CN115558012B - 一种薯蓣皂苷元-丹参素衍生物及其自组装纳米颗粒和制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然药物领域，公开了一种薯蓣皂苷元‑丹参素衍生物及其自组装纳米颗粒和制备方法及用途。本发明合成的薯蓣皂苷元‑丹参素衍生物具有纳米自组装特性，对三阴性乳腺癌细胞系具有明显抑制作用，而对正常细胞几乎无毒。体内实验证明，皮下移植MDA‑MB‑231荷瘤小鼠实验表明，该化合物可以显著抑制三阴性乳腺癌的生长，且未发现明显毒副作用。同时，具有辅助改善睡眠功能。

Description

一种薯蓣皂苷元-丹参素衍生物及其自组装纳米颗粒和制备 方法及用途
技术领域
本发明属于天然药物领域，特别涉及一种薯蓣皂苷元-丹参素衍生物及其自组装纳米颗粒和制备方法及用途。
背景技术
乳腺癌是世界上最常见的女性恶性肿瘤之一，已成为我国人口恶性肿瘤死亡原因的第1位；乳腺癌的疾病分型多种多样，其中三阴性乳腺癌因预后极差被称为“乳腺癌之王”。整体乳腺癌的生存情况较其他癌症要好，但三阴性乳腺癌(TNBC)的5年生存率非常差，不到15％。目前，临床仍无有效的靶向性治疗方案，化疗仍是三阴性乳腺癌的标准治疗方法，该方法对患者的机体正常细胞也存在巨大破坏，且肺癌易对化疗药物产生耐药性，且局部复发率和全身转移率高，疾病预后差，因此，选择性抑制TNBC肿瘤细胞增殖及杀灭其恶性生长，有针对性的处理TNBC仍然是TNBC靶向治疗的新希望。同时，辅助减少放化疗带来的毒副作用(比如疼痛和睡眠)，对患者生存质量具有非常重要的意义。
薯蓣皂苷元(Diosgenin，DG)，又称为皂素，一种重要的天然甾体皂苷元，属螺甾烷醇糖苷元，结构式为C27H42O3，相对分子质量为414.62。获取的来源广泛，广泛存在于豆科和薯蓣科植物中；主要从葫芦巴中获得，是合成甾体激素类药物的重要原料，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种显著的药理作用，对多种肿瘤细胞，包括乳腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、成骨肉瘤细胞等均有细胞毒性，可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、阻断细胞周期和抗肿瘤转移等方式发挥抗肿瘤作用。同时，研究证明DG还可以通过活性基团脂肪链OH成酯反应为药物前体，适于作为抗癌药物单元，通过偶联其他性质的分子构建肿瘤靶向纳米药物系统。
丹参素(Danshensu，Salvianic acid A，DSS)是中药材丹参中水溶性药效成分之一，对心肌具有较好保护作用，生物安全性好(小鼠LD50>500mg/kg)，分子式为C9H10O5，纯品为白色长针状结晶。DSS具有苯基乳酸的结构，含有两个酚羟基和一个α-醇羟基。DSS的邻二酚羟基极易被氧化，其羧酸基是一个强极性基团，使其不容易透过生物膜，生物利用度低。研究证明，将DSS的OH酯化，且在DSS的羧基部位引入体积较大的基团可以显著提高DSS衍生物的活性(J Cell Biochem.2016；117(1):94-105.)。虽然之前也有将DSS修饰用于心血管等疾病的治疗专利(CN102212008 B，CN103232350 A)，但尚未发现将其与DG做成前药和发现其纳米组装的特性及选择性偏向抗三阴性乳腺癌的研究。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种薯蓣皂苷元-丹参素衍生物(DG-DSS)。
本发明的再一目的在于提供一种上述薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的制备方法。
发明的另一目的在于提供一种上述薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的自组装纳米颗粒。
本发明的又一目的在于提供一种上述薯蓣皂苷元-丹参素衍生物或其自组装纳米颗粒在制备抗三阴性乳腺癌药物中的用途。
本发明的再一目的在于提供一种上述薯蓣皂苷元-丹参素衍生物或其自组装纳米颗粒在制备改善睡眠药物或保健品中的用途。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种薯蓣皂苷元-丹参素衍生物，所述薯蓣皂苷元-丹参素衍生物具有如下结构式：
上述薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的制备方法，包括以下操作步骤：将丹参素钠与醋酸酐进行反应，得到丹参素的邻二酚羟基和α-醇羟基乙酰化产物，然后在无水二氯甲烷溶剂中用草酰氯使羧基转化，得到酰氯丹参素；在无水二氯甲烷和室温条件下，三乙胺作缚酸剂，与薯蓣皂苷元反应，得到目标产物薯蓣皂苷元-丹参素衍生物。
