CN112870304A - 一种可有效助眠的口服液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可有效助眠的口服液及其制备方法，属于生物医药技术领域，其制备方法，包括如下步骤：（1）原料称取；（2）酸枣仁总皂苷、人参总皂苷的提取；（3）酸枣仁总皂苷、人参总皂苷最佳提取方法的确定；（4）茯苓多糖的提取；（5）茯苓多糖最佳提取方法的确定；（6）小米、花豆蛋白的提取；（7）小米、花豆蛋白最佳提取方法的确定；（8）搅拌混匀。本申请将我国传统食疗组方与现代生物提取技术结合，以的茯苓、酸枣仁、人参须、小米、花豆等的提取物为核心原料，配以酶、蜂蜜以、果糖等，形成服用方便，口感好，绿色安全，无副作用的“助眠功能食品”（口服液），可以调节改善人体内分泌紊乱，解除失眠人群对抗失眠药物的依赖。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种可有效助眠的口服液及其制备方法。
背景技术
失眠是一种症状，表现为入睡困难、睡眠不深、易惊醒、早醒、多梦、似睡非睡等，甚至通宵难眠。当睡眠生物医药不足时，会积累成“睡眠负债”，可使智力和运动功能低下，反应迟钝。据研究，每晚比正常睡眠少1小时，可使人的智商和认知能力暂时性的下降一个商数，一个星期积累下来，即可使智商和大脑工作能力明显降低。长期失眠或顽固性失眠症患者会引发抑郁、精神失常、甚至厌世、轻生！当睡眠债积累到一定程度后，就会对身体造成严重伤害，包括皮肤干燥、晦暗无光；听力减退、耳聋耳鸣；食欲不振、肥胖；胃粘膜糜烂溃疡；心脏病、感冒等疾病的患病几率升高。失眠成为威胁人们健康的巨大隐患。随着社会发展和生活节奏的加快，失眠人群体不断增加。失眠是一种具有原发性或继发性的睡眠障碍，我国目前有30%以上的人群存在失眠症状，超过3亿人口有睡眠障碍，严重影响人们的身体健康。而市场上现有的安眠药，虽然见效快，但只能治标不能治本，长期服用甚至会产生耐药性。此外，安眠药的副作用明显，如损坏肝脏分泌酶功能，从而导致肝功能下降，带来肝肾乃至五脏功能失调等。
英国萨里大学发表在“美国国家科学院院刊”上的研究表明，每晚睡眠时间不足6小时，持续一周，人体内就会有711种基因的功能发生改变，其中涉及新陈代谢、炎症、免疫力和抗压等功能。睡眠不充足还会扰乱生物钟，让人一天内的精神状况不稳定。这就意味着，缺乏睡眠会阻碍身体的补给功能，加大人们患病的风险。一旦你正常的睡眠模式持续遭到破坏，将对人体器官和生理组织造成永久性的损伤，引发多种疾病。临床医学研究表明，长期失眠者患肿瘤、癌症等严重疾病的几率要远远高出正常睡眠的人。因此亟需开发一种以生物技术和传统组方两者协同的方式研发，力求解决睡眠健康这一难题。
发明内容
本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种可有效助眠的口服液及其制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种可有效助眠的口服液，由如下重量份组分制成：
酸枣仁200~300份、人参200~300份、茯苓40~60份、小米15~25份、花豆15~25份、蜂蜜40~60份、L-色氨酸15~25份、维生素C 1~2份、山梨酸钾0.05~0.15份。
优选的，由如下重量份组分组成：
酸枣仁250份、人参250份、茯苓50份、小米20份、花豆20份、蜂蜜50份、L-色氨酸20份、维生素C 1.5份、山梨酸钾0.1份。
进一步的，所述一种可有效助眠的口服液的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料称取：
称取相应重量份的酸枣仁200~300份、人参200~300份、茯苓40~60份、小米15~25份、花豆15~25份、蜂蜜40~60份、L-色氨酸15~25份、维生素C 1~2份、山梨酸钾0.05~0.15份备用；
（2）通过下列方法之一进行酸枣仁总皂苷、人参总皂苷的提取：
A. 乙醇提取法：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后用乙醇回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在7000~9000rpm下离心25~35min去除不溶性杂质，得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
B. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
C. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
D. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后与0.05~0.15M含有0.5~1.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养1.5~2.5h，然后加热到95~105℃保持8~12min灭活酶；过滤得到上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
E. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后按照D中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
（3）酸枣仁总皂苷、人参总皂苷最佳提取方法的确定：
采用高效液相色谱法分别测定步骤（2）中步骤A、步骤B、步骤C、步骤D以及步骤E中酸枣仁皂苷含量和人参皂苷含量，然后比较不同提取方法酸枣仁总皂苷和人参总皂苷得率，选出最佳提取方法；
（4）通过下列方法之一进行茯苓多糖的提取：
A. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在7000~9000rpm下离心25~35min去除不溶性杂质得到茯苓多糖溶液；
B. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
C. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后与0.05~0.15M含有0.5~1.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养1.5~2.5h，然后加热到95~105℃保持8~12min灭活酶，过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
D. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后按照步骤C中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
（5）茯苓多糖最佳提取方法的确定：
使用D-半乳糖和半乳糖醛酸作为标准物，采用苯酚硫酸法分别测定步骤（4）中步骤A、步骤B、步骤C以及步骤D中总糖含量，然后比较不同提取方法茯苓多糖得率，选出最佳提取方法；
