CN108107126A - 一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法 - Google Patents

一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108107126A
CN108107126A CN201711355969.0A CN201711355969A CN108107126A CN 108107126 A CN108107126 A CN 108107126A CN 201711355969 A CN201711355969 A CN 201711355969A CN 108107126 A CN108107126 A CN 108107126A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solvent
peony petal
flavonoids
peony
flavonoid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711355969.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108107126B (zh
Inventor
杨德顺
张秀新
刘永森
薛璟祺
王顺利
张双峰
范俊峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengfa Investment Group Co ltd
Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Chengfa Investment Group Co ltd
Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengfa Investment Group Co ltd, Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Chengfa Investment Group Co ltd
Priority to CN201711355969.0A priority Critical patent/CN108107126B/zh
Publication of CN108107126A publication Critical patent/CN108107126A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108107126B publication Critical patent/CN108107126B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明涉及一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法，所述方法包括如下步骤：类黄酮提取液的制备；色谱条件、质谱条件以及二极管阵列检测器的检测波长的设置；采用超高效液相色谱‑二极管阵列检测器‑三重四极杆飞行时间串联质谱联用技术对类黄酮提取液进行检测，获得检测结果；通过分析检测结果，对类黄酮物质进行结构鉴定，推测类黄酮化合物的结构。本发明方法操作步骤简单，检测快速，精确度及灵敏度高，可检测出含量极微的类黄酮成分，鉴定种类全面，在牡丹花瓣中共鉴定出67种主要的黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇类化合物和5种主要的花青素化合物，填补了牡丹花瓣中类黄酮成分鉴定的空白，对不同品种的牡丹花瓣营养成分的分析具有重要的意义。

Description

一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法
技术领域
本发明涉及一种牡丹花瓣成分的研究方法，尤其涉及一种利用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-三重四极杆飞行时间串联质谱联用技术检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法。
背景技术
类黄酮是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物，即两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接的一系列化合物。依据类黄酮基本分子结构和杂氧环和构象的不同，一般把类黄酮分为六类：黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷酮、黄烷醇和花青素。类黄酮又称生物类黄酮，是人类饮食中含量最丰富的一类多酚化合物，广泛存在于蔬菜、水果、茶叶以及葡萄当中，对癌症的起始、促进、发展三个主要阶段均有显著抑制作用，相关研究表明，类黄酮例如芹菜素对乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤都有很好抑制作用；木犀草素具有抗过敏、抗氧化、抗癌、抗糖尿病等良好的效果；槲皮素具有良好的药用疗效，可以有效地抑制祛痰、止咳和平喘的作用，还能有效的降低血压、血脂、增强抵抗力，尤其对冠心病和高血压患者有辅助治疗的作用。
牡丹是世界著名花卉，不仅具有极高的观赏价值，而且还具有极高的药用价值和食用价值，随着牡丹资源的综合开发和利用，对牡丹花瓣的营养成分和含量进行全面开发和评价，对牡丹产业的发展具有极其重要的理论意义和现实价值。相关研究表明在牡丹花瓣中可能含有各种类黄酮物质，而且可能还含有与其花色相关的花青素。牡丹花瓣中类黄酮物质是综合评价牡丹资源最为重要的一项评价指标，其种类的分析鉴定以及含量测定对于牡丹花资源充分利用是非常必要的。然而，可能是由于牡丹花瓣所含类黄酮成分复杂的缘故，目前对其化学成分的准确与完整鉴定成为研究工作者的一个挑战。
