KR20120107452A - 무관계 표현형이 고갈된 분화된 다능성 줄기 세포 자손 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 영장류 다능성 줄기 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 세포의 혼성 개체군으로부터 무관계 표현형을 고갈시키는 방법을 제시한다. 본 발명에서는 또한, 표적 세포 표현형이 강화된 혼성 세포 개체군을 제시하고, 여기서 혼성 세포 개체군은 영장류 배아 줄기 세포의 분화된 시험관내 자손을 포함한다.

Description

무관계 표현형이 고갈된 분화된 다능성 줄기 세포 자손{Differentiated pluripotent stem cell progeny depleted of extraneous phenotypes}

본 발명의 기술분야

본 발명은 줄기 세포 생물학의 분야에 관계한다.

우선권

본 출원은 2009년 6월 25일 제출된 가출원 no. 61/220,418에 우선권을 주장한다.

배경기술

다능성 줄기 세포는 배양 동안 증식하고, 그리고 적절한 성장 조건 하에, 3가지 일차 배엽 (germ layer): 내배엽 (endoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 외배엽 (ectoderm) 모두를 대표하는 계통 한정된 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는다 (U.S. Patent No. 5,843,780; 6,200,806; 7,029,913; Shamblott et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726; Takahashi et al., (2007) Cell 131(5):861; Yu et al., (2007) Science 318:5858). 특정 계통 한정된 세포 유형에 대한 적절한 성장 조건을 규정하는 것은 연구 및 치료 적용에서 이용을 위한 세포 유형의 실질적으로 무제한적 공급을 제공할 것이다.

영장류 다능성 줄기 (pPS) 세포를 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte), 뉴런 세포, 심근세포 (cardiomyocyte), 조혈 세포 (hematopoietic cell), 췌장 섬 세포 (pancreatic islet cell), 간세포 (hepatocyte), 골아세포 (osteoblast) 및 연골세포 (chondrocyte)를 비롯한 다양한 표적화된 세포 유형으로 분화시키기 위한 프로토콜은 보고되었다 (참조: U.S. Patent No. 7,285,415; 6,833,269; 7,425,448; 7,452,718; 7,033,831; 7,326,572; 6,458,589; 6,506,574; 7,256,042; 7,473,555; U.S. Patent Publication No. 2005/0158855; 2004/0224403; 2005/0282272; 2005/0282274; 2006/0148077; U.S. Patent Application No. 12/412,183; PCT Publication No. WO 07/149182; WO 05/097980; Carpenter et al. (2001) Exp Neurology 172:383; Chadwick et al. (2003) Blood 102:906; Kierstad et al. (2005) J Neuroscience 25:4694); Laflamme et al. (2007) Nature Biotechnology 25:1015 Jiang et al. (2007) Stem cells 25:1940.

표적 표현형 세포로 pPS 세포의 분화는 표적화된 표현형뿐만 아니라 다양한 무관계 표현형을 포함하는 세포의 혼성 개체군의 생산을 유발할 수 있다. 미분화된 배아 줄기 세포의 다능성 잠재력을 유지하는 일정한 무관계 표현형은 개체에 투여될 때 기형종 (teratoma)을 형성할 수 있다 (참조: Thomson 1998 Science 282:1145). 다른 무관계 표현형은 단지 표적화된 표현형의 세포의 총수를 희석하여 세포 제조물의 전반적인 효능을 감소시킴으로써 표적 표현형의 효능을 간섭할 수 있다. 따라서 pPS 세포의 표적화된 분화된 자손을 포함하는 세포의 개체군에서 관찰되는 무관계 표현형을 갖는 세포의 총수를 감축하는 것이 요구된다. 치료, 진단 및/또는 연구 적용에서 이용을 위한 무관계 표현형의 세포의 최소 총수를 갖는 pPS 세포의 분화된 자손의 개체군이 추가로 요구된다. 본 명세서에서 기술된 본 발명의 다양한 구체예는 이들 요구 및 다른 요구를 충족시킨다.

본 발명의 요약

일부 구체예에서, 본 발명에서는 무관계 표현형 세포 유형이 본질적으로 없는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 세포의 개체군을 제시한다. pPS 세포의 시험관내 분화된 자손은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 간세포, 조혈 세포, 연골세포 및 골아세포에서 선택되는 표적 표현형을 포함할 수 있다. 무관계 표현형 세포의 한 가지 실례는 상피 계통 세포, 다시 말하면, 상피 세포와 연관된 하나 이상의 마커, 예를 들면, 아래의 마커: 시토케라틴 (cytokeratin), 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 (desmocollin) 3; 데스모글레인 (desmoglein) 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin) 중에서 하나 이상을 발현하는 세포이다. 이들 세포는 설치류와 같은 개체에 이식될 때 군생 상피 구조 (clustered epithelial structure)를 형성할 수 있다. 무관계 표현형 세포 유형이 본질적으로 없는 세포 개체군은 상피 세포와 연관된 마커, 예를 들면, 아래의 마커: 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin) 시토케라틴 중에서 하나 이상을 스크리닝함으로써 획득될 수 있다. 가령, 이들 마커 중에서 하나 이상에 대한 항체가 이용될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 무관계 표현형 세포가 본질적으로 없는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 세포의 개체군을 획득하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 세포의 개체군을 획득하는 단계; b) a)의 세포 개체군을 상피 세포에 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 c) b)의 리간드 결합된 세포를 제거하여 무관계 표현형 세포가 본질적으로 없는 세포의 개체군을 획득하는 단계를 포함한다. 리간드 결합된 세포의 제거는 리간드 결합된 세포를 나머지 세포 개체군으로부터 물리적으로 분리하는 것을 포함할 수 있다. 리간드 결합된 세포의 제거는 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 것을 포함할 수도 있다. 가령, 세포에 결합된 리간드에 결합하는 독소와 같은 작용제가 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 리간드는 항체이고, 그리고 보체 (complement)는 세포를 용해시키는 작용제로서 이용되고, 따라서 상기 세포를 세포의 개체군으로부터 제거한다.

일정한 다른 구체예에서, 본 발명에서는 영장류 다능성 줄기 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 세포의 혼성 개체군을 제시한다. 세포의 혼성 개체군은 이러한 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감소시켜 치료 또는 연구 산물로서 이용을 위한 더욱 적합한 세포의 개체군을 제공함으로써, 무관계 표현형 세포의 총수가 감축되지 않은 세포의 혼성 개체군에 비하여 강화된 표적화된 표현형 세포 개체군을 내포할 수 있다. 표적화된 세포의 개체군의 강화 (enrichment)는 무관계 표현형의 세포와 연관된 특정한 마커, 예를 들면, 상피 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 총수를 감축함으로써 달성된다. 무관계 표현형의 제거는 무관계 표현형을 이러한 개체군을 구성하는 다른 세포로부터 물리적으로 분리하는 것을 포함할 수 있다. 무관계 표현형의 제거는 무관계 표현형을 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 작용제, 예를 들면, 무관계 표현형 세포에 결합된 리간드에 특이적으로 결합하는 화학 작용제로 화학적으로 처리하는 것을 포함할 수도 있다.