（6）通过下列方法之一进行小米、花豆蛋白的提取：
A. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在7000~9000rpm下离心25~35min去除不溶性杂质得到茯苓多糖溶液；
B. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
C. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后与0.05~0.15M含有0.5~1.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养1.5~2.5h，然后加热到95~105℃保持8~12min灭活酶，过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
D. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后按照步骤C中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
（7）小米、花豆蛋白最佳提取方法的确定：
采用凯氏定氮法分别测定步骤（6）中步骤A、步骤B、步骤C以及步骤D中小米蛋白含量和花豆蛋白含量，然后比较不同提取方法小米蛋白得率，选出最佳提取方法；
（8）搅拌混匀：
将步骤（1）中称取的蜂蜜40~60份、L-色氨酸15~25份、维生素C 1~2份、山梨酸钾0.05~0.15份、步骤（3）中确定的最佳提取方法所提取的酸枣仁总皂苷、人参总皂苷溶液、步骤（5）中确定的最佳提取方法所提取的茯苓多糖溶液、步骤（7）中确定的最佳提取方法所提取的小米、花豆蛋白液共同置于搅拌罐内搅拌混匀后依次进行灭菌，灯检，包装，检验即可。
进一步的，步骤（2）中的步骤D中、步骤（4）中的步骤C中以及步骤（6）中的步骤C中所述的醋酸盐缓冲溶液的体积为450~550mL，pH值为4~5。
进一步的，步骤（2）中的步骤D中、步骤（4）中的步骤C中以及步骤（6）中的步骤C中所述的恒温震荡水浴的条件为震荡速度为100~200rpm，温度为45~55℃。
进一步的，步骤（3）中所述的高效液相色谱法测定时，色谱柱型号Kromasil C18(5μm，200×4.6mm)，柱温设置为20~30℃，流动相为甲醇:水=80~90:10~20(V/V)，流速 0.5~1.5mL/min，进样量15~25mL。
本申请提供了一种一种可有效助眠的口服液极其制备方法，在现有助眠口服液的基础上进行了很大程度的改善，细胞壁和细胞间质内果胶阻碍了酸枣仁、茯苓、人参、小米以及花豆等有效成分（如酸枣仁皂苷、茯苓多糖、人参皂苷、小米蛋白以及花豆蛋白等）的提取。这些核心原料的细胞壁主要为纤维素、半纤维素、果胶质组成，因此本申请针对不同原料采用纤维素酶、半纤维素酶以及果胶酶的不同组合能够有效提高提取效率。但是不同原料的细胞壁组成成分含量不同，因此需要针对五种原料，分别寻找出纤维素酶、半纤维素酶以及果胶酶的最佳配比，并针对纤维素酶和半纤维素酶的酶种选择、酶活性大小、有效成分粉碎程度、体系酸值、酶解时间和温度等工艺参数进行实验研究和优化。
为了确保产品最终的助眠效果，就需要确定产品中各有效成分的阈值，保证组方中每味组分有效成分的保有量（阈值）本申请依据中医学推荐的食疗组方酸枣仁200g、茯苓50g、人参须10g、小米25g以及花豆25g的配比，确定了配伍组分原料的有效成分含量和比例，通过提取工艺研究以及提取液调配，调整最终产品中各有效成分的保有量，确保产品符合组方要求，实现助眠效果。
本申请将我国传统食疗组方（偏方）与现代生物提取技术结合起来，以有促眠王之称的茯苓、酸枣仁、人参须、小米以及花豆等的提取物为核心原料，配以酶、蜂蜜以及果糖等，形成服用方便，口感好，绿色安全，无副作用的“助眠功能食品”（口服液），可以调节改善人体内分泌紊乱，解除失眠人群对抗失眠药物的依赖。本申请将我国传统食疗组方（偏方）与现代提取技术结合起来生产“助眠功能食品”（口服液）。针对不同原料，以各有效成分提取率为指标，比较了不同提取方法包括热水提取、乙醇提取、超声辅助提取、酶辅助提取以及酶-超声辅助提取等对各有效成分提取率的影响，尽可能提高每一味配伍组分原料中有效成分的提取率，提高原料的利用度。采用非化学防腐物质添加实现口服液的保质。本申请产品生物利用度高，吸收快，服用方便，口感好，各组份间无配伍禁忌，保证了调节内分泌、改善睡眠的综合疗效。
具体实施方式
实施例1
一种可有效助眠的口服液，由如下重量份组分制成：
酸枣仁200份、人参200份、茯苓40份、小米15份、花豆15份、蜂蜜40份、L-色氨酸15~25份、维生素C 1~2份、山梨酸钾0.05~0.15份。
所述一种可有效助眠的口服液的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料称取：
称取相应重量份的酸枣仁200份、人参200份、茯苓40份、小米15份、花豆15份、蜂蜜40份、L-色氨酸15~25份、维生素C 1~2份、山梨酸钾0.05~0.15份备用；
（2）通过下列方法之一进行酸枣仁总皂苷、人参总皂苷的提取：
A. 乙醇提取法：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后用乙醇回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在7000rpm下离心25min去除不溶性杂质，得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
B. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
C. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
D. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后与0.05M含有0.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养1.5h，然后加热到95℃保持8min灭活酶；过滤得到上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
E. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后按照D中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
（3）酸枣仁总皂苷、人参总皂苷最佳提取方法的确定：
采用高效液相色谱法分别测定步骤（2）中步骤A、步骤B、步骤C、步骤D以及步骤E中酸枣仁皂苷含量和人参皂苷含量，然后比较不同提取方法酸枣仁总皂苷和人参总皂苷得率，选出最佳提取方法；
（4）通过下列方法之一进行茯苓多糖的提取：
A. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在7000rpm下离心25min去除不溶性杂质得到茯苓多糖溶液；
B. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
C. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后与0.05M含有0.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养1.5h，然后加热到95℃保持8min灭活酶，过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
D. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后按照步骤C中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
（5）茯苓多糖最佳提取方法的确定：
使用D-半乳糖和半乳糖醛酸作为标准物，采用苯酚硫酸法分别测定步骤（4）中步骤A、步骤B、步骤C以及步骤D中总糖含量，然后比较不同提取方法茯苓多糖得率，选出最佳提取方法；
（6）通过下列方法之一进行小米、花豆蛋白的提取：
A. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在7000rpm下离心25min去除不溶性杂质得到茯苓多糖溶液；
B. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
C. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后与0.05M含有0.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养1.5h，然后加热到95℃保持8min灭活酶，过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
D. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后按照步骤C中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
（7）小米、花豆蛋白最佳提取方法的确定：
采用凯氏定氮法分别测定步骤（6）中步骤A、步骤B、步骤C以及步骤D中小米蛋白含量和花豆蛋白含量，然后比较不同提取方法小米蛋白得率，选出最佳提取方法；
（8）搅拌混匀：
将步骤（1）中称取的蜂蜜40份、L-色氨酸15份、维生素C 1份、山梨酸钾0.05份、步骤（3）中确定的最佳提取方法所提取的酸枣仁总皂苷、人参总皂苷溶液、步骤（5）中确定的最佳提取方法所提取的茯苓多糖溶液、步骤（7）中确定的最佳提取方法所提取的小米、花豆蛋白液共同置于搅拌罐内搅拌混匀后依次进行灭菌，灯检，包装，检验即可。
步骤（2）中的步骤D中、步骤（4）中的步骤C中以及步骤（6）中的步骤C中所述的醋酸盐缓冲溶液的体积为450mL，pH值为4。
步骤（2）中的步骤D中、步骤（4）中的步骤C中以及步骤（6）中的步骤C中所述的恒温震荡水浴的条件为震荡速度为100rpm，温度为45℃。
步骤（3）中所述的高效液相色谱法测定时，色谱柱型号Kromasil C18(5μm，200×4.6mm)，柱温设置为20℃，流动相为甲醇:水=80:10(V/V)，流速0.5mL/min，进样量15mL。
实施例2
一种可有效助眠的口服液，由如下重量份组分制成：
酸枣仁250份、人参250份、茯苓50份、小米20份、花豆20份、蜂蜜50份、L-色氨酸20份、维生素C 1.5份、山梨酸钾0.1份。
所述一种可有效助眠的口服液的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料称取：
称取相应重量份的酸枣仁250份、人参250份、茯苓50份、小米20份、花豆20份、蜂蜜50份、L-色氨酸20份、维生素C 1.5份、山梨酸钾0.1份备用；
（2）通过下列方法之一进行酸枣仁总皂苷、人参总皂苷的提取：
A. 乙醇提取法：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后用乙醇回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在8000rpm下离心30min去除不溶性杂质，得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
B. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
C. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
D. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后与0.1M含有1%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养2h，然后加热到100℃保持10min灭活酶；过滤得到上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
E. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后按照D中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
（3）酸枣仁总皂苷、人参总皂苷最佳提取方法的确定：
采用高效液相色谱法分别测定步骤（2）中步骤A、步骤B、步骤C、步骤D以及步骤E中酸枣仁皂苷含量和人参皂苷含量，然后比较不同提取方法酸枣仁总皂苷和人参总皂苷得率，选出最佳提取方法；
（4）通过下列方法之一进行茯苓多糖的提取：
A. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在8000rpm下离心30min去除不溶性杂质得到茯苓多糖溶液；
B. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
C. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后与0.1M含有1%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养2h，然后加热到100℃保持10min灭活酶，过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
D. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后按照步骤C中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
（5）茯苓多糖最佳提取方法的确定：
使用D-半乳糖和半乳糖醛酸作为标准物，采用苯酚硫酸法分别测定步骤（4）中步骤A、步骤B、步骤C以及步骤D中总糖含量，然后比较不同提取方法茯苓多糖得率，选出最佳提取方法；
（6）通过下列方法之一进行小米、花豆蛋白的提取：
A. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在8000rpm下离心30min去除不溶性杂质得到茯苓多糖溶液；
B. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
C. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后与0.1M含有1%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养2h，然后加热到100℃保持10min灭活酶，过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
D. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后按照步骤C中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
（7）小米、花豆蛋白最佳提取方法的确定：
采用凯氏定氮法分别测定步骤（6）中步骤A、步骤B、步骤C以及步骤D中小米蛋白含量和花豆蛋白含量，然后比较不同提取方法小米蛋白得率，选出最佳提取方法；
（8）搅拌混匀：
将步骤（1）中称取的蜂蜜50份、L-色氨酸20份、维生素C 1.5份、山梨酸钾0.1份、步骤（3）中确定的最佳提取方法所提取的酸枣仁总皂苷、人参总皂苷溶液、步骤（5）中确定的最佳提取方法所提取的茯苓多糖溶液、步骤（7）中确定的最佳提取方法所提取的小米、花豆蛋白液共同置于搅拌罐内搅拌混匀后依次进行灭菌，灯检，包装，检验即可。
步骤（2）中的步骤D中、步骤（4）中的步骤C中以及步骤（6）中的步骤C中所述的醋酸盐缓冲溶液的体积为500mL，pH值为4.5。
步骤（2）中的步骤D中、步骤（4）中的步骤C中以及步骤（6）中的步骤C中所述的恒温震荡水浴的条件为震荡速度为150rpm，温度为50℃。
步骤（3）中所述的高效液相色谱法测定时，色谱柱型号Kromasil C18(5μm，200×4.6mm)，柱温设置为25℃，流动相为甲醇:水=85:15(V/V)，流速 1mL/min，进样量20mL。
实施例3
一种可有效助眠的口服液，由如下重量份组分组成：
酸枣仁300份、人参300份、茯苓60份、小米25份、花豆25份、蜂蜜60份、L-色氨酸25份、维生素C 2份、山梨酸钾0.15份。
所述一种可有效助眠的口服液的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料称取：
称取相应重量份的酸枣仁300份、人参300份、茯苓60份、小米25份、花豆25份、蜂蜜60份、L-色氨酸25份、维生素C 2份、山梨酸钾0.15份备用；
（2）通过下列方法之一进行酸枣仁总皂苷、人参总皂苷的提取：
A. 乙醇提取法：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后用乙醇回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在9000rpm下离心35min去除不溶性杂质，得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
B. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
C. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
D. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后与0.15M含有1.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养2.5h，然后加热到105℃保持12min灭活酶；过滤得到上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
E. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后按照D中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
（3）酸枣仁总皂苷、人参总皂苷最佳提取方法的确定：
采用高效液相色谱法分别测定步骤（2）中步骤A、步骤B、步骤C、步骤D以及步骤E中酸枣仁皂苷含量和人参皂苷含量，然后比较不同提取方法酸枣仁总皂苷和人参总皂苷得率，选出最佳提取方法；
（4）通过下列方法之一进行茯苓多糖的提取：
A. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在9000rpm下离心35min去除不溶性杂质得到茯苓多糖溶液；
B. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
C. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后与0.15M含有1.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养2.5h，然后加热到105℃保持12min灭活酶，过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
D. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后按照步骤C中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
（5）茯苓多糖最佳提取方法的确定：
使用D-半乳糖和半乳糖醛酸作为标准物，采用苯酚硫酸法分别测定步骤（4）中步骤A、步骤B、步骤C以及步骤D中总糖含量，然后比较不同提取方法茯苓多糖得率，选出最佳提取方法；
（6）通过下列方法之一进行小米、花豆蛋白的提取：
A. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在9000rpm下离心35min去除不溶性杂质得到茯苓多糖溶液；
B. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
C. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后与0.15M含有1.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养2.5h，然后加热到105℃保持12min灭活酶，过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
D. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后按照步骤C中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
（7）小米、花豆蛋白最佳提取方法的确定：
采用凯氏定氮法分别测定步骤（6）中步骤A、步骤B、步骤C以及步骤D中小米蛋白含量和花豆蛋白含量，然后比较不同提取方法小米蛋白得率，选出最佳提取方法；