现有技术中，曾采用紫外可见分光光度计(UV)、薄层层析色谱法(TLC)和高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)对不同品种牡丹花瓣的类黄酮成分进行分析，但该方法中类黄酮物质的提取步骤复杂，采用的薄层层析色谱法操作繁琐但准确度并不高；该方法测定出的牡丹花瓣的类黄酮种类有限(参见：孙泽飞.牡丹花类黄酮成分及抗氧化能力分析[D].西北农林科技大学,2015.)。此外，现有技术中曾利用超高效液相色谱-二极管阵列检测器(UPLC-PDA)和超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)对7种牡丹花瓣中类黄酮组分进行了定性和定量分析，但是该方法中类黄酮物质提取步骤复杂，操作时间长，此外，该方法中色谱条件及质谱条件不够优化，检测牡丹花瓣类黄酮成分时，类黄酮用量多但灵敏度不够，仅检测到了牡丹花瓣中15种类黄酮组分，种类不够全面(参见：张宝智,胡永红,韩继刚,等.七个江南牡丹品种花瓣中类黄酮物质分析[J].北方园艺,2013(2):61-65.)。
目前，牡丹花瓣中类黄酮的许多珍贵成分通过现有技术还未能检测出来，能够最全面检测出牡丹花瓣中类黄酮成分的方法还未见报道。
发明内容
本发明的主要目的是获得一种操作方便、精确度高、灵敏度高、检测种类全面的有效检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法，以解决现有技术中存在的如上所述的一个或者多个问题。
本发明提供了一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)类黄酮提取液的制备：将牡丹花瓣在冷冻条件下研磨成牡丹花瓣粉末，用醇溶液混匀所述牡丹花瓣粉末，得到含有牡丹花瓣的混合料，然后将所述混合料依次进行超声处理和离心处理，收集上清液并去除沉淀，再将收集的所述上清液通过滤膜过滤除去固体杂质，得到类黄酮提取液；
(2)超高效液相色谱仪的色谱条件、三重四极杆飞行时间串联质谱仪的质谱条件以及二极管阵列检测器的检测波长的设置；
(3)采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-三重四极杆飞行时间串联质谱联用技术对类黄酮提取液进行检测，获得检测结果；和
(4)通过分析步骤(3)中获得的检测结果，对类黄酮物质进行结构鉴定，推测类黄酮化合物的结构。
优选地，所述方法还包括通过与标准物质和公开数据库对比，进一步确证步骤(4)中推测的类黄酮化合物的结构。
优选地，所述方法进一步还包括采用峰面积归一法计算牡丹花瓣中类黄酮各成分的相对含量。
优选地，所述色谱条件为：流动相：溶剂A为含有0.1％～0.3％体积甲酸的乙腈与水的混合溶液，其中水与乙腈的体积比为(90～95):(10～5)，溶剂B为含有0.1％～0.3％体积甲酸的乙腈溶液；流速为0.2～0.3mL/min；色谱柱温度为30～40℃；进样量为2～4μL；梯度洗脱条件：0～22min，100％溶剂A～72％溶剂A，0％溶剂B～28％溶剂B；22～22.5min，72％溶剂A～60％溶剂A，28％溶剂B～40％溶剂B；22.5～23min，60％溶剂A～0％溶剂A，40％溶剂B～100％溶剂B；23～26.5min，0％溶剂A，100％溶剂B；26.5～27min，0％溶剂A～100％溶剂A，100％溶剂B～0％溶剂B；27～32min，100％溶剂A，0％溶剂B。
优选地，所述质谱条件为：离子源温度为500～600℃，采用负离子扫描方式；喷雾电压为负压(4000～5000)V，去簇电压为负压(70～90)V；雾化气压力为0.3～0.4MPa，辅助雾化气压力为0.3～0.4MPa，气帘气压力为0.2～0.3MPa；采用飞行时间质谱全扫描-信息关联采集-子离子扫描模式，子离子扫描中碰撞电压为负压(30～40)eV，碰撞电压差为15～20eV；和/或三重四极杆飞行时间串联质谱仪的质量误差限定范围设置为小于5ppm。
优选地，所述的二极管阵列检测器检测波长设置为500～540nm或310～350nm。
优选地，所述牡丹花瓣的用量为250～350mg；和/或所述醇溶液为甲醇溶液，所述甲醇溶液的体积浓度为80％～90％，含有1％～3％体积甲酸，用量为900～1000μL
优选地，步骤(1)中所述超声的时间为20～30min；步骤(1)中所述离心的速度为11000～13000r/min；步骤(1)中所述离心的时间为10～20min。
优选地，步骤(1)中所述滤膜为直径0.22μm的有机滤膜。
优选地，所述类黄酮成分包含5种花青素化合物、17种黄酮、43黄酮醇、5黄烷酮和2黄烷醇。
本发明与现有技术相比至少具有如下有益效果：
(1)本发明方法操作步骤简单，检测快速，且利用三重四极杆飞行时间串联质谱的高分辨率特点可同时获得类黄酮化合物的一级分子离子、二级碎片离子的精确质荷比，质量误差小于5ppm，具有精确度高和灵敏度高的特点。
(2)本发明方法对色谱条件、质谱条件和二级管阵列检测器检测条件等进行了系统优化，可检测出含量极微的类黄酮物质，在牡丹花瓣中共鉴定出5种花青素化合物、17种黄酮、43黄酮醇、5黄烷酮和2黄烷醇，填补了牡丹花瓣中类黄酮成分鉴定的空白，对不同品种的牡丹花瓣营养成分的分析具有重要的意义。
(3)本发明方法可实现对牡丹花瓣中类黄酮成分最全面的检测，并且检测到了许多现有技术中未提及的珍贵的成分，具有预料不到的技术效果，但具体导致这种效果的原因还有待进一步探索。
附图说明
图1是牡丹花瓣中天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷的总离子流色谱图。
图中：(a)是牡丹花瓣中天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷的提取离子色谱图；(b)是牡丹花瓣中天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷的一级质谱图；(c)是牡丹花瓣中天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷的结合同位素分布图；(d)是牡丹花瓣中天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷的二级质谱图。
图2是牡丹花瓣中芹菜素-7-新橙皮糖苷的总离子流色谱图。
