CN107840814B - 单环二萜化合物cassipourol及其制备方法和在制药中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属中药制药技术领域，具体涉及从松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物华南五针松(Pinus kwangtungensis Chun ex Tsiang)的枝叶中提取分离获得的式Ⅰ结构的维生素A型单环二萜化合物cassipourol，及其制备方法。经体外生物活性测试结果证实该化合物具有显著的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制活性，用于制备预防、延缓或治疗糖尿病、肥胖症及其并发症和其他PTP1B介导的疾病药物。

Description

单环二萜化合物cassipourol及其制备方法和在制药中的 用途

技术领域

本发明涉及中药制药技术领域，具体涉及从华南五针松Pinus kwangtungensis中提取分离得到的维生素A型单环二萜化合物cassipourol及其制备方法和在制药中的用途；尤其是用于制备蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制剂药物中的用途。

背景技术

现有技术公开了蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTP)是调节细胞内蛋白酪氨酸残基磷酸化水平的酶家族，与细胞增殖和胞内多种信号转导过程密切相关(Fischer et al,Science 1991,253:401-406)；蛋白酪氨酸磷酸酶1B(proteintyrosine phosphatase 1B,PTP1B)广泛分布于多种人体组织中，全长约50KDa，是最早被纯化和确定生物学特征的PTP家族成员之一(Charbonneau et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1989,86:5252–5256)。有研究显示，PTP1B表达的改变与人类糖尿病、肥胖症和癌症等疾病相关。

据资料显示，糖尿病(diabetes mellitus)和肥胖症(obesity)是严重威胁人类身体健康的内分泌紊乱性代谢类疾病，常伴随着外周组织细胞对胰岛素敏感性的降低(即胰岛素抵抗)，引起肌肉、肝脏及脂肪组织中的糖脂代谢平衡失调。根据糖尿病的发病机制，目前一般将糖尿病分为I型糖尿病(胰岛素依赖型，IDDM)与II型糖尿病(非胰岛素依赖型，NIDDM)。其中II型糖尿病占90％以上，胰岛素抵抗是II型糖尿病发生、发展过程中的关键因素。有研究表明，PTP1B可使激活的胰岛素受体和胰岛素受体底物去磷酸化，在胰岛素和瘦素的信号传导过程中起着重要的负调控作用(Kenndy et al,Science 1999,283:1544–1548)；PTP1B的过度表达将会导致胰岛素和瘦素信号的变化，从而导致糖尿病和肥胖症的发生，因此，PTP1B被视为治疗糖尿病和肥胖症等相关疾病的一个潜在的重要的药物靶点(Johnson et al.,Nat.Rev.Drug.Discov.2002,1:696–709)。业内认为，寻找PTP1B的特异性抑制剂，通过抑制PTP1B的活性提高外周组织对胰岛素的敏感性，对糖尿病和肥胖症治疗有着重要的应用前景。

PTP1B作为新的药用靶点已成为近年来生物学及创新药物研究的一个热点。随着高通量筛选技术的广泛运用，目前已经发现较多种类的PTP1B抑制剂。然而迄今为止，尚未有任何PTP1B抑制剂得以成功上市成为药物，分析认为，限制其成药的首要原因是PTP1B与PTP家族中其他的酶具有相同的催化中心，在抑制PTP1B活性的同时提高其针对PTP1B的选择性极其重要。另外，目前发现的活性比较高的抑制剂多带有磷酸、羧酸、磺酸等极性基团，具有较高的负电荷，不利于透过细胞膜，导致生物利用度差。因此寻找高效、高选择性，同时兼具良好药代动力学性质的小分子PTP1B抑制剂具有重要意义，对于糖尿病和肥胖症等疾病的治疗有着广阔的应用前景。

本领域技术人员共识，天然产物具有结构复杂性和结构多样性的特点，是新药发现的重要来源。天然产物及其衍生物独特的化学结构，使其具有高药效和对特定靶点高选择性的优点以及潜在的独特的作用机制等优点(Newman et al.,J.Nat.Prod.2016,79:629–661)。因此从天然活性成分中寻找开发新型、高效的PTP1B抑制剂具有重要的研究价值。

研究统计表明濒危植物次生代谢产物的成药性较高，是发现具有新颖结构和独特作用机制的新药物的重要来源，在国际上正引起高度重视(Ibrahim et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.2013:110,16832–16837；Zhu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.US A.2011,108:12943–12948)。华南五针松隶属松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物，是一种常绿乔木，是我国特有种，1992年10月被中国植物红皮书收载，列为渐危种(Fu et al.,China Plant Red Data Book,Science Press:Beijing；New York,1992)。其天然主要分布于中国的广西金秀、海南五指山和广东北部等南方地区的海拔700-1600米的山脊悬岩陡坡和沟谷两侧(Zheng et al.,In Flora of China；Science Press:Beijing,1978；Vol.7,pp32-211)，目前其化学成分尚未有任何报道。业内人员期望能保护性地去采集少许华南五针松植物样品，这将会积极促进利用这一濒危珍稀资源为人类服务，同时亦可促进采用有效措施保护这一宝贵的植物资源。

基于现有技术的现状，本申请的发明发明人拟从华南五针松中分离得到二萜化合物cassipourol，并将进一步经药理试验研究证实该化合物的抑制PTP1B的显著活性。

发明内容

本发明目的是基于现有技术的现状，从华南五针松Pinus kwangtungensis中提取分离得到维生素A型单环二萜化合物cassipourol，进一步用于制备蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制剂药物。

本发明制得的维生素A型单环二萜化合物cassipourol经生物活性测试表明该化合物可显著抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)，从而可作为蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制剂，进一步用于制备预防或治疗PTP1B介导的疾病(特别是II型糖尿病、肥胖症及其并发症)的药物或该药物的先导化合物。

本发明的单环二萜化合物具有如下式Ⅰ的结构，

本发明的另一目的是提供该化合物的制备方法。

本发明的化合物由华南五针松经由本领域所涉常规的提取分离方法制备而得，其步骤如下：晾干粉碎的华南五针松枝叶用甲醇室温浸泡提取，提取液减压回收溶剂，合并后得浸膏。浸膏用水分散后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得石油醚部分、乙酸乙酯部分和水溶性部分。乙酸乙酯部分经硅胶、Sephadex LH-20及半制备HPLC分离，得化合物cassipourol。

本发明对所得二萜化合物cassipourol进行了蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制活性实验，表明该化合物具有显著的抑制活性，可用于制成预防、延缓或治疗由PTP1B介导的疾病，特别是II型糖尿病和肥胖症的药物或是作为该药物的先导化合物。

本发明制得的维生素A型单环二萜化合物cassipourol经生物活性测试，结果表明该化合物可显著抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)，从而可作为蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制剂，进一步用于制备预防或治疗PTP1B介导的疾病(特别是II型糖尿病、肥胖症及其并发症)的药物或该药物的先导化合物。

本发明所述的化合物可单独应用或者合用，亦可与药学上可接受的载体或赋形剂结合，按照常规方法制成口服或者非口服剂型。

本发明的维生素A型单环二萜化合物cassipourol具有如下优点：所述目标化合物cassipourol为首次从华南五针松中分到的维生素A型单环二萜；并经实验证实所述二萜化合物具有显著的PTP1B酶抑制活性，对现代人群中高发的糖尿病、肥胖症等具有应用前景。

具体实施方式

下面实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。

下述制备例中，比旋光测试通过JASCO P-1020旋光仪完成；紫外和红外光谱数据分别通过Shimadzu UV-2550紫外光谱仪和Nicolet AVATAR 360型红外光谱仪获得；核磁数据用Bruker Avance II 400型仪测定；质谱数据由Agilent 1100Series LC/MSD G1946D型质谱仪测定；所使用的硅胶和薄层板为烟台康比诺公司生产，Sephadex LH-20凝胶为瑞士GE Healthcare Bio-Sciences公司生产；半制备HPLC为Waters e2695，配备2998PDA和2424蒸发光散射双检测器以及SunFire ODS(5μm,250×10mm)半制备柱；所有试剂均为上海国药集团化学试剂有限公司生产。

实施例1：制备二萜化合物cassipourol

取干燥的华南五针松枝叶300g，粉碎后用90％甲醇室温冷浸提取5次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏约30g。浸膏用水分散后依次用石油醚(PE)和乙酸乙酯(EtOAc)萃取，得乙酸乙酯部分7.0g，乙酸乙酯部分经100-200目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯30:1-0:1及乙酸乙酯：甲醇15:1-0:1梯度洗脱，得到6个组分(Fr.1-Fr.6)。组分Fr.1采用半制备型HPLC进一步分离，以90％甲醇等度洗脱(流速：3mL/min)，得到化合物cassipourol(8.0mg,t_R＝15.0min)。化合物cassipourol的核磁及理化数据如下：

Cassipourol:淡黄色油状,[α]_D ²⁰+18.0°(c 0.1,CDCl₃).¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ0.83(3H,d,J＝6.8Hz,Me-19),0.84(3H,d,J＝6.8Hz,Me-18),0.85(3H,s,Me-16),0.87(3H,s,Me-17),1.05(1H,m,H-2a),1.24(2H,m,H-4),1.26(2H,m,H-3),1.28(1H,m,overlapped,H-1b),1.28(2H,m,H-7),1.28(1H,m,H-10a),1.34(2H,m,H-8),1.38(1H,m,H-6),1.38(1H,m,H-10b),1.40(2H,m,H₂-9),1.50(1H,m,H-5),1.53(2H,m,H₂-11),1.66(3H,br s,Me-20),1.99(2H,br t,J＝8.0Hz,H-12),4.14(2H,d,J＝7.0,H-15),5.40(1H,br t,J＝7.0Hz,H-14),¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ36.7(C-1),39.4(C-2),24.8(C-3),37.3(C-4),28.0(C-5),32.8(C-6),24.5(C-7),37.3(C-8),32.7(C-9),37.4(C-10),25.1(C-11),39.9(C-12),140.3(C-13),123.1(C-14),59.4(C-15),22.6(C-16),22.7(C-17),19.8(C-18),19.7(C-19),16.2(C-20)；(+)ESIMS m/z 295[M+H]⁺,317[M+Na]⁺.。

实施例2：蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制活性测定

实验方法：采用分子生物学的方法，构建基因重组的hGST-PTP1B-BL21E.coli人类PTP1B工程菌，经纯化后的hGST-PTP1B重组蛋白能水解底物para-Nitrophenyl Phosphate(pNPP)的磷脂键，得到的脱磷酸产物pNP在波长405nm处有很强的光吸收，因此可通过直接检测405nm处光吸收的变化以观察酶活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况；

初筛选择所述化合物浓度为20μg/ml时对PTP1B酶活性的百分抑制率进行考察，试验结果表明化合物cassipourol抑制率高于90％；

进一步测定IC₅₀值：样品临用前溶于DMSO配成合适浓度，3倍稀释，7个稀释度，三复孔，取2μL样品溶液加入到标准的测活体系(30nM GST-hPTP1B,2mM pNPP,50mM3-吗啉丙磺酸(MOPS)，pH 6.5,2mM DTT,1mM EDTA,2％DMSO)；反应温度为30℃，在VERSAmax上动态测量405nm处的光吸收，时间为3min，其动力学曲线一级反应的斜率作为酶的活性指标；以相对活性对化合物浓度作图，经公式v/v₀＝100/(1+b*[I]/IC₅₀)拟合得到IC₅₀值；实验重复三次，结果取三次的平均值，阳性对照齐墩果酸(oleanolic acid)IC₅₀值为1.5μg/ml。

表1.测试化合物抑制PTP1B活性数据

表1显示了所述化合物cassipourol抑制PTP1B的IC₅₀值，测试结果表明化合物cassipourol表现出显著的抑制活性，其作用强度与阳性对照齐墩果酸在同一个数量级，表明本发明所述化合物可用于制备治疗糖尿病、肥胖症及其并发症的药物或是作为该药物的先导化合物。

Claims (3)

1.一个化学结构式如下所示的维生素A型单环二萜化合物cassipourol的制备方法

其特征在于通过下述方法由华南五针松枝叶中提取、分离及制备：采用华南五针松干燥枝叶，粉碎后用甲醇提取，提取液经减压浓缩后，加水悬浮，再分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯提取物经硅胶、Sephadex LH-20凝胶及半制备HPLC色谱分离，得化合物cassipourol。

2.单环二萜化合物cassipourol作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制剂在制备药物中的用途。

3.单环二萜化合物cassipourol在制备预防、延缓或治疗糖尿病、肥胖症及其他与PTP1B介导相关疾病药物中的应用。