在于，每10mL涂剂中含有如下组分：
权利要求1～5任意一项所述的组合物10g，66％乙醇5mL，PEG-400 0.05mL，余量为水。
7.权利要求1-5任意一项所述组合物或权利要求6所述涂剂在制备抑菌活性产品中的用途。
8.权利要求1-5任意一项所述组合物或权利要求6所述涂剂在制备清除自由基产品中的用途。
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