图中：(a)是牡丹花瓣中芹菜素-7-新橙皮糖苷的提取离子色谱图；(b)是牡丹花瓣中芹菜素-7-新橙皮糖苷的一级质谱图；(c)是芹菜素-7-新橙皮糖苷的结合同位素分布图；(d)是牡丹花瓣中芹菜素-7-新橙皮糖苷的二级质谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)类黄酮提取液的制备：将牡丹花瓣在冷冻条件下研磨成牡丹花瓣粉末，用醇溶液混匀所述牡丹花瓣粉末，得到含有牡丹花瓣的混合料，然后将所述混合料依次进行超声处理和离心处理，收集上清液并去除沉淀，再将收集的所述上清液通过滤膜过滤除去固体杂质，得到类黄酮提取液；
(2)超高效液相色谱仪的色谱条件、三重四极杆飞行时间串联质谱仪的质谱条件以及二极管阵列检测器的检测波长的设置；
(3)采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-三重四极杆飞行时间串联质谱联用技术对类黄酮提取液进行检测，获得检测结果；和
(4)通过分析步骤(3)中获得的检测结果，对类黄酮物质进行结构鉴定，推测类黄酮化合物的结构。
根据一些优选的实施方式，所述方法还包括通过与标准物质和公开数据库对比，进一步确证步骤(4)中推测的类黄酮化合物的结构。
根据一些优选的实施方式，所述方法进一步还包括采用峰面积归一法计算牡丹花瓣中类黄酮各成分的相对含量。
根据一些优选的实施方式，所述色谱条件为：流动相：溶剂A为含有0.1％～0.3％体积(例如0.1％、0.2％或0.3％体积)甲酸的乙腈与水的混合溶液，其中水与乙腈的体积比为(90～95):(10～5)(例如90:10、92:8或95:5)，溶剂B为含有0.1％～0.3％体积(例如0.1％、0.2％或0.3％体积)甲酸的乙腈溶液；流速为0.2～0.3mL/min(例如0.2、0.25、0.3mL/min)；色谱柱温度为30～40℃(例如30℃、35℃或40℃)；进样量为2～4μL(例如2、3或4μL)；梯度洗脱条件：0～22min，100％溶剂A～72％溶剂A，0％溶剂B～28％溶剂B；22～22.5min，72％溶剂A～60％溶剂A，28％溶剂B～40％溶剂B；22.5～23min，60％溶剂A～0％溶剂A，40％溶剂B～100％溶剂B；23～26.5min，0％溶剂A，100％溶剂B；26.5～27min，0％溶剂A～100％溶剂A，100％溶剂B～0％溶剂B；27～32min，100％溶剂A，0％溶剂B。
根据一些优选的实施方式，所述质谱条件为：离子源温度为500～600℃(例如500℃、550℃或600℃)，采用负离子扫描方式；喷雾电压为负压(4000～5000)V(例如负压5000V、负压4500V或负压4000V)，去簇电压为负压(70～90)V(例如负压90V、负压80V或负压70V)；雾化气压力为0.3～0.4MPa(例如0.3、0.34或0.4MPa)，辅助雾化气压力为0.3～0.4MPa(例如0.3、0.34或0.4MPa)，气帘气压力为0.2～0.3MPa(例如0.2、0.24或0.3MPa)；采用飞行时间质谱全扫描-信息关联采集-子离子扫描模式，子离子扫描中碰撞电压为负压(30～40)eV(例如负压40eV、负压35eV或负压30ev)，碰撞电压差为15～20eV(例如15eV、18eV或20eV)；和/或三重四极杆飞行时间串联质谱仪的质量误差限定范围设置为小于5ppm。
根据一些优选的实施方式，所述的二极管阵列检测器检测波长设置为500～540nm或310～350nm。牡丹花瓣的花青素的检测波长为500～540nm，牡丹花瓣中黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇的检测波长为310～350nm。
根据一些优选的实施方式，所述牡丹花瓣的用量为250～350mg(例如250、300或350mg)；和/或所述醇溶液为甲醇溶液，所述甲醇溶液的体积浓度为80％～90％(例如80％、85％或90％)，含有1％～3％(例如1％、2％或3％)体积甲酸，用量为900～1000μL(例如900、950或1000μL)。
根据一些优选的实施方式，步骤(1)中所述超声的时间为20～30min(例如10、15或20min)；步骤(1)中所述离心的速度为11000～13000r/min(例如11000、12000或13000r/min)；步骤(1)中所述离心的时间为10～20min(例如10、15或20min)；和/或步骤(1)中所述滤膜为直径0.22μm的有机滤膜。
本发明所述类黄酮成分包含5种花青素化合物、17种黄酮、43黄酮醇、5黄烷酮和2黄烷醇。
本发明中涉及的实验材料、仪器、试剂和标准物质为：
(a)实验材料：牡丹花瓣取材于中国农业科学院蔬菜花卉研究所资源圃处于半盛开期、生长发育良好的牡丹植株，同时选取同一品种不同植株的花瓣，用锡箔纸包裹于液氮中，在-80℃下保存。本发明检测了15份牡丹品种的花瓣中类黄酮成分及相对含量。
15份牡丹花瓣分别为：白色系(1号‘冰罩蓝玉’、2号‘玉板白’、3号‘琉璃贯珠’、4号‘清香白玉翠’、5号‘水晶白’、6号‘凤丹’)、粉红色系(7号‘粉中冠’、8号‘杏花春雨’、9号‘朝阳红’、10号‘宫样装’、11号‘藏娇’)、深红色系(12号‘粉锦袍’、13号‘乌龙捧盛’、14号‘藏枝红’、15号‘二乔’)。
(b)仪器：LC-30A超高效液相色谱仪，购自日本岛津公司；AB SCIEX 6600三重四极杆飞行时间串联质谱仪(Triple-TOF-MS/MS)，购自美国应用生物系统公司；Triple-TOF-MS/MS配有Analyst TF 1.7.1数据采集软件和PeakView 2.1、MasterView 1.0、MultiQuant3.0和MakerView 1.2.1等数据处理软件。其中，Analyst TF 1.7.1软件用于原始数据采集，PeakView 2.1和MasterView 1.0软件用于类黄酮物质定性分析，MultiQuant 3.0软件用于对类黄酮含量进行相对定量分析处理；MakerView 1.2.1软件用于对牡丹样品进行统计分析。
(c)试剂：乙腈(高效液相色谱级，美国JT Baker公司)；甲酸(高效液相色谱级，美国Fluka公司)；超高效液相色谱分析用水由Milli-Q纯净水系统制备(美国Millipore公司)。