（8）搅拌混匀：
将步骤（1）中称取的蜂蜜60份、L-色氨酸25份、维生素C 2份、山梨酸钾0.15份、步骤（3）中确定的最佳提取方法所提取的酸枣仁总皂苷、人参总皂苷溶液、步骤（5）中确定的最佳提取方法所提取的茯苓多糖溶液、步骤（7）中确定的最佳提取方法所提取的小米、花豆蛋白液共同置于搅拌罐内搅拌混匀后依次进行灭菌，灯检，包装，检验即可。
步骤（2）中的步骤D中、步骤（4）中的步骤C中以及步骤（6）中的步骤C中所述的醋酸盐缓冲溶液的体积为550mL，pH值为5。
步骤（2）中的步骤D中、步骤（4）中的步骤C中以及步骤（6）中的步骤C中所述的恒温震荡水浴的条件为震荡速度为200rpm，温度为55℃。
步骤（3）中所述的高效液相色谱法测定时，色谱柱型号Kromasil C18(5μm，200×4.6mm)，柱温设置为30℃，流动相为甲醇:水=90:20(V/V)，流速 1.5mL/min，进样量25mL。
为了对比本申请效果，用上述实施例2方法制备口服液，然后对上述实施例2方法制备的口服液进行安全性毒理学评价试验，并对实施例2方法制备的口服液进行功能动物试验，具体为：
（一）安全性毒理学评价试验
1.材料和方法
1.1样品：实施例2方法制备的口服液，人体每日推荐量为60mL/60kg.BW。试验时用蒸馏水作溶剂配制受试物，冷藏保存。
1.2实验动物：
1.2.1饲养环境及饲料来源：试验动物房使用许可证号为SYXK（川）2016-043.屏障系统，温度20-25℃，相对湿度40-70%。饲料来源于四川省医学科学院，四川省人民医院实验动物研究所，生产许可证号为SCXK（川）2015-01。
1.2.2动物：相关试验动物使用情况见表1。
表1 实验动物一览表
1.3剂量选择与受试物给予方式：
1.3.1急性经口毒性试验：设15000mg/kg.BW一个剂量组，按20mL/kg.BW一次经口灌胃。灌胃前动物禁食16h，不限饮水，首次染毒后观察7天。
1.3.2Ames 试验：设0.16、0.8、4、20、1001/皿五个剂量组及溶剂对照组（蒸馏水）、自发对照组和阳性对照组。
1.3.3骨髓细胞微核试验：试验根据10倍浓缩物设2500mg/kg.BW、5000mg/kg.BW、10000mg/kg.BW三个剂量组，另设溶剂（蒸馏水）对照及环磷酰胺阳性对照组（CP，40mg/kg.BW）。按20mL/kg.BW经口灌胃，两次间隔24h，首次染毒后观察30h。
1.3.4精子畸形试验：试验根据10倍浓缩物设2500mg/kg.BW、5000mg/kg.BW、10000mg/kg.BW三个剂量组，另设溶剂（蒸馏水）对照组和环磷酰胺阳性对照组（CP，40mg/kg.BW）。每天按20mL/kg.BW经口灌胃，连续5天，首次染毒后观察35天。
1.3.530天喂养试验：试验根据10倍浓缩物设2.5mL/kg.BW、5.0mL/kg.BW、10.0mL/kg.BW三个剂量组（分别相当于人体推荐摄入量的25、50、100倍），另设蒸馏水对照组。采用灌胃法，首次染毒后观察30天。
1.4主要仪器与试剂：
1.4.1主要仪器：日本奥林巴斯光学株式会社生产的AU-400全自动生化分析仪、XT-2000i型全自动血细胞分析仪、METTLER电于天平、OLYMPSNH-2型显微镜、解剖器械、超净工作台。
1.4.2主要试剂：生化试剂盒、江苏盛迪医药有限公司生产的环磷酰胺（批号1612625）、Sigma公司生产的1，8-二羟基蒽醌（批号S52025-379）、沈阳化学试剂厂生产的叠氮化钠（批号200001012）、Adamas Reagent Co.Ltd 生产的2-氨基芴（批号26238B）、德国FLUKAAG生产的4-硝基喹啉-N氧化物（批号73265）、Sigma公司生产的丝裂霉素C（批号M4287）、S-9混合液。
1.5试验方法：
1.5.1急性经口毒性试验：采用最大耐受剂量法，大、小鼠分别随机分成两组，共4组，每组同系同性10只动物。称受试物75g加蒸馏水至100mL混匀后备用。大、小鼠一次经口给予受试物。观察一周内动物的中毒表现及死亡情况，试验结束称体重后处死动物作大体解剖。
1.5.2Ames 试验：菌种由国家（成都）中药安全性评价中心（成都华西海折医药科技有限公司）提供，使用经β-茶黄酮与苯巴比妥联合诱导雄性大鼠肝S9，按标准方法制成S9混合液后作为活化系统，用间接致突变物（20ug/皿2-氨基芴用于TA97、TA98、TA100，50ug/皿1，8-二羟基蒽醌醒用于TA102菌）测定S9活性。试验采用TA97、TA98、TA100、TA102四种菌林，受试物设0.16、0.8、4、20、100uL/皿五个剂量组及溶剂对照组（蒸馏水）、自发对照组和阳性对照组。首先配制受试物工作液：因10倍浓缩液过于浓稠影响试验，故用蒸馏水稀释成8倍浓缩液即可试验。试验时取8倍浓缩液100uL加入平皿即为最高受试物终浓度（100uL/皿），以最高浓度为基础用蒸馏水5倍往下稀释即得以下浓度。0.103MPa 20min高压蒸汽灭菌。在加和不加S9的试验条件下进行平板掺入法试验。每组作三个平行皿，重复试验一次。—S9阳性对照物：TA97和TA98用0.5ug/皿的4-硝基喹啉-N-氧化物；TA100用1.5ug/皿的叠氮化钠（NaN3）；TA102用1.0ug/皿的丝裂霉素C（MMC）；+S9阳性对照物TA102用50ug/皿的1，8一二羟基蒽醌，其余三个菌株均采用20ug/皿的2-氨基芴（2-AF）。每皿加入阳性对照的体积为0.1mL。
1.5.3骨髓细胞微核试验：采用30h两次给药法，将小鼠按雌雄分别随机分为5组，每组5只动物，称取2.5g、5.0g、10.0g受试物分别加蒸馏水至20mL，另称取0.04gCP加蒸馏水至20mL，混匀即可，两次灌胃间隔24h，于第二次给受试物后6h脱颈椎处死动物，取胸骨髓按《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中的规定进行制片，固定，Giemsa染色后，在油镜下每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞（PCE）中含微核的PCE数，计算微核细胞率（‰）。观察200个红细胞中嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值（PCE/NCE）。
1.5.4精子畸形试验：将小鼠随机分为5组，每组5只动物，称取10.0g、20.0g、40.0g受试物分别加蒸馏水至80mL，另称取0.04gCP加蒸馏水至20mL混匀即可（环磷酰胺每天临用时配制）。连续灌胃5天，于首次给受试物后第35天，脱颈椎处死动物取双侧附睾进行制片，按《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中的规定，甲醇固定，1%伊红染色后，在高倍镜下每只动物计数1000条完整精子，记录精子畸形、畸形类型及计算精子畸形率。
1.5.530天喂养试验：采用灌胃法，将大鼠随机分成4组，每组20只大鼠，雌雄各半。首先配制受试物溶液，低、中、高剂量组分别取10倍浓缩物75mL、150mL、300mL各加蒸馏水至600mL混匀备用，用完再配。每天按20mL/Kg.BW一次经口灌胃，连续30天给予受试物。
