CN101265251A - 从中药菝葜中提取柚皮素的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从中药菝葜中提取柚皮素的方法及应用。该方法的具体步骤为：将中药菝葜粉碎，用70％乙醇冷浸，浸出液浓缩得浸膏，混悬于蒸馏水中，用石油醚萃取脱脂，脱脂后的水相再用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯相上硅胶柱进行层析，用乙酸乙酯－甲醇系统(9∶1)进行洗脱，洗脱液分部收集，最前沿段合并浓缩，上硅胶柱用氯仿∶甲醇梯度洗脱，分部收集，浓缩后析出沉淀物。反复过柱，甲醇重结晶后，得到白色针状晶体。本发明方法从中药菝葜中提取出纯的黄酮类化合物3(S)－5，7，4’－三羟基二氢黄酮，即柚皮素，该化合物具有醛糖还原酶和α－葡萄糖苷酶两个酶的抑制活性，起到调控小肠对葡萄糖吸收和防治糖尿病并发症的作用。由于纯化后单体的结构明确，效果显著，有利于质量控制和中药现代化进程；进一步可通过对该化合物的化学修饰等，深入研究糖尿病及其并发症的发生发展机理，从而开发新一代抗糖尿病及其并发症药物。

Description

从中药菝葜中提取柚皮素的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种从中药菝葜中提取柚皮素的方法及应用。

背景技术

糖尿病并发症多由长期的高血糖、高血脂、血液高凝、高粘、内分泌失调引起。常见的并发症有：糖尿病酮症酸中毒、非酮症性高渗性昏迷、糖尿病乳酸性酸中毒、糖尿病性心脏病、糖尿病性脑血管病变、糖尿病性肢端坏疽、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变，以及糖尿病引起的多种感染，其中，又以糖尿病大血管病变和微血管病变最为常见。这些并发症通常比糖尿病本身更严重，导致某些疾病发病率和死亡率明显增加。目前认为糖尿病并发症与以下因素有关：(1)胰岛素的绝对或相对缺乏胰岛素抵抗是糖尿病发病前的主要病理生理表现。最常见的原因是受体缺陷，这一机制在糖尿病发病中起了非常重要的作用，致使骨骼肌和脂肪组织摄取葡萄糖障碍，肝糖输出增加，发生NIDDM高血糖，(2)血浆游离脂肪酸(FFA)增高近来的证据表明，在人类高浓度的血浆游离脂肪酸通过抑制肌肉内的葡萄糖转运活性而产生胰岛素抵抗。另外游离脂肪酸水平的慢性升高对胰岛β细胞功能也有损害——称为“脂毒性”——从而进一步加重了高血糖，(3)肌醇代谢异常和多元醇代谢途径增强大量证据表明，当体内血糖超过一定数量而形成高血糖时，醛糖还原酶被活化而使山梨醇的形成亢进。山梨醇的蓄集一方面会引起渗透压上升，产生组织(血管、神经、肾、视网膜、晶状体等)水肿，导致基质变化而发生并发症，另一方面，可使其他具有渗透活性的物质如肌醇等代偿性耗竭，致使神经传递速度下降，从而导致糖尿病并发症的发生。而醛糖还原酶抑制剂则可恢复神经传导速度，防止视网膜组织中蛋白异常渗透，减轻肾输入小动脉扩张，使肾小球滤过率恢复正常等。

