CN109394609A - 一种杨梅叶提取物及其制备方法和在化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杨梅叶提取物及其制备方法和在化妆品中的应用。本发明采用乙醇加热浸提法从杨梅叶中获得杨梅叶提取物，包括：取杨梅树的叶，去除腐烂变质的，清洗、干燥、粉碎后，与一定浓度的乙醇水溶液混合，加热至一定温度，持续浸提一定时间后，获得提取液；取提取液，减压回收溶剂，获得杨梅叶粗提物；取杨梅叶粗提物，经大孔树脂纯化后，减压回收溶剂，干燥既得。实验表明，本发明提供的杨梅叶提取物对酪氨酸酶有着良好的抑制作用，可作为植物添加剂用于美白和抗衰老化妆品的开发，且提取工艺简单，生产成本低，易于工业化生产，不仅提高了杨梅叶的利用率，将其“变废为宝”，也扩大了化妆品产品的种类，满足人们对天然化妆品的需求。

Description

一种杨梅叶提取物及其制备方法和在化妆品中的应用

技术领域

本发明属于植物应用以及化妆品领域，具体为一种杨梅叶提取物及其制备方法和在化妆品中的应用。

背景技术

随着生活压力的增大以及环境污染的加剧，人们的皮肤承受了越来越多的压力，皮肤暗沉、色素沉着、提早衰老已成为了很多女性所面临的一种困扰，因此具有美白、抗衰老等功效的化妆品越来越受到人们的追捧。目前市面上大多数的美白、抗衰老原料都是化学合成，如具有增白作用的汞盐和祛斑作用的氢醌，这些化合物虽然有快速达到美白之功效，但对皮肤有毒副作用，长期使用会引起接触性皮炎或引起永久脱色等不良作用。因此，寻找开发高效且对人体无副作用或副作用小的天然皮白、抗衰老活性成分已成为目前化妆品领域的一个趋势。

杨梅(Myrica rubra(Lour.)S.et Zucc)属杨梅科(Myricaceae)杨梅属多年生常绿乔木，是我国特色植物，主要分布在东南沿海的浙江、江苏、福建、广东和江西、安徽、湖南、贵州等省，其中浙江省的栽培面积、产量、品种、品质均为全国之首。目前有关杨梅的研究利用主要以杨梅果实为主，中医证实，杨梅果性味甘酸温和，具有生津解渴、和胃消食、治痢疾、腹痛等功效，杨梅叶作为农业废弃物，其富含黄酮类物质，而黄酮类物质在抗氧化与延缓衰老、美白、抗辐射、防晒、抗炎、抗过敏、抑菌等方面都有较好的功效，是一种极具潜力的化妆品植物原料。

专利CN105919875A公开了一种含有杨梅叶的用于美白化妆品的中药组合物，它是将杨梅叶与其他中药材复配，达到一种美白功效，但是杨梅叶起到功效的主要成分以及具体作用并不清楚。因此本发明系统具体研究了杨梅叶提取物的主要成分，及其抗氧化和美白功效，也能为杨梅叶在化妆品方面的开发利用提供学依据。

发明内容

为了克服现有技术的不足，扩大杨梅叶的应用范围，本发明旨在提供一种杨梅叶提取物及其在化妆品中的应用，本发明的杨梅叶提取物制备工艺简单、成本低、易实现大规模生产，且具有较好的美白、抗氧化等功效，可广泛应用于水、乳、霜等化妆品中。

本发明提供了一种杨梅叶提取物，其总黄酮含量为20～50％，其中杨梅苷的浓度不低于5％。

本发明提供的杨梅叶提取物的制备方法包括以下步骤：

步骤1：取杨梅树的叶，去除腐烂变质的杨梅叶，清洗、干燥、粉碎后，与一定浓度的乙醇水溶液混合，加热至一定温度，持续浸提一定时间后，获得提取液；

步骤2：取提取液，减压回收溶剂，获得杨梅叶粗提物；

步骤3：取杨梅叶粗提物，经大孔树脂纯化后，减压回收溶剂，干燥获得杨梅提取物。

作为优选，本发明提供的杨梅叶提取物的制备方法中，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为30～80％；杨梅叶干燥粉末与所述的乙醇水溶液的质量-体积比为1:10～1:50，所述的加热温度为30～80℃，提取时间为30～120min，提取次数为1～4。

