CN104523520A - 沉香叶提取物用作美白有效成分的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及沉香叶提取物作用美白有效成分的新用途，试验表明，沉香叶提取物具有美白的功效，可将之与其他化妆品用辅料与添加剂混合制成各种皮肤护理的化妆品组合物及各种剂型，具有实际应用价值，并具有天然、高效、安全无毒的特点。

Description

沉香叶提取物用作美白有效成分的用途

技术领域

本发明涉及植物提取物的新用途，尤其涉及沉香叶提取物用作美白有效成分的新用途。

背景技术

近年来随着生活工作节奏的加快以及环境污染的加剧，人们面对的皮肤问题也越来越多，由各种原因引起的色斑、色素沉着等已成为普遍问题，美白和抗氧化化妆品已成为护肤类化妆品的主流品种。随着人们消费观念的日益成熟，消费者对美白化妆品的关注重点不仅仅在于其功效性同时也更注重其安全性。

造成皮肤色斑、色素沉着的原因有多种，如遗传因素和紫外线、废气及活性氧等环境因素。目前的研究结果认为黑色素主要由人体皮肤表皮基底层的黑色素细胞产生，它的含量及分布决定了皮肤的颜色。然而，黑色素在基底层的异常蓄积形成的各类色斑给现代人尤其是女性造成了生理和心理的困扰，祛斑已是众多女性美容的首要目标。黑色素研究表明，酪氨酸酶是黑色素形成的关键酶，通过将酪氨酸羟化，产生L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)，然后再将L-DOPA进一步氧化成多巴醌，从而形成黑色素。它的过量表达是导致色素沉着过度的主要原因。因此，抑制酪氨酸酶的活性可以阻断黑色素的生物合成反应链，减少黑色素的生成，实现美白的效果。

皮肤美白剂就是作用于皮肤黑色素生成、代谢过程，抑制黑色素生成且符合规范的物质。但传统的皮肤美白剂，往往采用化学性物质，采用过氧化氢、氯化氨基汞以及各种酚类衍生物，它们能使黑色素组织迅速瓦解，达到快速美白功效，但对皮肤具有很大的腐蚀性细胞毒性和过敏性，在许多国家的卫生规范中已禁用。目前，越来越多的女性对肌肤的安全问题十分关注。为了开发符合“回归大自然”要求的化妆品，特别是安全，无副作用的美白产品，绿色已成为21世纪化妆品的主题，天然美白化妆品，特别是加有中草药活性成分的化妆品越来越受到消费者的青睐。在国际上化妆品发展最有代表性的国家如美国、日本、法国和德国等国家中，中草药因其天然药效温和且不良作用少而被广泛认同。目前，在日本含天然中草药的化妆品已占整个化妆品市场的50％以上。人们开始期待无毒、无污染化妆品的出现。研制以中草药为原料的功能性化妆品是化妆品业未来的必然发展趋势，此类新产品有着巨大的经济发展空间。

沉香为珍贵濒危的中药材，为瑞香科植物沉香(Aquilaria agallocha Roxb.)或白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.)含黑色树脂的木质部，前者主产于印度和马来西亚等国，称为进口沉香，后者主产于我国海南、广东、广西等省区，为国产沉香，具有行气止痛，温中止呕，纳气平喘等功效，用于胸腹胀闷、胃寒、呕吐、呃逆、气逆喘急等。沉香的野生资源已遭到严重破坏，被列为国家二级重点保护植物，是濒危野生植物种国际公约中的保护树种，是我国特有而珍贵的药用植物。研究表明，沉香叶乙醇回流提取物有显著的抗炎镇痛、促进小肠运动、抗脑缺血缺氧及降糖的作用，可将沉香叶制作成茶叶或颗粒剂等保健品，应用于炎症疼痛、便秘、高血糖及肿瘤等相关疾病的辅助治疗，是具有广阔的市场前景。沉香叶的产品开发应用相对较少，主要见于沉香茶的制作。这一生物资源还未被有效开发。近年来，从植物中提取安全而有效的天然酪氨酸酶抑制剂备受关注。目前还未见从沉香叶用于天然美白化妆品的相关报道或专利。

发明内容

本发明的目的在于提供一种沉香叶提取物的新用途。

色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶，产生色素所引起的。在黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴、多巴醌，经氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着，实现美白的效果。

因此，在化妆品领域，美白性能优劣是用抑制酪氨酸酶活性能力来表征的。

本发明的技术方案就是首先公开了一种沉香叶提取物用作美白有效成分的新用途。

进一步的，所述沉香叶提取物用于美白的有效成分是指抑制酪氨酸酶活性的有效成分。

本发明中所述沉香为珍贵濒危的中药材，为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(aquilaria)植物沉香(Aquilaria agallocha Roxb.)或白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.)含黑色树脂的木质部。沉香叶既是指沉香木的叶部。