发明内容：

本发明的目的之一在于提供一种从中药菝葜中提取柚皮素的方法。

本发明的目的之二在于提供柚皮素在制备抑制醛糖还原酶活性药物中的应用。

本发明的目的之三在于提供柚皮素在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性药物中的应用。

中药菝葜(Rhizoma Smilacinus，RS)为百合科植物菝葜(Smilax china L.)的干燥根茎，具活血化瘀，清热利湿，强筋壮骨，消肿毒，祛风湿，利小便，补气活血等功效，为一常用中药，味甘性平温，无毒，药价低廉，具多种生物活性，对多种疾病有独特疗效。菝葜煎剂对实验性糖尿病小鼠的血糖有明显的抑制作用，小鼠灌胃菝葜煎剂连续3天或6天，能显著对抗肾上腺素和葡萄糖引起的小鼠血糖升高，降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖浓度，明显增加肝糖元含量等(马世平，卫敏，郭健，等.菝葜对小鼠血糖和肝糖元的影响[J].中国现代应用药学杂志，1998，15(5)：5-7)。柚皮素是一种广泛存在于植物和中药中的黄酮类化合物，药理研究显示：柚皮素具有抗炎、止咳祛痰、抗氧化、降血脂、清除自由基、抗肿瘤等作用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案；

一种从中药菝葜中提取柚皮素的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a)将菝葜浸没在70％的乙醇中，浸出液浓缩后得浸膏，将该浸膏悬浮在蒸馏水中后，用石油醚萃取脱脂，脱脂后的水相再用乙酸乙酯萃取；

b)将乙酸乙酯相用200-300目硅胶柱层析分离，流动相为乙酸乙酯和甲醇按9∶1的体积比的混合液，根据薄层层析的结果收集前沿段的洗脱液，浓缩后再用200-300目硅胶柱层析分离，用氯仿和甲醇按(100～4)∶1的体积比的混合液进行梯度洗脱，根据薄层层析的结果收集前沿段的洗脱液，浓缩后析出沉淀物；该沉淀物再用氯仿和甲醇按9∶1的体积比的混合液洗脱，洗脱后再用甲醇重结晶，即得到白色针状晶体纯的柚皮素。

中药菝葜提取物柚皮素在制备抑制醛糖还原酶活性药物中的应用。

中药菝葜提取物柚皮素在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性药物中的应用。

采用本发明方法从从中药菝葜中提取出纯的黄酮类化合物3(S)-5，7，4’-三羟基二氢黄酮，即柚皮素，该化合物具有醛糖还原酶和α-葡萄糖苷酶两个酶的抑制活性，针对两个与糖尿病及其并发症发生和发展相关的酶靶，起到调控小肠对葡萄糖吸收和防治糖尿病并发症的作用。相比传统中药制剂，由于纯化后单体的结构明确，效果显著，有利于质量控制和中药现代化进程；进一步可通过对该化合物的化学修饰等，深入研究糖尿病及其并发症的发生发展机理，从而开发新一代抗糖尿病及其并发症药物。

附图说明

图1为菝葜提取物柚皮素的HPLC检测结果。

图2为菝葜提取物柚皮素对α-葡萄糖苷酶活性的影响。

图3为菝葜提取物柚皮素对醛糖还原酶活性的影响。

具体实施方式

实施例一：单体的分离提取和纯化

称取1000g菝葜经70％乙醇浸提，得浸膏78.32g，后经石油醚、乙酸乙酯依次萃取，乙酸乙酯相31.26g，将乙酸乙酯相上200-300目硅胶柱进行正相层析，流动相为乙酸乙酯-甲醇(9∶1)，分部收集，200mL/瓶，计收集28瓶，将其中4-12号瓶合并浓缩，再上200-300目硅胶柱(4.5×50cm)，流动相氯仿-甲醇(100∶1)到氯仿-甲醇(4∶1)梯度洗脱，分部收集，200mL/瓶，收集16瓶，12，13瓶浓缩后，析出沉淀物。沉淀物视纯度可进行单梯度柱层析，参考洗脱系统为氯仿-甲醇(9∶1)。视薄层层析结合紫外分析结果，可进行甲醇重结晶。1000g菝葜经过分离纯化得到固体0.96g，得率为0.096％。该部位纯度经HPLC鉴定，峰面积为99.5％，接近单体，参见图1和表1。

表1柚皮素的HPLC数据(280nm)

