CN114787340A - 诱导多能干细胞来源间充质干细胞前体细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞及其制备方法。本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞，较比一般的间充质干细胞或诱导多能干细胞来源间充质干细胞，其功能性更为强化，且增殖能力更优异。

Description

诱导多能干细胞来源间充质干细胞前体细胞及其制备方法
【技术领域】
本专利申请就2019年7月26日提交给大韩民国专利厅的大韩民国专利申请第10-2019-0091269号和2019年12月23日提交给大韩民国专利厅的大韩民国专利申请第10-2019-0173078号提出优先权要求，并将上述专利申请的公开内容作为参考引入本说明书中。
本发明涉及诱导多能干细胞来源间充质干细胞前体细胞及其制备方法。
【背景技术】
间充质干细胞作为一种具有多分化能的基质细胞，指的是可分化成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等多种细胞的一种细胞。间充质细胞可分化成软骨、骨组织、韧带和骨髓基质等各种缔结组织，因此，多被用于研究其在治疗各种疾病(如：治疗因关节炎、外伤、烧伤等引起的软组织缺损)方面的用途。另外，除了这种结构支撑功能之外，间充质干细胞还具有免疫调节功能或免疫抑制功能，如：表达抗炎性细胞因子，将巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞，故可抑制炎症反应，目前的很多研究都旨在将其用作治疗因免疫系统的过度激活而引起的免疫疾病(如：关节炎、炎症性肠病、特应性皮炎、自我免疫性疾病)的治疗剂。
最近，在研究间充质干细胞对各种疾病的治疗功效方面，大多选择使用间充质干细胞分泌的外泌体，而非间充质干细胞本身。为实现这种外泌体的商业应用性，就需要大量优质的外泌体。但，可从间充质干细胞中获取的外泌体数量极少，而且，间充质干细胞的功能和增殖能力也会随着继代的重复而减退，为此，需要开发一种建立细胞的技术，而该细胞应在功能方面等于或优于间充质干细胞，且具有优异的增殖能力。
【先行技术文献】
【专利文献】
大韩民国公开专利公报第10-2019-0063453号(2019.01.15公开)
【发明内容】
【技术问题】
本发明人潜心研究，旨在开发一种在功能方面等于或优于间充质干细胞且增殖能力优异的干细胞。结果证实，通过建立处于分化阶段的间充质细胞，取代诱导多能干细胞来源间充质干细胞，可表现出更为优异的功能性和增殖能力，借以完成了本发明。
因此，本发明的一个目的在于，提供一种诱导多能干细胞来源间充质干细胞前体细胞(precurosr cell of iPSC-derived mesenchymal stem cell)、由其组成的细胞群体(cell population)及其制备方法。
本发明的另一个目的在于，提供一种从上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞前体细胞中生产外泌体的方法。
【技术方案】
依据本发明的一个方面，本发明提供一种包含间充质干细胞(mesenchymal stemcell，MSC)前体细胞的细胞群体(cell population)。
在本说明书中，术语“干细胞”作为一种未分化细胞，指的是，具有自我复制能力，且具有可分化成两种以上不同类型细胞的能力的细胞。本发明的干细胞可以是自体或同种组织来源干细胞。
在本说明书中，术语“间充质干细胞”作为一种具有多分化能的细胞，指的是，可分化成包含骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等在内的各种细胞的干细胞。上述间充质干细胞最常用的就是骨髓来源间充质干细胞，但，除骨髓之外，还可以来源于脐带或脐带血、脂肪组织、羊水、臼齿牙蕾(tooth bud)。间充质干细胞又被称作基质细胞(stromalcell)。
在本说明书中，由本发明人开发的间充质干细胞的前体细胞，并非一般的间充质干细胞，而是来源于诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)的间充质干细胞的前体细胞。
在本说明书中，“诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)”是指通过人为逆向分化过程，从分化的细胞中诱导出的具有多能性分化能力的细胞，也被称作逆向分化干细胞。人为逆向分化过程，通过使用病毒性介导(其使用逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒)或非病毒性载体，并通过导入非病毒性介导的逆向分化因子(其使用蛋白或细胞提取物等)完成；或包括借由干细胞提取物、化合物等完成的逆向分化过程。上述诱导多能干细胞具有与胚胎干细胞几乎相同的特性，具体地，两者具有相似的细胞形状，基因和蛋白表达相似，在体外(in vitro)和体内(In vivo)具有全能性，并形成畸胎瘤(teratoma)，当插入到小鼠的囊胚(blastocyst)中时，会形成嵌合体(chimera)小鼠，并可进行基因的生殖系传递(germline transmission)。
本发明的诱导多能干细胞，可包括所有物种来源(如：人类、猴子、猪、马、牛、羊、狗、猫、小鼠、鼠、兔子)的诱导多能干细胞，但优选地，是人类来源的诱导多能干细胞。