优选的，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为40％，杨梅叶干燥粉末与所述的乙醇水溶液的质量-体积比为1:30，所述的加热温度为65℃，提取时间为75min。

作为优选，本发明提供的杨梅叶提取物的制备方法中，提取次数为2次；

作为优选，本发明提供的杨梅叶提取物的制备方法中，所述的步骤2具体为将获得的提取液在45～60℃旋转蒸发，去除经过步骤1得到的提取液中的乙醇，得到杨梅叶的粗提物。

作为优选，本发明提供的杨梅叶提取物的制备方法中，所述的大孔树脂为中等极性或弱极性大孔树脂，所述的步骤3具体为将步骤2获得的杨梅叶粗提物用水溶解后，将滤液通过大孔吸附树脂吸附，先后用水和低浓度乙醇洗脱到无色后，再依次用40～90％浓度的乙醇梯度洗脱，收集40～90％的乙醇洗脱液。

优选的，乙醇的洗脱浓度为70％，收集70％的乙醇洗脱液。

作为优选，本发明提供的杨梅叶提取物的制备方法中，所述步骤3的减压干燥步骤具体为，将获得的提取液在45～60℃旋转蒸发，去除经过步骤3得到的洗脱液中的乙醇，经真空干燥或低温冷冻干燥后，得到杨梅叶提取物。

优选的，杨梅叶提取物的干燥方法为真空干燥。

本发明还提供了杨梅叶提取物作为抗氧化剂和酪氨酸酶抑制剂在抗衰老和美白化妆品中的应用。

本发明提供的实验数据表明，本发明提供的杨梅叶提取物对酪氨酸酶有着良好的抑制作用，使酪氨酸酶活性降低50％的IC₅₀值小于40μg/mL，显著优于阳性对照品熊果苷；对ABTS、DPPH自由基有着良好的清除率，IC50值分别小于80μg/mL和25μg/mL，优于阳性对照品Trolox。

因此本发明提供的杨梅叶提取物可作为植物添加剂用于美白和抗衰老化妆品的开发，且提取工艺简单，生产成本低，易于工业化生产，不仅提高了杨梅叶的利用率，将其“变废为宝”，也扩大了化妆品产品的种类，满足人们对天然化妆品的需求。

本发明的优点和有益效果如下：

1.本发明以杨梅树的叶为原料，通过乙醇加热浸提法和大孔树脂纯化法获得杨梅叶提取物，建立了群体化学特征整体性的HPLC指纹图谱质量评价方法，以保证杨梅叶提取物的质量稳定性。本发明所述的杨梅叶提取物的制备工艺合理，简便易行，生产成本低，可用于大批量的工业化生产，具有广阔的市场应用前景。

2.本发明制得的杨梅叶提取物对酪氨酸酶有着良好的抑制作用，使酪氨酸酶活性降低50％的IC50值小于40μg/mL，显著优于阳性对照品熊果苷；对ABTS、DPPH自由基有着良好的清除率，IC50值分别小于80μg/mL和25μg/mL，优于阳性对照品Trolox。本发明提供的杨梅叶提取物可用于制备美白抗衰老的化妆品，不仅提高了杨梅叶的综合利用率，也扩大了产品种类，满足人们对天然化妆品的需求。

附图说明

图1杨梅叶提取物的HPLC指纹图谱，其中含量高、分离度好的特征峰共10个，分别以阿拉伯数字1-10表示，以杨梅苷作为对照品，在图中为峰6。

图2杨梅叶提取物对DPPH自由基清除能力的影响，阳性对照物Trolox的浓度为10μg/mL。

图3杨梅叶提取物对ABTS自由基清除能力的影响，阳性对照物Trolox的浓度为60μg/mL。

图4杨梅叶提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的影响，阳性对照物熊果苷的浓度为25μg/mL。

图5杨梅叶提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶抑制率的影响，阳性对照物熊果苷的浓度为25μg/mL。

具体实施方式

本发明下述实施例所指的的杨梅叶提取物中总黄酮的测定方法参照《中国药典》2015版一部附录的山楂叶总黄酮检测的具体方法，以芦丁为对照品，采用NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH法进行检测。

本发明采用的试剂均为普通市售品。

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1：杨梅叶提取物的制备

取新鲜杨梅叶，挑除腐烂变质的，用去离子水清洗干净后，与45℃烘箱中干燥，然后粉碎过三号筛，得到杨梅叶干燥粉末。称取杨梅叶干燥粉末55g，置于2000mL圆底烧瓶中，加入40％的乙醇溶液1.5L，在65℃条件下，加热回流提取75min，冷却至室温后，过滤，收集滤液，得到杨梅叶提取液，所得杨梅叶提取液中黄酮含量为1.64mg/mL，多糖含量为4.64mg/mL。

将杨梅叶提取液在45℃条件下真空浓缩至无醇味，再用去离子水溶解稀释成黄酮含量为14.21mg/mL，过滤，以2mL/min的流速上AB-8大孔吸附树脂，待流出液有颜色时，表明树脂吸附达到饱和，停止上样；吸附1小时后，先用去离子水洗脱至无色，再用70％的乙醇溶液进行洗脱，流速控制为3BV/h，洗脱剂用量为5BV，收集洗脱液。经计算，杨梅叶提取物中黄酮的回收率为82.29％。将洗脱液减压浓缩至粘稠状，再于45℃真空干燥箱中干燥即得杨梅叶提取物，最终得到干燥粉末5.48g，得率有9.96％。所得的杨梅叶提取物中黄酮含量为30.96％。

实施例2：杨梅叶提取物的制备

取新鲜杨梅叶，挑除腐烂变质的，用去离子水清洗干净后，与45℃烘箱中干燥，然后粉碎过三号筛，得到杨梅叶干燥粉末。称取杨梅叶干燥粉末30g，置于2000mL圆底烧瓶中，加入80％的乙醇溶液1.5L，在80℃条件下，加热回流提取30min，冷却至室温后，过滤，收集滤液，得到杨梅叶提取液，所得杨梅叶提取液中黄酮含量为3.05mg/mL，多糖含量为3.84mg/mL。

将杨梅叶提取液在45℃条件下真空浓缩至无醇味，再用去离子水溶解稀释成黄酮含量为15.35mg/mL，过滤，以2mL/min的流速上AB-8大孔吸附树脂，待流出液有颜色时，表明树脂吸附达到饱和，停止上样；吸附1小时后，先用去离子水洗脱至无色，再用90％的乙醇溶液进行洗脱，流速控制为3BV/h，洗脱剂用量为5BV，收集洗脱液。经计算，杨梅叶提取物中黄酮的回收率为88.39％。将洗脱液减压浓缩至粘稠状，再于45℃真空干燥箱中干燥即得杨梅叶提取物，最终得到干燥粉末3.59g，得率有11.96％。所得的杨梅叶提取物中黄酮含量为28.35％。

实施例3：杨梅叶提取物的制备

取新鲜杨梅叶，挑除腐烂变质的，用去离子水清洗干净后，与45℃烘箱中干燥，然后粉碎过三号筛，得到杨梅叶干燥粉末。称取杨梅叶干燥粉末55g，置于1000mL圆底烧瓶中，加入60％的乙醇溶液550mL，在40℃条件下，加热提取120min，冷却至室温后，过滤，收集滤液，滤渣再重复提取3次，合并四次滤液，得到杨梅叶提取液，所得杨梅叶提取液中黄酮含量为1.52mg/mL，多糖含量为4.84mg/mL。