上述薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的制备方法，具体包括以下操作步骤：
(1)室温下，将丹参素钠10g与醋酸酐搅拌均匀，醋酸酐的用量为丹参素体积的5倍，再滴加1-2mL的高氯酸，TLC监测反应进程，反应完成后将反应产物加入碎冰中直至融化，再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取有机层；饱和氢氧化钠水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，浓缩液经过硅胶柱分离纯化，得到如下结构式的中间产物1；
(2)室温下，取0.2～0.5mmol中间产物1，加入5～10mL无水二氯甲烷搅拌均匀，加入1-2滴DMF作为催化剂，再加入4mmol草酰氯，用带干燥器的塞子封闭进行反应6～12小时，减压浓缩，除去反应溶剂以及多余的草酰氯，得到的浓缩液，得到中间产物2，即为酰氯丹参素；
(3)立即将酰氯丹参素用20mL二氯甲烷溶解搅拌均匀，加入1 -2mL无水三乙胺作为去酸剂，然后加入0.6mmol薯蓣皂苷元，TLC监测反应进程，反应完成后，往体系中加30mL冰水，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相后，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相两次，随后用无水硫酸钠干燥有机相，经减压浓缩，浓缩液经硅胶柱分离纯化，展开剂为体积比1：1的乙酸乙酯和石油醚混合溶液，得到目标化合物薯蓣皂苷元-丹参素衍生物。
步骤(1)所述室温是20-30℃；所述乙酸乙酯的用量是每次萃取使用100mL。
步骤(3)所述乙酸乙酯的用量是每次萃取使用30mL；所述洗涤是每次使用80mL饱和氯化钠水溶液。
一种薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的自组装纳米颗粒，该自组装纳米颗粒是由上述的薯蓣皂苷元-丹参素衍生物自组装而成。
上述的薯蓣皂苷元-丹参素衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗三阴性乳腺癌药物中的用途。
上述的薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的自组装纳米颗粒在制备抗三阴性乳腺癌药物中的用途。
上述的薯蓣皂苷元-丹参素衍生物或其药学上可接受的盐在制备改善睡眠药物或保健品中的用途。
上述的薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的自组装纳米颗粒在制备改善睡眠药物或保健品中的用途。
一种具有抗三阴性乳腺癌活性的药物组合物，其中含有治疗有效量的上述薯蓣皂苷元-丹参素衍生物或其药学上可接受的盐。
一种具有抗三阴性乳腺癌活性的药物组合物，其中含有治疗有效量的上述薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的自组装纳米颗粒。
本发明在具体实施方式中对薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的合成、体外和体内药理活性会做进一步阐述。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明将薯蓣皂苷元和丹参素通过碳酸酯键偶联成前药，解决了丹参素进入肿瘤细胞内能力的不足和不稳定性带来的生物活性问题，协同薯蓣皂苷元共同发挥抗癌效应，尤其是其偏好抗三阴性乳腺癌的治疗，目前尚未见相关报道。
(2)本发明借助薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的脂溶性特性构建成分子组装的纳米颗粒系统，使其借用肿瘤细胞的增强渗透和滞留(EPR)效应，实现其被用于新型肿瘤靶向药物的开发；其对三阴性乳腺癌(MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-483)的增殖具有显著抑制作用，而对正常细胞系几乎无生长抑制；体内的异种移植MDA-MB-231荷瘤裸鼠效应表明，该衍生物可显著抑制MDA-MB-231细胞的生长，且对小鼠体重等毒副作用较小。
(3)本发明还通过研究发现薯蓣皂苷元-丹参素衍生物具有改善睡眠的效应。
附图说明
图1为DG-DSS的合成制备流程；
图2为DG-DSS自组装纳米颗粒的透射电镜图；
图3为DG-DSS在TNBC肿瘤细胞裂解液和碳酸酯酶孵化的释放情况(**，p<0.01)；
图4为DG-DSS、DG及DSS抑制MDA-MB-231肿瘤体积生长的曲线(**，p<0.01)；
图5为DG-DSS、DG及DSS抑制MDA-MB-231荷瘤组织体重的比较(**，p<0.01)；
图6为DG-DSS、DG及DSS对MDA-MB-231荷瘤小鼠的体重影响曲线(*，p<0.05)；