(d)标准物质：芦丁、槲皮素、苹果酸、山奈酚、锦葵花素半乳糖苷、锦葵花素葡萄糖苷、芍药素葡萄糖苷、飞燕草素、天竺葵-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷和矢车菊素等标准物质购自美国Sigma公司；6”-O-乙酰基紫云英苷、山奈酚-3-鼠李糖苷、大波斯菊苷、山奈酚-3-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-葡萄糖苷酸、山奈酚-3-巢菜糖苷、山奈酚-3-芸香糖苷、山奈酚-3-半乳糖、山奈酚-3-葡萄糖、槲皮素-3-葡萄糖苷酸、多花蔷薇苷B、野蔷薇苷A、杨属糖苷、樱桃糖苷、槲皮素-3-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3’-葡萄糖苷、槲皮素-4’-葡萄糖苷、6-葡萄糖基槲皮素和红景天糖苷等标准物质购自AnalytiConDiscovery公司。
实施例1
将15份新鲜牡丹花瓣在液氮条件下研磨成牡丹花瓣粉末后称量300mg，加入含有1％体积甲酸，体积浓度为80％的甲醇溶液900μL，提取牡丹花瓣中的类黄酮成分，涡旋1min混匀，超声提取30min，以13000r/min的离心速度，高速离心10min，收集上层清液并去掉沉淀，再将上层清液经过0.22μm有机滤膜除去固体杂质，得到类黄酮提取液。将获得的类黄酮提取液进行超高效液相色谱-二极管阵列检测器-三重四极杆飞行时间串联质谱联用技术分析。其中，色谱条件、质谱条件以及二极管阵列检测器检测波长范围的设置如下：
色谱条件为：流动相：溶剂A为含有0.1％体积甲酸的乙腈与水的混合溶液，水与乙腈的体积比为95:5，溶剂B为含有0.1％体积甲酸的乙腈溶液；流速为0.3mL/min；色谱柱温度为40℃；进样量为3μL；梯度洗脱条件：0～22min，100％溶剂A～72％溶剂A，0％溶剂B～28％溶剂B；22～22.5min，72％溶剂A～60％溶剂A，28％溶剂B～40％溶剂B；22.5～23min，60％溶剂A～0％溶剂A，40％溶剂B～100％溶剂B；23～26.5min，0％溶剂A，100％溶剂B；26.5～27min，0％溶剂A～100％溶剂A，100％溶剂B～0％溶剂B；27～32min，100％溶剂A，0％溶剂B，也即液相色谱梯度洗脱条件按表1中的程序设定。
质谱条件为：离子源温度为550℃；采用负离子扫描方式；喷雾电压为负压4500V，去簇电压为负压80V，雾化气压力为0.34MPa，辅助雾化气压力为0.34MPa，气帘气压力为0.24MPa；子离子扫描中碰撞电压为负压35eV，碰撞电压差为15eV，三重四极杆飞行时间串联质谱仪的质量误差限定范围设置为小于5ppm。
二极管阵列检测器检测波长：花青素的检测波长范围为500～540nm，黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇的检测波长范围为310～350nm。
一、牡丹花瓣中类黄酮成分的结构鉴定：
超高效液相色谱-二极管阵列检测器-三重四极杆飞行时间串联质谱联用技术分析的具体过程以牡丹花瓣中天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷和芹菜素-7-新橙皮糖苷为例。
天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷结构分析过程：
花青素在500～540nm具有明显的紫外可见特征吸收峰，与其它类黄酮化合物具有显著差异，因此可通过二极管阵列检测器判断是否为花青素类物质。对牡丹花瓣样品进行超高效液相色谱-二极管阵列检测器联用技术分析(UPLC-PDA)，得到保留时间为6.19、2.91、4.9、7.63、6.64min的色谱峰，对不同保留时间的色谱峰进行紫外吸收光谱分析，发现在505nm～515nm波长处均有特征性吸收峰，为典型的花青素吸收光谱图，判断这些色谱峰为花青素类物质。
在上述UPLC-PDA光谱信息的基础上，对牡丹花瓣中5种花青素进行质谱分析和结构鉴定。以牡丹花瓣样品UPLC-PDA色谱图中的保留时间为4.9min色谱峰进行相应的质谱分析，其提取离子色谱图和一级质谱图分别为图1中(a)和(b)，可见其分子离子峰[M]+的质荷比m/z为595.1662，以及结合其同位素分布为图1中(c)，推测其分子式为C27H31O15 +。该花青素的二级质谱图为图1中(d)，可见其碎片离子的质荷比m/z为433.1140，来自丢失一分子葡萄糖基团；进一步丢失另一分子的葡萄糖基团，产生主要的碎片离子质荷比m/z为271.0613，为天竺葵素阳离子。鉴定该花青素为天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷。通过天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷标准物质在相同条件下的超高效液相色谱-二极管阵列检测器-三重四极杆飞行时间串联质谱联用技术分析，确证该花青素为天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷。
芹菜素-7-新橙皮糖苷结构分析过程：
黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇的PDA光谱特征为在310nm～350nm处具有最大吸收峰，质谱特征为在负离子模式下具有较高的响应，并在碰撞诱导解离作用下可以发生糖苷键的断裂，生成特征性苷元碎片离子。以牡丹花瓣中芹菜素-7-新橙皮糖苷为例，负离子模式下的提取离子色谱图和一级质谱图分别为图2中(a)和(b)，可见其准分子离子峰[M-H]-的质荷比m/z为577.1574，结合同位素分布为图2中(c)，推测其分子式为C27H30O14；该物质在负离子模式下的二级质谱图为图2中(d)，可见主要碎片离子的质荷比m/z为269.0458，为芹菜素苷元离子；此外还可见碎片离子质荷比m/z为431.0991和m/z为413.0880，分别来自丢失一分子鼠李糖脱水基团和一分子鼠李糖基团，质荷比m/z为431.0991的碎片离子进一步失去一分子葡萄糖产生质荷比m/z为269.0458的苷元碎片离子，表明该化合物为芹菜素苷元结合一分子葡萄糖和一分子鼠李糖的双糖苷化合物，综合各碎片离子的强度分布和文献报道，该化合物为芹菜素-7-鼠李糖-葡萄糖苷，但尚且无法判断双糖的连接位置和方式。通过芹菜素-7-新橙皮糖苷标准物质在相同条件下的超高效液相色谱-二极管阵列检测器-三重四极杆飞行时间串联质谱联用技术对比分析，表明C7位双糖为2-α-L-鼠李糖基-D-葡萄糖，确证该化合物为芹菜素-7-新橙皮糖苷。