将杨梅叶提取液在45℃条件下真空浓缩至无醇味，再用去离子水溶解稀释成黄酮含量为13.05mg/mL，过滤，以2mL/min的流速上AB-8大孔吸附树脂，待流出液有颜色时，表明树脂吸附达到饱和，停止上样；吸附1小时后，先用去离子水洗脱至无色，再用40％的乙醇溶液进行洗脱，流速控制为3BV/h，洗脱剂用量为5BV，收集洗脱液。经计算，杨梅叶提取物中黄酮的回收率为71.29％。将洗脱液减压浓缩至粘稠状，再于45℃真空干燥箱中干燥即得杨梅叶提取物，最终得到干燥粉末5.02g，得率有9.12％。所得的杨梅叶提取物中黄酮含量为45.32％。

实施例4：杨梅叶提取物的质量检测

(1)指纹图谱

精密称取实施例1中干燥至衡重的提取物粉末32.5mg，用20％乙腈溶解定容至25ml，配成1.3mg/mL的供试品溶液，取上清液，过0.22μm微孔滤膜后上高效液相色谱仪进行检测，其中流动相A为0.05％的磷酸水(超纯水)溶液；流动相B为乙腈，配好后用溶剂过滤器过滤，再超声15min。流动相洗脱程序见表1。色谱条件：色谱柱为Aglient Poroshell 120ECC18(4.6*100mm，2.7μm)，保护柱为proshell EC C18(4.6*5mm，2.7μm)，流速为1mL/min，波长262nm，柱温30℃，进样量20μL。

表1杨梅叶提取物液相检测流动相洗脱程序

色谱图见图1，由图可知，共得到了12个色谱峰，其中含量高、分离度较好的色谱峰有10个，分别标记为1～10。上述色谱峰可用于杨梅提取物的质量。以杨梅苷(在图中峰为6)作为对照品，其含量为6.3％。

(2)感官性状

启开试样后，立即嗅其味；取适量样品置于白色瓷盘或透明塑料瓶中，在自然光照下，观察其色泽、状态，并检查有无异物。结果表明杨梅叶提取物具有植物特有气味，呈红棕色粉末。

(3)基本理化指标

基本理化指标包括干燥粉末的水分、灰分、黄酮含量以及复溶液的折光率、相对密度、以及pH等指标。

其中水分检测参照《中国药典》2015年版第四部(通则0832)，灰分检测参照照《中国药典》2015年版第四部(通则0841)炽灼残渣检查法。将干燥粉末，用50％丁二醇进行溶解，浓度为0.2％，分别用阿贝折光仪、比重瓶以及精密pH检测复溶液的折光率、相对密度、以及pH，结果见表2.

表2杨梅叶提取物基本理化指标

实施例5：DPPH自由基清除实验

DPPH自由基清除能力常用来表示物质的抗氧化能力，其原理是DPPH自由基溶液呈紫色，最大吸收波长为517nm，当有自由基清除剂存在时，由于其与DPPH中电子配对使DPPH液吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成一定关系，因而可用紫外分光光度法进行定量分析。

准确吸取1mL样品溶液，加入5mL DPPH溶液，混匀后在室温下(25℃)避光静置30min，测定517nm处的吸光值，计算清除率，以清除率为y、Trolox溶液浓度(μg/mL)为x制作标准曲线。

y＝(A₀-A₁-A₂)/A₀*100％

y—清除率，％

A₀—1mL蒸馏水+5mL DPPH溶液的吸光度

A₁—1mL样品/Trolox标准液+5mL DPPH溶液的吸光度

A₂—1mL样品/Trolox标准液+乙醇溶液的吸光度(消除不同样品之间颜色的误差)

以Trolox标准工作液为阳性对照，以无水乙醇为空白对照。

本发明实施例1中杨梅叶提取物对DPPH自由基清除能力随浓度的变化如图2所示，由图可知，当杨梅叶提取物浓度为5μg/mL时，其对DPPH自由基的清除率为12.04％，当浓度为25μg/mL，清除率为85.66％，因此，在5～25μg/mL范围内，杨梅叶提取物对DPPH自由基的清除率随着浓度的增加而增加。用Origin作拟合曲线，可得IC50值分别为13.76μg/mL，阳性对照物Trolox的IC₅₀值为14.94μg/mL，由此可见杨梅叶提取物具有较好的抗氧化能力。

