CN104784077A - 天山堇菜活性部位及其在制备美白化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物提取物在具有美白作用的化妆品领域中的应用，公开了天山堇菜活性部位在具有美白作用的化妆品领域中的应用。这种活性部位的制备方法为取天山堇菜全草干燥粉末，以乙醇提取，滤液合并，减压回收溶剂，得到天山堇菜粗提物；天山堇菜粗提物经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，收集，蒸干，得到天山堇菜活性部位。通过上述方法得到的天山堇菜乙酸乙酯和正丁醇部位，是一种天然的具有抑制酪氨酸酶作用和B16黑色素细胞抑制作用的植物提取物，对人体无副作用，可用于制备具有美白作用的化妆品。

Description

天山堇菜活性部位及其在制备美白化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及植物提取物和日化领域，具体为天山堇菜活性部位及其在制备美白化妆品中的应用。

背景技术

近年来，随着人们生活水平和审美标准的提高，越来越多的人追求、渴望白皙及洁润的肌肤。因此，具有防止由太阳光线及其它原因引起的色斑、色素沉着作用的美白类化妆品以及皮肤美白制剂的研究与开发，正日益受到各国化妆品生产商和研究者的重视，美白和抗氧化化妆品已成为护肤类化妆品的主流品种之一。

然而，随着化学合成化妆品中毒事件的频频发生，人们开始热衷于植物化妆品及回归自然的美容方法。

造成皮肤黑色素生成的原因有：遗传因素；紫外线、废气、活性氧等环境因素；体内氧化与抗氧化平衡失调；内分泌失调；微生态失衡；代谢紊乱；机体微量元素含量异常等。祖国医学则认为色素沉着的主要病因是：①肝气郁结；②肾阴不足；③气血淤阻；④劳伤脾土。在治疗上，全身疗法以疏肝、补肾、活血、益气健脾为主，外用以中药面膜和霜、膏剂居多。但此类资料多以临床报道为主，缺乏严密的科研设计、实验室研究和统计学处理。至今为止，也尚末发现开发出治疗“黄褐斑”中药搽剂的文献报道。因此，寻找高效且对人体无副作用或副作用小的美白祛斑制剂已成为目前药学及化妆品领域的一个研究热点。

美白机理美白剂的作用是通过抑制酪氨酸酶活性或者阻断酪氨酸生成黑色素的氧化途径，从而减少黑色素生成达到美白皮肤的效果。皮肤美白剂就是作用于皮肤黑色素生成、代谢过程中，抑制黑色素生成且符合规范的物质，但传统的皮肤美白剂，往往采用化学性物质，如具有增白作用的汞盐和祛斑作用的氢醌。这些化合物虽然有快速达到美白之功效，但对皮肤有毒副作用，长期使用会引起接触性皮炎或引起永久脱色等不良作用，在许多国家已被禁用。目前要求的皮肤美白剂应该符合两个标准：一是对酪氨酸酶活性有较高的抑制率，能显著的减少黑色素的生成；二是有较高的安全性，以人体皮肤无毒无刺激。熊果苷、VC及其衍生物和曲酸是目前国内外美白化妆品中较常使用的美白成分。为了开发符合“回归大自然”要求的化妆品，特别是安全，无副作用的美白产品，一些具有很好美白效果的中草药目前越来越受到消费者的青睐。在国际上化妆品发展最有代表性的国家美国、日本、法国和德国等国家中，中草药因其天然药效温和且不良作用少而被广泛认同，从中了解到近年来崇尚自然，远离化学污染的理念。特别是日本化妆品工业的发展趋势看，各化妆品公司使用的中草药已达200余种，目前，在日本含天然中草药的化妆品已占整个化妆品市场的50%以上。因此，寻找开发高效且对人体无副作用或副作用小的天然中草药皮肤美白祛斑制剂已成为目前化妆品领域的一个较被重视的课题。

天山堇菜为堇菜科植物天山堇菜（Viola tianshanica Maxim.）的干燥全草，维药名比乃非谢吉，是新疆特色药物中清热解毒药材的著名代表之一。主要用于轻泻异常胆液质，调节血液热性过盛，生津止渴，发汗退烧。临床用于热性感冒，发烧，头痛，咽痛，肢肿，小儿惊厥，也可外用于疔疮肿痛等症。在2003年我国SARS(非典)爆发期间，维医药将天山堇菜及其复方作为首推的药物对该类重症感染性疾病进行防治，如天山堇菜糖浆、天山堇菜小丸、天山堇菜汤(维药名分别为：谢日比提比乃非谢、艾比比乃非谢、买提布合比乃非谢)等。