在牡丹花瓣中共鉴定出5种主要的花青素和67种主要的黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇类化合物，具体的化合物鉴定结果如表2所示。
二、牡丹花瓣中类黄酮成分的相对含量分析：
由于花青素、黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇类化合物的分子结构具有相似性，因此它们的质谱响应具有相似性和可比性。利用这些化合物在一级质谱中提取离子色谱峰的峰面积，采用峰面积归一化的方法，比较各类黄酮化合物的相对含量。
牡丹花瓣中花青素的相对含量分析
将15份牡丹花瓣样品中5种主要花青素的相对含量进行加和，初步分析牡丹花瓣中总花青素的相对含量，发现在3种不同花色的牡丹花瓣中，深红色牡丹花瓣中含有花青素含量最高，远远高于其它花色的花瓣；粉红色牡丹花瓣中总花青素的含量次之，而白色牡丹花花瓣中仅含有少量的花青素。不同花色牡丹花瓣样品中5种花青素的相对含量如表3所示。对15份不同花色牡丹花瓣样品中5种花青素的相对含量进行统计分析，发现矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、芍药素-3,5-双葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷的总相对含量在深红色系12-15号样品中含量较高；天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷在8号、9号、11号样品中含量较高。
牡丹花瓣中黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇的相对含量分析
将15份牡丹花瓣样品中不同种类的黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇的相对含量分别加和得到黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇的总含量并进行统计分析，发现牡丹花瓣中黄酮类物质均含有较高含量，此外粉红色和深红色牡丹花瓣样品中黄酮醇类化合物的含量也较高；黄烷醇的含量在所有牡丹花瓣样品中的含量都很低。
进一步对类黄酮化合物中每一种苷元及其糖苷的相对含量进行统计分析，不同花色牡丹花瓣样品中主要含有黄酮、黄酮醇和黄烷酮。不同花色牡丹花瓣样品中主要黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇的相对含量情况如表4所示。金圣草黄素类物质在深红色牡丹花瓣样品中含量明显高于其他样品，而槲皮素类物质和异鼠李素类物质在13-15号样品中的含量明显高于其他样品；山奈酚类物质在7-9号样品中的含量最高，在10-15号样品中也含有相对较高的含量。可见不同的苷元及其衍生物在牡丹花瓣样品中的相对含量具有明显的样品特异性。
进一步对每一种已鉴定的类黄酮物质进行相对含量的分析，牡丹花瓣中主要含有的类黄酮物质相对含量情况如表5所示，发现深红色的牡丹花瓣中主要类黄酮化合物的种类更为多样性。
实施例2
实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于：
色谱条件为：流动相：溶剂A为含有0.2％体积甲酸的乙腈与水的混合溶液，水与乙腈的体积比为90:10，溶剂B为含有0.2％体积甲酸的乙腈溶液；流速为0.2mL/min；色谱柱温度为30℃；进样量为4μL；梯度洗脱条件：0～22min，100％溶剂A～72％溶剂A，0％溶剂B～28％溶剂B；22～22.5min，72％溶剂A～60％溶剂A，28％溶剂B～40％溶剂B；22.5～23min，60％溶剂A～0％溶剂A，40％溶剂B～100％溶剂B；23～26.5min，0％溶剂A，100％溶剂B；26.5～27min，0％溶剂A～100％溶剂A，100％溶剂B～0％溶剂B；27～32min，100％溶剂A，0％溶剂B，也即液相色谱梯度洗脱条件按表1中的程序设定。
在牡丹花瓣中共鉴定出5种主要的花青素和47种主要类黄酮类化合物，具体的化合物鉴定结果如表6所示。
对比例1
对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于：梯度洗脱条件：0-30min，100％溶剂A～72％溶剂A，0％溶剂B～28％溶剂B；30-30.5min，72％溶剂A～60％溶剂A，28％溶剂B～40％溶剂B；30.5-31min，60％溶剂A～0％溶剂A，40％溶剂B～100％溶剂B；31～33.5min，0％溶剂A，100％溶剂B；33.5～34min，0％溶剂A～100％溶剂A，100％溶剂B～0％溶剂B；34～40min，100％溶剂A，0％溶剂B。
在牡丹花瓣中共鉴定出5种主要的花青素和28种主要类黄酮类化合物，具体的化合物鉴定结果如表7所示。
对比例2
将15份新鲜牡丹花瓣样品进行UPLC-PDA-Triple-TOF-MS分析，采用与实施例1中基本相同的方式进行，不同之处在于：色谱条件和质谱条件的设置。
色谱条件：流动相：溶剂A为含有0.5％体积甲酸的水溶液，溶剂B为含有0.5％体积甲酸的乙腈溶液；流速为0.4mL/min；色谱柱温度为45℃；进样量为5μL；梯度洗脱条件：0～2.5min，95％溶剂A～90％溶剂A，5％溶剂B～10％溶剂B；2.5～12min，90％溶剂A～75％溶剂A，10％溶剂B～25％溶剂B；12～14min，75％溶剂A～60％溶剂A，25％溶剂B～40％溶剂B；14～15.5min，60％溶剂A～15％溶剂A，40％溶剂B～85％溶剂B；15.5～17min，15％溶剂A～0％溶剂A，85％溶剂B～100％溶剂B；17～20min，0％溶剂A～95％溶剂A，100％溶剂B～5％溶剂B。
质谱条件为：离子源温度为100℃；采用正离子扫描方式；喷雾电压为喷雾电压为正压5500V，去簇电压为正压80V，雾化气压力为0.34MPa，辅助雾化气压力为0.34MPa，气帘气压力为0.24MPa；碰撞电压为正压35eV，碰撞电压差为25eV。