每天每只大鼠单笼喂养，每天观察动物的一般表现、行为、中毒表现及死亡，每周计算两次进食量，并称一次体重，根据食物摄入量，计算食物利用率，试验结束时禁食后称重并将动物麻醉后采血，用XT-2000i型全自动血细胞分析仪测定血液学指标，用日本奥林巴斯光学林式会社生产的AU-400全自动生化分析仪及德国奥林巴斯（欧洲）诊断有限公司提供的试剂金，测定血生化指标，解剖动物观察内脏改变，称肝、肾、脾、睾丸重，计算其脏体比，取肝、肾、脾、胃肠、睾丸（卵巢）作组织病理学检查。试验期间动物自由进食、饮水。
1.6试验数据统计：骨髓微核试验采用卡方检验，精子喷形试验采用秩和检验，30天喂养试验数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如P值小于0.05则用Dunnett法进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如P值小于0.05，则用Dunnett's T3法进行两两比较，上述统计均用SPSS 11.0for Windows软件处理。
1.7结果判定：
1.7.1急性经口毒性试验：根据LDs0数值，判定受试物的毒性分级。
1.7.2Ames试验：受试物组回变菌落数增加一倍以上（即回变菌落数等于或大于2乘以未处理对照数），并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物诱变试验阳性。
1.7.3骨髓细胞微核试验：试验组与对照组相比，试验结果微核率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。
1.74精子畸形试验：每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行比较，畸形率至少为阴性对照组的倍量或经统计有显著意义，并有剂量反应关系，即可判定为阳性。
2、结果
2.1急性经口毒性试验：给受试物后大、小鼠的一般表现和行为均未见异常，观察期内未见动物死亡（表2），试验结束时处死动物，大体解剖肉眼未见异常。口服液对大、小鼠急性经口MTD值均大于15000mg/kg.BW，按急性毒性分级属无毒级。
表2 口服液对大小鼠急性经口毒性试验结果（`X±s）
表3 口服液Ames试验结果（第一次）
注：以上结果为3个平皿的均值±标准值
表4 口服液Ames试验结果（第二次）
注：以上结果为3个平皿的均值±标准值
2.3骨髓细胞微核试验：结果见表5，受试物三个剂量组的微核细胞率与阴性对照组比较，经卡方检验，雌雄鼠的微核细胞率均无显著性差异（P>0.05），而环磷酰胺阳性对照组则非常显著高于阴性对照组（P<0.01），受试物各剂量组的PCE/NCE不少于对照组的20%。结果未见受试物诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核细胞率增高。
表5 口服液对小鼠骨髓细胞微核试验结果（`X±s）
注：**表示与阴性对照组比较P<0.01。
2.4精子畸形试验：结果见表6，受试物三个剂量组精子畸形率与阴性对照组比较，经秩和检验无显著性差异（P>0.05），而环磷酰胺阳性对照组则非常显著高于阴性对照组（P<0.01）。精子畸形类型主要表现以不定形、无钩为主。上述结果表明受试物未诱发小鼠精子畸形率增高。
表6 口服液对小鼠精子畸形试验结果（`X±s）
注：**表示与阴性对照组比较P<0.01。
2.530天喂养试验
试验期间动物健康状况良好，体重持续增长，每组大鼠每天经口给予不同剂量的受试物后均未出现中毒表现，也未见动物死亡。
2.5.1口服液对大鼠体重的影响
由表7可见，三个剂量组雌雄大鼠的初始体重、1-4周体重、第30天体重与对照组相比较，经统计学处理，各项指标均无显著性差异（P>0.05）。
表7 口服液对大鼠体重的影响（`X±s）
2.5.2口服液对大鼠每周进食量的影响
由表8可见，三个剂量组雌雄大鼠的每周进食量与对照组相比较，经统计学处理，雄性第2周低剂量组和第3周低、高剂量组显著降低（P<0.01、P<0.05、P<0.05），雌性第3周高剂量组显著降低（P<0.05），其余均无显著性差异（P>0.05）。
表8 口服液对大鼠每周进食量的影响（`X±s）
2.5.3口服液对大鼠食物利用率的影响
结果见表9，三个剂量组雌雄大鼠的每周食物利用率以及总食物利用率与对照组相比较，经统计学处理，各项指标无显著性差异（P>0.05）。
表9 口服液对大鼠食物利用率的影响（`X±s）
2.5.4口服液对大鼠血液学的影响
由表10可见，三个剂量组雌雄大鼠的血液学指标检测结果与对照组比较，经统计学处理，各项指标均无显著性差异（P>0.05）。以上所测值均在本室正常值范国内。
表10 口服液对大鼠血液学指标的影响（`X±s）
表11 口服液对大鼠末期生化检验结果（`X±s）
2.5.5口服液对大鼠末期血生化的影响
由表11可见，三个剂量组的末期血生化指标检测结果与对照组相比较，经统计学处理，雌性大鼠的低、中剂量组的血糖降低（P<0.01、P<0.01），其余均无显著性差异（P>0.05）。以上所测值均在本室正常值范围内。
2.5.6口服液对大鼠脏体比的影响
结果见表12，三个剂量组雌雄大鼠的肝体比、脾体比、肾体比以及雄鼠的睾丸体比值与对照组相比较，经统计学处理，均无显著性差异（P>0.05）。
表12 口服液对大鼠胀体比的影响（`X±s）
2.5.7病理学检查
试验结束后处死动物，进行大体解剖，肉眼未见异常改变。组织病理学检查结果显示：对照组有2例动物肝组织汇管区局灶性轻度炎细胞浸润，1例动物肝组织肝小叶局灶性轻度脂肪变性，其余受检组织未见异常；受试物高剂量组有2例动物肾组织局灶性肾小管轻度扩张，其余受检组织均未见异常。以上发现均为动物自发病变，未见受试物高剂量组引起动物中毒性损伤改变（见表13-19）。
表13 口服液对大鼠肝脏的组织学研究
表14 口服液对大鼠肾脏的组织学研究
表15 口服液对大鼠脾胀的组织学影响
表16 口服液对大鼠胃的组织学影响
表17 口服液对大鼠空肠的组织学影响
表18 口服液对大鼠睾丸的组织学影响
表19 口服液对大鼠卵巢的组织学影响
3.小结
3.1口服液对大、小鼠急性经口毒性试验结果MTD值均>15000mg/kg.BW，按急性毒性分级，属无毒级。
3.2三项遗传毒性试验（Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验以及小鼠精子畸形试验）结果未见口服液致突变作用。
3.330天喂养试验，可见动物生长发育正常，体重持续增长，体态活泼，被毛光滑柔顺，大、小便未见异常改变。试验期间未见动物出现中毒症状及死亡。三个剂量组雌雄大鼠的每周体重、每周进食量、每周食物利用率、总食物利用率、脏体比值、血液学指标及末期血生化指标检测结果与对照组比较，雄性第2周低剂量组和第3周低、高剂量组进食量显著降低（P<0.01、P<0.05、P<0.05），雌性第3周高剂量组进食量显著降低（P<0.05），但无明显剂量反应关系，且各周食物利用率及总食物利用率未见显著变化，说明受试物对大鼠进食量的影响不是毒性反应。雌性大鼠低、中剂量组血糖虽显著降低，但无明显剂量反应关系，其它各项指标均无显著性差异（P>0.05），以上所测值均在本室正常值范围内。组织病理学检查结果，除动物自发病变外，未见受试物高剂量组引起动物中毒性损伤改变。
