KR20100088634A - 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물 및 이것의 치료 용도 - Google Patents

프락시누스 엑셀시어 종자 추출물 및 이것의 치료 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 지방 합성을 차단하고, PPAR-α를 활성화하고, 혈당 강하 활성을 증가시키고, 체중을 감소시키고, 고인슐린혈증에 대해 공복 혈장 인슐린 수치를 억제하고, 인슐린 감수성을 향상시키고, 유익한 급성 인슐린 분비 자극 효과를 유발하는 것에 의한, 인간을 비롯한 피험체의 치료적 처치를 위해 투여될 수 있는 프락시누스 엑셀시어(Fraxinus excelsior) 종자 추출물에 관한 것이다. 상기 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물은, 특히, 단리된 화합물, 즉 일반명이 엑셀사이드 A인 (2S,3E,4S)2H-피란-4-아세트산-3-에틸리덴-2-[(6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실)옥시]-3,4-디하이드로-5-(메톡시카보닐)메틸 에스테르, 단리된 화합물, 즉 일반명이 엑셀사이드 B인 (2S,3E,4S)2H-피란-4-아세트산-3-에틸리덴-2-[(6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실)옥시]-3,4-디하이드로-5-(메톡시카보닐)2-(4-하이드록시페닐)에틸 에스테르 및 화합물 GI5, GI3, 누제나이드 및 올레오사이드 디메틸 에스테르를 포함한다.

Description

프락시누스 엑셀시어 종자 추출물 및 이것의 치료 용도{EXTRACT OF FRAXINUS EXCELSIOR SEEDS AND THERAPEUTIC APPLICATIONS THEREFOR}
제2형 당뇨병(DM-2)은 인슐린 결핍 및 인슐린 불감증을 특징으로 하는 일반적인 세계적 질환이다. DM-2는 높은 이환율 및 사망률과 관련된 건강 문제를 야기하는 심각한 질환으로 간주되고 있고, 미국에서는 주 사망 원인 중 6위를 차지하고 있다[Minino et al, 2007, National Vital Statistical Report, 55]. 당뇨병 환자의 수가 2025년에 이르러서는 전세계적으로 3억명으로 증가할 것으로 예측되고 있다[King et al, 1998, Diabetes Care, 21, 1414-31]. 미국에서는 인구의 7%(어린이와 성인 2천8십만명)가 당뇨병에 이환되어 있고[French, 2007, Inside, 12, 46-7], 이는 미국에서 2002년 의료비 지출 및 생산성 손실로 약 천3백2십억 달러의 비용을 발생시켰다[Hogan et al, 2003, Diabetes Care, 26, 917-32]. DM-2의 치료 방법은 인슐린 분비 및 인슐린 작용을 향상시키고 간의 글루코스 생산을 억제하고 글루코스 흡수를 억제하는 인슐린, 인슐린 유사체 또는 변성 인슐린을 사용하는 것을 포함한다[Moller, 2001, Nature, 414, 821-27]. 이러한 치료제 이외에도, 또한 DM-2 치료를 위한 전통적 의약이 전세계적으로 사용되고 있다. 1,200종이 넘는 유기체가 DM-2 증상의 치료를 위해 민간 요법으로 또는 실험적으로 사용되어 왔다[Marles and Farnsworth, 1996, Protocol J. Botanical Med., 1, 85-137].
빠르게 증가하는 비만 유병률은 미국에서 심각한 공공 보건 문제에 해당하는 것으로 일반적으로 인식되고 있다. 1999∼2000년 국립 건강 영양 조사 기관(National Health and Nutrition Examination Survey: NHANES)의 데이터에 따르면, 1988∼1994년 사이에 수행된 NHANES III 연구에 의해 상술된 55.9%와 비교하여 미국 성인 인구의 거의 2/3(64.5%)가 과체중이다. 또한 비만의 유병률은 동기간 동안 22.9%에서 30.5%로 급격히 증가하였다. 비만 인구수의 증가는 당뇨병을 비롯한 각종 비만 관련 질환의 발병 위험을 높일 수 있다[Flegal et al, 2002, JAMA. 288, 1723-1727 and Kuczmarski et al 1994, JAMA. 272, 205-221].
물푸레나무과(Oleaceae family) 식물인 프락시누스 엑셀시어 엘.(Fraxinus excelsior L.)은 온대성 기후의 아시아 및 유럽에서는 "커먼 애쉬(Common Ash)" 또는 "유러피언 애쉬(European Ash)"로 일반적으로 알려져 있다[Gilman and Watson, 1993, Fact Sheet ST-264, November]. 이 식물은 또한 모로코 남동쪽 지역인 타필라레(Tafilalet)에 널리 분포되어 있으며, 이 지역에서는 "라쌍 루스푸어(l'ssane l'ousfour)"로 알려져 있다. 타필라레 지역은 모로코 지역 중에서도 식물 요법 지식이 가장 발달한 지역으로 간주되고 있다[Eddouks et al, 2002, J. Ethnopharmacol. 82, 97-103]. 최근의 연구는 에프. 엑셀시어(FE)가 항균 활성 및 항산화 활성을 보유한다는 것을 보여주었다. FE의 메탄올 추출물은 정성적 α,α-디페닐-β-피크릴하이드라질(DPPH) 분석에서 1.35×10-2의 RC50으로 강력한 항산화 활성을 나타내었다. FE의 n-헥산 및 디클로로메탄 추출물은 또한 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 비롯하여 테스트된 8종의 그램 양성 및 그램 음성 병원성 박테리아에 대해 1.25×10-1 mg/mL 내의 최소 억제 농도(MIC)로 활성을 나타내었다[Middleton et al, 2005, Indian J. Pharma. Res., 2, 81-6]. 정상 혈압 래트 및 자발성 고혈압 래트 둘 다에 대해 FE의 혈압 강하 효과가 보고되었다. FE 종자의 수성 추출물을 매일 경구 투여하자 두 유형의 래트 모두에서 수축기 혈압이 현저히 감소되었고 배뇨가 현저히 개선되었다[Eddouks et al, 2005, J. Ethnopharmacol., 99, 49-54]. FE 종자의 수성 추출물은 정상 래트와 스트렙토조토신(STZ) 유발 래트에서 기저 혈장 인슐린 농도에 영향을 주지 않고 강력한 혈당 강하 및 고혈당 방지 활성을 나타내었다[Maghrani et al, 2004, J. Ethnopharmacol., 91, 309-16]. 신장에 의한 글루코스 재흡수의 플로리진 유사 억제 효과가 FE의 혈당 강하 효과에 대한 메커니즘 중 하나일 수 있다[Eddouks et al, 2004, J. Ethnopharmacol., 94, 149-54].