二极阵列管检测检测器的检测波长：花青素为520nm，黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷醇为350nm。
在牡丹花瓣中共鉴定出15种类黄酮成分，其中包括4种主要的花青素和11种主要的黄酮和黄酮醇类化合物，具体的化合物鉴定结果如表8所示。
表1：液相色谱梯度洗脱程序。
时间(min) 溶剂A(％) 溶剂B(％)
0 100 0
22 72 28
22.5 60 40
23 0 100
26.5 0 100
27 100 0
32 100 0
表2：实施例1的牡丹花瓣中类黄酮成分鉴定结果。
a表示通过数据库和标准物质确证的类黄酮物质。
表6：实施例2的牡丹花瓣中类黄酮物质鉴定结果。
表7：对比例1的牡丹花瓣中类黄酮物质鉴定结果。
表8：对比例2的牡丹花瓣中类黄酮物质鉴定结果。
特别说明的是，表2、表6-8中a表示通过数据库和标准物质确证的类黄酮物质。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)类黄酮提取液的制备：将牡丹花瓣在冷冻条件下研磨成牡丹花瓣粉末，用醇溶液混匀所述牡丹花瓣粉末，得到含有牡丹花瓣的混合料，然后将所述混合料依次进行超声处理和离心处理，收集上清液并去除沉淀，再将收集的所述上清液通过滤膜过滤除去固体杂质，得到类黄酮提取液；
(2)超高效液相色谱仪的色谱条件、三重四极杆飞行时间串联质谱仪的质谱条件以及二极管阵列检测器的检测波长的设置；
(3)采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-三重四极杆飞行时间串联质谱联用技术对类黄酮提取液进行检测，获得检测结果；和
(4)通过分析步骤(3)中获得的检测结果，对类黄酮物质进行结构鉴定，推测类黄酮化合物的结构。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过与标准物质和公开数据库对比，进一步确证步骤(4)中推测的类黄酮化合物的结构。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法进一步还包括采用峰面积归一法计算牡丹花瓣中类黄酮各成分的相对含量。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱条件为：流动相：溶剂A为含有0.1％～0.3％体积甲酸的乙腈与水的混合溶液，其中水与乙腈的体积比为(90～95):(10～5)，溶剂B为含有0.1％～0.3％体积甲酸的乙腈溶液；流速为0.2～0.3mL/min；色谱柱温度为30～40℃；进样量为2～4μL；梯度洗脱条件：0～22min，100％溶剂A～72％溶剂A，0％溶剂B～28％溶剂B；22～22.5min，72％溶剂A～60％溶剂A，28％溶剂B～40％溶剂B；22.5～23min，60％溶剂A～0％溶剂A，40％溶剂B～100％溶剂B；23～26.5min，0％溶剂A，100％溶剂B；26.5～27min，0％溶剂A～100％溶剂A，100％溶剂B～0％溶剂B；27～32min，100％溶剂A，0％溶剂B。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱条件为：离子源温度为500～600℃，采用负离子扫描方式；喷雾电压为负压(4000～5000)V，去簇电压为负压(70～90)V；雾化气压力为0.3～0.4MPa，辅助雾化气压力为0.3～0.4MPa，气帘气压力为0.2～0.3MPa；采用飞行时间质谱全扫描-信息关联采集-子离子扫描模式，子离子扫描中碰撞电压为负压(30～40)eV，碰撞电压差为15～20eV；和/或
三重四极杆飞行时间串联质谱仪的质量误差限定范围设置为小于5ppm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二极管阵列检测器检测波长设置为500～540nm或310～350nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述牡丹花瓣的用量为250～350mg；和/或
所述醇溶液为甲醇溶液，所述甲醇溶液的体积浓度为80％～90％，含有1％～3％体积甲酸，用量为900～1000μL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述超声的时间为20～30min；
步骤(1)中所述离心的速度为11000～13000r/min；
步骤(1)中所述离心的时间为10～20min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述滤膜为直径0.22μm的有机滤膜。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述类黄酮成分包含5种花青素化合物、17种黄酮、43黄酮醇、5黄烷酮和2黄烷醇。
CN201711355969.0A 2017-12-16 2017-12-16 一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法 Expired - Fee Related CN108107126B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711355969.0A CN108107126B (zh) 2017-12-16 2017-12-16 一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711355969.0A CN108107126B (zh) 2017-12-16 2017-12-16 一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108107126A true CN108107126A (zh) 2018-06-01
CN108107126B CN108107126B (zh) 2020-12-08

Family