实施例6：ABTS自由基清除实验

ABTS自由基清除能力也常用来表示抗氧化能力，其原理是与过硫酸钾反应生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS·+，抗氧化活性物质与该离子反应，单个电子从抗氧化剂分子转移到氧化剂分子上，使反应体系中的蓝色褪去，可在紫外分光光度计下测定734nm处的吸光度变化值从而来评价其清除自由基的能力。

准确吸取0.2mL样品溶液，加入7.8mL ABTS自由基工作液，混匀后在室温下(25℃)避光静置10min，测定734nm处的吸光值，计算清除率，以清除率为y、Trolox溶液浓度(μg/mL)为x制作标准曲线。

y＝(A₀-A₁-A₂)/A₀*100％

y—清除率，％

A₀—0.2mL蒸馏水+7.8mL ABTS自由基工作液的吸光度

A₁—0.2mL样品/Trolox标准液+ABTS自由基工作液的吸光度

A₂—0.2mL样品/Trolox标准液+乙醇溶液的吸光度(消除不同样品之间颜色的误差)

以Trolox标准工作液为阳性对照，以无水乙醇为空白对照。

本发明实施例1杨梅叶提取物的ABTS自由基清除能力随浓度的变化如图3所示，由图可知，当杨梅叶提取物的浓度为20μg/mL时，其对ABTS自由基的清除率为24.75％，当浓度为100μg/mL时，清除率可达99.40％，因此，在20～100μg/mL范围内，杨梅叶提取物对ABTS自由基的清除率随着浓度的增加而增加。用Origin作拟合曲线，可得IC50值为43.04μg/mL，效果优于比阳性对照Trolox，由此可见杨梅叶提取物具有较好的抗氧化能力。

实施例7：杨梅叶提取物对小鼠B16黑素瘤细胞存活率的影响

本发明采用噻唑蓝(MTT)法检测杨梅叶提取物对小鼠B16细胞增殖的影响，目的在于找出一个合适的安全剂量范围。

将本发明实施例1提供的杨梅叶提取物用培养基配制成1000μg/mL的母液冻存备用。取对数生长期的细胞，用培养基调节成细胞密度至3.5×104个/mL，将细胞接种于96孔板中，每孔100μL，37℃，5％CO2饱和湿度环境下孵育24h。向检测组的培养孔中加入不同终浓度的本发明提供的杨梅叶提取物，使每孔中杨梅叶提取物的终浓度分别为：75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL，并设立对照组：单纯培养基组、阳性药对照组(熊果苷，浓度：25μg/mL)，和空白对照组(培养基)，置于孵箱中作用48h。向每孔加20μL浓度为5mg/mL MTT溶液，在孵箱中作用4h后.小心吸除培养孔内的上清，再向每孔加入100μLDMSO，震荡10min，使结晶完全溶解后，放置于酶标仪上，选取检测波长为492nm，测定吸光度值，并计算细胞存活率，细胞存活率的计算公式如下：

测试结果如图4所示，由图可知，本发明提供的杨梅叶提取物在浓度为75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL时使B16黑素瘤细胞的存活率分别为3.01％，23.24％，48.14％，57.51％，72.58％，96.86％。用Graphpad Prism 6.0计算杨梅叶提取物导致细胞存活率下降50％的抑制浓度(IC50)为16.74μg/mL。

其中化妆品中常用美白剂熊果苷在浓度为25μg/mL时，细胞存活率为96.86％％。说明本发明的杨梅叶提取物可以添加到化妆品中使用。

实施例8：杨梅叶提取物对小鼠B16细胞酪氨酸酶活性的影响

酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，通过抑制酪氨酸酶的活性，可以减少黑素的合成。美白功效评价的评价方法有：生物化学法，细胞生物学法和人体试用试验。本发明采用细胞生物学法评价杨梅叶提取物的美白功效。本发明采用多巴氧化法测定小鼠B16细胞酪氨酸酶活性。