所述沉香叶提取物是指通过提取溶剂进行提取制得的提取物。所述提取溶剂优选为乙醇的水溶液。

本发明进一步公开所述沉香叶提取物的制备方法，为取沉香叶，干燥后，粉碎成粉，加乙醇水溶液冷浸后加热回流，合并滤液，然后减压回收提取溶剂后既得沉香叶提取物。

所述乙醇水溶液，即乙醇和水按体积比进行混合制得的混合溶液；优选的，所述乙醇水溶液的体积浓度为30-95％。

优选的，所述冷浸的温度为10-30℃。

优选的，所述加热回流的温度为70-90℃，加热回流的时间为60-120min。

优选的，所述乙醇水溶液与沉香叶粉末的用量比为10～20ml乙醇水溶液：1g沉香叶粉末。

所述减压回收的目的在于去除提取溶剂(包括乙醇和水)，至提取物中无醇味。

所述沉香叶提取物直接用作美白有效成分，或经进一步提纯后用作美白有效成分。

优选的，所述提纯的方法为，将沉香叶提取物用大孔吸附树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇水溶液洗脱，收集流份，蒸干，得到沉香叶不同浓度乙醇洗脱活性部位。

优选的，所述大孔吸附树脂为D101树脂。

优选的，所述用于洗脱的乙醇水溶液的体积浓度为30％～95％；更优选为30-70％。

进一步优选的，所述沉香叶提取物还包括所述体积浓度为30％～70％乙醇洗脱活性部位中浓度任选的乙醇洗脱活性部位。

其中，体积浓度为30％乙醇洗脱活性部位美白效果更佳。

进一步，所述一种沉香叶提取物用作美白有效成分的新用途是指：将所述沉香叶提取物作为美白有效成分用于美白化妆品的制备。

所述将沉香叶提取物用作美白有效成分是指：在化妆品组合物中，可以将沉香叶提取物作为其唯一美白有效成分，或者也可以将沉香叶提取物作为其美白有效成分之一与其他同样具有美白作用的成分同时使用。

可采用常规方法，将有效量的沉香叶提取物与化妆品常用辅料混合制备各种形式的化妆品。

本发明所述各优选条件均可任意组合。

试验表明，沉香叶提取物具有美白的功效，可将之与其他化妆品用辅料与添加剂混合制成各种皮肤护理的化妆品组合物及各种剂型，具有实际应用价值。

优选的，所述制备的美白化妆品包括但不限于化妆水、爽肤水、乳液、霜膏、洁面霜等。

通过上述方法得到的沉香叶提取物，是一种天然的植物美白提取物，对人体无副作用，在美白化妆品领域有广泛的应用潜能。

进一步的，除了可用于制备预防皮肤晒黑、增白、祛斑的化妆品，沉香叶提取物还可以用于制备治疗色素沉着性疾病的药物。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1沉香叶不同体积浓度乙醇粗提物对蘑菇酪氨酸酶的抑制

在化妆品领域中通常美白性能的优劣是用酪氨酸酶抑制活性能力测试来表征的。酪氨酸酶抑制活性能力测试原理如下：

色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶，产生色素所引起的。在黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴、多巴醌，经氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。

试验方法：

1)使用96孔板设立样品孔，样品对照孔，阳性对照孔，阴性对照孔。

2)在样品孔和样品对照孔中各加入30μL不同浓度的样品溶液，阳性和阴性对照孔以磷酸缓冲液(PBS)代替。所述磷酸缓冲溶液是指磷酸氢二钠7.16克，加上磷酸二氢钠3.12克，用200ml去离子水溶解，调pH值6.8。

3)在样品孔，样品对照孔，阳性对照孔，阴性对照孔中各加入60μL的0.15％L-多巴溶液，然后用磷酸缓冲液补至各孔总体积为180μL，混匀。

4)在样品孔和阳性对照孔中加入30μL酪氨酸酶溶液(酶活100u/ml)，样品对照孔和阴性对照孔以30μL磷酸缓冲液(pH＝6.8)代替，使样品和酪氨酸酶充分混匀，30℃恒温在475nm处测定吸光度，每5s记一次数，连续测定30s，以反应时间对吸光度作图并进行直线拟合，根据样品孔与阳性对照孔直线斜率的变化计算抑制率。