近年来对天山堇菜的化学成分研究分离得到山柰酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素3-O-葡萄糖苷、山柰酚、槲皮素、烟花苷、七叶内酯、腺苷、尿嘧啶核糖核苷、2, 2’-二硫代二苯并噻唑、α-亚麻酸甲酯、α-亚麻酸单甘油酯、1, 2-二亚麻酸甘油酯、1, 3-二亚麻酸甘油酯、姜糖脂 A、2,3-二亚麻酸甘油酯-1-O-β-D-半乳糖苷、(2S,3S,4R,11E)-2-[(2R)-2-hydroxytetra cosanoylamino]-11-octadecene-1,3,4-triol、9-hydroxy-4-megastigmen-3-one、β-谷甾醇和胡萝卜苷等黄酮类和香豆素类化合物（中国中药杂志，2009，22：2916-2917；中草药，2014，21：3057-3061）。报道了采用大孔树脂吸附纯化天山堇菜的总黄酮成分的工艺（中国实验方剂学杂志，2013，19：93-95）。药理实验表明天山堇菜的粗提物显示出抗菌、抗氧化和抗病毒等生物活性（中国民族医药杂志，2009，3：36-37；食品科学，2009，1：139-141；时珍国医国药，2013，2:54-56）。

综合现有文献资料，未发现天山堇菜及其所含成分具有美白作用的文献和专利报道。

发明内容

本发明旨在提供天山堇菜活性部位及其在美白化妆品领域中的应用。

本发明所要解决的技术问题是在于寻找开发高效且对人体无副作用或副作用小的天然植物美白制剂。本发明提供了天山堇菜活性部位的制备方法及在美白领域有应用潜能的天山堇菜活性部位。

天山堇菜活性部位的提取方法，步骤包括：

（1） 取干燥的天山堇菜全草粉末，加入乙醇溶液冷浸后提取2～5次，取滤液；

提取方法为常温下（10～30℃）用体积浓度为30%～95%乙醇溶液（优选为60%～75%）冷浸、超声提取10～60分钟；每次提取时，乙醇溶液与天山堇菜粉末的用量比为5～15 ml / g；

（2）合并滤液，去除乙醇后石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取物回收溶剂，蒸干，即得。

本发明的技术方案为，取天山堇菜全草，干燥、粉碎成粗粉，取干燥粉末，以乙醇提取，滤液合并，减压回收溶剂，得到天山堇菜粗提物；天山堇菜粗提物经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，收集，蒸干，得到天山堇菜活性部位。测定所得到的活性部位酪氨酸酶抑制作用和B16黑色素细胞抑制作用，其中乙酸乙酯和正丁醇部位具有良好的美白作用，尤其是乙酸乙酯部位，效果最佳。

通过上述方法得到的天山堇菜活性部位，是一种天然的植物美白提取物，对人体无副作用，在美白化妆品领域有应用潜能。这种天山堇菜活性部位可用于制备具有美白作用的化妆品：如化妆水、爽肤水、乳液、霜膏、洁面霜等。

具体实施方式

实施例1

天山堇菜干燥粉末20g，室温下（10～30℃）以体积浓度为30％乙醇200ml冷浸、超声提取2次，每次10min（500W），取滤液合并，减压回收溶剂至干，取提取物适量，配制成0.5mg/ml溶液备用，测定其酪氨酸酶抑制作用，以便与后续制得的天山堇菜活性部位的活性作比较。

结果：天山堇菜粗提物的酪氨酸酶抑制作用IC₅₀为2.8 mg/ml。

实施例2

天山堇菜干燥粉末20g，室温下以体积浓度为60％乙醇200ml冷浸、超声提取2次，每次30min（500W），取滤液合并，减压回收溶剂至干，取提取物适量，配制成0.5mg/ml溶液备用，测定其酪氨酸酶抑制作用，以便与后续制得的天山堇菜活性部位的活性作比较。

结果：天山堇菜粗提物的酪氨酸酶抑制作用IC₅₀为2.9 mg/ml。

实施例3

天山堇菜干燥粉末20g，室温下以体积浓度为70％乙醇200ml冷浸、超声提取2次，每次30min（500W），取滤液合并，减压回收溶剂至干，取提取物适量，配制成0.5mg/ml溶液备用，测定其酪氨酸酶抑制作用，以便与后续制得的天山堇菜活性部位的活性作比较。

结果：天山堇菜粗提物的酪氨酸酶抑制作用IC₅₀为1.2 mg/ml。

实施例4

天山堇菜干燥粉末20g，室温下以体积浓度为75％乙醇200ml冷浸、超声提取2次，每次30min（500W），取滤液合并，减压回收溶剂至干，取提取物适量，配制成0.5mg/ml溶液备用，测定其酪氨酸酶抑制作用，以便与后续制得的天山堇菜活性部位的活性作比较。

结果：天山堇菜粗提物的酪氨酸酶抑制作用IC₅₀为1.8 mg/ml。

实施例5

天山堇菜干燥粉末20g，室温下以体积浓度为95％乙醇200ml冷浸、超声提取2次，每次30min（500W），取滤液合并，减压回收溶剂至干，取提取物适量，配制成0.5mg/ml溶液备用，测定其酪氨酸酶抑制作用，以便与后续制得的天山堇菜活性部位的活性作比较。

结果：天山堇菜粗提物的酪氨酸酶抑制作用IC₅₀为2.2 mg/ml。

实施例6  活性部位富集

取天山堇菜干燥粉末50g，室温下（10～30℃）以体积浓度为95%乙醇500ml冷浸、超声提取2次，每次30min（500W），取滤液合并，减压回收溶剂至无醇味；依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别收集各部位、蒸干，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，配制成不同浓度的溶液备用。

实施例7  酪氨酸酶抑制活性能力测试

在本领域中通常美白性能的优劣是用酪氨酸酶抑制活性能力测试来表征的。酪氨酸酶抑制活性能力测试原理如下：近年的研究证明色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶，产生色素所引起的。在黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴，多巴醌，经非酶氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。

试验方法：

1） 设立样品管，样品对照管，阳性对照，阴性对照。

2） 在样品管和样品对照管中各加入1ml不同浓度的样品溶液，阳性和阴性对照管以磷酸缓冲液代替。

3） 在样品管和阳性对照管中加入0.5ml酪氨酸酶溶液（酶活单位125u/ml），样品对照和阴性对照管以0.5ml磷酸缓冲液（pH=6.8）代替，振摇所有试管，使样品和酪氨酸酶充分混匀，37℃水槽孵育10分钟。

4） 加入2ml的0.03wt%酪氨酸溶液，反应10分钟。即刻在475nm处测定吸光度。

抑制率I（%）=［1－（T－T0）/(C-C0)］×100%

式中：

T0：样品溶剂对照；

T：样品对照；

C：阳性对照

C0：阳性对照溶剂对照

按照上面公式计算抑制率，抑制率越大美白能力越强。结果见表1。

表1  天山堇菜粗提物和各部位酪氨酸酶抑制作用

实施例6所得石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位中，在0.5 mg/ml时，对酪氨酸酶抑制率分别为31%，96%和87%，由此可见，乙酸乙酯和正丁醇部位均具有很强的美白作用，其中，以乙酸乙酯美白能力最强。

实施例8  B16黑色细胞抑制作用测定

用含10% 胎牛血清、青霉素100U·mL-1及链霉素100U·mL-1DMEM细胞培养液将B16黑色素细胞密度调为1×105 个/mL，以每孔3mL接种于6孔细胞培养板中，在37℃，5%CO2条件下培养24h后添加待测样品。作用3d后，弃上清并用PBS洗涤，然后每孔加入0.5mL胰酶消化细胞3min，添加2mL细胞培养液终止消化反应，计数每组 细胞。弃除细胞悬液后， 添加1mol·L-1 NaOH溶液0.5mL，震动1h后1500r·min-1离心5min，分别 取200μL移到96孔细胞培养板，酶标仪检测450nm的吸光度。计算黑色素合成抑制率： 抑制率=[1-(A/B)/(C/D)]×100%。其中，A为药物孔吸光度，B为药物孔细胞数，C对照孔吸光度，D为对照孔细胞数。结果见表2。

表2 天山堇菜粗提物和各部位B16黑色细胞抑制作用

实施例6所得石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位中，在0.5 mg/ml时，对B16黑色细胞抑制率分别为23%，65%和60%，再次表明，乙酸乙酯和正丁醇部位均具有很强的美白作用，其中，以乙酸乙酯美白能力最强。

Claims (3)

1.天山堇菜活性部位在制备具有美白作用的化妆品领域中的应用，其特征在于，所述的天山堇菜活性部位的制备方法包括以下步骤：

(1) 取干燥的天山堇菜全草粉末，加入体积浓度为30％～ 95％乙醇溶液冷浸后提取2 ～ 5 次，每次提取时，乙醇溶液与天山堇菜全草粉末的用量比为5 ～ 15ml/g，超声提取10 ～ 60 分钟，取滤液；

(2) 合并滤液，去除乙醇后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取物蒸干，即得。

2.根据权利要求1所述天山堇菜活性部位的应用，其特征在于，步骤(1) 中，所述乙醇溶液的体积浓度为60％～ 95％。

3.根据权利要求1 所述天山堇菜全草活性部位的应用，其特征在于，所述部位为乙酸乙酯部位和正丁醇部位。