FE는 주로 쿠마린, 세코이리도이드(secoiridoid) 및 페닐에타노이드를 포함하는 것으로 보고되었다[Kostova and Iossifova, 2007, Fitoterapia 78, 85-106]. FE에서 발견되는 세코이리도이드는 올레오사이드(oleoside)로부터 유도된다. 이러한 유형의 세코이리도이드는 물푸레나무과 식물에만 존재한다[Egan et al, 2004, Biochem. Sys. Ecol., 32, 1069-71].
본 발명은 프락시누스 엑셀시어(일반명: 애쉬)의 종자 추출물로부터 단리한 신규한 세코이리도이드에 관한 것이다. 2종의 화합물이 (1) 화학식 C22H32O16으로 표시되는, 엑셀사이드 A(excelside A)로 명명된 (2S,3E,4S)2H-피란-4-아세트산-3-에틸리덴-2-[(6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실)옥시]-3,4-디하이드로-5-(메톡시카보닐)메틸 에스테르(도 1a), 및 (2) 화학식 C30H40O17로 표시되는, 엑셀사이드 B(excelside B)로 명명된 (2S,3E,4S)2H-피란-4-아세트산-3-에틸리덴-2-[(6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실)옥시]-3,4-디하이드로-5-(메톡시카보닐)2-(4-하이드록시페닐)에틸 에스테르(도 1b)로서 확인되었다. 상기 두 화합물은 외향 고리 8,9-올레핀성 작용기를 특징으로 하는 올레오사이드형 세코이리도이드이다.
본 발명은 또한 단리된 FE 유래 조성물을 얻는 방법에 관한 것이다. 이 조성물은 특유의 추출 및 단리 공정에 의해 얻을 수 있다. 접촉을 위한 용매의 표면적을 증가시키고 추출 효율을 높이기 위해, 상기 종자를 0.1 mm∼30 mm 범위의 입도를 갖는 과립으로 분쇄한다. 본 방법의 일 실시형태에서, 추출 온도는 2O℃∼100℃ 범위이다. 바람직한 실시형태에서, 추출 온도는 50℃∼7O℃ 범위이다. 식물 재료 대 추출 공정에서 사용되는 용매 혼합물의 비는 그램(g) 대 밀리리터(mL) 기준으로 1:1∼1:10으로 다양하다. 본 방법의 일 실시형태에서, 상기 비는 1:3∼1:8이다. 식물 재료가 용매 혼합물과 접촉하는 인큐베이션 시간은 약 2 시간∼약 24 시간 동안이다. 상기 추출 용매는 물, 물-알코올 혼합물(1%∼99% 알코올 수용액) 및 알코올일 수 있다. 바람직한 알코올은 에탄올(EtOH) 및 메탄올(MeOH)이다. 식물 재료와 용매를 인큐베이션한 후, 잔류 식물 재료로부터 용매를 분리하고, 추출 조성물이 일반적으로 약 1%∼35%의 에프. 엑셀시어 세코이리도이드를 함유하는 고체 성분을 가질 때까지 농축시킨다. 세코이리도이드는 2종의 신규한 올레오사이드형 글루코사이드, 즉 엑셀사이드 A 및 엑셀사이드 B, 이량체 세코이리도이드, 누제나이드(nuzhenide)(3)(도 1-c), GI 3(4)(도 1-d) 및 GI 5(5)(도 1-e)뿐만 아니라, 리그스트로사이드, 올레오사이드 디메틸 에스테르(6)(도 1-f) 및 올레오사이드-11-메틸 에스테르를 포함한다. 다른 성분들로는 페놀성 화합물, 살리드로사이드(salidroside), 쿠마린 및 플라보노이드를 포함한다. 추출물 형성이 완료된 후, 세코이리도이드를 단리한다. 상기 세코이리도이드는 크로마토그래피법에 의해 FE 추출물로부터 단리할 수 있다.
세코이리도이드는 FE의 건조 분말 추출물로부터 단리한다. 이 분말을 알코올에 용해시키고, 알코올에 의해 분말로부터 세코이리도이드를 추출한다. 그 후, 알코올을 증발시키고, 세코이리도이드를 포함하는 남아있는 잔류물을 역상 C-18 수지가 충전된 크로마토그래피 컬럼에 로딩한다. 상이한 화합물들을 함유하는 몇 개의 분획을 연속되는 물 및 10% MeOH/90% 물 및 MeOH 시스템으로 용리시킨다. 분획들을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석으로 비교하고, 유사한 HPLC 패턴을 갖는 용리물을 합한다. 합한 분획을 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에서 분리하고 클로로포름(CHCl3), CHCl3-메탄올 혼합물(90% CHCl3에서 출발하여, 80% CHCl3 → 100% MeOH 순)로 용리시켜 몇 개의 소분획을 얻는다. 소분획들을 HPLC로 비교하고, 엑셀사이드 A 및 엑셀사이드 B를 함유하는 분획들을 각각 합한다. 계속해서 합한 분획들을 C-18, MCI GEL CHP-20P 및/또는 세파덱스(Sephadex) LH-20 수지의 컬럼 크로마토그래피 조합으로 정제하여 순수한 엑셀사이드 A 및 엑셀사이드 B를 얻는다.
엑셀사이드 A 및 엑셀사이드 B의 새로운 화학 구조는 핵 자기 공명(NMR), 자외선(UV), 적외선(IR) 및 질량 분광분석(MS)을 비롯한 분광분석법을 이용하여 규명하며, 또한 물리적 특성도 측정한다. 세코이리도이드의 공지된 화학 구조는 NMR 스펙트럼을 문헌에 기재된 것과 직접 비교하여 확인한다. IR 스펙트럼은 KBr 플레이트를 사용하여 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 1600 FTIR 분광광도계로 기록하였다. 용매로서 중수소화 메탄올(CD3OD)을 사용하여 베리언(Varian) INOVA 400에서 NMR 스펙트럼을 기록하였다. 베리언 NMR 소프트웨어의 표준 구배 펄스 시퀀스를 이용하여 모든 2D 상관 스펙트럼을 얻었다. 이 상관 스펙트럼은 COSY(Correlation Spectroscopy: 상관 분광분석), TCOSY(Total Correlation Spectroscopy: 총 상관 분광분석), HMQC(Heteronuclear Multiple Quantum Coherence: 이핵 다중 양자 결맞음), HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation: 이핵 다중 결합 상관) 및 ROESY(Rotating Frame Overhauser Enhancement Spectroscopy: 회전 프레임 오버하우저 증강 분광분석)을 포함한다. 상기 HPLC 분석은 4 용매 펌프, 오토샘플러, 4 채널 온라인 탈기 장치, 광다이오드 어레이 검출기 및 Agilent Chemstation 소프트웨어가 구비된 Agilent 1100 모델 HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다. 분자량은 Finnigan LCQ 이온 트랩 질량 분광광도계에서 LC/MS ESI/APCI 모드를 이용하여 측정하였다. UV 스펙트럼은 Schimadzu의 UV-1700 UV-가시광 분광광도계로 측정하였다.
본 발명은 또한 2종의 이량체 세코이리도이드, 즉 GI5(5) 및 누제나이드(3)가 미분화 3T3-L1 세포에 미치는 억제 효과에 관한 것이다. 체중 증가의 주된 요소는 지방 세포 생성 과정을 통해 체내에 지방 조직이 축적되는 것이다. 지방 세포 생성은 지방 세포의 수와 크기의 증가를 특징으로 한다. 지방 세포의 수와 크기를 감소시키기 위해 지방 세포 합성을 억제함으로써 지방 세포 생성을 억제하는 것은 체중 억제로 이어진다.
본 발명은 프락시누스 엑셀시어(FE) 및 FE로부터의 단리된 세코이리도이드, 올레오사이드 디메틸 에스테르(6), 엑셀사이드 A(1) 및 GI3(4)에 의한 PPAR-α의 활성화에 관한 것이다. 퍼옥시솜 증식인자 활성화 수용체(PPAR)는 많은 세포내 과정 및 대사 과정을 조절하는 핵 수용체이다. PPAR-α는 간에서 주로 발현되며, 이곳에서 지방산 산화를 제어하는 데 있어서 중요한 역할을 한다[Reddy and Hashimoto, 2001, Annu Rev Nutr., 21, 193-230]. PPAR-α 활성화에 의한 지방산 산화의 유도는 혈장 지질 프로파일을 개선한다. 다양한 마우스 모델에서, PPAR-α 효현제는 혈장 중성지방을 줄이고, 지방 과다를 감소시키고, 간 및 근육 지방증을 개선하여, 그 결과 인슐린 감수성을 향상시키고 혈당을 낮춘다[Guerre-Millo et al, 2000, J. Biol. Chem., 275, 16638-42; and Kim et al, 2003, Diabetes, 52, 1770-8].
본 발명은 또한, 대사 증후군을 치료하여, DM-2 환자의 혈당을 감소시키고 체중 감소를 보조하고 DM-2 환자에 있어서 인슐린 저항성의 증상인 고인슐린혈증이 예방되도록 인슐린 수치의 균형을 맞추는 데 유용한 상기 조성물에 관한 것이다. 수컷 C57BL/6J 마우스에게 고지방 식이를 공급할 경우, 이들은 비만, 고혈당증 및 고인슐린혈증을 발생시킨다. 유효량의 FE의 투여는 마우스에서 글루코스 수치를 현저히 감소시키고 체중 및 체지방을 줄이며 혈장 인슐린 수치를 감소시킬 수 있다.
인체를 대상으로 한 임상 시험에서, 16명의 건강한 공복 지원자에게 글루코스 50 g을 공급하여 식후 혈당을 유도하고 FE 또는 플라시보(밀기울)를 투여하였다. FE 추출물 그룹은 플라시보 그룹에 비해 식후 혈장 글루코스 농도 증가량이 감소되었다. 이것은 혈당 곡선 아래 혈당 면적(AUC)을 통계적으로(P=0.02) 감소시켰다. 상기 FE 종자 추출물은 또한 글루코스를 투여한 후 90분째 유의적인(P=0.002) 인슐린 분비를 유도하였다.
첨부된 도면과 관련하여 후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태의 상세한 설명을 참고할 때 당업자에게는 본 발명의 추가적인 특징, 이점 및 특성이 명백할 것이다.
도 1a∼1f는 각각 엑셀사이드 A, 엑셀사이드 B, 누제나이드, GI3, GI5 및 올레오사이드 디메틸 에스테르의 분자 구조를 도시한다.
도 2는 1: 미처리, 2: 인슐린, 3: 인슐린 및 MeOH, 4: 0.004%, 0.02%, 0.05% 및 0.1% 농도의 누제나이드, 5: 0.004%, 0.02%, 0.05% 및 0.1% 농도의 GI5에 대한 화합물 GI5(5) 및 누제나이드(3)의 글루코스 흡수 활성(cpm)을 도시한다.
도 3은 DMSO(대조군 조건)의 효과와 비교하여 프락시누스 엑셀시어 엘. 종자 추출물 및 100 μM의 페노피브레이트(양성 대조군)에 의한 GAL4/PPAR-α 융합 수용체의 상대 활성화를 도시한다(값은 평균±SD임(n=4)). *P<0.05, **P<0.01; ***P<0.001. (스튜던트 t-검정).
도 4는 16주 처리 후 저지방(LF), 고지방(HF) 및 프락시누스(HF + FE 추출물)로 처리된 마우스의 공복 혈당(mg/dL) 결과를 도시한다.
도 5는 상이한 처리 기간(주) 후의 저지방(LF), 고지방(HF) 및 프락시누스(HF + FE 추출물)로 처리된 마우스의 평균 체중(g) 결과를 도시한다.
도 6은 10-5 M∼10-9 M 농도의 선택적인 합성 PPAR-α 활성화 인자 WY 14,643 및 10-4 M 농도의 단리된 화합물 및 1:10 FE 종자 추출물 수용액에 대한 리포터 세포주에서의 상대 PPAR-α 활성화율(%)을 도시하며, 여기서 화합물 명칭은 FE19028(누제나이드, 3), FE20015(GI3, 4), FE20031(올레오사이드 디메틸 에스테르, 6), FE21008(엑셀사이드 A, 1) 및 FE21023(GI5, 5)이다.
도 7은 각각 LF 그룹(n=10), HF 그룹(n=10) 및 FE 종자 추출물 그룹의 개별 마우스로부터 얻은 그물막 지방의 중량(g)을 도시한다.
도 8은 각각 LF 그룹(n=10), HF 그룹(n=10) 및 FE 종자 추출물 그룹의 개별 마우스로부터 얻은 복막뒤 지방의 중량(g)을 도시한다.
도 9는 각각 LF 그룹(n=10), HF 그룹(n=10) 및 FE 종자 추출물 그룹의 개별 마우스로부터 얻은 공복 혈장 인슐린 수치(ng/mL)를 도시한다.
도 10a 및 10b는, 각각 (a) 각각의 시점에서의 혈당 증가량 및 (b) 혈당 곡선 아래 면적(AUC)과 관련하여, 50 g의 글루코스를 투여한 건강한 지원자에 있어서의 혈당에 대한 프락시누스 엑셀시어 엘. 종자 추출물(FE)(1.0 g)과 대응하는 밀기울 플라시보(1.0 g)의 비교 결과(mmol/L 대 시간)를 도시하며, 이때 값은 평균±SEM이다. *P = 0.02, 쌍대 스튜던트 t-검정(n=16).
도 11a 및 11b는, 각각 (a) 각각의 시점에서의 혈당 증가량 및 (b) 혈중 인슐린 곡선 아래 면적(AUC)과 관련하여, 50 g의 글루코스를 투여한 건강한 지원자에 있어서의 인슐린 수치에 대한 프락시누스 엑셀시어 엘. 종자 추출물(1.0 g)과 대응하는 밀기울 플라시보(1.0 g)의 비교 결과(mU/ 대 시간)를 도시하며, 이때 값은 평균±SEM이다. *P = 0.002, 스튜던트 t-검정(n=16).
이하에서는, 도면과 하기 실시예를 참조하여 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물에 대한 본 발명의 바람직한 실시형태에 관해 설명한다.
실시예 1
물을 사용한 프락시누스 엑셀시어로부터의 세코이리도이드의 추출. 에프. 엑셀시어 종자 총 2.5 kg을 공기 중에서 건조시킨 후 입자 크기 약 1∼2 mm의 조대 분말로 분쇄하였다. 이 조대 분말을 80∼90℃의 퍼콜레이터에서 5 시간 동안 수침하고, 퍼콜레이터로부터 수추출물을 배수시켰다. 추출 공정은 3회 반복하였다. 모든 수추출물을 함께 합하여 회전식 진공 증발기에서 농축시켰다. 물을 증발시킨 후, 건조된 분말 추출물 총 550 g을 얻었다. HPLC 분석은, 이 분말 추출물이 2종의 주요 세코이리도이드, 즉 11.4%(중량/중량)의 누제나이드 및 6.2%의 GI3을 함유함을 나타낸다. 이 조성물은 또한, 리그스트로사이드, 올레오사이드 디메틸 에스테르 및 엑셀사이드 A를 비롯한 몇 종의 미량 세코이리도이드와 함께, 0.19%의 올레오사이드-11-메틸 에스테르, 0.41%의 엑셀사이드 B, 0.63%의 GI5, 0.2%의 살리드로사이드를 함유하였다.
실시예 2
물, 물-EtOH 및 EtOH를 사용한 프락시누스 엑셀시어로부터의 세코이리도이드의 추출. 5개 샘플을 제조하였고, 각각의 샘플은 5 g의 에프. 엑셀시어 종자를 함유하였다. 각각의 샘플을 분말로 분쇄하여 각각 200 mL의 물, 25% EtOH/75% 물, 50% EtOH/50% 물, 75% EtOH/25% 물 및 EtOH를 사용한 용매 추출을 실시하였다. 실온(22∼24℃)에서 24 시간 동안 추출한 후, 용매를 증발시키고, 잔류 고체를 HPLC로 분석하였다. 세코이리도이드 및 살리드로사이드 함량을 하기 표 1에 기재하였다.
Figure pct00001
실시예 3
에프. 엑셀시어로부터의 세코이리도이드의 단리. 메탄올 3.5 L를 첨가하여 실시예 1에 기재된 절차로부터 얻은 분말 추출물 500 g과 실온에서 3 시간 동안 혼합하였다. 메탄올 용액을 여과 공정에 의해 분말로부터 분리하였다. 동일한 공정을 1회 반복하고, 2개의 메탄올 추출물을 합하고 감압 하에 농축시켜 건조된 메탄올 추출물 총 54 g을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 물에 재용해시키고 여과하여 수불용성 물질을 제거하였다. 여액에 대해 추가로 C-18 수지 상에서 역상 컬럼 크로마토그래피 분리를 실시하고, 물 및 10% MeOH 수용액에서 100% MeOH까지의 구배 MeOH-물 용매 시스템으로 세척하였다. 총 7개의 분획을 수집하였다. 컬럼으로부터 용리된 각 분획을 진공 하에 증발시키고 HPLC 분석으로 합하였다. 분획 2, 3 및 7을 실리카 겔 수지가 충전된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하고, CHCl3로부터 출발하여 10% MeOH/CHCl3, 20% MeOH/CHCl3에서부터 100% MeOH까지의 클로로포름-메탄올 시스템으로 용리시켰다. 실리카 겔 컬럼으로부터 수집한 분획을 HPLC 분석으로 비교하고, 순수한 단일 화합물이 얻어질 때까지 각각의 분리된 용리액에 대해 MCI GEL CHP-20P 및/또는 세파덱스 LH-20 수지 상에서 컬럼 크로마토그래피를 반복적으로 실시하고, 물-메탄올 시스템으로 용리시켰다. 몇 종의 공지 화합물, 즉 누제나이드, GI3, GI5, 리그스트로사이드, 올레오사이드 디메틸 에스테르, 올레오사이드-11-메틸 에스테르 및 살리드로사이드와 함께, 2종의 신규 화합물, 즉 엑셀사이드 A 및 엑셀사이드 B가 발견되었다. 모든 화학 구조는 분광분석법으로 규명하였다.
실시예 4
엑셀사이드 A 및 엑셀사이드 B의 구조 규명: 엑셀사이드 A(1)를 비결정질 분말로서 얻었다. 이것의 분자식은 MS에 기초하여 C22H32O16으로 결정되었고 1H 및 13C NMR 데이터에 의해 확인되었다(표 2). UV 스펙트럼은 카보닐기와 공액된 이리도이드 에놀 에테르 시스템으로부터 유도된 232(sh) nm에서의 전형적인 흡수를 나타내었다. IR 스펙트럼은 νmax 3401 cm-1에서의 하이드록실 작용기, 1734, 1717 cm-1에서의 에스테르 및 1626 cm-1에서의 α,β-불포화 에스테르를 나타내었다. 이것의 1H, 13C-NMR 및 2D 상관 스펙트럼의 상세한 분석은 δH 7.51(s, H-3), 5.93(s, H-1), 6.08(qd, J = 7.2, 0.8 Hz, H-8), 1.72(d, J = 7.6 Hz, H3-10) 및 4.80(d, J = 8.0 Hz, H-1')에서의 양성자 신호 및 δC 155.2(C-3), 94.8(C-1), 124.7(C-8), 13.6(C-10) 및 100.5(C-1')에서의 상응하는 13C 신호에 의해 뒷받침되는 올레오사이드형 세코이리도이드 글루코사이드 부분을 보유하는 엑셀사이드 A를 나타내었다. δH 3.62(OCH3, δC 51.9) 및 3.70(OCH3, δC 52.3)에서의 2개의 메톡시 신호는 gHMBC 스펙트럼에서 각각 C-7(δC 173.7) 및 C-11(δC 168.6)과 상관성을 나타내었으며, 이는 엑셀사이드 A가 7,11-올레오사이드 디메틸 에스테르 단위를 갖는다는 것을 나타낸다[Boros and Stermitz, 1991, J. Nat. Prod., 54, 1173-246]. 이것 이외에도, β-글루코피라노실 부분으로 인한 추가적인 NMR 신호의 출현(δC 100.6, 77.6, 77.8, 71.6, 75.3 및 70.1)은, 엑셀사이드 A가 또 다른 글루코실을 갖는 7,11-올레오사이드 디메틸 에스테르를 보유함을 제시하였다. 글루코실의 위치는 올레오사이드 부분의 C-6'에 부착된 것으로 확인되었는데, 왜냐하면 7,11-디메틸 올레오사이드의 신호와 동일한 위치를 갖는 엑셀사이드 A와 비교할 때, C-6'에서의 신호의 7.5 ppm의 다운필드 이동 및 각각 C-3' 및 C-5'에서의 0.5 ppm 및 2.6 ppm의 업필드 이동이 있었기 때문이다. 이러한 감소는 gHMBC 상관 스펙트럼에 의해 추가로 뒷받침되었으며, 이때 δH 4.35 ppm에서의 H-1'"과 δC 70.1 ppm에서의 C-6' 사이와, H-6'(δH 4.15 & 3.84 ppm)과 C-1'"(δC 105.3 ppm) 사이에 교차 피크가 관찰되었다. 메틸기가 8,9-올레핀성 결합에서의 E-입체배치에 위치하였고, ROESY 스펙트럼에 의해 뒷받침되었으며, 이때 H-10(δH 1 -72)과 H-5(δH 3.96) 사이에 강한 상관성이 관찰되었다. 동일한 스펙트럼에서, H-1(δH 5.93)과 H-6(δ 2.51) 사이의 상관성은 C-1의 글루코실이 β-입체배치를 채택하였음을 제시하였다. 따라서, 엑셀사이드 A의 구조는 (2S,3E,4S)2H-피란-4-아세트산-3-에틸리덴-2-[(6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실)옥시]-3,4-디하이드로-5-(메톡시카보닐)메틸 에스테르인 것으로 확인되었고, 엑셀사이드 A로 명명되었다. 완전한 1H 및 13C NMR 데이터 할당을 하기 표 2에 기재하였다.
엑셀사이드 B(2)는 무색의 비결정질 분말로서 단리되었다. 이것의 분자식은 MS에 의해 C30H40O17로 결정되었고, NMR 데이터에 의해 확인되었다. (2)의 UV 스펙트럼에서, 카보닐기와 공액된 이리도이드 에놀 에테르의 230 nm에서의 전형적 흡수 이외에도, 275 nm 및 283 nm에서의 추가적인 흡수가 페놀의 존재를 나타내었다. IR은 νmax 3400 cm-1에서의 하이드록실, 1701, 1636 cm-1에서의 α,β-불포화 에스테르 및 1518 cm-1에서의 방향족 고리를 나타내었다. 엑셀사이드 B의 1H NMR 및 13C 스펙트럼은 올레오사이드 부분으로 인한 전형적 신호를 나타내었다: δH 7.50(s, H-3), δC 155.2(C-3)에서의 올레핀성 신호, δH 5.94(s, H-1), δC 94.7(C-1)에서의 알릴릭 아세탈, δH 4.82(d, H-1'), δC 100.3(C-1')에서의 글루코실로부터의 아노머 신호, δH 6.05(d, H-8), δC 124.8(C-8)에서의 에틸리덴 기로부터의 올레핀성 양성자 및 δH 1.61(d, H3-10), δC 13.6(C-10)에서의 에틸리덴으로부터의 메틸. 관찰된 페닐에타노이드 신호뿐만 아니라 δH 6.71(2H, dd, J = 6.8, 2.8 Hz) 및 δH 7.02(2H, dd, J = 6.8, 2.8 Hz)에서의 방향족 고리에서의 AA'BB' 스핀 시스템은 페닐에타노이드의 파라 치환 패턴을 제시하였다. gHMBC에서 δH 4.26 ppm에서의 H-1"과 δC 67.0 ppm에서의 C-7 사이에 확인된 긴 범위의 1H-13C 상관성은 페닐에탄올이 C-7 위치에 부착되었음을 제시하였으며, 이것은 엑셀사이드 B의 구조를 파라-하이드록시페닐에탄올 메틸 올레오사이드 에스테르인 리그스트로사이드와 관련시켰다[Takenaka et al, 2000, Phytochemistry, 55, 275-84]. 엑셀사이드 A와 유사하게, 엑셀사이드 B에서의 명백한 추가적인 β-글루코피라노실 단위는 C-6'에 부착된 것으로 제시되었다. 이것은 리그스트로사이드의 것과 비교할 때 엑셀사이드 B의 C-6'에서의 C-13 신호에 의한 7.3 ppm의 다운필드 화학 이동 및 각각 C-3' 및 C-5'에서의 0.7 ppm 및 2.9 ppm의 업필드 이동에 의해 확인되었다. 이러한 관계의 추가적인 확인은 gHMBC 스펙트럼에서 관찰되었는데, 여기에서는 δH 4.31(H-1'")에서의 글루코실로부터의 아노머 신호와 δC 70.1(C-6')에서의 아노머 신호 사이에 강한 상관성이 있었다. 메틸기의 위치는, gHMBC 스펙트럼에서, 관찰된 δH 3.69(OCH3)에서의 신호와 δC 168.7(C-11)에서 신호의 긴 범위 교차 피크로 인하여 C-11에 할당되었다. 따라서, 화합물 엑셀사이드 B는 (2S,3E,4S)2H-피란-4-아세트산-3-에틸리덴-2-[(6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실)옥시]-3,4-디하이드로-5-(메톡시카보닐)2-(4-하이드록시페닐)에틸 에스테르로서 지정되었고, 엑셀사이드 B로 명명되었다. 1H 및 13C NMR 데이터 할당을 하기 표 2에 기재하였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
참조 표준으로서의 테트라메틸실란(TMS)에 대해 백만분율(ppm)로 표시된 화학 이동 δ; 신호 다중도는 단일선(s), 이중선(d), 삼중선(t), 사중선(q), 이중선의 이중체(dd), 사중선의 이중체(dq) 및 다중선(m)으로 기록된다; 괄호 안의 결합 상수는 Hz로 표시된다; NMR 스펙트럼을 얻기 위해 이용된 용매는 CD3OD이다.
실시예 5
미분화 3T3-L1 세포에 대한 GI5(5) 및 누제나이드(3)의 억제 효과. 체중 증가의 주된 요소는 지방 세포 생성 과정을 통해 체내에 지방 조직이 축적되는 것이다. 지방 세포 생성은 지방 세포의 크기와 수의 증가를 특징으로 한다. 에프. 엑셀시어로부터 단리된 세코이리도이드, GI5 및 누제나이드는 각각 미분화 3T3-L1 세포가 분화 지방 세포로 분화되는 경로를 차단하는 것에 의해 현저한, 또, 경미한 지방 세포 생성 억제 활성을 나타내어, 체중 조절과 체지방 감소에 대한 효과를 발휘하였다. 3T3-L1 전구 지방 세포를 화합물의 존재 또는 부재 하에 메틸이소부틸크산틴, 덱사메타손 및 인슐린(MDI) 호르몬 혼합물로 분화되도록 유도하였다. 분화 유도 10일 후, 처리된 세포를, 분화의 간접적 측정 기준(지방 세포 생성)인 그 각각의 글루코스 흡수 활성에 대해 분석하였는데, 그 이유는 전구 지방 세포는 인슐린에 의해 유도된 글루코스 수송체-4(GLUT4) 매개 글루코스 흡수를 행할 수 없는 반면, 완전히 분화된 지방 세포는 이러한 흡수를 행할 수 있기 때문이다. 화합물, GI5 및 누제나이드가 4 가지의 상이한 농도로 사용되었다: 0.004%, 0.02%, 0.05% 및 0.1%. 미처리(미분화) 세포가 음성 대조군으로서 사용된 한편, 인슐린이 양성 대조군으로서 사용되었다. 상기 화합물의 용매인 메탄올(MeOH) 역시 대조군으로서 사용되었다. 결과는 에프. 엑셀시어로부터 단리된 GI5 및 누제나이드가, 각각 미분화 3T3-L1 세포에서 분화 지방 세포로 분화되는 경로를 차단하는 것에 의한 현저한, 또 경미한 지방 세포 생성 억제 활성을 보유하여, 체중 조절 및 체지방 감소에 영향을 미친 것으로 나타났다(도 2 참조).