（二）功能动物试验
1.材料和方法
1.1样品：实施例2方法制备的口服液，人体每日推荐量为60mL/60kg.BW。以蒸馏水作溶剂配制受试物，冷藏保存。
1.2实验动物：由四川省中医药科学院实验动物中心提供的雌性昆明种小鼠120只，体重18-22g，生产许可证号为SCXK1）2013-19.SPF级。饲料来源于四川省医学科学院，四川省人民医院实验动物研究所，生产许可证号为SCXK（川）2015-01.实验动物房使用许可证号为SYXK（川）2016-043.屏障系统。温度20-25℃，相对湿度40%-70%。
1.3剂量选择及受试物给予方式；直接睡眠试验、延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间试验、发巴比妥纳阀下剂量催眠试验及巴比妥销睡眠潜伏期试验，均按1.5倍浓缩液设6.67mLkg.BW、13.33m/kg.BW、20.00mLkg.BW三个剂量组（分别相当于人体推荐量的10、20、30倍）。首先配制受试物溶液，即低中剂量组分别取1.5倍浓缩液166.8mL、333.3mL，依次加蒸馆水至500mL混匀即可，高剂量组直接取1.5倍浓缩液经口灌胃，冰箱保存备用，用完再配。每日按20mL/kg.BW经口灌胃一次，连续给予30天。
1.4主要仪器与试剂：试验用玻璃槽、石类钟。SIGMA-ALDRICH生产的戊巴比妥钠，批号：P3761；国药集团化学试剂有限公司生产的巴比妥钠，批号：F20070124。
1.5试验方法
1.5.1直接睡眠试验；各组动物分别给予不同剂量的受试物，对照组给予同体积的蒸馏水后，以小鼠翻正反射消失为指标，观察各受试物组是否出现睡眠现象。
1.5.2延长成巴比妥纳诱导的小鼠睡眠时间试验：各组动物于未次给予受试物和溶剂对照后15分钟，按10mL/kg.BW腹腔注射戊巴比妥钠51.5mg/kg.BW（经预试所得，以小鼠翻正反射消失为指标，观察受试物能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。
1.5.3反巴比妥纳阈下剂量催眼试验：各组动物于末次给予受试物和溶剂对照后15分钟，按10mL/kg.BW给各组动物腹腔注射或巴比妥钠最大阀下催眼剂量39.8mg/kg.BW（经预试所得），记录30分钟内翻正反射消失达1分钟以上入睡动物数。
1.5.4巴比妥钠睡眠潜伏期试验：动物末次给予受试物和溶剂对照后15分钟，按10mL/kg.BW给各组动物腹腔注射巴比妥钠420mg/kgBW（经预试所得），以翻正反射消失为指标，观察受试物对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。
1.6试验数据统计：睡眠时间和体重的数据经方差齐性检验，进行方差分析，如P值小于0.05，则用Dunnet法进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如P值小于005，则用DunnettsT3法进行两两比较。睡眠发生率用X2检验，以上数据均由SPSS 11.0for Windows软件包处理。
1.7结果判定：延长成巴比妥的睡眠时间试验、戊巴比妥钠阀下剂量催眼试验，巴比妥钠睡眠潜伏期试验三项实验中二项阳性，且无明显直接睡眠作用，可判定该受试样品具有改善睡眠功能作用。
2结果
2.1口服液对小鼠体重的影响
从表1-3可见，各组动物的初始体重经方差齐性检验，方差齐（P>0.05），且方差分析结果（P>0.05），说明各组动物之间的初始体重是均衡的。试验期间各组动物的体重持续增长，各剂量组小鼠的中期体重、结来体重与阴性对照组比较，均无显著性差异（P>0.05）。
表1 口服液对延长成巴比妥的诱导小鼠睡眠时间试险小鼠体重的影响（`X±s）
表2 口服液对戊巴比妥钠阀下剂量催眠试验小鼠体重的影响（`X±s）
表3 口服液对睡眠潜伏期试验小鼠体重的影响（`X±s）
2.2口服液直接睡眠试验
结果见表4，三个剂量组动物连续30天经口给予不同剂量的受试物后，均未出现直接睡眠现象。
表4 口服液对小鼠直接睡眠的影响（`X±s）
2.3口服液延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间试验
结果见表5，三个剂量组动物的睡眠时间与阴性对照组比较，中、高剂量组反巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间延长均有显著性差异（P<0.05，P<0.01），而低剂量组的睡眠时间无显著性差异（P>0.05）。
表5 口服液对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响（`X±s）
2.4口服液茂巴比妥钠阈下剂量催眼试验
结果见表6，三个剂量组的成巴比要的诱导小鼠睡眠发生率与阴性对照组比较，可见高剂量组的小鼠睡眠发生率有显著性差异（P<0.05）。
表6 口服液对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠发生率的影响（`X±s）
2.5口服液巴比妥钠睡眠潜伏期试验
结果见表7，三个剂量组的小鼠睡眠潜伏期与阴性对照组比较，中、高剂量组的睡眠潜伏期时间缩短均有显著性差异（P<0.05，P<0.05），而低剂量组无显著性差异（P>0.05）。
表7 口服液对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响（`X±s）
3小结：
口服液连续30天经口灌胃给予动物后，可见动物生长良好，体重持续增长。中、高剂量组的小鼠睡眠时间延长均有显著性差异（P<0.05，P<0.01）；中、高剂量组的睡眠潜伏期时间缩短均有显著性差异（P<0.05，P<0.05）；高剂量组的小鼠睡眠发生率有显著性差异（P<0.05）；且无直接睡眠作用。根据结果判定标准，可见口服液对动物具有改善睡眠功能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，但本发明不以所示限定实施范围，凡是依照本发明的构想所作的改变，或修改为等同变化的等效实施例，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种可有效助眠的口服液，其特征在于，由如下重量份组分制成：
酸枣仁200~300份、人参200~300份、茯苓40~60份、小米15~25份、花豆15~25份、蜂蜜40~60份、L-色氨酸15~25份、维生素C 1~2份、山梨酸钾0.05~0.15份。
2.根据权利要求1所述一种可有效助眠的口服液，其特征在于，由如下重量份组分制成：
酸枣仁250份、人参250份、茯苓50份、小米20份、花豆20份、蜂蜜50份、L-色氨酸20份、维生素C 1.5份、山梨酸钾0.1份。
3.根据权利要求1或2所述一种可有效助眠的口服液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）原料称取：