另外，本发明的上述诱导多能干细胞逆向分化前的体细胞，可以是来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜、羊水或胎盘等的前体细胞，但不限于此。具体地，上述体细胞包括：成纤维细胞(fibroblast)、干细胞(hepatocyte)、脂肪细胞(adiposecell)、上皮细胞(epithelial cell)、表皮细胞(epidermal cell)、软骨细胞(chondrocyte)、肌细胞(muscle cell)、心肌细胞(cardiac muscle cell)、黑色素细胞(melaonocyte)、神经细胞(neural cell)、胶质细胞(glial cell)、星形胶质细胞(astroglial cell)、单核细胞(monocyte)、巨噬细胞(macrophage)等，但不限于此。
在本发明的一个实现例中，上述细胞群体的特征在于，在至少80％以上的细胞中，表达在细胞表面上的标记蛋白为CD73+、CD90+、CD105+或其组合。在本发明的具体实现例中，上述细胞群体的特征在于，在至少80％、85％、90％或95％以上的细胞中，表达在细胞表面上的标记蛋白为CD73+、CD90+、CD105+或其组合。
另外，在本发明的另一个实现例中，上述细胞群体的特征在于，在至多5％以下的细胞中，表达在细胞表面上的标记蛋白为CD34+及/或CD45+。在本发明的具体实现例中，上述细胞群体的特征在于，在至多5％、4％、或3％以下的细胞中，表达在细胞表面上的标记蛋白为CD34+及/或CD45+。
在本说明书中，CD是指细胞表面抗原分化簇(cluster of differentiation)，“+”或“(+)”是指细胞表面上存在相应的细胞表面标记(阳性)，“-”或“(-)”是指细胞表面上不存在相应的细胞表面标记(阴性)。上述标记的存在(阳性)或不存在(阴性)并不意味着物理上的绝对存在与否，其意味的是根据相对标准判定的存在或不存在，具体指，如果高于本领域技术水平的实验可检测值，则判定为存在(阳性)，而低于该数值，则判定为不存在(阴性)。
在本发明的另一个实现例中，上述本发明的间充质干细胞的前体细胞，相较于等量的间充质干细胞，其以更高的水平表达选自由ANKRD1、CPE、NKAIN4、LCP1、CCDC3、MAMDC2、CLSTN2、SFTA1P、EPB41L3、PDE1C、EMILIN2、SULT1C4、TRIM58、DENND2A、CADM4、AIF1L、NTM、SHISA2、RASSF4，及ACKR3组成的组中的一个或多个基因。
上述本发明的间充质干细胞的前体细胞以更高水平表达的基因表达量，意味的是，相较于等量的间充质干细胞表达的基因表达量，其表达水平高至少3倍、5倍、7倍或10倍以上。
另外，在本发明的另一个实现例中，上述本发明的间充质干细胞的前体细胞，相较于等量的间充质干细胞，其以更低的水平表达选自由DHRS3、BMPER、IFI6、PRSS12、RDH10，及KCNE4组成的组中的一个或多个基因。
上述本发明的间充质干细胞的前体细胞以更低的水平表达的基因表达量，意味的是，相较于等量的间充质干细胞表达的基因表达量，其表达水平低至少3倍、5倍、7倍或10倍以上。
在本发明的一个具体实现例中，上述间充质干细胞的前体细胞和等量的间充质干细胞属于同种组织来源。更具体地，上述间充质干细胞的前体细胞，是来源于同种组织来源的诱导多能干细胞的间充质干细胞的前体细胞。
在本发明的一个实施例中，上述间充质干细胞的前体细胞，是来源于脐带组织来源诱导多能干细胞的间充质干细胞的前体细胞，与其相比较的等量间充质干细胞则是脐带组织来源间充质干细胞。
本发明人将上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞命名为BxC(brexogen stem cell)。在本说明书中，上述“诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)”也可用“诱导多能干细胞来源间充质前体细胞”，或“诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞”来表达。
在本说明书中，上述“诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)”，被保藏在“韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Culture，KCTC)”，保藏号为“KCTC14019BP”。
正如本发明的实施例所证实的，本发明的同种组织来源(例如：脐带组织)的诱导多能干细胞的间充质干细胞的前体细胞(BxC)，相较于同种组织来源(例如：脐带组织)的间充质干细胞(MSC)，其染色体核型未见异常且增殖能力更为优异。具体地，当BxC完成9次以上的继代时，相较于同种组织来源间充质干细胞(MSC)，其表现出10倍以上的增殖能力差异，且即使完成12次以上的继代，也未观察到增殖能力的减退迹象。另外，BxC在与细胞增殖能力相关的标记Ki67的表达量方面，显示高出MSC 2倍以上。
在本发明的一个实现例中，本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)，相较于等量的间充质干细胞，其分泌大量的内皮抑素(Endostatin)、内皮素-1(Endothelin-1)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、血小板反应蛋白-2、胎盘生长因子(PlGF)、血小板衍生因子(PDGF-AA)、β神经生长因子(β-NGF)，及肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)等功能性蛋白。