ID=62216491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711355969.0A Expired - Fee Related CN108107126B (zh) 2017-12-16 2017-12-16 一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108107126B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110133141A (zh) * 2019-05-24 2019-08-16 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种鉴定山茶花色芽变品种的方法
CN111999411A (zh) * 2020-09-01 2020-11-27 山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 果蔬中矢车菊素及3种花色苷的高效液相色谱检测方法
CN112461949A (zh) * 2020-11-03 2021-03-09 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） 一种锯叶棕果实中黄酮类物质的分析方法
CN112557486A (zh) * 2020-11-25 2021-03-26 杭州市农业科学研究院 一种花青素种类分析鉴定方法及定量检测方法
CN113484432A (zh) * 2021-07-01 2021-10-08 华中农业大学 一种石竹属花卉中花色苷的高效液相色谱检测方法
CN115184502A (zh) * 2022-07-20 2022-10-14 北京农学院 一种快速分离鉴定苹果属植物叶片中类黄酮物质的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102716208A (zh) * 2012-07-05 2012-10-10 东北林业大学 一种牡丹种皮总黄酮提取物的制备方法
CN103272008A (zh) * 2013-06-11 2013-09-04 洛阳建洛生物科技有限公司 一种牡丹花黄酮的协同提取工艺
CN104000892A (zh) * 2014-06-16 2014-08-27 河南科技大学 一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法
CN106950307A (zh) * 2017-03-29 2017-07-14 中国科学院上海药物研究所 一种血必净注射液中五类化合物的检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102716208A (zh) * 2012-07-05 2012-10-10 东北林业大学 一种牡丹种皮总黄酮提取物的制备方法
CN103272008A (zh) * 2013-06-11 2013-09-04 洛阳建洛生物科技有限公司 一种牡丹花黄酮的协同提取工艺
CN104000892A (zh) * 2014-06-16 2014-08-27 河南科技大学 一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法
CN106950307A (zh) * 2017-03-29 2017-07-14 中国科学院上海药物研究所 一种血必净注射液中五类化合物的检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINHUA LI 等: "Identification of Chemical Composition of Leaves and Flowers from Paeonia rockii by UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS", 《MOLECULES》 *
张宝智 等: "七个江南牡丹品种花瓣中类黄酮物质分析", 《北方园艺》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110133141A (zh) * 2019-05-24 2019-08-16 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种鉴定山茶花色芽变品种的方法
CN110133141B (zh) * 2019-05-24 2022-05-27 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种鉴定山茶花色芽变品种的方法
CN111999411A (zh) * 2020-09-01 2020-11-27 山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 果蔬中矢车菊素及3种花色苷的高效液相色谱检测方法
CN112461949A (zh) * 2020-11-03 2021-03-09 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） 一种锯叶棕果实中黄酮类物质的分析方法
CN112557486A (zh) * 2020-11-25 2021-03-26 杭州市农业科学研究院 一种花青素种类分析鉴定方法及定量检测方法
CN113484432A (zh) * 2021-07-01 2021-10-08 华中农业大学 一种石竹属花卉中花色苷的高效液相色谱检测方法
CN115184502A (zh) * 2022-07-20 2022-10-14 北京农学院 一种快速分离鉴定苹果属植物叶片中类黄酮物质的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108107126B (zh) 2020-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108107126A (zh) 一种检测牡丹花瓣中类黄酮成分的方法
CN108088926A (zh) 一种检测牡丹叶片中类黄酮成分的方法