图7为DG-DSS、DG及DSS对MDA-MB-231荷瘤小鼠的主要器官影响(ns，无统计差异)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：DG-DSS的合成(合成制备流程如图1所示)
(1)室温环境下，将10g的丹参素钠与5倍体积的醋酸酐于200mL圆底烧瓶中搅拌均匀(50mL)，用滴管缓慢滴加1.5mL的高氯酸(HClO4)，TLC监测反应产物至结束反应；然后，在反应产物加入碎冰中直至融化，乙酸乙酯萃取3次(100mL×3)，合并萃取有机层；饱和氢氧化钠水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，浓缩液经过硅胶柱分离纯化，得白色固体中间产物1(13g，～87％产率)，在真空干燥箱中干燥后，将白色固体粉末保存于干燥器内。
(2)室温环境下，取0.5mmol中间产物1放入圆底烧瓶中，加入10mL无水二氯甲烷搅拌均匀，加入2滴DMF催化反应，再缓慢加入草酰氯(0.4mL，4mmol)，然后用带干燥器的塞子封闭进行反应12小时；减压浓缩，除去反应溶剂以及多余的草酰氯，得到浓缩液，得到中间产物2，即为酰氯丹参素；
(3)室温条件下，立即将中间产物2用20mL二氯甲烷溶解搅拌均匀，加入1 -2mL无水三乙胺作为去酸剂，然后加入薯蓣皂苷元(0.6mmol)，TLC监测反应进程，反应完成后，往体系中加30mL冰水，乙酸乙酯萃取3次(30mL×3)，合并有机相后，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相两次(80mL×2)，随后用无水硫酸钠干燥有机相，经减压浓缩，浓缩液经硅胶柱分离纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)，得到白色固体的目标化合物3，即为终产物薯蓣皂苷元-丹参素衍生物(DG-DSS)(～364mg，产率大约为84％)。
目标产物DG-DSS的质谱和光谱数据如下：
ESI-MS(m/z)：[M+H]+为721.8，[M+Na]+为743.8；1H-NMR：δ：0.82～0.90，9H；1.12～1.28，5H；1.49～1.71，17H；1.85～2.00，3H；2.22～2.39，11H；3.17，2H；3.43，IH；3.59，2H；4.71，1H；5.31，1H；5.95，1H；7.12～7.19，3H(苯环)。从而确定目标产物DG-DSS的分子式为C42H56O10，理论分子量应为720.9；具体结构如下所示：
实施例2：DG-DSS的CAC浓度测定
参照文献方法(Huang P,Wang D,Su Y,Huang W,Zhou Y,Cui D,Zhu X,YanD.Combination of small molecule prodrug and nanodrug delivery:amphiphilicdrug-drug conjugate for cancer therapy.J Am Chem Soc.2014；136(33):11748-56.)，在去离子水中室温下，芘作为探针，通过荧光光谱法获得CAC浓度。测试结果表明，DG-DSS的CAC约为6μg/mL。
实施例3：DG-DSS的自组装及表征
室温下，将20mL去离子水于磁力搅拌器上搅拌均匀，将10mg实施例1合成所得GD-DSS溶于DMSO/无水乙醇溶剂中(v/v＝1:1)，然后用100μL的移液器吸取其DMSO溶液，在磁力搅拌的条件下，依次进行缓慢滴加，用MW～1000的透析袋于去离子水溶液中透析24h，即得尺寸均一的自组装纳米颗粒；用DLS测定仪检测其水合粒径约为70nm，PDI＝0.15；其干燥的形态通过高分辨透射电镜进行表征鉴定，约25nm左右(图2所示)。
实施例4：乳腺癌细胞裂解液和羧酸酯酶对实施例1所得DG-DSS的释放响应特性研究
首先，我们参照研究文献(Wu X,Wang R,Qi S,Kwon N,Han J,Kim H,Li H,Yu F,Yoon J.Rational Design of a Highly Selective Near-Infrared Two-PhotonFluorogenic Probe for Imaging Orthotopic Hepatocellular CarcinomaChemotherapy.Angew Chem Int Ed Engl.2021；60(28):15418-15425.)测定细胞内羧酸酯酶的方法，对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7，正常乳腺细胞MCF-10A，肝脏细胞LO2和健康志愿者的外周血淋巴细胞(PBMC)中羧酸酯酶(CE)的活力进行测定，比较CE在正常细胞和三阴性乳腺癌细胞中的含量区别(图3中的A)，结果表明CE在乳腺癌细胞中具有显著性高表达，可作为乳腺癌前药释放的响应酶。