将本发明实施例1提供的杨梅叶提取物用培养基配制成1000μg/mL的母液冻存备用。取对数生长期的细胞，用培养基调节成细胞密度至3.5×104个/mL，将细胞接种于96孔板中，每孔100μL，于37℃，5％CO₂饱和湿度环境下孵育24h。向检测组的培养孔中加入不同终浓度的本发明提供的杨梅叶提取物，使每孔中杨梅叶提取物的终浓度分别为：75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL，并设立对照组：单纯培养基组、阳性药对照组(熊果苷，浓度：25μg/mL)，和空白对照组(培养基)，置于孵箱中作用48h。吸去药液，用PBS洗2次后，每孔加1％TritonX-100溶液100μL，迅速放入-80℃冰箱冻存1h，随后移至室温下融化使细胞完全破裂、分解，在37℃预温后每孔加入0.1％L-DOPA 100μL，于37℃水浴2h，后置酶标仪下测A492，测定吸光度值，并计算酪氨酸酶活性，酪氨酸酶活性的计算公式如下：实验重复三次。

测试结果如图5所示，由图可知，本发明提供的杨梅叶提取物浓度在75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL时使B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶的活性分别降低为12.55％，30.55％，71.27％，72.62％，91.74％，用Graphpad Prism 5.0计算杨梅叶提取物导致酪氨酸酶活性下降50％的抑制浓度(IC50)为29.67μg/mL。

而具有较高美白活性的熊果苷在浓度为25μg/mL时，B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性降低为58.45％。说明本发明提供的杨梅叶提取物具有优异的美白作用，可以作为添加到化妆品中。

Claims (10)

1.一种杨梅叶提取物，其特征在于其中，总黄酮含量为20～50％，杨梅苷的浓度不低于5％。

2.根据权利要求1所述的一种杨梅叶提取物，其特征在于制备方法包括如下步骤：

步骤1：取杨梅树的叶，去除腐烂变质的杨梅叶，清洗、干燥、粉碎后，与一定浓度的乙醇水溶液混合，加热至一定温度，持续浸提一定时间后，获得提取液；

步骤2：取提取液，减压回收溶剂，获得杨梅叶粗提物；

步骤3：取杨梅叶粗提物，经大孔树脂纯化后，减压回收溶剂，干燥获得杨梅提取物。

3.根据权利要求2所述的一种杨梅叶提取物，其特征在于乙醇水溶液中乙醇的体积分数为30～80％；杨梅叶干燥粉末与所述的乙醇水溶液的质量-体积比为1:10～1:50，所述的加热温度为30～80℃，提取时间为30～120min，提取次数为1～4。

4.根据权利要求2所述的一种杨梅叶提取物，其特征在于乙醇水溶液中乙醇的体积分数为40％，杨梅叶干燥粉末与所述的乙醇水溶液的质量-体积比为1:30，所述的加热温度为65℃，提取时间为75min；提取次数为2次。

5.根据权利要求3或4所述的一种杨梅叶提取物，其特征在于所述的步骤2具体为将获得的提取液在45～60℃旋转蒸发，去除经过步骤1得到的提取液中的乙醇，得到杨梅叶的粗提物。

6.根据权利要求5所述的一种杨梅叶提取物，其特征在于所述的大孔树脂为中等极性或弱极性大孔树脂，所述的步骤3具体为将步骤2获得的杨梅叶粗提物用水溶解后，将滤液通过大孔吸附树脂吸附，先后用水和低浓度乙醇洗脱到无色后，再依次用40～90％浓度的乙醇梯度洗脱，收集40～90％的乙醇洗脱液。

7.根据权利要求6所述的一种杨梅叶提取物，其特征在于乙醇的洗脱浓度为70％，收集70％的乙醇洗脱液。

8.根据权利要求6或7所述的一种杨梅叶提取物，其特征在于所述步骤3的减压干燥步骤具体为：将获得的提取液在45～60℃旋转蒸发，去除经过步骤3得到的洗脱液中的乙醇，经真空干燥或低温冷冻干燥后，得到杨梅叶提取物。

9.据权利要求8所述的一种杨梅叶提取物在化妆品中的应用，其特征在于：杨梅叶提取物能够作为制作美白、抗衰老化妆品的原料。

10.根据权利要求8所述的一种杨梅叶提取物在化妆品中的应用，其特征在于：所述化妆品剂型包括膏霜、乳液和水剂。