称取相应重量份的酸枣仁200~300份、人参200~300份、茯苓40~60份、小米15~25份、花豆15~25份、蜂蜜40~60份、L-色氨酸15~25份、维生素C 1~2份、山梨酸钾0.05~0.15份备用；
（2）通过下列方法之一进行酸枣仁总皂苷、人参总皂苷的提取：
A. 乙醇提取法：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后用乙醇回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在7000~9000rpm下离心25~35min去除不溶性杂质，得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
B. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
C. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
D. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后与0.05~0.15M含有0.5~1.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养1.5~2.5h，然后加热到95~105℃保持8~12min灭活酶；过滤得到上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
E. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的酸枣仁、人参分别制成粉末后按照D中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照A中的方法离心得到酸枣仁皂苷溶液和人参皂苷溶液；
（3）酸枣仁总皂苷、人参总皂苷最佳提取方法的确定：
采用高效液相色谱法分别测定步骤（2）中步骤A、步骤B、步骤C、步骤D以及步骤E中酸枣仁皂苷含量和人参皂苷含量，然后比较不同提取方法酸枣仁总皂苷和人参总皂苷得率，选出最佳提取方法；
（4）通过下列方法之一进行茯苓多糖的提取：
A. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在7000~9000rpm下离心25~35min去除不溶性杂质得到茯苓多糖溶液；
B. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
C. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后与0.05~0.15M含有0.5~1.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养1.5~2.5h，然后加热到95~105℃保持8~12min灭活酶，过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
D. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的茯苓制成粉末后按照步骤C中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到茯苓多糖溶液；
（5）茯苓多糖最佳提取方法的确定：
使用D-半乳糖和半乳糖醛酸作为标准物，采用苯酚硫酸法分别测定步骤（4）中步骤A、步骤B、步骤C以及步骤D中总糖含量，然后比较不同提取方法茯苓多糖得率，选出最佳提取方法；
（6）通过下列方法之一进行小米、花豆蛋白的提取：
A. 热水提取法：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后用蒸馏水回流提取，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，在7000~9000rpm下离心25~35min去除不溶性杂质得到茯苓多糖溶液；
B. 超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后放在超声清洗锅里超声处理，然后过滤得到上清液，残渣继续用上述方法提取，合并两次提取的上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
C. 酶辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后与0.05~0.15M含有0.5~1.5%（V/V）复合酶（纤维素酶、果胶酶以及半纤维素酶）的醋酸盐缓冲溶液混合，在恒温震荡水浴中培养1.5~2.5h，然后加热到95~105℃保持8~12min灭活酶，过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
D. 酶-超声辅助提取：
将步骤（1）中称取的小米、花豆制成粉末后按照步骤C中的方法处理之后进行超声处理，反应液冷却至室温后过滤得到上清液，再按照步骤A中的方法离心得到小米蛋白溶液和花豆蛋白溶液；
（7）小米、花豆蛋白最佳提取方法的确定：
采用凯氏定氮法分别测定步骤（6）中步骤A、步骤B、步骤C以及步骤D中小米蛋白含量和花豆蛋白含量，然后比较不同提取方法小米蛋白得率，选出最佳提取方法；
（8）搅拌混匀：
将步骤（1）中称取的蜂蜜40~60份、L-色氨酸15~25份、维生素C 1~2份、山梨酸钾0.05~0.15份、步骤（3）中确定的最佳提取方法所提取的酸枣仁总皂苷、人参总皂苷溶液、步骤（5）中确定的最佳提取方法所提取的茯苓多糖溶液、步骤（7）中确定的最佳提取方法所提取的小米、花豆蛋白液共同置于搅拌罐内搅拌混匀后依次进行灭菌，灯检，包装，检验即可。
4.根据权利要求3所述一种可有效助眠的口服液的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的步骤D中、步骤（4）中的步骤C中以及步骤（6）中的步骤C中所述的醋酸盐缓冲溶液的体积为450~550mL，pH值为4~5。
5.根据权利要求3所述一种可有效助眠的口服液的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的步骤D中、步骤（4）中的步骤C中以及步骤（6）中的步骤C中所述的恒温震荡水浴的条件为震荡速度为100~200rpm，温度为45~55℃。
6.根据权利要求3所述一种可有效助眠的口服液的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的高效液相色谱法测定时，色谱柱型号Kromasil C18(5μm，200×4.6mm)，柱温设置为20~30℃，流动相为甲醇:水=80~90:10~20(V/V)，流速 0.5~1.5mL/min，进样量15~25mL。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210601 |
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