抑制率I(％)＝[1－kT/kC]×100％

式中：

kT：样品孔直线斜率；

kC：阳性对照孔直线斜率；

半数抑制率(IC₅₀)的计算：

IC₅₀值定义为抑制率为50％时所需酪氨酸酶抑制剂的浓度。以样品的浓度对酪氨酸酶的抑制率作图并进行拟合，读取计算IC₅₀值。

沉香叶干燥粉末分别取30g，室温下(10～30℃)分别以体积浓度为30％，50％、70％、95％乙醇水溶液480ml冷浸、85℃回流提取120min，取滤液，减压回收溶剂至干，取提取物适量，配制成7mg/ml溶液备用，测定其酪氨酸酶抑制作用，以便与后续制得的沉香叶活性部位的活性作比较。

结果：沉香叶30％乙醇粗提物的酪氨酸酶抑制作用IC₅₀为5.45mg/ml，50％乙醇粗提物的酪氨酸酶抑制作用IC₅₀为3.56mg/ml，70％乙醇粗提物的酪氨酸酶抑制作用IC50为2.32mg/ml，95％乙醇粗提物的酪氨酸酶抑制作用IC₅₀为3.76mg/ml。

实施例2沉香叶70％乙醇提取物经大孔树脂吸附后不同洗脱活性部位对蘑菇酪氨酸酶的抑制

取沉香叶干燥粉末30g，室温下(10～30℃)以体积浓度为70％乙醇水溶液480ml冷浸、85℃回流提取120min，取滤液合并，减压回收溶剂至无醇味；经D101大孔树脂吸附，依次以体积浓度为30％乙醇、50％乙醇，70％乙醇，95％乙醇进行洗脱，分别收集各流份、蒸干，分别得到30％乙醇洗脱部位、50％乙醇洗脱部位、70％乙醇洗脱部位、95％乙醇洗脱部位的沉香叶活性部位，并配制成不同浓度的溶液备用。测定不同洗脱活性部位对蘑菇酪氨酸的抑制，试验方法同实施1。

结果：30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇洗脱得到的沉香叶活性部位，酪氨酸酶抑制作用的IC₅₀分别为1.39mg/ml、1.51mg/ml、3.26mg/ml、6.38mg/ml。而沉香叶70％乙醇粗提物酪氨酸酶抑制作用的IC₅₀为2.32mg/ml，由此可见，30％乙醇洗脱活性部位酪氨酸酶抑制作用最强。

从上述结果可以看出，沉香叶粗提物经D101大孔吸附树脂吸附并用梯度乙醇洗脱得到的部位，较粗提物相比，酪氨酸酶抑制作用大幅提高，尤其是经体积浓度30％乙醇水溶液洗脱后获得的沉香叶活性部位酪氨酸酶抑制作用的IC₅₀为1.39mg/ml，显示了非常高的酪氨酸酶抑制活性。亦即本发明所公开的沉香叶活性部位有良好的美白作用。

实施例3沉香叶提取物对黑色素瘤细胞B16中黑素含量的影响

黑素瘤细胞B16是由正常黑素细胞突变所致，其生化代谢与正常黑素细胞相似，现已成为医药部门进行色素病变研究广泛使用的细胞，国外化妆品生产企业的科研部门，在筛选美白剂的过程中，广泛使用该细胞作为化妆品美白剂功效测定的受试细胞。这种方法，比体外生化法更准确，同时较人体实验更快速、简便，已成为美白化妆品添加剂功效评价的重要手段。方法如下：

1.铺板：按密度1×10⁵/孔将B16接种于12孔板，每孔1ml；

2.药物干预：于37℃，5％CO₂培养箱中培养12h后，将原来的培液移走，每孔加入2ml用培液稀释好的沉香叶70％乙醇粗提物(提取方式同实施例1)，同时设立空白对照(不加提取物，即阴性对照)，孵育48小时；

3.收集药物处理过的细胞：移走培养液，用PBS清洗两遍，加PBS 200μL，用细胞刮刀将不同药物处理组和空白组分别收集到不同的EP管中，10000r/min、4℃离心1min收集细胞；

4.裂解细胞，释放黑色素颗粒：收集后的细胞用1000μL含10％DMSO(二甲基亚砜)的NaOH溶液(1M)溶解，并在90℃下加热2h，将获得的每种溶有各组处理后细胞的1M NaOH溶液100μL加入到96孔中；

5.每孔细胞蛋白浓度的分析：在96孔板中每孔加入90μL蛋白染料和10μLNaOH(1M)溶解的细胞溶液；

6.酶标仪测定：用酶标仪在405nm处测定步骤4加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的黑色素含量的吸光度值；用酶标仪在562nm处测定步骤5加入96孔板中的吸光度，得到每孔蛋白浓度的吸光度值；

7.结果分析：

黑色素合成抑制率＝[1-(各待测孔黑色素含量的吸光度值÷待测物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照孔黑色素含量的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％

结果见表1：

表1沉香叶提取物对B16细胞黑色素含量的影响(X±S,％)

沉香叶提取物浓度(μg/ml)	140	175	210	350
					黑色素合成抑制率(％)	12.3±3.6	14.5±3.9	18.3±4.2	25.7±4.7

研究中B16细胞在添加不同质量浓度(100～600μg/ml)的沉香叶提取物溶液的培养环境下，细胞形态正常，且存活率均超过90％，说明沉香叶提取物对细胞并无毒性作用。

结果：沉香叶提取物对B16细胞黑色素含量具有明显的抑制作用，呈明显的剂量效应关系。

实施例4沉香叶70％乙醇提取物对黑色素瘤细胞B16中酪氨酸酶活性影响

黑色素合成是一个多步骤的酶促反应，酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，许多美白药物通过抑制酪氨酸酶的活性来实现美白功能，沉香叶提取物对细胞酪氨酸酶活性测定方法如下：

1.铺板：按密度1×10⁵/孔将B16接种于12孔板，每孔1ml；

2.药物干预：于37℃、5％CO₂培养箱中培养12h后。将原来的培液移走，每孔加入2ml用培液稀释好的70％乙醇回流提取的沉香叶提取物(提取过程同实施例3步骤2)，同时设立空白对照(不加药物组)，孵育48小时；

3.收集药物处理过的细胞：移走培养液，用PBS清洗两遍，加PBS 200μL，用细胞刮刀将不同药物处理组和空白组分别收集到不同的EP管中，10000r/min、4℃离心1min收集细胞；

4.裂解细胞，释放黑色颗粒：收集后的细胞每管加入1％Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)150μL，4℃溶解半小时，13000r/min、4℃离心20min，得到的上清液即是含酪氨酸酶的胞质蛋白；

5.每孔细胞蛋白浓度分析：在96孔板中每孔加入90μL蛋白染液和10μL细胞裂解液溶解的胞质蛋白，用酶标仪在562nm处测量各孔的蛋白浓度的吸光度值；

6.酪氨酸酶活性试验：在96孔板中每孔加入90μL含胞质蛋白的细胞裂解液，加入10μL0.25％的L-DOPA溶液，在37℃反应0.5-1小时。用酶标仪在475nm处测量各孔的吸光度；

7.结果分析：

酪氨酸酶活性抑制率(％)＝[1-(各待测物浓度孔的吸光度值÷待测物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照孔的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％

结果见表2：

表2沉香叶提取物对B16细胞酪氨酸酶活性的影响(X±S,％)

沉香叶提取物浓度(μg/ml)	140	175	210
				酪氨酸酶活性抑制率(％)	33.9±3.7	45.2±4.8	53.2±6.4

结果：沉香叶提取物对B16细胞酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用，呈明显的剂量效应关系。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.沉香叶提取物用作美白有效成分的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述美白有效成分是指抑制酪氨酸酶活性的有效成分。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述沉香叶提取物为通过提取溶剂进行提取制得的提取物。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述沉香叶提取物采用以下制备方法制得：取沉香叶，干燥后，粉碎成粉，加乙醇水溶液冷浸后加热回流，合并滤液，然后减压回收提取溶剂后既得沉香叶提取物。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述沉香叶提取物制备时，还满足以下条件中的任一项或多项：

(1)所述乙醇水溶液的体积浓度为30-95％；

(2)所述冷浸的温度为10-30℃；

(3)所述加热回流的温度为70-90℃，加热回流的时间为60-120min；

(4)所述乙醇水溶液与沉香叶粉末的用量比为10～20ml乙醇水溶液：1g沉香叶粉末。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述沉香叶提取物直接用作美白有效成分，或经进一步提纯后用作美白有效成分。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述提纯的方法为：将沉香叶提取物用大孔吸附树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇水溶液洗脱，收集流份，蒸干，得到沉香叶不同浓度乙醇洗脱活性部位。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述提纯还满足以下条件中的任一项或两项：

(1)所述大孔吸附树脂为D101树脂；

(2)所述用于洗脱的乙醇水溶液的体积浓度为30％～95％。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述沉香叶提取物包括体积浓度为30％～70％乙醇洗脱活性部位中浓度任选的乙醇洗脱活性部位。

10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，将所述沉香叶提取物用作美白有效成分用于美白化妆品的制备。