놀랍게도, 상피 계통의 무관계 표현형 세포와 연관된 적어도 하나 이상의 마커의 발현은 미분화된 세포와 연관된 적어도 하나 이상의 마커, 예를 들면, RA-1-60의 발현과 중복된다. 따라서 상피 계통의 무관계 표현형과 연관된 마커를 발현하는 세포를 고갈시킴으로써, 미분화된 세포의 총수, 또는 혼성 개체군 내에서 미분화된 세포에 의해 발현되는 적어도 하나의 마커 (가령, TRA-1-60)를 발현하는 세포의 총수 역시 감소된다.

일부 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 무관계 표현형 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 무관계 표현형 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 이러한 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

일정한 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) a)의 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) a)의 리간드 결합된 세포를 a)의 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키고 이러한 세포의 혼성 개체군을 미분화된 pPS 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키고 이러한 세포의 혼성 개체군을 미분화된 pPS 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) a)의 리간드 결합된 세포를 a)의 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) a)의 리간드 결합된 세포를 a)의 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10 CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; b) 세포의 혼성 개체군을 미분화된 pPS 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 c) a), b) 또는 a)와 b)의 리간드 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; b) 세포의 혼성 개체군을 TRA-160에 특이적으로 결합하는 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 c) 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; b) 세포의 혼성 개체군을 TRA-160에 특이적으로 결합하는 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 c) a), b) 또는 a)와 b)의 리간드 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

일정한 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 상피 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 세포의 혼성 개체군으로부터 상피 세포의 총수를 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

일정한 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) a)의 세포를 a)의 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 세포의 혼성 개체군으로부터 상피 세포의 총수를 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 상피 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 세포의 혼성 개체군으로부터 상피 세포의 총수를 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 상피 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 세포의 혼성 개체군으로부터 상피 세포의 총수를 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM 결합된 세포를 이들 EpCAM 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 시토케라틴 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 시토케라틴 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 데스모콜린 3 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 데스모콜린 3 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 데스모콜린 3 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 데스모콜린 3 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 데스모글레인 2 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 데스모글레인 2 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 데스모글레인 2 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 데스모글레인 2 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 E-카데린 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) E-카데린 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 E-카데린 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) E-카데린 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD49f 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD49f 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD49f 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD49f 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EMA 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EMA 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EMA 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EMA 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 E-cad 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) E-cad 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 E-cad 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) E-cad 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD321 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD321 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD321 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD321 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD66 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD66 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD66 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD66 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD10 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD10 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD10 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD10 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD105 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD105 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD105 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD105 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군으로부터 시토케라틴 발현 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 시토케라틴 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 시토케라틴 발현 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

일정한 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드 및 미분화된 세포에서 발현된 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM에 대한 리간드에 결합된 세포 및 미분화된 세포에서 발현된 마커의 리간드에 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드 및 미분화된 세포에서 발현된 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM에 대한 리간드에 결합된 세포 및/또는 미분화된 세포에서 발현된 마커의 리간드에 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드 및 TRA-1-60에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM에 대한 리간드에 결합된 세포 및 TRA-1-60의 리간드에 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드 및 TRA-1-60에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM에 대한 리간드에 결합된 세포 및/또는 TRA-1-60의 리간드에 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

일정한 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드 및 미분화된 세포에서 발현된 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 분자에 결합된 세포 및 미분화된 세포에서 발현된 마커의 리간드에 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드 및 미분화된 세포에서 발현된 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드에 결합된 세포 및/또는 미분화된 세포에서 발현된 마커의 리간드에 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) a)의 리간드 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 시토케라틴 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 시토케라틴 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 데스모콜린 3에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 데스모콜린 3 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 데스모콜린 3에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 데스모콜린 3 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 데스모글레인 2에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 데스모글레인 2 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 데스모글레인 2에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 데스모글레인 2 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 E-카데린에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) E-카데린 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 E-카데린에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) E-카데린 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD49f에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD49f 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD49f에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD49f 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EMA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EMA 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EMA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EMA 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 E-cad에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) E-cad 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 E-cad에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) E-cad 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD321에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD321 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD321에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD321 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD66에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD66 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD66에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD66 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD10에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD10 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD10에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD10 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD105에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD105 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 CD105에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) CD105 결합된 세포를 이들 리간드 결합된 세포를 사멸시키는 화학 작용제와 접촉시켜 상피 클러스터 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 클러스터 형성 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 미분화된 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 미분화된 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 미분화된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 제거하여 미분화된 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다. 일부 구체예에서, 리간드에는 항체, 예를 들면, TRA-1-60에 특이적으로 결합하는 IgG가 포함될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 미분화된 세포에 의해 발현된 하나 이상의 분자를 발현하는 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) a)의 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 제거하여 미분화된 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 미분화된 세포에 의해 발현된 하나 이상의 분자를 발현하는 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 EpCAM 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 제거하여 미분화된 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 미분화된 세포에 의해 발현된 하나 이상의 분자를 발현하는 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드 및 TRA-1-60에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 제거하여 미분화된 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 미분화된 세포에 의해 발현된 하나 이상의 분자를 발현하는 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 시토케라틴 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 제거하여 미분화된 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포의 혼성 개체군에서 미분화된 세포에 의해 발현된 하나 이상의 분자를 발현하는 세포의 총수를 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 시토케라틴에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드 및 TRA-1-60에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 제거하여 미분화된 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 세포 상에서 관찰되는 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 세포 상에서 관찰되는 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포 및 미분화된 줄기 세포에서 관찰되는 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 분자 중에서 하나 이상을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 EpCAM을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 시토케라틴을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 데스모콜린 3을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 데스모글레인 2를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 E-카데린을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 CD49f를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 EMA를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 E-cad를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 CD321을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 CD166을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 CD105를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포 및 미분화된 영장류 다능성 세포에서 관찰되는 마커를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 EpCAM을 발현하는 적어도 하나의 세포 및 미분화된 영장류 다능성 세포에서 관찰되는 마커를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 시토케라틴을 발현하는 적어도 하나의 세포 및 미분화된 영장류 다능성 줄기 세포에서 관찰되는 마커를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 EpCAM을 발현하는 적어도 하나의 세포 및 TRA-1-60을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 시토케라틴을 발현하는 적어도 하나의 세포 및 TRA-1-60을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형을 갖는 세포를 포함하는 세포의 개체군을 개체 내로 이식하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 표적화된 표현형을 포함하는 세포의 개체군을 획득하는 단계, 여기서 세포의 개체군은 무관계 표현형을 갖는 적어도 하나의 세포가 고갈되고; 그리고 b) a)로부터 세포의 개체군을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포 요법이 필요한 개체를 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 표적화된 표현형을 갖는 세포를 포함하는 세포의 개체군을 획득하는 단계, 여기서 세포의 개체군은 무관계 표현형을 갖는 적어도 하나의 세포가 고갈되고; 그리고 b) a)로부터 세포의 개체군을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형을 갖는 세포를 포함하는 세포 요법이 필요한 개체를 치료하기 위한 세포의 개체군의 용도를 제시하고, 여기서 세포의 개체군은 무관계 표현형을 갖는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형을 갖는 세포를 포함하는 세포의 개체군을 개체 내로 이식하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 표적화된 표현형을 갖는 세포를 포함하는 세포의 개체군을 획득하는 단계, 여기서 세포의 개체군은 상피 세포 마커를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다; 그리고 b) a)로부터 세포의 개체군을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포 요법이 필요한 개체를 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 a) 표적화된 표현형을 갖는 세포를 포함하는 세포의 개체군을 획득하는 단계, 여기서 세포의 개체군은 상피 세포 마커를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다; 그리고 b) a)로부터 세포의 개체군을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형을 갖는 세포를 포함하는 세포 요법이 필요한 개체를 치료하기 위한 세포의 개체군의 용도를 제시하고, 여기서 세포의 개체군은 상피 세포 마커를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 무관계 표현형을 갖는 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 고갈시키기 위한 키트를 제시하고, 상기 키트는 a) 상피 세포에서 발현된 하나 이상의 분자에 대한 리간드; b) 미분화된 세포에서 발현된 하나 이상의 분자에 대한 리간드; 그리고 c) 하나 이상의 용기를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 무관계 표현형을 갖는 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 고갈시키기 위한 키트를 제시하고, 상기 키트는 a) 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, 상피 막 항원 (EMA), E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 분자에 대한 리간드; b) 미분화된 세포에서 발현된 하나 이상의 분자에 대한 리간드; 그리고 c) 하나 이상의 용기를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 무관계 표현형을 갖는 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 고갈시키기 위한 키트를 제시하고, 상기 키트는 EpCAM에 대한 리간드, TRA-1-60에 대한 리간드 및 하나 이상의 용기를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 무관계 표현형을 갖는 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 고갈시키기 위한 키트를 제시하고, 상기 키트는 시토케라틴에 대한 리간드, TRA-1-60에 대한 리간드 및 하나 이상의 용기를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 무관계 표현형을 갖는 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 고갈시키기 위한 키트를 제시하고, 상기 키트는 a) 시토케라틴, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)에서 선택되는 하나 이상의 분자에 대한 리간드; 그리고 b) 하나 이상의 용기를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 TRA-1-60에 특이적으로 결합하는 항체를 제시하고, 여기서 상기 항체는 IgG 아이소타입 (isotype)을 갖는다.