在本说明书中，上述内皮抑素(Endostatin)是来源于天然生成的XVIII型胶原蛋白的20kDa C末端片段，其被报道是一种抗血管生成抑制剂。
在本说明书中，上述内皮素-1(endothelin-1)，也称为内皮素前体-1(preproendothelin-1，PPET1)，是一种由EDN1基因编码的蛋白，生成于血管内皮细胞。已知内皮素-1(endothelin-1)是一种强效血管收缩剂。
在本说明书中，上述血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factorA，VEGF-A)，作为一种由VEGFA基因编码的蛋白，已知其借助与血管内皮细胞的VEGFR1和VEGFR2的相互作用，诱导血管的生长。
在本说明书中，上述血小板反应蛋白-2，作为一种由THBS2基因编码的蛋白，已知其介导细胞－细胞相互作用或细胞－基质相互作用。血小板反应蛋白-2在癌症中发挥的作用仍存在争议，但据报道称，其可调节间充质干细胞的细胞表面特性，并参与细胞粘附和细胞迁移。
在本说明书中，上述胎盘生长因子(placental growth factor，PlGF)是由PFG基因编码的蛋白，已知其作为血管内皮生长因子亚家族(VEGF sub-family)的一员，是在胚胎发育期间的血管生成方面发挥主要作用的一种蛋白。
在本说明书中，上述血小板衍生因子(platelet-derived growth factor，PDGF-AA)作为一种调节细胞生长和分裂的生长因子，已知其在血管的生成和生长，及间充质干细胞的增殖、趋化和迁移方面发挥重要作用。
在本说明书中，神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)作为一种神经亲和性因子和神经肽，其主要参与神经的生长、维持、增殖和存活。NFG是三种蛋白的复合物，其中，α-、β-，和γ-NGF的表达比例约为2:1:2。已知其中的γ-NGF发挥丝氨酸蛋白酶的作用，通过切割beta-NGF的N-末端来激活NGF。
在本说明书中，上述肝素结合表皮生长因子(hepari-binding EGF-like growthfactor，HB-EGF)是一种由HBEGF基因编码的EGF家族(EGF family)蛋白的成员。已知HB-EGF在心脏发育和血管分布方面发挥重要作用，其在表皮创伤愈合方面，还是上皮化过程中的必需蛋白。
依据本发明的另一个方面，本发明提供一种间充质干细胞的前体细胞的制备方法，其包括以下步骤：
在包含FBS和bFGF的培养基中，培养诱导多能干细胞1～10天；及
分离SSEA-4(-)细胞并在包含FBS和bFGF的培养基中培养1～10天。
本发明的上述间充质干细胞的前体细胞，与上述间充质干细胞的前体细胞属于同种细胞，因此，省略两者的共同内容。
依据本发明的一个实现例，上述诱导多能干细胞，是在逆向分化用培养基中培养来源于人类的脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜、羊水或胎盘等的体细胞制备而得的。
具体地，上述体细胞包括：成纤维细胞(fibroblast)、干细胞(hepatocyte)、脂肪细胞(adipose cell)、上皮细胞(epithelial cell)、表皮细胞(epidermal cell)、软骨细胞(chondrocyte)、肌细胞(muscle cell)、心肌细胞(cardiac muscle cell)、黑色素细胞(melaonocyte)、神经细胞(neural cell)、胶质细胞(glial cell)、星形胶质细胞(astroglial cell)、单核细胞(monocyte)、巨噬细胞(macrophage)，或来源于骨髓、脐带、脐带血、脂肪组织、羊水、臼齿牙蕾(tooth bud)的间充质干细胞等，但不限于此。
在本说明书中，阶段特异性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)是人类的诱导多能干细胞和胚胎干细胞的特征性细胞表面标记之一。在本发明的一个实现例中，在分化成本发明的间充质干细胞前体细胞(BxC)的过程中，上述SSEA-4可被用作筛选因子，用以区分保留诱导多能干细胞特性的细胞和丧失诱导多能干细胞特性的细胞。
在本发明的一个实现例中，本发明人培养诱导多能干细胞，并以是否表达SSEA-4为准进行筛选，分离SSEA-4(-)细胞后，完成进一步培养。
在本发明的一个实施例中，上述诱导多能干细胞，及SSEA-4(-)细胞，具体地，可培养1～10天、3～10天、5～10天，更具体地，可培养5～7天或7～10天。
在本发明的一个实现例中，上述诱导多能干细胞在培养1～10天之后，SSEA-4(-)细胞的分离可使用荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)或磁性激活细胞分选(magnetic-activated cell sorting，MACS)方法，优选地，可使用FACS方法，但不限于此，可不受限地使用本领域已知的细胞分离方法。
在本发明的另一个实现例中，上述培养细胞的培养基包含5～20％，5～15％，10～15％或10～20％的FBS，最具体地，包含10％的FBS，但不限于此。
在本发明的另一个实现例中，上述培养细胞的培养基包含的1～20ng/ml、2～20ng/ml、3～20ng/ml、5～20ng/ml、7～20ng/ml、10～20ng/ml、1～15ng/ml、2～15ng/ml、3～15ng/ml、5～15ng/ml、7～15ng/ml、10～15ng/ml、1～10ng/ml、2～10ng/ml、3～10ng/ml、5～10ng/ml、7～10ng/mld的bFGF，最具体地，包含10ng/ml的bFGF。
依据本发明的另一方面，本发明提供外泌体的制备方法，其包括以下步骤：
(a)在细胞培养基中，培养包含上述间充质干细胞的前体细胞的细胞群体；及
(b)从上述细胞培养基中分离出外泌体。
在本发明的一个实现例中，上述细胞培养基的特征在于，含有去除外泌体的胎牛血清。
在本发明的一个具体实现例中，上述细胞培养基之所以使用去除外泌体的FBS，是因为常用FBS中包含大量的牛血清来源的外泌体，因此，这样做的目的在于，避免混入干细胞分泌的外泌体之外的FBS来源的外泌体。
在本说明书中，术语“外泌体(Exsome)”是一种纳米级膜囊泡(vesicle)，其借助于胞吞途径(endocytic pathway)的细胞小器官细胞—多泡体(multivesicular body)和质膜(plasma membrane)的融合而释放，存在于几乎所有真核生物的体液中。外泌体的直径约为30～150nm，其比LDL蛋白大，但明显小于红细胞。外泌体在多泡体(multivesicularbodies)与细胞膜融合时从细胞中释放出来，或直接从细胞膜中释放出来。已知外泌体发挥重要的特化功能，如：细胞免疫的介导、细胞间信号传导。已知外泌体的标记蛋白有CD9、CD63、CD81等。本发明的上述外泌体并不严格限定于30～150nm的大小，其概念包括：落在上述大小范围内的多泡体(multivesicular body)、由大于或等于上述大小的脂质双分子层组成的微泡(microvesicle)及其混合物。
在本发明的一个实现例中，上述培养可培养12小时至120小时，24小时至96小时，48小时至96小时，或60小时至84小时，最具体地，可培养72小时，但不限于此。
在本发明的一个实现例中，上述间充质干细胞的前体细胞在分离外泌体前，可使用各种物质进行预处理。例如，本发明的上述间充质干细胞的前体细胞在分离外泌体前，可使用选自包含干扰素-γ(interferon-gamma)、吡格列酮(pioglitazone)、二甲双胍(metformin)、5-氨基-4-咪唑甲酰胺(5-Aminoimidazole-4-carboxamideribonucleotide，AICAR)、凝血酶(thrombin)、白藜芦醇(resveratrol)、P物质(substanceP)、透明质酸、粉防己碱(tetrandrine)、佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、exendine-4、地塞米松(dexamethasone)、胰岛素(insulin)、抗坏血酸盐(ascorbate)、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)、转化生长因子-β(Transforming Growth Factorβ1，TGF-β1)在内的组中的一种或多种物质进行预处理，但不限于此。
另外，在本发明的另一个实现例中，从上述细胞培养基中分离出外泌体的步骤，是从上述培养的间充质干细胞的前体细胞中，分离出分泌到细胞培养基中的外泌体的一个过程。
在本发明的一个实现例中，上述外泌体的分离方法如下。
以200～400×g的条件，离心培养基5至20分钟，去除剩余的细胞和细胞残留物后，取上清液，以9,000～12,000×g的条件高速离心60～80分钟。这时，再取上清液，以90,000～120,000×g条件离心80～100分钟，去除上清液，便可获得下层残留的外泌体。
依据本发明的特定实现例，收集间充质干细胞培养基，以300×g的条件离心10分钟，去除剩余的细胞和细胞残留物，使用高速离心机(high speed centrifuge)，以100×g，4℃的条件离心70分钟。再取离心后的上清液，使用超高速离心机(ultracentrifuge)，以100,000×g，4℃的条件离心90分钟，去除上清液，从而分离出下层残留的外泌体。
上述外泌体的制备方法是通过培养上述间充质干细胞的前体细胞来制备外泌体，在这一点上与上述间充质干细胞的前体细胞有共同之处。本说明书中的上述外泌体分离方法仅作为示例用，也可不受限地使用本领域使用的外泌体分离方法。
借由本发明的制备方法制备的外泌体，可包含亦可不包含治疗剂。
在本发明的一个实现例中，上述治疗剂是治疗性蛋白、抗体(例如：全长抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、F(ab')2、双抗体(diabody)、三体(triabody)或微抗体(minibody))、抑制性RNA或小分子药物。
在本发明的一个实现例中，治疗性蛋白是已知的与治疗丢失或失活的疾病相关的蛋白(例如：肿瘤抑制因子、激酶、磷酸酶或转录因子)。
在本发明的一个实现例中，抗体结合细胞内抗原。这种细胞内抗原可以是蛋白(例如：肿瘤基因)，蛋白的活性是细胞增殖和或存活所需的。在某些情况下，抗体会阻断抗原的功能。在某些情况下，抗体还会干扰蛋白-蛋白的相互作用。
在本发明的一个实现例中，抑制性RNA为siRNA、shRNA、miRNA或pre-miRNA。在各种实施方案中，抑制性RNA阻断蛋白(例如：肿瘤基因)的表达，蛋白的活性是维持疾病状态所需的。当肿瘤基因是突变形态的基因时，抑制性RNA会优先阻断突变体肿瘤基因的表达，而非野生型蛋白。