然后，将20μM的DG-DSS与购买的羧酸酯酶CE(2U/mL；Sigma)和不同细胞裂解液CE酶在生理盐水中进行37℃孵化不同时间点，分别对其释放的DSS片段在280nm波长下进行HPLC检测；实验结果表明，DG-DSS前药设计具有显著的乳腺肿瘤响应特性(图3中的B和C所示)。
实施例5：实施例1所得DG-DSS抗TNBC细胞增殖具有选择性
购于中国科学院上海细胞库的乳腺癌细胞株MDA-MB-231(三阴性)、MDA-MB-468(三阴性)、BT-483(三阴性)、SK-BR-3和MCF-7；肝癌细胞HepG2，肺癌A549，结直肠癌细胞Caco-2及健康志愿者来源的乳腺细胞MCF-10A、肝脏细胞系LO2采用10％的胎牛血清和DMEM或1640培养基进行培养增殖；通过淋巴细胞分离液获取健康志愿者外周血淋巴细胞(PBMC)，用20％的胎牛血清和1640培养基进行培养和药物毒性评价；所述细胞均由本课题组进行复苏、传代、培养及冻存等。
5％CO2，37℃培养箱中(相对湿度90％)培养环境；取对数生长期的细胞，分别接种2×104乳腺癌细胞/孔于96孔板上待生长6小时后，离心弃上清；然后按以下分组给药：肿瘤细胞设不加药组和DG-DSS加药组，每组设5个复孔，培养24或72小时，弃上清，加入100μL含0.5mg/mL的MTT(四氮唑盐)无血清培养液培养4小时，加入100μL二甲亚砜(DMSO)，放置于酶标仪上进行60s自动振荡，再用570nm处检测OD值。PBMC按6×104/孔直接与药物进行孵化。结果按照以下抑制率公式计算每种情况下肿瘤细胞生长的抑制率，具体结果见表1。
抑制率(％)＝(1-加药组OD值/对照组OD值)×100％
表1为DG、DSS、DG+DSS(DG和DSS按照摩尔比1:1混合)和DG-DSS给药作用不同细胞不同时间后的IC50。从表中，我们可以发现，其GD-DSS用于TNBC细胞系(BT-483，MDA-MB-231和MDA-MB-468)治疗的选择性更好，且对正常乳腺细胞MCF-10A、肝细胞LO2和PBMC的毒性几乎没有体现。
表1作用TNBC和对照细胞的IC50值
实施例6：实施例1所得DG-DSS抗三阴性乳腺癌MDA-MB-231皮下瘤的体内效应
将BALB/C裸鼠适应SPF动物房环境条件6天(5周龄，体重(18.6±g)，雌性，由斯莱克景达实验动物技术有限公司提供)，自由饮水饮食，室温(22±1)℃，湿度(40±10)％，光照周期12小时/12小时(白夜交替)。
取0.1mL MDA-MB-231乳腺癌细胞，接种于裸鼠右腋皮下。接种后，待裸鼠移植瘤长至体积80±mm3时，将成瘤裸鼠随机组。腹腔注射给药，末次给药后停药2天处理；每2天称量裸鼠体重和测量移植瘤体积一次，每次测量移植瘤的长径(a)和与之垂直的短径(b)，根据TV＝a×b2/2计算肿瘤体积(Tumor Volume，TV)，绘制各组移植瘤的生长曲线。记录化合物对荷瘤裸鼠体内肿瘤生长的影响，分析用药前后分别称取各组荷瘤裸鼠肿瘤组织的重量，比较各组主要器官的差异情况。
实验结果如图4-7所示，荷瘤裸鼠腹腔注射生理盐水和12mg/kg/天的DG及等摩尔的DSS和DG-DSS化合物干预20天后，第21天麻醉处死小鼠，结果表明，除DSS无显著抑制效应，DG和DG-DSS明显抑制MDA-MB-231肿瘤生长(图4)，肿瘤生长抑制率均大于40％(图5)，对小鼠体重和主要器官重量的影响无显著性变化(图6和图7)，与DG和DSS比较，DG-DSS在体内对乳腺癌具有显著抑瘤效应，且毒副作用尚未发现。
实施例7：改善小鼠睡眠功能的评价
参照本申请人之前的实验方法(CN202010136016.0)。取SPF级健康雄性昆明小鼠180只，～6周，体重17～21g，饲养在SPF实验动物中心。设对照组，DG-DSS低、中、高剂量组(20、40和80mg/kg/天)，DG(80mg/kg/天)，熊果酸组(UA，50mg/kg/天)，对照组灌服同样的溶媒，灌胃，连续30天。动物预饲1周后，随机分为3个实验组，第一组进行直接睡眠实验和延长戊巴比妥钠睡眠时间实验，第二组进行戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验，第三组进行戊巴比妥钠睡眠潜伏期实验。
实验结果：
(1)小鼠生长体重影响：高剂量组DG-DSS和UA组均有明显促生长作用(表2)。
表2对小鼠体重的影响
备注：与对照组相比，*，统计学差异显著(p<0.05)；**，统计学差异极显著(p<0.01)。
(2)小鼠直接睡眠影响：DG，UA以及DG-DSS各剂量组入睡动物数及睡眠时间均为0，提示DG-DSS对小鼠无直接催眠作用(表3)。
表3对小鼠直接睡眠作用的观察
(3)对延长戊巴比妥钠睡眠时间影响：在延长戊巴比妥钠睡眠时间实验中，DG-DSS和UA能延长戊巴比妥钠睡眠时间(表4)。
表4对小鼠延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响