정의

본 명세서에서, "대략"은 규정된 양 또는 값의 + 또는 - 5%의 양 또는 값 평균을 지칭한다.

본 명세서에서, "심근세포"에는 성숙 심근세포 (소아 또는 성체 영장류로부터 분리된 심근세포의 기능적 능력을 갖는 세포) 및/또는 심근세포 전구체 (심근세포 상에서, 심근세포 내에서 또는 심근세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하고 및/또는 심근세포와 연관된 하나 이상의 형태학적 속성을 갖고, 그리고 시험관내에서 또는 개체 내로 이식될 때 성숙 심근세포로 분화되는 세포)가 포함된다.

본 명세서에서, "세포 배양액"은 시간의 흐름에서 시험관내에서 성장된 복수의 세포를 지칭한다. 세포 배양액은 복수의 pPS 세포로부터 또는 단일 pPS 세포로부터 기원할 수 있고, 그리고 1) 세포 배양액이 배양의 일생 동안 겪는 계대배양 (passages) 또는 분열 (division)의 횟수; 그리고 2) 배양의 일생 동안 배양액 내에서 하나 이상의 세포에 대한 표현형에서 변화에 상관없이, 기원하는 세포 또는 세포의 모든 자손을 포함할 수 있다. 따라서 본 명세서에서, 세포 배양은 적어도 하나의 pPS 세포로 하나 이상의 적절한 용기의 최초 접종 (seeding)으로 시작되고 최초 창시자(들)의 마지막 생존 자손이 수확되거나 사멸할 때 종료된다. 최초 창시자 세포의 자손으로 하나 이상의 추가 배양 용기의 접종 역시 최초 세포 배양액의 일부인 것으로 간주된다.

본 명세서에서, "연골세포"에는 성숙 연골세포 (소아 또는 성체 영장류로부터 분리된 연골세포의 기능적 능력을 갖는 세포) 및/또는 연골세포 전구체 (연골세포 상에서, 연골세포 내에서 또는 연골세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하고 및/또는 연골세포와 연관된 하나 이상의 형태학적 속성을 갖고, 그리고 시험관내에서 또는 개체 내로 이식될 때 성숙 연골세포로 분화되는 세포)가 포함된다.

본 명세서에서, "군생 상피 구조"는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 세포의 혼성 개체군에서 관찰되는 상피 계통의 무관계 표현형 세포가 개체 내로 이식될 때 형성되는 구조를 지칭한다. 이들 구조는 상피 세포의 형태를 갖고, 그리고 하기에서 기술된 바와 같이 상피 세포에서 발현되는 적어도 하나의 분자 마커를 발현한다. 일부 경우에, 이들 구조는 낭 또는 소포의 형태를 가질 수도 있다.

본 명세서에서, "시토케라틴"은 상피 조직의 세포질내 세포뼈대 (intracytoplasmic cytoskeleton)에서 관찰되는 중간 세섬유 케라틴을 지칭한다. 2가지 유형의 시토케라틴이 존재한다: 산성 I형 시토케라틴 및 염기성 또는 중성 II형 시토케라틴. 시토케라틴은 통상적으로, I형 시토케라틴 및 II형 시토케라틴을 포함하는 쌍으로 관찰된다. 염기성 또는 중성 시토케라틴인 II형 시토케라틴은 아류형 CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6a, CK6b, CK6c, CK7 및 CK80을 포함한다. 산성 시토케라틴인 I형 시토케라틴은 아류형 CK9, CK10, CK12, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18, CK19, CK20, CK23 및 CK24를 포함한다. 모든 시토케라틴 단백질은 비-α-나선 N-과 C-말단 도메인과 함께, 중심 α-나선-풍부 도메인 (동일 유형의 시토케라틴 사이에 50-90% 서열 동일성 및 상이한 유형의 시토케라틴 간에 대략 30% 서열 동일성)을 보유한다.