실시예 6
프락시누스 엑셀시어의 PPAR-α 활성화. 퍼옥시솜 증식인자 활성화 수용체(PPAR)는 다수의 세포내 과정 및 대사 과정을 조절하는 핵 수용체이다. PPAR-α는 간에서 주로 발현되며, 이곳에서 지방산 산화를 제어하는 데 있어서 중요한 역할을 한다[Reddy and Hashimoto, 2001, Annu Rev Nutr., 21, 193-230]. PPAR-α 활성화에 의한 지방산 산화의 유도는 혈장 지질 프로파일을 개선한다. 다양한 마우스 모델에서, PPAR-α 효현제는 혈장 중성지방을 줄이고, 지방 과다를 감소시키고, 간 및 근육 지방증을 개선하여, 그 결과 인슐린 감수성을 향상시키고 혈당을 낮춘다[Guerre-Millo et al, 2000, J. Biol. Chem., 275, 16638-42; and Kim et al, 2003, Diabetes, 52, 1770-8].
실시예 2에 기재된 바와 같이 용매로서 물을 사용하여 얻은 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물(FE 추출물)은 PPAR-α를 활성화시키는 것으로 입증되었다. DMSO(대조군 조건)와 비교한 FE 추출물 및 페노피브레이트(양성 대조군)에 의한 PPAR-α의 상대 활성화는 GAL4/PPAR-α 수용체 형질감염 세포와 함께 인큐베이션한 후 활성 화합물로부터 얻은 루시퍼라제(유전자 리포터)의 발광 신호로서 계산되었다. 먼저, COS-7 세포(DMEM + 10% FCS 중에서 배양함)를 융합 단백질 GAL4/PPAR-α 및 루시퍼라제를 보유하는 DNA 구성체로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염을 위해, 먼저, pTK-pGL3 플라스미드의 티미딘 키나제 프로모터 앞에 GAL4(효모 전사 인자) DNA 결합 부위 5 카피를 삽입함으로써 플라스미드 pGAL5-TK-pGL3를 구성하였다. 그 후, hPPAR-α DEF 도메인(aa 180-464)을 PCR 증폭시킴으로써 플라스미드 pGAL4-hPPAR-α를 구성하였다. 형성된 PCR 생성물을 pBD-GAL4(미국 라호야 소재의 Stratagene 제품)에 클로닝하고, 이어서 키메라를 pCDNA3 벡터에 서브클로닝하였다. 형질감염 후, COS-7 세포를 0 ㎍/mL(대조군 조건), 1 ㎍/mL, 3 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 30 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 300 ㎍/mL 및 1,000 ㎍/mL의 FE 추출물, 또는 100 μM의 페노피브레이트(양성 대조군)와 함께 24 시간 동안 인큐베이션하였다. DMSO를 용매로 사용하였다. 인큐베이션 후, 세포를 수거하여 루시퍼라제 분석을 수행하였다. FE 추출물 및 페노피브레이트에 의한 PPAR-α의 활성화는 루시퍼라제 발현으로 이어졌고 그 결과 발광 신호가 증가되었으며, 이는 Tecan 울트라 분광광도계(오스트레일리아 Tecan 제품)로 측정하였다. 결과는, 대조군(DMSO)의 발광 활성과 비교한, FE 추출물 및 페노피브레이트로 인해 방출된 발광 신호에 비례하는 GAL4/PPAR-α의 상대 활성화로서 표현되었다. 결과는 각 테스트에 대한 4회 시험의 평균±SD로서 기록된다(도 3). 그룹 간의 차이는 스튜던트 t-검정(XLSTAT 2008, Addinsoft™, USA)을 이용하여 계산하였다. FE 추출물에 의한 PPAR-α 활성화 결과는 도 3에 도시하였다. FE 추출물은 1.000 ㎍/mL에서 PPAR-α 활성화의 18%를 나타내었다. 결과는 참조 화합물로서 사용된 PPAR-α의 활성화 인자인 페노피브레이트에 대한 백분율(%)로서 나타낸다.
PPAR-α를 활성화시키는 FE 추출물의 능력은 동물 실험에서 관찰된 혈당 강하 효과를 부분적으로 설명할 수 있었다.
실시예 7
수컷 C57BL/6J 마우스에 대한 FE 추출물의 혈당 강하 활성. 수컷 C57BL/6J 마우스를 3개 그룹, 즉 1) 20 마리의 수컷 마우스에게 저지방 식이(LF)로 매일 약 10 kcal의 섭취량을 공급한 음성 대조 그룹; 2) 20 마리의 마우스에게 고지방 식이(HF)를 매일 약 60 kcal의 섭취량으로 공급한 양성 대조 그룹으로서, 이 그룹의 마우스는 고지방 식이로 인하여 비만, 고혈당증 및 고인슐린혈증을 발생시킴; 3) 10 마리의 수컷 마우스에게 그룹 2에서와 같이 고지방 식이를 공급하되, 식이에 0.5% FE 추출물도 함께 혼합한 0.5% FE 추출물 그룹. 사료와 음용수 섭취량 및 체중을 매주 측정하였다. 이상 및 독성 가능성의 징후를 모니터링하였다. 꼬리 정맥으로부터 혈액을 샘플링하여 혈당 측정기로 공복 혈당 수치를 측정하였다. 실험 전에 기저 데이터를 측정하였다. 3 그룹 간에 통계적 차이는 없었다.
처리 16주 후, FE 추출물로 처리된 그룹의 마우스는 고지방 대조 그룹의 마우스보다 유의적으로 낮아진 공복 혈당 수치를 보였으며(p<0.001), 이는 FE 추출물의 강한 혈당 강하 효과를 나타내었다(도 4).
실시예 8
수컷 C57BL/6J 마우스에 대한 FE 추출물의 체중 감소 활성. 실시예 7에서의 동일한 그룹으로부터의 각각의 마우스의 체중을 측정하였다. 3 그룹 간에 기저 체중의 통계적 차이는 없었다. 처리 16주 후, 고지방 처리 그룹(그룹 2 및 3)의 모든 마우스는 저지방 처리 그룹의 마우스보다 유의적으로 더 많은 체중 증가가 있었다. 그러나, FE 그룹에서의 체중 증가 정도는 양성 대조 그룹과 비교하여 훨씬 더 낮았으며, 이는 체중 억제에 대한 FE 추출물의 활성을 나타내는 것이다(도 5).
실시예 9
엑셀사이드 A(1), GI3(4) 및 올레오사이드 디메틸 에스테르(6)의 PPAR-α 활성. 프락시누스 엑셀시어(FE) 종자 수추출물로부터 단리한 5종의 단일 화합물을 PPAR-α 활성에 대해 테스트하였다. 합성 및 선택성 PPAR-α 활성화 인자 WY 14,643이 양성 대조군으로서 사용되었고, 이들 화합물을 용해시키는 데 사용된 DMSO가 이 분석에서 음성 대조군으로서 사용되었다. 5종의 순수한 세코이리도이드는 10-4 M의 농도에서 부분적으로 활성을 보였다. 화합물 엑셀사이드 A, 올레오사이드 디메틸 에스테르 및 GI3은 우수한 활성을 보였다(도 6).
실시예 10
수컷 C57BL/6J 마우스에 대한 프락시누스 엑셀시어(FE) 종자 추출물의 지방 감소. 16주 처리 후 실험 종료시(실시예 7로부터), 모든 그룹의 마우스를 마취시켜 희생시켰다. 개개의 마우스로부터 그물막 지방 및 복막뒤 지방을 수집하여 칭량하였다. 결과는 FE 종자 추출물이 각각 그물막 지방 증가를 18.3% 및 복막뒤 지방 증가를 17.8% 감소시켰음을 보여 주었다(도 7 및 8).
실시예 11
수컷 C57BL/6J 마우스에 대한 프락시누스 엑셀시어(FE) 종자 추출물의 공복 혈장 인슐린 수치 감소. 실험 종료시(실시예 7로부터), 마우스 ELISA 키트를 사용하여 공복 혈장 인슐린 수치를 측정하였다. 프락시누스 종자 추출물로 처리된 마우스는 고지방 식이 대조 그룹의 마우스에 비해 현저히 더 낮은 공복 혈장 인슐린 수치를 나타내었다(P<0.05)(도 9).
실시예 12
인간에 있어서의 프락시누스 엑셀시어(FE) 종자 추출물의 혈당 강하 활성. 인간에 있어서의 본 발명 조성물의 효과를 평가하기 위해, 인간에 대해 무작위화, 이중 맹검, 플라시보 효과 통제 및 교차 디자인 연구를 수행하였다. 인도에서 총 16명의 건강한 개인(남성 11명, 여성 5명)을 모집하였다. 연령이 25∼55세이고, 체질량 지수가 26±2.2 kg/m2이며, 공복 혈당이 4.4±0.09 mmol/L인 사람을 피험자로 하였다. FE 종자 추출물을 처리 그룹에 사용하였고, 밀기울 분말을 플라시보 그룹에 사용하였다. 이 연구 대상의 1인 1일 투여량은 FE 종자 추출물 1 g이었다. 혈당 반응 평가를 위한 글루코스 투여(100 mL 물 중 50 g) 전에 피험자에게 FE 종자 추출물 캡슐 2개(각각 500 mg) 또는 플라시보 캡슐 2개(각각 밀기울 500 mg)를 단일 용량으로서 경구 투여하도록 지시하였다. 1주간의 워시아웃 기간 후, 2개 그룹을 서로 교체하였다. 연구 기간 동안, 0, 15, 30, 45, 60, 90 및 120분째 손가락 단자 혈액 샘플을 수집하였다. 0분째 공복 혈액 샘플을 수집한 후 즉시 물 100 mL와 함께 테스트 추출물/플라시보를 투여하였다. 그 후, 피험자는 5∼8분 내에 글루코스 음용수(물 100 mL 중 D-글루코스 50 g, Qualigens Co., Glaxo India)를 섭취하였다. 이 시점에 타이머를 가동하였다. 글루코스 음용 시작 후 15, 30, 45, 60, 90 및 120분째 추가적인 손가락 단자 혈액 샘플을 수집하였다. 글루코스 농도는 Bayer 글루코미터(혈당측정기) 및 Essentia 글루코트립(glucotrip)을 사용하여 모세관 전혈로 측정하였다. 다양한 시간 간격에 혈당 농도에 대해 플라시보 처리 그룹과 FE 처리 그룹 둘 다에 대한 양의 값 증가량의 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였다. 양측 쌍대 스튜던츠 t-검정을 이용하여 그룹 간의 유의적인 차이를 계산하였다. 분석은 XLSTAT 2008 소프트웨어(Addinsoft™, 미국)를 이용하여 수행하였다. P<0.05에서 통계적 유의성이 성립되었다. 모든 데이터는 평균±SEM으로 기록된다.
쌍대 비교에 의한 혈당 증가량의 그래프는, 실험 기간 동안, 대응하는 밀기울 플라시보와 비교하여, 15분(2.0±0.26 mmol/L vs 1.7±0.21 mmol/L), 30분(4.0±0.41 mmol/L vs 3.7±0.33 mmol/L), 45분(4.2±0.41 mmol/L vs 3.7±0.47 mmol/L), 60분(3.4±0.46 mmol/L vs 3.4±0.41), 90분(1.8±0.38 mmol/L vs 1.6±0.31 mmol/L)∼120분(0.58±0.29 mmol/L vs 0.21±0.27 mmol/L)의 FE 종자 추출물에 의한 식후 혈당 수치의 감소를 보여주었다(도 10a). 쌍대 스튜던츠 t-검정은, 평균 AUC에 대한 처리(FE 대 플라시보) 효과에 있어서의 차이(299.8±28.8 min. mmol/L vs 273.2±25.2 min. mmol/L)가 통계적으로 유의적인 것임(P=0.02)을 나타내었다. 결과는 도 10b에 도시되어 있다.
실시예 13
인간에 대한 프락시누스 엑셀시어(FE) 종자 추출물의 급성 인슐린 분비 자극 효과. 이 조성물의 인슐린 분비 자극 효과는 실시예 12에 기재된 임상 연구의 추가적 목적으로서 평가되었다. 테스트 FE/플라시보로 처리된 건강한 피험자의 0, 30, 60, 90 및 120분째 정맥혈 샘플(7∼8 mL)을 혈청 분리기 튜브에 수집하였다. 이 혈액을 15분 동안 응고되도록 두었다가 1,500 ×g로 10분 동안 원심분리하였다. 그 후, 얻어진 혈청을 전기 화학발광 면역분석(ECLIA)을 이용하여 인슐린에 대해 분석하였다. 상이한 시간 간격에 인슐린 수치를 얻기 위해 플라시보 그룹과 FE 처리 그룹 둘 다에 대한 양의 값 증가량의 혈중 인슐린 면적 아래 곡선(AUC)을 계산하였다. 양측 쌍대 스튜던트 t-검정을 이용하여 그룹 간의 통계적 차이를 계산하였다. 분석은 XLSTAT 2008 소프트웨어(Addinsoft™, 미국)를 이용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 P<0.05에서 성립되었다. 모든 데이터는 평균±SEM으로 기록된다. FE(55.5±4.6 mU/L)는 플라시보(43.5±5.0 mU/L)에 비해 90분째 유의적인(P=0.002) 인슐린 분비를 유도하였다(도 11a). 플라시보 처리 그룹(5,996.3±594.58 min.mU/L)에 비해 FE 처리 그룹(6,041.6±340.5 min.mU/L)에서 평균 혈중 인슐린 AUC(0∼120분)에서 유의적인 차이가 관찰되지 않았다(도 11b).
90분째의 인슐린 분비의 자극은 췌장 섬 세포에 대한 FE의 직접적 작용인 것으로 생각되며, 이것은 연구 종료시(120분) 정상 상태로 회복되었다. 이는 이같은 경우에 인슐린 저항성을 감소시키고 인슐린 감수성을 향상시킬 수 있다. 또한, 처리 그룹과 플라시보 그룹 간에 평균 혈중 인슐린 AUC에 있어서 유의적인 차이가 없었기 때문에, 추출물의 사용은 안전하고 처리 후 수시간이 지나도 결과적으로 고인슐린혈증이 나타나지 않는다.
당업자에게 알려져 있는 바와 같이, FE 추출물의 유효량은 처리받는 동물 또는 사람의 체중에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, FE 추출물은, 처방전 없이 살 수 있는 의약품 및 건강 보조 식품에 통상적으로 사용되는 것과 같은 그러한 충전제, 첨가제, 결합제, 부형제, 향료 등과 함께, 액제, 분말제 또는 캐플릿, 정제 또는 캡슐제 또는 다른 통상적인 의약 형태를 형성하는 제제로 임의의 통상적인 매질에 의해 전달될 수 있다.
당업자는 본 발명이 개시된 실시형태가 아닌 다른 형태로도 보호될 수 있으며, 개시된 수량 및 수치 범위는 예시를 위해 제시된 것이며 한정을 의도한 것이 아님을 이해할 것이다.

Claims (30)

  1. 약 1 중량%∼약 15 중량%의 누제나이드(nuzhenide),
    약 1 중량%∼약 17 중량%의 GI3,
    약 0.5 중량%∼약 1 중량%의 올레오사이드 메틸 에스테르(oleoside methyl ester),
    약 0.03 중량%∼약 0.12 중량%의 엑셀사이드 B(excelside B),
    약 0.1 중량%∼약 1.7 중량%의 GI5, 및
    약 0.08 중량%∼약 0.7 중량%의 살리드로사이드(salidroside)
    를 포함하는 프락시누스 엑셀시어(Fraxinus excelsior) 종자 추출물.
  2. (2S,3E,4S)2H-피란-4-아세트산-3-에틸리덴-2-[(6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실)옥시]-3,4-디하이드로-5-(메톡시카보닐)메틸 에스테르의 단리된 화합물.
  3. (2S,3E,4S)2H-피란-4-아세트산-3-에틸리덴-2-[(6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노실)옥시]-3,4-디하이드로-5-(메톡시카보닐)2-(4-하이드록시페닐)에틸 에스테르의 단리된 화합물.
  4. 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물을 투여함으로써 피험체를 치료적으로 처치하는 방법.
  5. 피험체를 치료하는 데 유효한 양의 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물을 투여함으로써 지방 합성을 차단하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물이 GI5를 포함하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물이 누제나이드를 포함하는 것인 방법.
  8. 피험체를 치료하는 데 유효한 양의 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물을 투여함으로서 PPAR-α를 활성화시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물이 GI3인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물이 올레오사이드 디메틸 에스테르인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물이 엑셀사이드 A인 방법.
  12. 피험체를 치료하는 데 유효한 양의 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물을 투여함으로써 혈당 강하 활성을 유발하는 방법.
  13. 피험체를 치료하는 데 유효한 양의 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물을 투여함으로써 체중을 감소시키는 방법.
  14. 피험체를 치료하는 데 유효한 양의 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물을 투여함으로써 체지방을 감소시키는 방법.
  15. 피험체를 치료하는 데 유효한 양의 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물을 투여함으로써 고인슐린혈증에 대해 공복 혈장 인슐린 수치를 조절하는 방법.
  16. 피험체를 치료하는 데 유효한 양의 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물을 투여함으로써 인슐린 감수성을 향상시키고 유익한 급성 인슐린 분비 자극 효과를 유발하는 방법.
  17. 피험체를 치료하는 데 유효한 양의 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물을 투여함으로써 대사 증후군을 치료하는 방법.
  18. 피험체를 치료하는 데 유효한 양의 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물을 투여함으로써 제2형 당뇨병을 치료하는 방법.
  19. 피험체를 치료하는 데 유효한 양의 프락시누스 엑셀시어 종자 추출물을 투여함으로써 고인슐린혈증을 예방하는 방법.
  20. 제4항, 제5항, 제8항 또는 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험체가 인간인 방법.
  21. 프락시누스 엑셀시어 종자를 입자로 분쇄하는 단계;
    분쇄된 입자를 용매 혼합물과 접촉시키는 단계;
    상기 분쇄된 입자를 상기 용매 혼합물로부터 분리하는 단계;
    분말을 알코올에 용해시키는 단계; 및
    상기 알코올을 증발시키는 단계
    를 포함하는 공정에 의해 프락시누스 엑셀시어 종자로부터 세코이리도이드를 추출하고 단리하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 분쇄된 입자가 약 0.1 mm∼30 mm의 직경을 갖는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 추출 온도가 20℃∼100℃인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 추출 온도가 50℃∼70℃인 방법.
  25. 제21항에 있어서, 분쇄된 입자 대 용매 혼합물의 비가 약 1 g 대 1 mL∼약 1 g 대 10 mL인 방법.
  26. 제21항에 있어서, 분쇄된 입자 대 용매 혼합물의 비가 약 1 g 대 3 mL∼약 1 g 대 8 mL인 방법.
  27. 제21항에 있어서, 상기 분쇄된 입자를 상기 용매 혼합물과 약 2 시간∼약 24 시간 동안 접촉시키는 것인 방법.
  28. 제21항에 있어서, 상기 용매 혼합물이 물, 물-알코올 혼합물 또는 알코올인 방법.
  29. 제21항에 있어서, 상기 용매 혼합물이 에탄올을 포함하는 것인 방법.
  30. 제21항에 있어서, 상기 용매 혼합물이 메탄올을 포함하는 것인 방법.
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