在本发明的一个实现例中，上述小分子药物为造影剂。在本发明的另一个实现例中，上述小分子药物为化学治疗剂。
在本发明的一个实现例中，本组合物被剂型化，以用于口服给药，或被剂型化，以用于肠胃外给药(例如：静脉内、肌肉内、皮下或腹腔内注射)。
在本发明的一个实现例中，上述治疗剂包括抗微生物剂。抗微生物剂可以是苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、溴硝醇、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、依西替丁、酰亚胺尿素、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇或硫柳汞，但不限于此。
依据本发明的另一个方面，本发明提供一种诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞。在本发明的一个实现例中，上述诱导多能干细胞来源于人类的脐带。在本发明的另一个实现例中，上述前体细胞已保藏，保藏号为KCTC14019BP。
【发明的效果】
本发明提供一种诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞及其制备方法。本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞，较比一般的间充质干细胞或诱导多能干细胞来源间充质干细胞，其功能性更为强化，且增殖能力更优异。
【附图说明】
图1a～1b是显示本发明的诱导多能干细胞(iPSC)培养第0天、第7天后的细胞表面表达标记SSE-4的表达比例和显微照片的图。图1c是显示本发明的诱导多能干细胞培养7天，从中分离相应的SSEA-4(-)细胞后培养7天后的细胞(BxC)的表面表达标记SSEA-4的图。SSE-4的表达比例和显微照片的图。
图2是显示本发明的诱导多能干细胞培养第0天(iPSC)、培养第7天(pre-BxC)、分离SSEA-4(1)后培养的第7天(BxC)，及间充质干细胞(MSC)的细胞表面标记类型的图表。
图3示出的是本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)及同种组织来源间充质干细胞(MSC)的核型分析结果。
图4a是显示本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)及同种组织来源间充质干细胞(MSC)通过继代培养得到的细胞数的图。
图4b示出的是本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)与同种组织来源间充质干细胞(MSC)的细胞增殖因子Ki67的表达比例的比较图。
图5a～5d示出的是本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)所表达的功能蛋白的分泌量的比较图(5a:内皮抑素，内皮素-1；5b:VEGF-A，血小板反应蛋白-2；5c:PlGF，PDGF-AA；5d:β-NGF，HB-EGF)。
图6a和图6b示出的是用于比较本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)及同种组织来源间充质干细胞(MSC)的增殖能力的CFU-F assay结果图。
图7a示出的是RNA-seq分析结果的模式图，旨在确认本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)及同种组织来源间充质干细胞(MSC)之间存在表达量差异的基因。图7b示出的是BxC中的表达量高于MSC的基因的图，图7c示出的是在BxC中的表达量低于MSC的基因的图。
图8a是确认从本发明的BxC中分离的外泌体的数和大小分布的图表，图8b是确认外泌体特异性表面抗原TSG101和CD63的表达的图。
【具体实施方式】
以下，结合实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于本发明的更详细说明，根据本发明的要旨，本发明的范围不受这些实施例的限制，这对本领域技术人员来说是显而易见的。
【实施例】
在本说明书中，用于表示特定物质的浓度的“％”，即固体/固体为(重量/重量)％，固体/液体为(重量/体积)％，液体/液体为(体积/体积)％，除非另有提及。
【实施例1：诱导多能干细胞(iPSC)来源间充质干细胞前体细胞(BxC)的分离和培养】
首先，在添加有10％的FBS和10ng/ml的bFGF的DMEM中，培养诱导多能干细胞(iPSC)7天。然后，通过FASC从培养的诱导多能干细胞中，分离出细胞表面不表达阶段特异性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)蛋白的SSEA-4(-)细胞。另外，对分离出的SSEA-4(-)细胞进行继代，并在上述相同的培养基中进一步培养7天，从而制备出本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞。本发明人将上述诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞命名为BxC(brexogen stem cell)，并将其保藏在“韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Culture，KCTC)”，保藏号为“KCTC14019BP”。
在培养基【高葡萄糖DMEM(Gibco，Cat no.11995-065)，10％胎牛血清(HyClone)，1％MEM非必需氨基酸溶液(100×)(Gibco，Cat no.11140-050)】中，进一步培养被命名为BxC的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞。
上述第0天的诱导多能干细胞(iPSC)(D0)、培养7天后的诱导多能干细胞(Pre-BxC)(D7)，及本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)的每个细胞的细胞表面标记SSEA-4比例如下表1和图1a-1c、图2所示。
最初的诱导多能干细胞群体的96.6％在细胞表面表达了SSEA-4蛋白(图1a)，但培养7天后，表达SSEA-4蛋白的SSEA04(+)细胞群体减至总细胞的35.8％(图1b)。在分离出占总细胞剩余64.2％的SSEA-4(-)蛋白，进行继代并培养7天后(BxC细胞)，确认到，SSEA-4蛋白表达细胞占总细胞群体的3％以下(图1c)。
由此可知，在本发明的诱导多能干细胞(iPSC)来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)在细胞群体中的SSEA-4蛋白表达率为5％以下。
【实施例2：诱导多能干细胞(iPSC)来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的细胞表面标记表达】
针对第0天的诱导多能干细胞(iPSC)(D0)、培养7天后的诱导多能干细胞(Pre-BxC)(D7)，及本发明的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞(BxC)的每个细胞的细胞表面标记(SSEA-4、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105)进行了如下分析。
使用rypLETM Express(Gibco，12604-021)，将每个阶段的细胞处理成单细胞，并用PBS洗涤。再将其分装入管中进行分离，以避免特异性结合在SSEA-4(BD560128)、CD73(BD550257)、CD90(BD5555950)、CD105(BD560839)、CD45(BD555483)及CD34(BD348053)上的抗体出现波长重叠。使细胞团块重悬于FACS用悬浮液100μL中，一次加入2份6μL抗体，以免波长重叠，在避光(dark)30分钟的室温下静置30分钟，再用PBS洗涤，然后，使其悬浮在300μL FACS缓冲液中，利用FACS设备进行了分析。
干细胞的每个细胞表面标记(SSEA-4、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105)的表达比例如下表1和图2所示。
由上述结果可知，在本发明的诱导多能干细胞(iPSC)来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)在细胞群体中的CD73、CD90、CD105蛋白表达率为90％以上。
【表1】
分化阶段 SSEA-4(％) CD34(％) CD45(％) CD73(％) CD90(％) CD105(％)
iPSC 96.7 0.1 0.7 0.3 0.6 0.9
Pre-BxC 38.8 0.4 0.9 1.3 1.7 3.8
BxC 2.7 1.4 1.2 99.0 96.9 98.6
MSC 0.2 0.3 0.5 99.7 99.2 98.6
【实施例3：诱导多能干细胞(iPSC)来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的染色体分析】
为了确认本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)和诱导多能干细胞来源间充质干细胞(MSC)是否存在染色体异常，分别对继代6次的BxC和MSC的核型进行了分析。
如图3所示，确认到，本发明的BxC和MSC在染色体数和结构上并无异常。
【实施例4：诱导多能干细胞(iPSC)来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的增殖能力特性比较】
为了比较本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)和诱导多能干细胞来源间充质干细胞(MSC)的增殖能力，进行了如下实验。
在6孔培养板中，接种相同继代数(P4)的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)和同种组织(脐带)来源间充质干细胞(MSC)，每孔接种1×105个细胞后，每隔3.5天去除一次培养基并用PBS洗涤，然后，通过TrypLETM Express处理，分离出细胞。以300×g的条件离心5分钟后，使其重悬于1mLd的培养基中，然后，对细胞数进行了测量。再次接种已完成细胞数测量的细胞，每孔接种1×105个细胞后，每隔3.5天重复一次培养，并确认了每个继代的细胞数增量。
另外，为了确认每个细胞的细胞增殖标记Ki67的表达比例，进行了如下实验。
通过TrypLETM Express(Gibco，12604-021)将相同继代数(P4)的诱导多能干细胞来源功能强化间充质前体细胞(BxC)和同种组织(脐带)来源间充质干细胞(MSC)处理为单细胞并用PBS洗涤。洗涤后，将细胞放入cold 80％乙醇(ethanol)中，在-20℃条件下固定2小时以上，并用PBS洗涤3次。将PE Mouse Anti-Ki-67kit(BD556027)中包含的每100μL缓冲液中的20μL Ki-67特异性抗体转移到新管中，室温下放置30分钟，然后，用PBS洗涤，使其与附有标记的二次抗体反应后，在避光(dark)室温下静置30分钟，然后，利用FASC设备进行了分析。
如图4a所示，相较于间充质干细胞(MSC)，本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)自第9次继代开始，便表现出10倍以上的增殖能力差异。另外，间充质干细胞自继代12次起，增殖能力开始减退，而本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)继代12次以上，也未出现增殖能力减退迹象。
另外，如图4b所示，相较于间充质干细胞(MSC)，本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的细胞增殖标记Ki67的表达量高出两倍以上。
由此可知，相较于间充质干细胞(MSC)，本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的增殖能效果非常优异。
【实施例5：诱导多能干细胞(iPSC)来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的蛋白分泌能力比较】
为了比较与本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)和诱导多能干细胞来源间充质干细胞(MSC)的功能性相关的蛋白的分泌能力，进行了如下实验。
在6孔培养板中，接种相同继代数的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)和间充质干细胞(MSC)，每孔接种1×105个细胞，24小时后去除上清液。用DPBS洗涤后，加入1mL无血清培养基(serum free medium)，48小时后去除培养基。以300×g的条件离心5分钟，使死细胞或残渣沉淀，只取上清液后，储存在-80℃条件下。利用R&D systems的Luminex High performance assay的定制服务(custom service)制作阵列试剂盒(arraykit)后，进行了Luminex assay。
【表2】
蛋白 MSC BxC
内皮抑素 3516.6pg/ml 6682.0pg/ml
内皮素-1 17.0pg/ml 79.4pg/ml
VEGF-A 32.2pg/ml 78.5pg/ml
血小板反应蛋白-2 21802.9pg/ml 36912.7pg/ml
PlGF 5.8pg/ml 9.4pg/ml
PDGF-AA 29.2pg/ml 328.4pg/ml
β-NGF 10.5pg/ml 17.3pg/ml
HB-EGF 3.9pg/ml 15.7pg/ml
如图5a～5d所示，相较于诱导多能干细胞来源间充质干细胞(MSC)，本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)分泌大量与间充质干细胞(MSC)的功能性相关的蛋白。由此可知，相较于间充质干细胞(MSC)，本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的功能性更为强化。
【实施例6：诱导多能干细胞(iPSC)来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的干细胞特性(Stemness)考察】
为了比较本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)和间充质干细胞(MSC)的干细胞特性(Stemness)，进行了如下实验。
在包含10mL培养基【高葡萄糖DMEM(Gibco，Cat no.11995-065)、10％胎牛血清(HyClone)、1％MEM非必需氨基酸溶液(100×)(Gibco，Cat no.11140-050)】的100mm细胞培养皿(dish)中，接种间充质干细胞和诱导多能干细胞来源功能强化的间充质干细胞前体细胞(BxC)，每个培养皿各接种1000个细胞，培养21天。使用PBS，洗涤2次附着有培养细胞的培养皿，室温下用95％甲醇固定约2分钟。用PBS洗涤3次固定的细胞之后，添加0.5％结晶紫溶液【结晶紫(Sigma，C-3886，USA)5g，甲醇100ml】，染色5分钟，水洗后，放在室温下干燥。对每个培养皿中由50个以上的细胞组成的集落数进行计数后，进行了比较。
如图6a～6b所示，诱导多能干细胞来源间充质干细胞(MSC)的集落形成单位成纤维细胞(CFU-F)数量，高出本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)约3倍。由此确认到，本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的干细胞特性(stemness)优于间充质干细胞(MSC)。
【实施例7：诱导多能干细胞(iPSC)来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的特征基因表达模式考察】
为了确认本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)和间充质干细胞(MSC)的基因表达模式差异，在每个细胞群体中提取出mRNA，利用RNA-seq分析法，对每个细胞的基因表达量进行了比较。
