CN107693792A - 巨噬细胞靶向mTORC1激活剂用于控制NASH进展 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了巨噬细胞靶向mTORC1的激活剂用于控制NASH进展。本发明提供了能够降低巨噬细胞中mTORC1活性的物质在制备能够促进非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的产品中的应用。本发明通过研究巨噬细胞中mTORC1在非酒精性脂肪性肝炎中的作用，发现抑制巨噬细胞中mTORC1的活性能够加快非酒精性脂肪性肝炎的病情进展。本发明对于非酒精性脂肪性肝炎的发病机制的研究以及未来治疗策略的选择具有重要参考意义。

Description

巨噬细胞靶向mTORC1激活剂用于控制NASH进展
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及对巨噬细胞靶向mTORC1激活剂用于控制NASH进展。
背景技术
非酒精性脂肪性肝脏疾病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以肝内脂肪堆积为特征，包含一系列组织学改变的疾病，主要有单纯肝脏脂肪变性，非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，肝纤维化，肝硬化和肝癌。其发病率在发达国家为30％，发展中国家近10％，在一般人群中占20-30％，肥胖人群中为75-100％，是目前认为最普遍的肝脏疾病，可发展成终末期肝脏疾病。肥胖、高血压、血脂异常和胰岛素抵抗与NAFLD有密切关系。单纯肝脏脂肪变性可逆转为正常肝脏，而进展到NASH后，脂肪变性将伴随炎症、肝细胞凋亡以及不同程度的肝纤维化。目前对于NASH的治疗尚缺乏有效的治疗手段，所以对于其发病机制的进一步研究至关重要。根据最新提出的“多次打击”学说，一旦肝脏的胰岛素信号通路受损，巨噬细胞以及自然杀伤性T细胞等免疫细胞介导的炎症反应将伴随肝脏脂质沉积而发生，因此免疫细胞在NASH的进展中发挥了关键作用。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。mTOR以mTOR复合物1(mTOR complex 1，mTORC1)和mTOR复合物2(mTOR complex 2，mTORC2)两种形式发挥功能。mTORC1由mTOR，deptor，mLST8，TTI1–TEL2，raptor和PRAS40组成，mTORC2由mTOR，deptor，mLST8，TTI1–TEL2，protor，rictor和mSIN1组成。mTORC1和mTORC2在对于控制细胞生长与存活以及调节代谢平衡等方面具有不同的作用。mTORC1可感知来自营养物质、生长因子以及其他刺激，从而通过调控脂质合成、蛋白质合成以及自噬，进而影响细胞的生长与功能。
目前，巨噬细胞中mTORC1在NASH中的作用还未知。
发明内容
本发明的目的是通过研究巨噬细胞中mTORC1在非酒精性脂肪性肝炎中的作用，提供一种巨噬细胞中mTORC1的活性调节剂在控制非酒精性脂肪性肝炎的病情进展中的应用。
第一，本发明提供了能够降低巨噬细胞中mTORC1活性的物质在如下(A1)或(A2)中的应用：
(A1)制备能够促进非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的产品；
(A2)促进非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展。
第二，本发明提供了能够降低巨噬细胞中mTORC1活性的物质在如下(B1)-(B7)任一中的应用：
(B1)制备促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中巨噬细胞浸润的产品，或者促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中巨噬细胞浸润；
(B2)制备提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的血浆转氨酶的含量的产品，或者提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的血浆转氨酶的含量；
(B3)制备提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中炎症因子的表达量(如mRNA的表达量)的产品，或者提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中炎症因子的表达量(如mRNA的表达量)；
(B4)制备促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中胶原沉积的产品，或者促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中胶原沉积；
(B5)制备提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中纤维化标记物的表达量(如mRNA的表达量)的产品，或者提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中纤维化标记物的表达量(如mRNA的表达量)；
(B6)制备降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞消化凋亡肝细胞的能力的产品，或降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞消化凋亡肝细胞的能力；
(B7)制备干扰非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞溶酶体的分裂和/或酸化的产品，或干扰非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞溶酶体的分裂和/或酸化。
第三，本发明提供了一种构建非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的动物模型的方法。
本发明所提供的建非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的动物模型的方法，具体可包括如下步骤：降低患有非酒精性脂肪性肝炎的动物的巨噬细胞中mTORC1的活性，从而获得所述非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的动物模型。
第四，本发明提供了一种构建患有非酒精性脂肪性肝炎且具有如下(C1)-(C7)所示性状中至少一种的动物模型的方法。
本发明所提供的构建患有非酒精性脂肪性肝炎且具有如下(C1)-(C7)所示性状中至少一种的动物模型的方法，具体可包括如下步骤：降低患有非酒精性脂肪性肝炎的动物的巨噬细胞中mTORC1的活性，从而获得所述患有非酒精性脂肪性肝炎且具有如下(C1)-(C7)所示性状中至少一种的动物模型；
(C1)肝脏中巨噬细胞的浸润程度更高；
(C2)血浆转氨酶的含量更高；
(C3)肝脏中炎症因子的表达量(如mRNA的表达量)更高；
(C4)肝脏中胶原的沉积量更多；
(C5)肝脏中纤维化标记物的表达量(如mRNA的表达量)更高；
(C6)巨噬细胞消化凋亡肝细胞的能力更弱；
(C7)巨噬细胞溶酶体的分裂和/或酸化能力更弱。
第五，本发明提供了能够提高巨噬细胞中mTORC1活性的物质在如下(D1)或(D2)中的应用：
(D1)制备能够抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的产品；
(D2)抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展。
第六，本发明提供了能够提高巨噬细胞中mTORC1活性的物质在如下(E1)-(E7)任一中的应用：
(E1)制备抑制非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中巨噬细胞浸润的产品，或者抑制非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中巨噬细胞浸润；
(E2)制备降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的血浆转氨酶的含量的产品，或者降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的血浆转氨酶的含量；
(E3)制备降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中炎症因子的表达量(如mRNA的表达量)的产品，或者降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中炎症因子的表达量(如mRNA的表达量)；
(E4)制备抑制非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中胶原沉积的产品，或者抑制非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中胶原沉积；
(E5)制备提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中纤维化标记物的表达量(如mRNA的表达量)的产品，或者提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中纤维化标记物的表达量(如mRNA的表达量)；
(E6)制备提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞消化凋亡肝细胞的能力的产品，或提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞消化凋亡肝细胞的能力；
(E7)制备促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞溶酶体的分裂和/或酸化的产品，或促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞溶酶体的分裂和/或酸化。
前文所述的应用或方法中，所述肝脏中炎症因子具体可为如下中至少一种：TNF-α、MCP-1、iNOS。
前文所述的应用或方法中，所述肝脏中纤维化标记物具体可为如下中至少一种：α-SMA、collagenI、TIMP1。
前文所述能够降低巨噬细胞中mTORC1活性的物质可为任何能够使巨噬细胞中mTORC1活性降低的物质，可以是巨噬细胞中mTORC1的活性抑制剂，也可以是能够通过基因编辑手段使巨噬细胞中mTORC1的组成蛋白Raptor的编码基因被特异性敲除的基因编辑工具(如Cas9、TALEN等)。在本发明的一个实施例中，所述能够降低巨噬细胞中mTORC1活性的物质具体为能够特异性敲除机体中巨噬细胞Raptor基因表达的基因编辑工具(loxP-cre系统)。
前文所述能够提高巨噬细胞中mTORC1活性的物质可为任何能够使巨噬细胞中mTORC1活性提高的物质，可以是巨噬细胞中mTORC1的活性促进剂，也可以是能够通过基因编辑手段使巨噬细胞中TSC1敲减的基因编辑工作(如TSC1-shRNA的表达载体)。
前文所述的非酒精性脂肪性肝炎患病机体可为患有非酒精性脂肪性肝炎的人，也可为患有非酒精性脂肪性肝炎的动物模型。在本发明的一个实施例中，所述非酒精性脂肪性肝炎患病机体具体为高果糖高软脂酸高胆固醇(high-fructose,palmitate andcholesterol，FPC)饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型或蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine-and choline-deficient，MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型。
本发明通过研究巨噬细胞中mTORC1在非酒精性脂肪性肝炎中的作用，发现巨噬细胞靶向使用mTORC1的活性调节剂可以控制非酒精性脂肪性肝炎的病情进展。抑制巨噬细胞中mTORC1的活性能够加快非酒精性脂肪性肝炎的病情进展，增强巨噬细胞中mTORC1的活性能够延缓非酒精性脂肪性肝炎的病情进展。本发明对于非酒精性脂肪性肝炎的发病机制的研究以及未来治疗策略的选择具有重要参考意义。
附图说明
图1为将正常人、轻度NASH及重度NASH病人肝脏切片进行免疫荧光染色的代表图。绿色为p-S6，红色为巨噬细胞的标记物CD68，蓝色为DAPI。
图2为FPC喂养后体重及组织重量。Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予FPC饮食24周后肝脏重量、脂肪组织重量以及体重。ND，正常饮食；Rf/f，Raptorflox/flox小鼠(对照小鼠)；Rf/fCre，Mac-RaptorKO小鼠(巨噬细胞Raptor敲除小鼠)。*p<0.05，n＝6。
图3为Mac-RaptorKO小鼠FPC饮食喂养后出现更严重的NASH表型。A：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予FPC饮食24周后油红O染色显示，FPC饮食诱导了肝脏脂质沉积，但Mac-RaptorKO小鼠与对照小鼠之间没有差异；B：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予FPC饮食24周后，抽提肝脏脂质并定量，FPC饮食增加了肝脏甘油三酯和胆固醇的含量，但Mac-RaptorKO小鼠与对照小鼠之间没有差异；C：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予FPC饮食24周后，IPGTT显示FPC饮食引起了糖耐量受损，但Mac-RaptorKO小鼠与对照小鼠之间没有差异；D：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予FPC饮食24周后，H&E染色(上)以及免疫组织化学染色标记巨噬细胞的标记物Mac-3均显示Mac-RaptorKO小鼠FPC饮食喂养后较对照小鼠肝脏巨噬细胞浸润更严重；E：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予FPC饮食24周后，Mac-RaptorKO小鼠FPC饮食喂养后较对照小鼠血浆转氨酶水平更高；F：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予FPC饮食24周后，Mac-RaptorKO小鼠FPC饮食喂养后较对照小鼠肝脏中TNFα，MCP-1和iNOS的mRNA表达水平更高；G：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予FPC饮食24周后，Mac-RaptorKO小鼠FPC饮食喂养后较对照小鼠天狼星红染色显示其肝脏中胶原沉积更为严重；H：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予FPC饮食24周后，Mac-RaptorKO小鼠FPC饮食喂养后较对照小鼠肝脏中α-SMA，collagen I和TIMP1的mRNA表达水平更高。ND，正常饮食；Rf/f，Raptorflox/flox小鼠(对照小鼠)；Rf/fCre，Mac-RaptorKO小鼠(巨噬细胞Raptor敲除小鼠)。*p<0.05，n＝6。
图4为Mac-RaptorKO小鼠MCD饮食喂养后出现更严重的NASH表型。A：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予MCD饮食4周后，油红O染色显示，MCD饮食诱导了肝脏脂质沉积，但Mac-RaptorKO小鼠与对照小鼠之间没有差异；B：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予MCD饮食4周后，抽提肝脏脂质并定量，MCD饮食增加了肝脏甘油三酯和胆固醇的含量，但Mac-RaptorKO小鼠与对照小鼠之间没有差异；C：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予MCD饮食4周后，H&E染色(上)以及免疫组织化学染色标记巨噬细胞的标记物Mac-3均显示Mac-RaptorKO小鼠MCD饮食喂养后较对照小鼠肝脏巨噬细胞浸润更严重；D：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予MCD饮食4周后，Mac-RaptorKO小鼠MCD饮食喂养后较对照小鼠血浆转氨酶水平更高；E：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予MCD饮食4周后，Mac-RaptorKO小鼠MCD饮食喂养后较对照小鼠肝脏中TNFα，MCP-1和iNOS的mRNA表达水平更高；F：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予MCD饮食4周后，Mac-RaptorKO小鼠MCD饮食喂养后较对照小鼠天狼星红染色显示其肝脏中胶原沉积更为严重；G：Mac-RaptorKO小鼠及对照小鼠给予MCD饮食4周后，Mac-RaptorKO小鼠MCD饮食喂养后较对照小鼠肝脏中α-SMA，collagen I和TIMP1的mRNA表达水平更高。ND，正常饮食；Rf/f，Raptorflox/flox小鼠(对照小鼠)；Rf/fCre，Mac-RaptorKO小鼠(巨噬细胞Raptor敲除小鼠)。*p<0.05，n＝7。
图5为凋亡肝细胞诱导了Mac-RaptorKO小鼠巨噬细胞的炎症反应。A和B分别为用MCD小鼠血浆(A)或凋亡肝细胞(B)处理Mac-RaptorKO及Raptorflox/flox小鼠的巨噬细胞6小时，检测TNFα，MCP-1和IL-6的表达水平，n＝3次独立实验；C：Mac-RaptorKO及Raptorflox/flox小鼠MCD或正常饮食4周后肝脏切片的TUNEL染色代表图(左)及统计图(右)，n＝7；D：Western blot检测Mac-RaptorKO及Raptorflox/flox小鼠MCD饮食处理后肝脏中cleavedcaspase-3，caspase-3，cleaved PARP和PARP的蛋白水平，n＝7。AH，凋亡肝细胞；Rf/f，Raptorflox/flox小鼠(对照小鼠)；Rf/fCre，Mac-RaptorKO小鼠(巨噬细胞Raptor敲除小鼠)，*p<0.05。
图6为Mac-RaptorKO小鼠的巨噬细胞消化凋亡肝细胞能力受损并且溶酶体的分裂和酸化出现障碍。A为实验流程图：用succinimidyleaster标记原代肝细胞后用紫外促凋亡，用荧光标记的凋亡肝细胞处理分离的腹腔巨噬细胞；B：用凋亡肝细胞处理Mac-RaptorKO及Raptorflox/flox小鼠来源的巨噬细胞30分钟，6小时和24小时，用F-actin标记细胞骨架；C：用30分钟时间点的图片计算吞噬率；D用Lysotracker标记巨噬细胞的溶酶体，再用荧光标记的凋亡肝细胞处理6小时，显示溶酶体内凋亡肝细胞的降解以及溶酶体的形态变化；E：用Lysotracker标记活的巨噬细胞，再用荧光标记的凋亡肝细胞处理实时监测肝细胞消化情况；F：Western blot检测Mac-RaptorKO及Raptorflox/flox小鼠来源巨噬细胞用凋亡肝细胞处理或不处理6小时后LAMP1的蛋白水平；G：Mac-RaptorKO及Raptorflox/flox小鼠的巨噬细胞用凋亡肝细胞处理或不处理6小时，用lysosensor监测细胞pH值。B-D，F-G，n＝5次独立实验；E，n＝3次独立实验。AH，凋亡肝细胞；Rf/f，Raptorflox/flox小鼠(对照小鼠)；Rf/fCre，Mac-RaptorKO小鼠(巨噬细胞Raptor敲除小鼠)，*p<0.05。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、巨噬细胞中mTORC1在非酒精性脂肪性肝炎中的作用的研究
一、NASH病人肝脏巨噬细胞中mTORC1的活性增加
5例轻度NASH病人、5例重度NASH病人的肝脏标本来自于其肝活检标本，6例正常人的肝活检标本来自评估其是否适合作为肝脏供体时。NASH的程度由病理专家根据H&E染色判断。S6是mTORC1的经典下游，其磷酸化的增加反应了mTORC1的活性增加。我们用免疫荧光的方法在人的肝脏切片中用CD68标记巨噬细胞，同时检测正常人以及NASH病人肝脏中巨噬细胞中pS6的含量。我们发现，轻度NASH病人肝脏切片中巨噬细胞中pS6的含量显著高于正常人，而进展到重度NASH的病人肝脏巨噬细胞中pS6的含量较轻度NASH病人低(图1)。
二、持续抑制巨噬细胞中mTORC1的活性加重了FPC饮食诱导的NASH症状
我们使用loxp-cre系统构建组织特异性的基因敲除鼠，即用Raptorflox/flox小鼠(Jackson Laboratory；货号013188)和LysM-cre小鼠杂交(Jackson Laboratories；货号004781)，得到巨噬细胞特异性Raptor敲除小鼠(Mac-RaptorKO小鼠)和相应的对照小鼠(Raptorflox/flox小鼠)(Ai D,Jiang H,Westerterp M,Murphy AJ,Wang M,Ganda A,Abramowicz S,et al.Disruption of mammalian target of rapamycin complex 1inmacrophages decreases chemokine gene expression and atherosclerosis.Circ Res2014；114:1576-1584.)。长时间的FPC饮食可诱导小鼠NASH(Wang X,Zheng Z,CavigliaJM,Corey KE,Herfel TM,Cai B,Masia R,et al.Hepatocyte TAZ/WWTR1PromotesInflammation and Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis.Cell Metab 2016；24:848-862.)。我们使用8周龄的雄性小鼠，给予其FPC饮食或正常饮食喂养24周。两种小鼠在给予FPC饮食后体重、脂肪组织重量、肝脏甘油三酯和胆固醇含量均增加，并且葡萄糖耐量受损，但两组小鼠之间没有差别(图2；图3中A-C)。但用Mac-3标记巨噬细胞后发现，与对照小鼠相比，FPC饮食处理后Mac-RaptorKO小鼠肝脏中有更多的巨噬细胞浸润(图3中D)。并且Mac-RaptorKO小鼠血浆转氨酶水平(图3中E)以及肝脏中TNFα、MCP-1和iNOS的mRNA表达水平均显著高于对照小鼠(图3中F)。除此之外，天狼星红染色显示Mac-RaptorKO小鼠肝脏具有更多的胶原沉积(图3中G)，肝脏纤维化的标记物α-SMA、collagen I和TIMP1的mRNA表达水平也进一步增加(图3中H)，提示巨噬细胞mTORC1缺乏促进了NASH向肝纤维化的进展。
三、持续抑制巨噬细胞中mTORC1的活性加重了MCD饮食诱导的NASH症状
为了进一步确定巨噬细胞中mTORC1缺乏对NASH的影响，我们使用了另一个NASH模型，即MCD饮食诱导的NASH。我们给予8周龄的雄性小鼠喂养MCD饮食和正常饮食4周。同样，我们发现MCD饮食处理的Mac-RaptorKO小鼠与对照小鼠相比，肝脏脂质沉积没有变化(图4中A-B)，但肝脏巨噬细胞浸润、血浆转氨酶水平和肝脏炎症因子表达均增加(图4中C-E)，肝脏胶原沉积和肝纤维化的标记物表达也显著增加(图4中F-G)。
四、缺乏mTORC1使巨噬细胞在凋亡肝细胞刺激下表达更多的炎症因子
因为肝脏固有的巨噬细胞，即Kupffer细胞在肝脏对血清中的脂质和病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)等介质产生炎性反应中起到关键作用并促进NASH的发展。我们首先用MCD饮食喂养小鼠的血浆处理Mac-RaptorKO小鼠和Raptorflox/flox小鼠腹腔来源巨噬细胞6小时，处理浓度为10％，发现与正常饮食喂养小鼠的血浆相比，MCD饮食喂养小鼠的血浆使得小鼠巨噬细胞TNFα、MCP-1和IL-6等炎症因子的表达增加，表明MCD饮食喂养小鼠血浆中存在促炎因子。但Mac-RaptorKO和Raptorflox/flox小鼠来源的巨噬细胞对其的反应没有差异(图5中A)。
而肝细胞的凋亡在NASH的进展中至关重要，巨噬细胞需要对其进行清除来减轻凋亡细胞对肝脏的影响。为了检测mTORC1缺乏的巨噬细胞是否对凋亡肝细胞的反应异常，我们培养了小鼠原代肝细胞，并用紫外线(100mJ/cm2,3分钟)促凋亡，48小时后1500g离心收集凋亡肝细胞。将凋亡的肝细胞处理巨噬细胞6小时(肝细胞与巨噬细胞比例约1:1)，发现Mac-RaptorKO小鼠来源的巨噬细胞炎症因子mRNA表达增加，提示其处理凋亡细胞能力受损导致了炎症反应(图5中B)。接下来我们用TUNEL染色检测Mac-RaptorKO小鼠凋亡肝细胞清除情况，但发现与对照小鼠相比凋亡细胞数量没有差异(图5中C)，剪切形式的caspase 3和poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)表达也没有变化(图5中D)，提示mTORC1缺乏的巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬能力没有影响。
五、缺乏mTORC1使巨噬细胞吞噬溶酶体功能障碍从而导致消化凋亡肝细胞的能力受损
为了确定巨噬细胞缺乏mTORC1对其处理凋亡肝细胞能力的具体影响，我们用Alexa Fluor 488-succinimidyl ester荧光标记肝细胞然后促凋亡，将标记的凋亡肝细胞与巨噬细胞共孵育30分钟、6小时和24小时(图6中A-B)。30分钟时，我们用吞噬了凋亡肝细胞的巨噬细胞数除以总的巨噬细胞数计算巨噬细胞的吞噬率，发现Mac-RaptorKO小鼠的巨噬细胞与对照小鼠的巨噬细胞对凋亡肝细胞的吞噬率没有差异(图6中C)。而到了6小时和24小时，对照小鼠来源的巨噬细胞中凋亡肝细胞明显变小，Mac-RaptorKO小鼠来源的巨噬细胞中的凋亡肝细胞的体积缩小明显减慢(图6中B)。
我们接下来用lysotracker和溶酶体表面标记物LAMP1标记巨噬细胞的溶酶体，发现Mac-RaptorKO小鼠的巨噬细胞溶酶体中的凋亡肝细胞降解减慢(图6中D-E)。Westernblot检测LAMP1的蛋白含量没有变化，提示mTORC1缺乏对溶酶体含量没有影响(图6中F)。
溶酶体中有大量的消化酶需要溶酶体的酸性环境。我们进一步用lysosensor根据pH标准曲线检测了巨噬细胞中溶酶体的pH值。我们发现对照小鼠巨噬细在加入凋亡肝细胞6小时后，胞溶酶体pH值降低至4.56；但Mac-RaptorKO小鼠的巨噬细胞溶酶体酸化受到抑制(图6中G)。
因此，我们认为mTORC1缺失可通过影响巨噬细胞溶酶体的分裂和酸化从而使其消化凋亡肝细胞的能力受损，从而导致巨噬细胞炎症反应进而加重NASH的进展。
综合以上实施例部分的全部结果，可见：对巨噬细胞靶向使用mTORC1的活性调节剂来控制非酒精性脂肪性肝炎的病情进展会成为一种可能。抑制巨噬细胞中mTORC1的活性能够加快非酒精性脂肪性肝炎的病情进展(用于制备各种动物模型)，增强巨噬细胞中mTORC1的活性能够延缓非酒精性脂肪性肝炎的病情进展(用于NASH的治疗)。

Claims (9)

1.能够降低巨噬细胞中mTORC1活性的物质在如下(A1)或(A2)中的应用：
(A1)制备能够促进非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的产品；
(A2)促进非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展。
2.能够降低巨噬细胞中mTORC1活性的物质在如下(B1)-(B7)任一中的应用：
(B1)制备促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中巨噬细胞浸润的产品，或者促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中巨噬细胞浸润；
(B2)制备提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的血浆转氨酶的含量的产品，或者提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的血浆转氨酶的含量；
(B3)制备提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中炎症因子的表达量的产品，或者提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中炎症因子的表达量；
(B4)制备促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中胶原沉积的产品，或者促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中胶原沉积；
(B5)制备提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中纤维化标记物的表达量的产品，或者提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中纤维化标记物的表达量；
(B6)制备降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞消化凋亡肝细胞的能力的产品，或降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞消化凋亡肝细胞的能力；
(B7)制备干扰非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞溶酶体的分裂和/或酸化的产品，或干扰非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞溶酶体的分裂和/或酸化。
3.一种构建非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的动物模型的方法，包括如下步骤：降低患有非酒精性脂肪性肝炎的动物的巨噬细胞中mTORC1活性，从而获得所述非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的动物模型。
4.一种构建患有非酒精性脂肪性肝炎且具有如下(C1)-(C7)所示性状中至少一种的动物模型的方法，包括如下步骤：降低患有非酒精性脂肪性肝炎的动物的巨噬细胞中mTORC1活性，从而获得所述患有非酒精性脂肪性肝炎且具有如下(C1)-(C7)所示性状中至少一种的动物模型；
(C1)肝脏中巨噬细胞的浸润程度更高；
(C2)血浆转氨酶的含量更高；
(C3)肝脏中炎症因子的表达量更高；
(C4)肝脏中胶原的沉积量更多；
(C5)肝脏中纤维化标记物的表达量更高；
(C6)巨噬细胞消化凋亡肝细胞的能力更弱；
(C7)巨噬细胞溶酶体的分裂和/或酸化能力更弱。
5.能够提高巨噬细胞中mTORC1活性的物质在如下(D1)或(D2)中的应用：
(D1)制备能够抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的产品；
(D2)抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展。
6.能够提高巨噬细胞中mTORC1活性的物质在如下(E1)-(E7)任一中的应用：
(E1)制备抑制非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中巨噬细胞浸润的产品，或者抑制非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中巨噬细胞浸润；
(E2)制备降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的血浆转氨酶的含量的产品，或者降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的血浆转氨酶的含量；
(E3)制备降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中炎症因子的表达量的产品，或者降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中炎症因子的表达量；
(E4)制备抑制非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中胶原沉积的产品，或者抑制非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中胶原沉积；
(E5)制备提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中纤维化标记物的表达量的产品，或者提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的肝脏中纤维化标记物的表达量；
(E6)制备提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞消化凋亡肝细胞的能力的产品，或提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞消化凋亡肝细胞的能力；
(E7)制备促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞溶酶体的分裂和/或酸化的产品，或促进非酒精性脂肪性肝炎患病机体的巨噬细胞溶酶体的分裂和/或酸化。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述肝脏中炎症因子为如下中至少一种：TNF-α、MCP-1、iNOS。
8.根据权利要求1-7中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述肝脏中纤维化标记物为如下中至少一种：α-SMA、collagenI、TIMP1。
9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述能够降低巨噬细胞中mTORC1活性的物质为能够特异性敲除机体中Raptor基因表达的物质。
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