Figueiredo-González et al. Pattern recognition of three Vitis vinifera L. red grapes varieties based on anthocyanin and flavonol profiles, with correlations between their biosynthesis pathways
Natić et al. Analysis and characterisation of phytochemicals in mulberry (Morus alba L.) fruits grown in Vojvodina, North Serbia
De Rosso et al. Identification of new flavonols in hybrid grapes by combined liquid chromatography–mass spectrometry approaches
Wang et al. Variation of anthocyanins and flavonols in Vaccinium uliginosum berry in Lesser Khingan Mountains and its antioxidant activity
Kucharska et al. Iridoids and anthocyanins in cornelian cherry (Cornus mas L.) cultivars
Castillo-Muñoz et al. Flavonol profiles of Vitis vinifera white grape cultivars
Fuleki The anthocyanins of strawberry, rhubarb, radish and onion
Hilbert et al. Flavonol profiles in berries of wild Vitis accessions using liquid chromatography coupled to mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectrometry
Mohy-ud-Din et al. Chemotaxonomic value of alkaloids in Solanum nigrum complex
Feng et al. Rapid determination of flavonoids in plumules of sacred lotus cultivars and assessment of their antioxidant activities
CN111337586B (zh) 一种基于代谢组筛选的标记类黄酮评价金银花特性的方法
Patonay et al. Polyphenols in northern Hungarian Mentha longifolia (L.) L. treatedwith ultrasonic extraction for potential oenological uses
Budić-Leto et al. Anthocyanin composition of the red wine Babić affected by maceration treatment
Godshall et al. The effect of sugarcane extracts on the growth of the pathogenic fungus, Colletotrichum falcatum
Chidewe et al. Structural Analysis and Antimicrobial Activity of Chromatographically Separated Fractions of Leaves of Sesamum angustifolium (Oliv.) Engl.
Acharya et al. Pharmacognostic standardization based on physicochemical and molecular parameters of a medicinal mushroom Schizophyllum commune
Acharya et al. Pharmacognostic standardization of a well known edible mushroom Volvariella volvacea
MARIA et al. Anthocyanins and phenolic compounds in five ripening stages of Byrsonima ligustrifolia after extraction optimization
Whalen Foliar flavonoids of Solanum section Androceras: a systematic survey
Gevrenova Determination of natural colorants in plant extracts by high performance liquid chromatography
CN112147249B (zh) 一种杨梅酒中31种有效成分的UPC2-PDA-Q-Tof/MS检测方法
Deeva et al. Anthocyanin content in the flowers of common lilac varieties (Syringa vulgaris L.)
Ouhammou et al. The Impact of Drying Method on Bioactive Compounds and Microstructure of Jujube Zizyphus Lotus Leaves

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20201208

Termination date: 20211216

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee