CN101342159B

CN101342159B - 溴酚化合物在制备治疗2型糖尿病或肥胖症药物中的应用

Info

Publication number: CN101342159B
Application number: CN2007100152979A
Authority: CN
Inventors: 史大永; 韩丽君; 范晓; 许凤; 袁兆慧
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2007-07-13
Filing date: 2007-07-13
Publication date: 2010-11-03
Anticipated expiration: 2027-07-13
Also published as: CN101342159A

Abstract

本发明涉及治疗2型糖尿病和肥胖症的药物，具体地说是3种溴酚类化合物在制备治疗2型糖尿病和肥胖症药物中的应用。本发明中的溴酚类化合物具有蛋白质酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制活性，可用于治疗2型糖尿病和肥胖症。

Description

溴酚化合物在制备治疗2型糖尿病或肥胖症药物中的应用

技术领域

本发明涉及治疗2型糖尿病和肥胖症的药物，具体地说是溴酚化合物在制备治疗2型糖尿病或肥胖症药物中的应用，包括三种海洋溴酚化合物的制备、药理活性及药学用途。该化合物作为蛋白质酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制剂，可用于治疗2型糖尿病和肥胖症。

背景技术

糖尿病是一种常见的多发内分泌疾病，其发病原因是由于胰岛素相对或绝对不足及靶细胞对胰岛素敏感性降低，分为胰岛素依赖型糖尿病(1型)和非胰岛素依赖型糖尿病(2型)，临床90％以上为2型糖尿病患者。

胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的关键因素，胰岛素通过与受体胞外α亚基结合，激活受体胞内β亚基内在的酪氨酸激酶活性，导致酪氨酸残基自身磷酸化，从而完全激活胰岛素受体酪氨酸激酶，再通过磷酸化胰岛素受体底物将信号传递下去。酪氨酸磷酸化是胰岛素效应实现的一个重要环节，受作用相反的一对酶即PTK和PTP所调节。PTK在胰岛素信号传递中的作用很早即被人们所关注，但直到最近，人们才逐渐认识到PTP在糖尿病发病中的重要性。

在胰岛素Insulin信号传导过程中，PTP1B酶将自身磷酸化活化的胰岛素受体(IR)去磷酸化，从而降低受体激酶的活性，或将胰岛素受体底物(IRs)中的蛋白质酪氨酸残基去磷酸化，从而负调控胰岛素作用受体后通路；在瘦素Leptin信号传导过程中，PTP1B酶可将瘦素受体ObR下游的S JAK2去磷酸化，从而负调控瘦素作用受体后通路，STAT3与P110/p85(胰岛素信号响应过程中P13K的特殊形式)分别为JAK2与IRS1的下游作用靶点，进而影响血糖的吸收与能量转化，导致糖尿病及肥胖症的发生。

研究发现，胰岛素抵抗患者的胰岛素靶组织中PTP1B和LARPTP表达增加，这两种PTP的表达增加能阻断胰岛素受体酪氨酸的激活和胰岛素的信号转导；PTP1B基因剔除鼠可提高胰岛素的敏感性，且这种增敏效应具有组织特异性，它可增加骨骼肌对葡萄糖的摄取，但对脂肪组织无明显影响，这些结果证实PTP1B在胰岛素信号转导中的负调控作用，它的活性增高，可能是发生胰岛素抵抗和胰岛素受体信号受损的一个致病因素，因此，寻找PTP1B的小分子抑制剂可能开发出有效的抗2型糖尿病和肥胖症的新药。

国际上对PTP1B抑制剂的研究不多，主要有以下几类：反义寡核苷酸类化合物、二氟酯甲基磷酯类(difluro-methylenePhosPhaonates)、甲氧基苯甲酸类(2-carbometh-oxybenzoicacids)、二草酰基氨基苯甲酸类(oxalyaminobenzoic acids)、苯并呋喃类(benzbromarone)、ABDF(the fluorogenic reagent4-(aminosulfonyl)-7-fluoro-2，1，3-benzoxa-diazole)；但目前尚未见溴酚类化合物作为PTP1B抑制剂抗糖尿病方面的研究报道。

21世纪人类生存和发展的巨大压力，迫使人们加快合理开发海洋资源的步伐，如何进行海洋天然活性物质的深度开发与利用，开发针对人类重大疾病的新药，是合理利用我国生物资源的战略需求。海洋是生命的起源，海藻是海洋中最大的植物类群，为了对付海洋食草动物的大量吞食来维护自身的生存繁衍，大多海藻能产生一些很有特色的活性物质。

发明内容

本发明目的是提供3种溴酚类化合物在制备治疗2型糖尿病和肥胖症药物中的应用，所述溴酚类化合物具有蛋白质酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制活性，可用于治疗2型糖尿病和肥胖症。

申请人从海洋红藻中得到三个结构新颖的溴酚类化合物，体外活性筛选中发现其具有极强的PTP1B酶抑制活性，抑制率高达73.38％、69.79％、72.71％(浓度5μg/mL)；对海藻乙醇提取物进行动物试验，结果发现中、高级量组表现出显著的降血糖效果，且呈良好的量效关系，这说明海藻内含有强活性的降糖成分，溴酚类化合物是一类2型糖尿病和肥胖症防治的新型药物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

溴酚化合物在制备治疗2型糖尿病和肥胖症药物中的应用。

所述溴酚化合物分别为3，4-二溴-5(甲氧基甲基)-1，2-二苯酚、2-甲基-3-(2，3-二溴-4，5-二羟基)苯丙醛、3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃及其药物学上可接受的盐、酯或醚；蛋白质酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制剂可作为2型糖尿病和肥胖症治疗药物。

溴酚化合物结构如下：

3，4-二溴-5(甲氧基甲基)-1，2-二苯酚

3，4-dibromo-5(methoxymethyl)-1，2-benzenediol

2-甲基-3-(2，3-二溴-4，5-二羟基)苯丙醛

2-methyl-3(2，3-dibromo-4，5-dihydroxy)-propylaldehyde

3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃

3-(2，3-dibromo-4，5-dihydroxy-phenyl)-4-bromo-5，6-dihydroxy-1，3-dihydroiso-benzofuran

本发明具有如下优点：(1)、生物资源丰富：我国是海洋大国，拥有丰富的海洋生物资源，海藻资源分布尤其广泛，其中富含溴酚类化合物。(2)、生物利用度高：溴酚化合物分子量相对较小(MW<500)，生理环境下具有较好的细胞膜通透性，易于口服，吸收，具有较高的生物利用度。(3)、疗效显著：作为极具海洋特色的多卤代化合物，溴酚类药物是一种新型、高效的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制剂，在试验动物体内表现出显著的降血糖活性，具有很好的抗糖尿病和肥胖症疗效。(4)、副作用小：溴酚类药物来源于海藻，属纯天然生物制品，相比化学合成类药物，具有高效低毒的优点。

具体实施方式

实施例1溴酚化合物的提取、分离及结构鉴定

风干的松节藻Rhodomela confervoides样品14.4kg(干重)粉碎后用10L95％乙醇提取三次，每次72小时；合并浸提液，提取液40℃下减压浓缩的乙醇提取物723g，浓缩物用10倍重量蒸馏水悬浮后，用乙酸乙酯(体积比1：1)萃取，减压浓缩，得乙酸乙酯相浸膏594.6g，乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮梯度洗脱(体积比从500:1至1:1)，改用氯仿-甲醇梯度洗脱(体积比从20:1至1:1)，最后用95％乙醇洗脱，薄层色谱检查，合并成分相似的洗脱液，减压浓缩得14个部分L₁～L₁₄。

L₁₀部分[氯仿：甲醇＝5：1]洗脱部分经过硅胶色谱，采用氯仿-甲醇(体积比依次为50:1-20:1-10:1-5:1)进行梯度洗脱，HPLC纯化、重结晶可得纯化合物I25mg，经波谱分析，此化合物为3，4-二溴-5(甲氧基甲基)-1，2-二苯酚(中文)；3，4-dibromo-5(methoxymethyl)-1，2-benzenediol(英文)。

L₉部分[石油醚：丙酮体积比＝1：1]洗脱部分经过Sephadex LH20凝胶色谱，采用石油醚-氯仿-甲醇(体积比为5:5:1)进行洗脱，HPLC纯化、重结晶可得纯化合物II18mg，经波谱分析，此化合物为2-甲基-3-(2，3-二溴-4，5-二羟基)苯丙醛(中文)；2-methyl-3(2，3-dibromo-4，5-dihydroxy)-propylaldehyde(英文)。

采集并风干褐藻小粘膜藻Leathesia nana样品8.25kg(干重)，粉碎后用10L95％乙醇提取三次，每次72小时；合并浸提液，提取液40℃下减压浓缩的乙醇提取物710g，浓缩物用10倍重量蒸馏水悬浮后，依次用等体积乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩，得乙酸乙酯相浸膏125g，正丁醇相浸膏70g。乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮梯度洗脱(体积比依次为500:1～1:1)，改用氯仿-甲醇梯度洗脱(体积比20:1～1:1)，最后用95％乙醇洗脱，薄层色谱检查，合并成分相似的洗脱液，减压浓缩得24个部分L₁～L₂₄。L₁₁-L₁₅[石油醚：丙酮＝5：1]洗脱部分经过SephadexLH-20色谱、硅胶色谱和反相HPLC等分离纯化技术得到纯化合物III18mg，经波谱分析，此化合物为3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃(中文)；3-(2，3-dibromo-4，5-dihydroxy-phenyl)-4-bromo-5，6-dihydroxy-1，3-dihydroiso-benzofuran(英文)。

化合物具有以下理化特性：

化合物I淡黄色粉末，C₈H₈Br₂O₃，mp：129～130℃，EI-MS：m/z(％)：312，293，281，252，231，217，201，188，173，145，124，107，92，75，64，53；IR

Figure S07115297920070816D00004114257QIETU

cm^-1：3467，3157，2927，1684，1572，1466，1446，1371，1273，1165，1092，1014，916，858，804；¹H-NMR(300MHz，Me₂CO-d₆)：3.38(3H，s，H-8)，4.40(2H，s，H-7)，7.05(1H，s，H-6)；¹³C-NMR(75MHz，Me₂CO-d₆)：57.7(q，C-8)，74.5(t，C-7)，113.1(d，C-3)，113.9(s，C-4)，114.8(s，C-6)，130.8(s，C-5)，143.9(s，C-2)，144.9(s，C-1).

化合物II胶状物，C₁₀H₁₀Br₂O₃，IR

Figure 2007100152979100002S07115297920070816D00004114257QIETU

cm^-1：3386，2968，2931，2873，2733，1712，1576，1469，1406，1273，1188，1014，930，856，814，650.¹H-NMR(300MHz，Me₂CO-d₆)：1.07(3H，d，J＝6.9Hz，H-9)，2.73(1H，m，H-8)，3.21(2H，d，H-7)，6.86(1H，s，H-6)，9.70(1H，d，J＝1.5Hz，H-10).¹³C-NMR(75MHz，Me₂CO-d₆)：12.8(q，C-9)；37.7(t，C-7)；46.5(d，C-8)；117.0(d，C-6)，113.3(s，C-3)；115.8(s，C-4)；131.5(s，C-5)；143.4(s，C-2)；144.9(s，C-1)，203.7(d，C-10).

化合物III红色粉末(Me₂CO)，C₁₄H₉Br₃O₅，mp：132～134℃，

Figure S07115297920070816D00005114412QIETU

+6°(MeOH，c0.16)；HREIMS m/z493.7971(calcd.for C₁₄H₉ ⁷⁹Br₃O₅，493.8000)；EIMS m/z500/498/496/494[M]⁺(8/36/35/10％)，297/295/293(35/77/40)，231/229(100/98)；IR

Figure 2007100152979100002S07115297920070816D00005114412QIETU

cm^-1：3415，3386，2866，1595，1464，1408，1358，1308，1277，1163，1024，858，812；¹H-NMR(Me₂CO-d₆，500MHz)δ：6.88(1H，s，H-6′)，6.45(1H，s，H-7)，6.31(1H，s，H-6)，5.03(1H，d，J＝12.0Hz，H-7′a)，4.94(1H，d，J＝12.0Hz，H-7′b)；¹³C-NMR(Me₂CO-d₆，125MHz)δ：147.0(s，C-5′)，145.4(s，C-5)，145.3(s，C-4)，143.5(s，C-4′)，133.5(s，C-1′)，133.2(s，C-1)，132.8(s，C-2′)，117.5(s，C-2)，115.2(d，C-6)，113.8(s，C-3)，107.5(d，C-6′)，105.0(s，C-3′)，87.9(d，C-7)，73.5(t，C-7′)。

实施例2蛋白质酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)活性抑制活性测试

实验原理：

PTP1B是首个被鉴定的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶(protein tyrosinephosphatase)，通过基因敲除试验表明，PTP1B在胰岛素Insulin信号传导及瘦素Leptin信号传导过程中起负调控作用，在调节胰岛素敏感性和糖代谢过程中起关键作用。

利用分子生物学手段在大肠杆菌系统表达人源蛋白质酪氨酸磷脂酶1B(hPTP1B)催化活性域，经纯化后的hPTP1B重组蛋白能水解底物pNPP的磷脂键，得到的产物在410nm处有很强的光吸收，因此，可以通过直接检测410nm处的光吸收的变化，以观察酶的活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况，计算抑制率及IC₅₀，阳性对照为正矾酸钠。

实验方法：将实施例1中的3种溴酚化合物分别用磷酸盐缓冲液配制200μM和20μM供试品溶液，分别加入到标准的测活体系(10mM Tris.Cl，PH7.6，10mM pNPP，2％DMSO，100nM hPTP1B)，动态测定波长为410nm处的光吸收，时间为3分钟，计算化合物PTP1B抑制率及IC₅₀；PTP1B：为大肠杆菌中表达并纯化的GST融合蛋白；底物：PNPP；阳性参照物：正钒酸钠(2μM)。

表1人源蛋白质酪氨酸磷脂酶1B抑制率及IC₅₀

Figure1Inhibition and IC₅₀of PTP1B

[实验结论]：溴酚化合物对人源蛋白质酪氨酸磷脂酶1B(PTP1B)有显著的抑制作用，可用于2型糖尿病及肥胖症的防治。

实施例3松节藻乙醇提取物体内抗糖尿病活性测试

(1)、动物分组及处理

采用高脂饮食STZ-DM模型(链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠模型)对松节藻的乙醇提取物进行了体内抗糖尿病活性试验，分别测定体重、血糖生理指标，评价海藻乙醇提取物的体内降糖活性。

1、2型糖尿病模型制备

Wistar大白鼠70只，环境适应性饲养3d后，随机抽取10只(雌雄各半)作为正常对照组，其余大鼠禁食24h后，按照35mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素(溶解于0.1mol/L枸橼酸钠溶液，pH＝4.5)，诱导糖尿病模型。3d后禁食12h，尾静脉采血，血糖仪测定空腹血糖，以血糖大于16.7mmol/L确定为糖尿病模型造模成功。

2、治疗

采用随机分组法，将成模大鼠分为模型组，醇提物高剂量组，醇提物中剂量组，醇提物低剂量组和阳性对照组(即文迪雅组)，每组10只(雌雄各半)。高、中、低剂量组分别按照200mg/kg，100mg/kg，50mg/kg剂量每日灌服ig松节藻醇提物大豆色拉油稀释液；阳性对照组灌服ig阳性药物文迪雅(有效成分罗格列酮)；正常组和模型组灌服等量大豆色拉油，各组均采用高脂饮食，自由饮水。

3、指标检测

每7d将小鼠禁食12h后，称体重，尾静脉采血测定血糖。

表2松节藻醇提物对大鼠血糖的影响

Fig 2 Hypoglycemic Effect of Ethanolic Extract of Rhodomela confervoides

[实验结论]：采用STZ-DM模型对松节藻的醇提取物体内降血糖活性进行研究，发现其在大鼠体内具有显著的降血糖效果，且呈良好的量效关系。

Claims

1.溴酚化合物在制备治疗2型糖尿病或肥胖症药物中的应用，其特征在于：所述溴酚化合物为3，4-二溴-5(甲氧基甲基)-1，2-二苯酚、2-甲基-3-(2，3-二溴-4，5-二羟基)苯丙醛和/或3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃。

2.溴酚化合物在制备治疗2型糖尿病或肥胖症药物中的应用，其特征在于：所述溴酚化合物为3，4-二溴-5(甲氧基甲基)-1，2-二苯酚的药物学上可接受的盐、2-甲基-3-(2，3-二溴-4，5-二羟基)苯丙醛的药物学上可接受的盐和/或3-(2，3-二溴-4，5-二羟基苯)-4-溴-5，6-二羟基-1，3-二氢异苯并呋喃的药物学上可接受的盐。