备注：与对照组相比，*，统计学差异显著(p<0.05)；**，统计学差异极显著(p<0.01)。
(4)对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用影响：UA和DG-DSS能显著提高小鼠睡眠率(表5)。
表5对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响
备注：与对照组相比，*，统计学差异显著(p<0.05)；**，统计学差异极显著(p<0.01)。
(5)对小鼠戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响：对照组小鼠睡眠潜伏期为25.1min，UA和DG-DSS组对小鼠睡眠潜伏期均明显缩短(表6)。
表6对小鼠戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响
备注：与对照组相比，*，统计学差异显著(p<0.05)；**，统计学差异极显著(p<0.01)。
综合以上结果，DG-DSS具有明显的改善小鼠睡眠的功效，具有剂量依赖性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种薯蓣皂苷元-丹参素衍生物，其特征在于：所述薯蓣皂苷元-丹参素衍生物具有如下结构式：
2.根据权利要求1所述的薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：将丹参素钠与醋酸酐进行反应，得到丹参素的邻二酚羟基和α-醇羟基乙酰化产物，然后在无水二氯甲烷溶剂中用草酰氯使羧基转化，得到酰氯丹参素；在无水二氯甲烷和室温条件下，三乙胺作缚酸剂，与薯蓣皂苷元反应，得到目标产物薯蓣皂苷元-丹参素衍生物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于具体包括以下操作步骤：
(1)室温下，将丹参素钠10g与醋酸酐搅拌均匀，醋酸酐的用量为丹参素体积的5倍，再滴加1-2mL的高氯酸，TLC监测反应进程，反应完成后将反应产物加入碎冰中直至融化，再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取有机层；饱和氢氧化钠水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，浓缩液经过硅胶柱分离纯化，得到如下结构式的中间产物1；
(2)室温下，取0.2～0.5mmol中间产物1，加入5～10mL无水二氯甲烷搅拌均匀，加入1-2滴DMF作为催化剂，再加入4mmol草酰氯，用带干燥器的塞子封闭进行反应6～12小时，减压浓缩，除去反应溶剂以及多余的草酰氯，得到的浓缩液，得到中间产物2，即为酰氯丹参素；
(3)立即将酰氯丹参素用20mL二氯甲烷溶解搅拌均匀，加入1-2mL无水三乙胺作为去酸剂，然后加入0.6mmol薯蓣皂苷元，TLC监测反应进程，反应完成后，往体系中加30mL冰水，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相后，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相两次，随后用无水硫酸钠干燥有机相，经减压浓缩，浓缩液经硅胶柱分离纯化，展开剂为体积比1：1的乙酸乙酯和石油醚混合溶液，得到目标化合物薯蓣皂苷元-丹参素衍生物。
4.根据权利要求3的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述室温是20-30℃；所述乙酸乙酯的用量是每次萃取使用100mL。
5.根据权利要求3的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述乙酸乙酯的用量是每次萃取使用30mL；所述洗涤是每次使用80mL饱和氯化钠水溶液。
6.一种薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的自组装纳米颗粒，其特征在于：该自组装纳米颗粒是由权利要求1所述的薯蓣皂苷元-丹参素衍生物自组装而成。
7.根据权利要求1所述的薯蓣皂苷元-丹参素衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗三阴性乳腺癌药物中的用途。
8.根据权利要求6所述的薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的自组装纳米颗粒在制备抗三阴性乳腺癌药物中的用途。
9.根据权利要求1所述的薯蓣皂苷元-丹参素衍生物或其药学上可接受的盐在制备改善睡眠药物中的用途。
10.根据权利要求6所述的薯蓣皂苷元-丹参素衍生物的自组装纳米颗粒在制备改善睡眠药物中的用途。
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