본 명세서에서, "고갈된"은 세포의 혼성 개체군 내에 포함된 무관계 표현형이 인간 손에 의해 개시된 행위의 결과로써, 상기 개체군 내에 다른 표현형 세포 유형에 비하여 총수에서 감소되는 행위를 지칭한다. 무관계 표현형이 예로써, 무관계 표현형 세포를 면역-침전시킴으로써 개체군 내에 다른 세포로부터 물리적으로 격리되는 방법이 포함된다. 또한, 예로써 무관계 표현형 세포가 화학 작용제, 예를 들면, 독소, 보체 등으로 특이적으로 표적화되는 경우에, 무관계 표현형 세포가 나머지 개체군으로부터 화학적으로 제거되는 방법이 포함된다. 따라서 무관계 표현형을 갖는 하나 이상의 세포가 고갈된 세포 개체군은 고갈된 것으로 간주된다. 전형적으로, 고갈은 인간 손에 의해 개시된 행위 전후에 무관계 표현형을 갖는 세포의 총수를 비교함으로써 측정되고, 여기서 인간 손에 의해 개시된 행위의 결과로써, 무관계 표현형을 갖는 세포 개체군의 상대적인 숫자에서 감소는 고갈인 것으로 간주된다. 세포의 혼성 개체군으로부터 무관계 표현형의 고갈은 세포의 혼성 개체군 내에서 표적 세포 개체군의 강화 (enrichment)를 유발할 수 있다.

본 명세서에서, "데스모콜린 3"은 카데린 슈퍼패밀리의 데스모콜린 하위패밀리의 구성원인 칼슘-의존성 당단백질인 상피 세포 마커를 지칭한다. 이들 결합소체 (desmosome) 패밀리 구성원은 데스모글레인과 함께, 주로 상피 세포에서 관찰되고, 여기서 이들은 결합소체 세포-세포 연접의 점착성 단백질을 구성하고 세포 부착 및 결합소체 형성에 요구된다. 이들 결합소체 패밀리 구성원은 염색체 18 상에서 2개 클러스터 내에 정렬되고 합치면 650 kb 이하를 점유한다. 대안적 절단접합 (alternative splicing)은 상이한 동족체 (isoform)를 인코딩하는 2개의 전사체 변이체 (transcript variant)를 발생시킨다.

본 명세서에서, "데스모글레인 2"는 상피 세포 마커를 지칭한다. 데스모글레인 2는 척추동물 상피 세포에서 결합소체의 칼슘-결합 막통과 당단백질 성분이다. 결합소체는 상피, 심근, 그리고 일정한 다른 세포 유형 사이에 세포-세포 연접이다. 현재, 3개의 데스모글레인 하위패밀리 구성원이 확인되었는데, 이들 모두 카데린 세포 부착 분자 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이들 데스모글레인 유전자 패밀리 구성원은 염색체 18 상에서 한 클러스터 내에 위치한다. 이러한 두 번째 패밀리 구성원은 결장, 결장 암종, 그리고 다른 단층과 중층 상피-유래된 세포에서 발현된다.

본 명세서에서, "E- 카데린 " ( CD324 )은 세포 표면에서 발현된 상피 세포 마커를 지칭한다. 이것은 5개의 세포외 카데린 반복부, 막통과 영역 및 고도로 보존된 세포질 꼬리로 구성되는 칼슘 의존성 세포-세포 부착 당단백질이다. 이러한 유전자에서 돌연변이는 위, 유방, 결장직장, 갑상선 및 난소 암과 상관된다. 기능 상실 (loss of function)은 증식, 침입, 및/또는 전이를 증가시킴으로써 암에서 진행에 기여하는 것으로 생각된다. 이러한 단백질의 엑토도메인은 포유동물 세포에 세균 부착을 매개하고, 그리고 상기 세포질 도메인은 내재화 (internalization)에 요구된다.

본 명세서에서, "강화된"은 세포의 혼성 개체군 내에 포함된 표적 표현형이 상기 개체군 내에 다른 표현형 세포 유형에 비하여 총수에서 증가되는, 인간 손에 의해 개시된 행위를 지칭한다. 전형적으로, 강화는 인간 손에 의해 개시된 행위 전후에 표적 표현형 세포의 총수를 비교함으로써 측정되고, 여기서 인간 손에 의해 개시된 행위의 결과로써, 표적화된 세포 개체군의 상대적인 숫자에서 증가는 강화인 것으로 간주된다.

본 명세서에서, "배양체 ( embryoid body )"는 영장류 다능성 줄기 세포가 현탁 배양액에서 비-특이적 방식으로 분화하거나, 또는 집합하도록 허용될 때 나타나는 미분화된, 분화된 및 부분적으로 분화된 세포를 포함하는 이종성 클러스터를 지칭한다.

본 명세서에서, "배아 줄기 세포" ( ES )는 1) 세포의 3가지 배엽으로의 실질적인 분화 이전에 배반포 (blastocyst)로부터 유래되거나, 또는 2) 대안으로, 확립된 세포주로부터 획득되는 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 달리 명시되는 경우를 제외하고, 상기 용어는 ES 세포의 특징적인 표현형을 갖는 일차 조직 및 확립된 가계 (line), 그리고 다능성 표현형을 갖는 이런 가계의 자손을 포함한다. ES 세포는 인간 ES 세포 (hES)일 수 있다. 원형 (prototype) "인간 배아 줄기 세포" (hES 세포)는 Thomson et al., Science 282:1145, 1998 및 U.S. Patent 6,200,806에서 기술되고 다수의 확립된 줄기 세포 은행, 예를 들면, UK Stem Cell Bank (Hertfordshire, England) 또는 the National Stem Cell Bank (Madison, WI)로부터 획득될 수 있다.

본 명세서에서, "EpCAM"은 상피 세포 부착 분자 상피 세포 마커를 지칭한다. 이것은 상피 세포 및 거의 모든 암종에서 발현되는 범-상피 분화 항원이다.

본 명세서에서, "상피 세포"는 a) 편평 (얇고 납작한); b) 입방 (입방체 유사); c) 원주 (키가 큰); d) 거짓중층 (모든 세포가 기저 막에 도달하고, 그리고 일부가 표면까지 연장되고, 반면 다른 것들은 그렇지 못하다); e) 과도 (가령, 방광에서 관찰되는 바와 같이) (여기서 세포는 일부 조건 하에 편평하고 다른 조건 하에 둥근 것으로 보인다)에서 선택되는 형태를 갖는 세포를 지칭하고, 그리고 상피 세포와 연관된 적어도 하나의 마커를 발현한다. 예시적인 상피 마커에는 EpCAM; 시토케라틴; 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin)가 포함된다.

본 명세서에서, "무관계 표현형"은 바람직하지 않은 세포의 혼성 개체군 내에 포함된 하나 이상의 세포 유형을 지칭한다. 따라서 표적 표현형 세포 개체군을 내포하는 세포의 혼성 개체군에서, 표적 개체군과 상이한 표현형을 갖는 임의의 세포는 무관계인 것으로 간주될 수 있다. 무관계 표현형 세포는 고갈에 대하여 표적화될 수 있다. 무관계 표현형 세포의 실례는 개체에 투여될 때 군생 상피 구조를 형성하는 잠재력을 갖고 상피 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포이다.

본 명세서에서, "조혈 세포"에는 성숙 조혈 세포 (소아 또는 성체 영장류로부터 분리된 조혈 세포의 기능적 능력을 갖는 세포), 예를 들면, 수상돌기 세포, 대식세포, B 림프구, CD8+과 CD4+ 림프구 둘 모두를 비롯한 T 림프구, 호중구, 호염기구, 호산구, 자연 킬러 (NK) 세포, 혈소판, 적혈구 및 비만 세포 및/또는 조혈 전구체 (조혈 세포 상에서, 조혈 세포 내에서 또는 조혈 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하고 및/또는 조혈 세포와 연관된 하나 이상의 형태학적 속성을 갖고, 그리고 시험관내에서 또는 개체 내로 이식될 때 성숙 조혈 세포로 분화되는 세포)가 포함된다.

본 명세서에서, "간세포"에는 성숙 간세포 (소아 또는 성체 영장류로부터 분리된 간세포의 기능적 능력을 갖는 세포) 및/또는 간세포 전구체 (간세포 상에서, 간세포 내에서 또는 간세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하고 및/또는 간세포와 연관된 하나 이상의 형태학적 속성을 갖고, 그리고 시험관내에서 또는 개체 내로 이식될 때 성숙 간세포로 분화되는 세포)가 포함된다.

본 명세서에서, "섬 세포" 또는 "췌장 섬 세포"에는 성숙 섬 세포 (소아 또는 성체 영장류로부터 분리된 섬 세포의 기능적 능력을 갖는 세포) 및/또는 섬 세포 전구체 (섬 세포 상에서, 섬 세포 내에서 또는 섬 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하고 및/또는 섬 세포와 연관된 하나 이상의 형태학적 속성을 갖고, 그리고 시험관내에서 또는 생체내에서, 다시 말하면, 개체 내로 이식될 때 성숙 섬 세포로 분화되는 세포)가 포함된다.

본 명세서에서, 시험관내에서 분화된 자손은 시험관내에서 하나 이상의 성장 인자, 사이토킨, 모르포겐 (morphogen) 등의 첨가에 의해 pPS 세포로부터 분화되고, 그리고 인간 손에 의해 pPS 세포의 배양액에 또는 이미, 하나 이상의 특정 경로를 하향 분화시키기 시작한 pPS 세포의 배양액에 첨가되는 세포를 지칭한다. pPS를 분화시키는데 유용한 추가의 적절한 작용제에는 마이크로 RNA 분자, siRNA 분자, 그리고 소형 분자, 예를 들면, IDE1, IDE2, -(-)인돌락탄 (Indolactan) 및 스타업리미드 (Stauplimide)가 포함된다 (참조: Borowick et al. (2009) Cell Stem Cell 4:348; Chen et al. (2009) Nature Chem Biol 4:258; Zhu (2009) Cell Stem Cell 4:416). 배양체를 단순히 형성함으로써, 또는 하나 이상의 성장 인자, 사이토킨, 모르포겐 등의 첨가 없이 단순히 pPS 세포의 배양액이 그들을 포함하는 용기보다 커지도록 허용함으로써 (상업적으로 구입가능한 세포 배양 배지 또는 상업적으로 구입가능한 혈청 산물 또는 혈청 대체 산물에서 관찰되는 것을 초과하여) 획득된 무작위 또는 자발적 분화 사건은 이러한 정의로부터 배제된다. 하지만, 배양체로부터 분화되는 세포는 하나 이상의 성장 인자, 사이토킨, 모르포겐 등이 표적 표현형을 획득하기 위하여 특정 경로의 하향 분화를 가능하게 하도록 배양액에 첨가되면, 이러한 정의에 포함된다.

본 명세서에서, "리간드"는 두 번째 분자와 특이적으로 상호작용하여 화학 결합을 형성하는 첫 번째 분자를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 결합은 비-공유 결합, 예를 들면, 이온 상호작용 (ionic interaction), 수소 결합 (hydrogen bond), 또는 반데르 발스 힘 (Van der Waals forces)에 의해 매개된 상호작용일 것이다. 리간드 쌍 (즉, 앞서 지칭된 첫 번째와 두 번째 분자)의 실례에는 에피토프, 그리고 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 및 효소에 특이적으로 결합하는 기질이 포함된다. 두 분자 간에 해리 상수 (dissociation constant, K_d)는 리간드 및 이의 특정한 결합 상대 사이에 친화성의 한 가지 척도이다. 특정한 상호작용은 전형적으로, 상대적으로 적은 K_d로 특징된다. 매우 높은 친화성(매우 적은 K_d)로 서로 결합하는 리간드 쌍의 실례는 비오틴 (biotin)/아비딘 (avidin)이다. 대조적으로, 두 분자 간에 비-특이적 결합은 전하 및 소수성에 기초된 화학 결합의 형성을 수반할 수 있긴 하지만, 이들 상호작용은 특이적인 결합과 달리, 두 분자의 정확한 구조에 기초되지 않는다.

본 명세서에서, "세포의 혼성 개체군"은 하나 이상의 표현형으로 구성되는 세포의 시험관내 배양액을 지칭한다.

본 명세서에서, "희소돌기아교세포"에는 성숙 희소돌기아교세포 (소아 또는 성체 영장류로부터 분리된 희소돌기아교세포의 기능적 능력을 갖는 세포) 및/또는 희소돌기아교세포 전구체 (희소돌기아교세포 상에서, 희소돌기아교세포 내에서 또는 희소돌기아교세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하고 및/또는 희소돌기아교세포와 연관된 하나 이상의 형태학적 속성을 갖고, 그리고 시험관내에서 또는 개체 내로 이식될 때 성숙 희소돌기아교세포로 분화되는 세포)가 포함된다.

본 명세서에서, "골아세포"에는 성숙 골아세포 (소아 또는 성체 영장류로부터 분리된 골아세포의 기능적 능력을 갖는 세포) 및/또는 골아세포 전구체 (골아세포 상에서, 골아세포 내에서 또는 골아세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하고 및/또는 골아세포와 연관된 하나 이상의 형태학적 속성을 갖고, 그리고 시험관내에서 또는 개체 내로 이식될 때 성숙 골아세포로 분화되는 세포)가 포함된다.

본 명세서에서, "범-시토케라틴"은 적어도 복수의 시토케라틴 패밀리 구성원 상에서 또는 내에서 발현된 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체의 혼합물을 지칭한다.

본 명세서에서, "영장류 다능성 줄기 세포"(pPS)는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있고, 그리고 적절한 조건 하에, 3가지 배엽 (내배엽, 중배엽, 그리고 외배엽) 모두의 유도체인 상이한 세포 유형의 영장류 자손을 생산할 수 있는 세포를 지칭한다. pPS 세포는 8-12주령 SCID 생쥐에서 기형종을 형성하는 능력 및/또는 조직 배양액에서 3가지 배엽 모두의 확인가능 세포를 형성하는 능력을 갖는다. 영장류 다능성 줄기 세포의 정의에는 인간 배아 줄기 (hES) 세포 (참조: Thomson et al. (1998) Science 282:1145) 및 인간 배아 생식 (hEG) 세포 (참조: Shamblott et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726)를 비롯한 다양한 유형의 배아 세포; 다른 영장류로부터 배아 줄기 세포, 예를 들면, 붉은털 원숭이 줄기 세포 (참조: Thomson et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844), 명주원숭이 줄기 세포 (참조: (1996) Thomson et al., Biol. Reprod. 55:254,), 핵 이식 기술에 의해 산출된 줄기 세포 (U.S. Patent Application Publication No. 2002/0046410), 그리고 유도된 다능성 줄기 세포 (참조: Yu et al., (2007) Science 318:5858); Takahashi et al., (2007) Cell 131(5):861)가 포함된다. pPS 세포는 세포주로서 확립되고, 따라서 pPS 세포의 연속 공급원을 제공한다. 본 명세서에서 기술된 본 발명의 임의의 구체예는 pPS 세포를 pPS 세포의 하기 하위-그룹 중에서 한 가지 이상으로 치환함으로써 실행될 수 있는 것으로 고려된다: 인간 배아 줄기 세포, 인간 배아 생식 세포, 붉은털 원숭이 줄기 세포, 명주원숭이 줄기 세포, 핵 이식 줄기 세포 및/또는 유도된 다능성 줄기 세포.

본 명세서에서, "표적 표현형" 또는 "표적화된 표현형"은 시험관내에서 pPS 세포로부터 분화된 바람직한 세포 유형을 지칭한다.

본 명세서에서, "미분화된 영장류 다능성 줄기 세포"는 개체군 내에 실질적인 비율의 영장류 다능성 줄기 세포 및 이들의 유도체가 미분화된 세포의 형태학적 특징을 나타내고, 그리고 3가지 배엽: 내배엽, 중배엽 및 외배엽 각각으로부터 적어도 하나의 세포 유형을 발생시키는 능력을 유지하는 세포 배양액을 지칭한다. 개체군 내에서 미분화된 세포의 집락은 부분적으로 분화된 이웃 세포에 의해 둘러싸일 수도 있는 것으로 해석된다.

본 명세서에서, "치료한다", "치료", "치료하는"은 하기 중에서 한 가지를 의미한다: 질환 또는 장애의 심각도에서 감소; 질환 경과의 지속 기간에서 감소; 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 완화; 질환 또는 장애를 반드시 치료하지는 않으면서 질환 또는 장애를 앓는 개체에 유익한 효과의 제공, 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 예방.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 적어도 부분적으로, 무관계 표현형이 때때로, pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 세포 배양액 내에 존재한다는 발견에 관계한다. 전형적으로, 이들 무관계 표현형은 드물고 낮은 수준으로 존재한다. 무관계 표현형은 예로써, pPS 세포의 시험관내 분화된 자손이 개체에 투여될 때 생체내에서 배가함으로써 그 자신을 드러낼 수 있다. 무관계 표현형 세포의 한 가지 실례는 개체 내로 이식될 때, 군생 상피 구조로 발달하는 능력을 갖는 세포이다. 개체 내로 이식될 때 군생 상피 구조로 발달하는 능력을 갖는 세포는 전형적으로, 상피 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현할 수 있다. 일정한 무관계 표현형 세포는 상피 세포 마커, 예를 들면, EpCAM, 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, CD105 (endoglin), 시토케라틴 등의 존재에 의해 확인될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 무관계 표현형 세포의 세포 표면 상에서 발현된 상피 마커는 무관계 표현형 세포의 존재를 확인하고 고갈을 위하여 이들 세포를 표적하는데 적절한 마커를 제공한다. EpCAM은 이런 마커의 실례이다. EpCAM은 단독으로 또는 하기에 기술된 하나 이상의 마커와 공동으로, 고갈을 위하여 표적화될 수 있다. 따라서 EpCAM은 미분화된 세포에서 관찰되는 마커, 예를 들면, TRA-160과 함께, 고갈을 위하여 표적화될 수 있다. 다른 실례에는 하기 마커 중에서 하나 이상이 포함된다: 데스모콜린 3; 데스모글레인 2; E-카데린 CD49f, EMA, E-cad, CD321 (Jam1), CD10, CD66, 그리고 CD105 (endoglin). 따라서 하기에 기술된 마커는 무관계 표현형을 갖는 세포를 내포하거나, 또는 예로써 개체 내로 이식될 때 무관계 표현형을 갖는 세포로 발달할 수 있는 세포를 내포하는 세포의 혼성 개체군으로부터 제거/고갈을 위하여 이들 세포를 표적으로 하는데 이용될 수 있다.

놀랍게도, 이들 상피 마커를 발현하는 세포의 일정한 하위-개체군은 미분화된 pPS 세포에서 관찰되는 마커, 예를 들면, TRA-1-60을 발현하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 상피 세포 마커를 발현하는 세포를 적절한 리간드로 표적화하는 것은 개체군 내에 무관계 표현형 세포의 총수를 감축시킬 뿐만 아니라 다능성 줄기 세포를 내포하는, 세포 배양액에서 미분화된 pPS 세포와 연관된 마커를 발현하는 세포의 총수를 감축하는데 조력할 수 있다.

무관계 표현형 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 방법

일정한 구체예에서, 본 발명에서는 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 세포의 혼성 개체군을 무관계 표현형을 갖는 세포에 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키고, 이후 무관계 표현형 세포를 개체군으로부터 분리하는 단계를 포함한다. 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함할 수 있다.

혼성 세포 개체군은 적절한 완충액 내에서 리간드와 접촉될 수 있다. 적절한 완충액에는 인산염 완충된 염수 (phosphate buffered saline, PBS), 또는 세포의 혼성 개체군의 생존을 가능하게 하는 임의의 상업적으로 구입가능한 세포 배양 배지가 포함될 수 있다. 전형적으로, 완충액은 등장성 완충액이고 대략 6.8 내지 대략 7.7, 대략 6.9 내지 대략 7.6; 대략 7.0 내지 대략 7.5 범위의 pH를 가질 것이다. 일부 구체예에서, 완충액의 pH는 생리 pH일 것이다.

상기 방법은 마이크로웰 평판의 단일 웰로부터 획득가능한 샘플 크기에서부터 정률-증가 생물반응기 (scale-up bioreactor)로부터 획득되는 샘플까지 넓은 범위의 샘플 용적 (sample volumes)에 적용가능하다. 혼성 세포 개체군을 접촉시키는데 적합한 용적은 대략 50 ㎕ 내지 대략 10,000 리터 범위에서 변할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포의 혼합물을 접촉시키는데 적합한 용적은 대략 100 ㎕, 대략 200 ㎕, 대략 500 ㎕, 대략 1 ㎖, 대략 10 ㎖, 대략 50 ㎖, 대략 100 ㎖, 대략 1 리터, 대략 10 리터, 대략 50 리터, 대략 100 리터, 대략 1000 리터, 대략 2000 리터, 대략 5000 리터, 대략 8,000 리터, 대략 10,000 리터 또는 그 이상이다.

리간드 대(對) 혼성 세포 개체군을 내포하는 세포 총수의 임의의 적절한 비율이 이용될 수 있다. 가령, 리간드 대 세포 총수의 적절한 비율은 대략 1:1; 대략 10:1; 대략 100:1; 대략 1000:1; 대략 10,000:1; 대략 10⁵:1; 대략 10⁶:1; 대략 10⁷:1; 대략 10⁸:1; 대략 10⁹:1; 대략 10¹⁰:1이다.

일부 구체예에서, 리간드는 고형 서포트, 예를 들면, 구슬에 연결될 수 있다. 세포의 혼성 개체군 내에 존재하는 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하기 위하여 복수의 리간드 연결된 구슬이 이용될 수 있다. 가령, 구슬의 적절한 총수는 세포당 대략 1개 구슬; 세포당 대략 5개 구슬; 세포당 대략 10개 구슬; 세포당 대략 15개 구슬; 세포당 대략 20개 구슬; 세포당 대략 25개 구슬; 세포당 대략 30개 구슬; 세포당 대략 35개 구슬; 세포당 대략 40개 구슬; 세포당 대략 45개 구슬; 세포당 대략 50개 구슬; 세포당 대략 60개 구슬; 세포당 대략 70개 구슬; 세포당 대략 80개 구슬; 세포당 대략 90개 구슬; 세포당 대략 100개 구슬이다. 차례로, 각 구슬은 적어도 10개 리간드; 적어도 100개 리간드; 적어도 1000개 리간드; 적어도 10,000개 리간드; 적어도 10⁵개 리간드; 적어도 10⁶개 리간드; 적어도 10⁷개 리간드; 적어도 10⁸개 리간드; 적어도 10⁹개 리간드; 적어도 10¹⁰개 리간드; 적어도 10²⁰개 리간드; 적어도 10³⁰개 리간드; 적어도 10⁴⁰개 리간드; 적어도 10⁵⁰개 리간드에 연결될 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 방법은 리간드의 결합 상대를 발현하는 무관계 표현형 세포에 리간드의 결합을 용이하게 하기 위하여 상기 리간드 및 혼성 세포 개체군을 공동-배양하는 단계를 포함한다. 리간드 및 혼성 세포 개체군은 대략 3℃ 내지 대략 40℃ 범위의 온도에서 배양될 수 있다. 일부 구체예에서, 리간드 및 혼성 세포 개체군은 대략 4℃; 대략 20℃; 대략 37℃에서 배양될 수 있다. 리간드 및 세포의 혼성 개체군을 배양하기 위한 적절한 시간 길이는 대략 1분 내지 대략 60분; 대략 5분 내지 대략 50분; 대략 10분 내지 대략 40분 범위에서 변할 수 있다. 일부 구체예에서, 리간드 및 혼성 세포 개체군은 대략 10분; 대략 15분; 대략 20분; 대략 25분; 대략 30분; 대략 60분 동안 배양될 수 있다. 혼성 세포 개체군을 리간드와 접촉시킨 후, 세포는 비-특이적으로 결합된 리간드를 씻어내기 위하여 적절한 완충액으로 1회 이상 세척될 수 있다. 적절한 완충액에는 PBS, 임의의 상업적으로 가용한 등장성 완충액 또는 매체가 포함된다.

리간드 결합된 세포의 분리는 혼합물을 분리하기 위한 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 가령, 리간드는 하기에 기술된 바와 같은 검출가능 물질로 표식 (tagging)되고, 그리고 분리는 형광 활성화된 세포 분류기 (FACS)를 이용한 세포 분류 (cell sorting)에 의해 달성될 수 있다. 다른 실례로써, 리간드는 하기에 기술된 바와 같은 고형 서포트에 연결될 수 있다. 리간드 결합된 세포는 중력에 의해 침전될 수 있다. 대안으로, 리간드 결합된 세포가 세포의 혼성 개체군을 내포하는 다른 세포로부터 분리되도록 외력 (external force)이 리간드 결합된 세포에 적용될 수 있다. 가령, 리간드는 자화된 고형 서포트, 예를 들면, 자성 구슬에 연결될 수 있고, 그리고 리간드 결합된 세포를 내포하는 혼성 세포 개체군은 리간드 결합된 세포가 세포의 혼성 개체군을 내포하는 다른 세포로부터 분리되도록 자기장에 노출될 수 있다.

다른 구체예에서, 세포는 무관계 표현형인 것으로 간주되는 세포에 의해 발현되는 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉될 수 있다. 일부 구체예에서, 리간드는 세포와 접촉되기 이전에, 화학 작용제와 접합될 수 있다. 다른 구체예에서, 리간드는 세포에 먼저 결합되고, 이후 화학 작용제와 접촉될 수 있다. 따라서 리간드 결합된 세포는 리간드 결합된 세포에 결합하는 화학 작용제, 예를 들면, 리간드에 특이적으로 결합하는 작용제로 표적화될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 개입 리간드 (intervening ligand)가 이용될 수 있다. 따라서 첫 번째 리간드는 세포에 결합한다. 두 번째 리간드는 첫 번째 리간드 등에 결합한다. 화학 작용제는 세포에 결합된 임의의 리간드에 결합할 수 있다. 상기 작용제는 독소일 수 있고, 그리고 리간드 결합된 세포에 이의 결합은 따라서, 세포를 사멸시킬 수 있다. 적절한 독소의 실례에는 디프테리아 독소, 파상풍 독소 등이 포함된다. 상기 작용제는 소형 분자, 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질일 수 있다. 한 구체예에서, 리간드가 면역글로불린인 경우에, 화학 작용제는 보체이다.