表现出基因表达量差异的基因类型，及表达量差异(BxC的基因表达量/MSC的基因表达量)如下表2和图7a-7c所示。
如图7a-7c所示，相较于等量的间充质干细胞(MSC)，本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的ANKRD1、CPE、NKAIN4、LCP1、CCDC3、MAMDC2、CLSTN2、SFTA1P、EPB41L3、PDE1C、EMILIN2、SULT1C4、TRIM58、DENND2A、CADM4、AIF1L、NTM、SHISA2、RASSF4及ACKR3的基因表达量至少高出10倍以上，至多高出55倍。
相比之下，DHRS3、BMPER、IFI6、PRSS12、RDH10及KCNE4的基因，在本发明的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)中的表达则低至少10倍至20倍。
【表3】
Figure GDA0003590844780000101
Figure GDA0003590844780000111
【实施例8：来源于诱导多能干细胞(iPSC)来源功能强化的间充质前体细胞(BxC)的外泌体的分离及确认】
在添加10％的去除外泌体的FBS(Exosome-depleted FBS，无外泌体胎牛血清)培养基中，进一步培养由上述实施例1制备的诱导多能干细胞来源功能强化的间充质干细胞的前体细胞(BxC)。培养72小时后，收集BxC细胞培养基，以300×g的条件离心10分钟，去除剩余的细胞和细胞残渣。使用高速离心机(high speed centrifuge)，以1,000×g，4℃的条件离心70分钟。再取离心后的上清液，使用超高速离心机(ultracentrifuge)，以100,000×g，4℃的条件离心90分钟，去除上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate bufferd salin)稀释下层残留的外泌体后予以使用。分离的外泌体数和大小分布分别通过纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking assay)(NanoSight NS300，Malvern)得到确认(图8a)。外泌体特异性表面抗原TSG101和CD63的表达则通过蛋白质印迹法得到确认(图8b)。
【保藏】
【保藏机构】韩国典型培养物保藏中心
【保藏号】KCTC14019BP
【保藏日】20191113
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
国际表格
在原始保藏情况下的收条
细则第7.1款发给
至：KIM Sue
KIM Sue
首尔，松坡区，正大路109
韩国
Figure GDA0003590844780000121
BP/4表格(KCTC表格17)(单页)。

Claims (10)

1.一种包含间充质干细胞(mesenchymalstem cell，MSC)的前体细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少80％以上的细胞为CD73+、CD90+或CD105+。
2.根据权利要求1所述的细胞群体，其中所述细胞群体中至多5％以下的细胞为SSEA-、CD34+或CD45+。
3.根据权利要求1所述的细胞群体，其中所述间充质干细胞的前体细胞，相较于等量的同种组织来源的间充质干细胞，其以更高的水平表达选自由ANKRD1、CPE、NKAIN4、LCP1、CCDC3、MAMDC2、CLSTN2、SFTA1P、EPB41L3、PDE1C、EMILIN2、SULT1C4、TRIM58、DENND2A、CADM4、AIF1L、NTM、SHISA2、RASSF4及ACKR3组成的组中的一个或多个基因。
4.根据权利要求1所述的细胞群体，其中所述间充质干细胞的前体细胞，相较于等量的同种组织来源的间充质干细胞，其以更低的水平表达选自由DHRS3、BMPER、IFI6、PRSS12、RDH10及KCNE4组成的组中的一个或多个基因。
5.根据权利要求1所述的细胞群体，其中所述间充质干细胞的前体细胞来源于诱导多能干细胞。
6.根据权利要求1所述的细胞群体，其中所述间充质干细胞的前体细胞已保藏，保藏号为KCTC14019BP。
7.一种诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞的制备方法，其包括以下步骤：
在包含FBS和bFGF的培养基中培养诱导多能干细胞1～10天；及
分离SSEA-4(-)细胞并在包含FBS和bFGF的培养基中培养1～10天。
8.一种外泌体的生产方法，其包括以下步骤：
在细胞培养基中培养根据权利要求1～6中任一项所述的细胞群体；及
从所述细胞培养基中分离出外泌体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞培养基含有去除外泌体的胎牛血清。
10.一种诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞，
其中所述诱导多能干细胞来源于人类的脐带，
其中所述前体细胞已保藏，保藏号为KCTC14019BP的前体细胞。
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