实施例二：单体的结构鉴定

白色针状晶体(甲醇)。溶于甲醇，乙醇。分子量为272，分子式C₁₅H₁₂O₅。。ESI-MSm/z：273[M-H]⁺。¹H NMR(CD₃OD)δ：7.36(2H，d，J＝8.5，C₂’-H，C₆’-H)，6.82(2H，d，J＝2.7，9.4，C₃’-H，C₅’-H)，5.98(1H，d，J＝2.1，C₆-H)，5.35(1H，dd，J＝3.0，13.5，C₂-H)，3.05(1H，d，J＝14.5，C₃-H_α)，2.78(1H，dd，J＝3.0，14.6，C₃-H_β)。¹³C NMR(CD₃OD)δ：79.1(C-2)，42.6(C-3)，196.3(C-4)，164.1(C-5)，127.6(C-6)，167.1(C-7)，94.8(C-8)，163.5(C-9)，101.9(C-10)，129.7(C-2’)，115.0(C-3’)，157.6(C-4’)，115.0(C-5’)，127.6(C-6’)。

综上所述，化合物为3(S)-5，7，4’-三羟基二氢黄酮，即柚皮素Naringenin，Nar)。

实施例三：单体对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

在试管中依次加入0.76mL pH6.8的磷酸钾缓冲液，20μL 1mg/mL还原型谷胱甘肽，10μL 0.0167U/mL α-葡萄糖苷酶，37℃保温10min后，加入10μL 0.116M PNPG，在400nm波长下扫描6min记录吸光度的变化。α-葡萄糖苷酶活力单位定义：在pH 6.8，温度为37℃的条件下，在400nm下，每分钟吸光度值上升0.1为一个活力单位。

依次加入磷酸钾缓冲液、20μL 1mg/mL还原型谷胱甘肽、10μL 0.0167U/mL α-葡萄糖苷酶、和一定量抑制剂溶液(1mg/mL，用磷酸钾缓冲液配制)，37℃保温10min后，加入10μL 0.116M PNPG，在400nm波长下扫描6min记录吸光度的变化，总反应体系为0.8mL。α-葡萄糖苷酶抑制剂活力单位定义：在pH 6.8，温度为37℃的条件下，使一个酶活力单位丧失活性为一个抑制剂活力单位。

参见图2，当加入10μL浓度为1mg/mL的Nar量时，对α-葡萄糖苷酶抑制率即已达到29.8％，当体积为40μL时，抑制率可达45.5％，表明该成分对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性。对照组生理盐水无抑制活性。

实施例四：单体对醛糖还原酶的抑制活性

在0.8mL磷酸钾缓冲液(pH6.5)中加入40μL 0.4M硫酸锂，40μL 10mM还原型辅酶II溶液和80μL醛糖还原酶提取液，37℃下保温4min，再加入40μL 10mM DL-甘油醛溶液，在340nm下扫描记录吸光度6min的变化。醛糖还原酶活力单位定义：在pH 6.8，温度为37℃的条件下，在340nm下每分钟吸光度值下降0.01为一个活力单位。

在一定量磷酸钾缓冲液(pH6.5)中加入40μL 0.4M硫酸锂，40μL 10mM还原型辅酶II溶液，一定量抑制剂溶液(1mg/mL，用磷酸钾缓冲液配制)和80μL醛糖还原酶提取液，37℃下保温4min，再加入40μL 10mM DL-甘油醛溶液，总反应体系为1mL，在340nm下扫描记录吸光度6min的变化。醛糖还原酶抑制剂活力单位定义：在pH 6.5，温度为37℃的条件下，使一个酶活力单位丧失活性为一个抑制剂活力单位。抑制剂的比活力用U/mg抑制剂来表示，即每mg抑制剂所具有的抑制活力。

参见图3，当加入4μL浓度为1mg/mL的成分时，对醛糖还原酶的抑制率为34.2％，当加入8μL时，抑制率为90.1％，如加入10μL时，抑制率可达到100％，表明其对醛糖还原酶有强的抑制活性。对照组生理盐水无抑制活性。

实施例五：单体一次给药对正常小鼠血糖含量的影响

取正常小鼠60只，随机分为6组，每组10只，分别灌胃生理盐水(PB)、拜糖平(阳性对照)、不同剂量的柚皮素(Nar)。禁食4h后眼眶静脉丛取血，葡萄糖氧化酶法测定血糖值(fasting serum glucose，FSG)。结果参见表2，120mg/kg剂量组能明显降低正常小鼠血糖含量，再加大剂量对正常小鼠血糖含量没有明显变化。

Tab.2一次给药对正常小鼠血糖含量的影响(n＝10)

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs Normal

实施例六：单体连续给药对正常小鼠血糖含量的影响

取正常小鼠50只，随机分为5组，分别灌胃生理盐水、拜糖平、Nar，连续8d。末次给药后禁食4h，眼底取血测定血浆血糖浓度。参见表3，Nar多次给药对正常小鼠的血糖含量有较显著的影响。

Tab.3多次给药对正常小鼠血糖含量的影响(n＝10)

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs PB

实施例七：对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响

四氧嘧啶糖尿病小鼠50只，分为5组(另一组为正常小鼠10只)，分别灌胃生理盐水、拜糖平及Nar，连续8d。末次灌胃后禁食4h，取血测定血浆血糖浓度。参见表4，其降血糖效果接近市售降糖药物拜糖平。

Tab.4 Nar对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖含量的影响(n＝10)

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs Model

实施例八：对四氧嘧啶小鼠肝糖原含量的影响

四氧嘧啶糖尿病小鼠40只，分为5组(另一组为正常小鼠8只)，连续给药灌喂8d(模型组给生理盐水)，末次给药30min后处死动物，取肝脏测定肝糖原含量。参见表5，Nar能提高肝脏糖原的含量，效果逊于市售降糖药物拜糖平。

Tab.5 Nar对四氧嘧啶小鼠肝糖原含量的影响(n＝8)

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs Model

实施例九：对四氧嘧啶小鼠体内酶活的影响

四氧嘧啶糖尿病小鼠连续灌喂给药8d，末次给药后禁食4h，处死小鼠，取其晶状体和小肠，测定酶活。该成分对四氧嘧啶小鼠晶状体醛糖还原酶活力有降低的作用。要好于市售降糖药物拜糖苹和格华止。参见表6。

Tab.6 Nar对四氧嘧啶小鼠晶状体醛糖还原酶活性的影响

与生理盐水组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

同时其对四氧嘧啶小鼠小肠α-葡萄糖苷酶活力也有一定降低的作用，但效果不明显。参见表7

表6Nar对四氧嘧啶小鼠小肠α-葡萄糖苷酶活性的影响

与生理盐水组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

Claims (3)

1.一种从中药菝葜中提取柚皮素的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将菝葜浸没在70％的乙醇中，浸出液浓缩后得浸膏，将该浸膏悬浮在蒸馏水中后，用石油醚萃取脱脂，脱脂后的水相再用乙酸乙酯萃取；

b.将乙酸乙酯相用200-300目硅胶柱层析分离，流动相为乙酸乙酯和甲醇按9∶1的体积比的混合液，根据薄层层析的结果收集前沿段的洗脱液，浓缩后再用200-300目硅胶柱层析分离，用氯仿和甲醇按(100～4)∶1的体积比的混合液进行梯度洗脱，根据薄层层析的结果收集前沿段的洗脱液，浓缩后析出沉淀物；该沉淀物再用氯仿和甲醇按9∶1的体积比的混合液洗脱后，再用甲醇重结晶，即得到白色针状晶体柚皮素。

2.中药菝葜提取物柚皮素在制备抑制醛糖还原酶活性药物中的应用。

3.中药菝葜提取物柚皮素在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性药物中的应用。

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