분리가 수행되는 경우에, 무관계 표현형 세포는 리간드로부터 제거 또는 용리에 의해 수확될 수 있다. 무관계 표현형 세포의 용리는 한 가지 이상의 결합 조건, 예를 들면, 결합된 세포를 내포하는 완충액의 pH 또는 결합된 세포를 내포하는 완충액의 염 농도를 변화시킴으로써 달성될 수 있다.

리간드

무관계 표현형을 갖는 세포에 의해 발현된 마커에 특이적으로 결합하는 임의의 적절한 리간드가 이용될 수 있다. 리간드는 전장 단백질의 단백질 또는 펩티드 단편으로 구성될 수 있다. 적절한 단백질에는 무관계 표현형 세포의 표면 상에서 발현된 분자에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 펩티드가 포함될 것이다; 하지만, 일부 구체예에서, 리간드는 세포내 표적에 결합할 수 있다. 리간드는 또한, 핵산, 당, 지질, 당단백질, 또는 레시틴 또는 이들 중에서 한 가지의 조합, 또는 단백질 또는 펩티드 및 이들 중에서 한 가지의 조합으로 구성될 수 있다. 따라서 특정한 결합 쌍을 포함하는 임의의 리간드는 무관계 표현형을 포함하는 세포에 의해 발현되는 분자에 특이적으로 결합하고 표적 표현형 세포에 결합하지 않으면, 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 리간드가 이용될 수 있다. 따라서 첫 번째 리간드는 무관계 표현형 세포에 의해 발현된 마커에 직접적으로 결합하고, 그리고 두 번째 리간드는 이후, 첫 번째 리간드에 결합한다. 두 번째 또는 임의의 차후 리간드에 결합하는 추가의 리간드 역시 고려된다. 두 번째 (또는 차후) 리간드는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, FACS에 의한 세포 분류; 고형 서포트에 결합된 리간드의 침전; 자성 기질에 결합된 리간드의 자성 분리; 고형 서포트에 연결된 리간드에서 칼럼 크로마토그래피에 따른, 첫 번째 리간드에 결합된 세포의 분리를 용이하게 하는 태그 (tag)를 포함할 수 있다. 물론, 여분-표현형 세포에 의해 발현된 복수 분자는 상이한 리간드와 각각 결합될 수 있고, 그리고 이들 각 리간드는 차례로, 하나 이상의 추가 리간드와 접촉될 수 있다.

일부 구체예에서, 리간드는 항체일 수 있다. 본 명세서에서, 항체는 면역글로불린 또는 이의 일부분을 포함하고, 그리고 출처, 생산 방법, 그리고 기타 특징에 상관없이, 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포괄한다. 상기 용어에는 예로써, 다중클론, 단일클론, 단일특이적, 다중특이적, 인간화, 단일 사슬, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이 및 CDR 이식된 항체, 그리고 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 구성되는 분자가 포함된다. 항체의 일부는 항원에 여전히 결합할 수 있는 임의의 단편, 예를 들면, Fab, F(ab')2, Fv, scFv를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 무관계 표현형 세포에서 관찰되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 가변 영역 및 고형 서포트 또는 두 번째 리간드에 결합을 용이하게 하는 Fc 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체는 하기에 기술된 바와 같은 고형 서포트에 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 고형 서포트는 구슬이다. 특정한 구체예에서, 구슬은 자화된다.

일정한 구체예에서, 적절한 리간드는 상피 세포 또는 상피 계통 세포의 표면 상에서 발현된 에피토프에 대한 항체일 수 있다. 에피토프는 상피 세포의 표면 상에서 발현된 단백질, 탄수화물, 당, 및/또는 지질로 구성될 수 있다. 적절한 에피토프는 하기 분자 중에서 한 가지 이상을 발현하는 세포 상에서 관찰될 수 있다: EpCAM; 데스모콜린, 예를 들면, 데스모콜린 3; 데스모글레인, 예를 들면, 데스모글레인 2; E-카데린. 따라서 EpCAM, 데스모콜린, 예를 들면, 데스모콜린 3, 데스모글레인, 예를 들면, 데스모글레인 2, E-카데린에 결합하는 항체는 하기에 기술된 방법을 실행하는데 적합한 리간드일 수 있다. 이들 항체는 단독으로 또는 하나 이상의 추가 리간드와 공동으로 이용될 수 있다. 추가 리간드에는 상피 세포에 의해 발현된 분자에 특이적으로 결합하는 리간드가 포함될 수 있다. 대안으로, 리간드는 미분화된 pPS 세포에 의해 발현된 하나 이상의 분자에 결합하는 리간드와 합동될 수 있다. 가령, 미분화된 세포 상에서 관찰되는 에피토프에 결합하는 항체는 상피 세포 상에서 관찰되는 하나 이상의 마커를 발현하는 세포에 결합하는 리간드와 공동으로 이용될 수 있다. 따라서 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법에 이용될 수 있는 적절한 항체의 실례에는 상피 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커에 결합하는 리간드 이외에, TRA-1-60; TRA-1-81; SSEA 3; SSEA4; (참조: Thomson 1998, Science 282:1145) Cripto, 가스트린-방출 펩티드 (GRP) 수용체, 그리고 포도칼릭신 (podocalyxin)-유사 단백질 (참조 U.S. Patent Application No. 10/388,578)에 대한 항체가 포함될 수 있다.

리간드는 결합된 세포의 확인 및/또는 분리를 용이하게 하는 검출가능 물질과 결합되거나, 또는 공유 또는 비-공유 연결될 수 있다. 검출가능 물질에는 리간드에 부착될 때, 이러한 리간드의 존재의 인식을 가능하게 하는 임의의 화합물이 포함될 수 있다. 화합물은 예로써, 방사성 분자, 형광 분자, 합텐, 담체, 효소, 개입 분자, 예를 들면, 비오틴, 또는 염료를 포함할 수 있다. 검출가능 물질은 예로써, 화학발광 물질, 또는 생물발광 물질일 수 있다. 리간드는 또한, 독소, 예를 들면, 세포 사멸, 세포 용해 등을 유도하는 임의의 분자와 연결될 수 있다.

일정한 구체예에서, 리간드는 고형 서포트에 결합되거나 연결된다. 고형 서포트는 구슬, 겔, 모노리드 또는 막을 포함할 수 있다. 고형 서포트는 목적 리간드 (가령, 폴리스티렌, 세파로오스, 세파덱스)에 연결될 수 있는 임의의 물질을 포함할 수 있다. 고형 서포트는 임의의 합성 유기 중합체, 예를 들면, 폴리아크릴, 비닐 중합체, 아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리아실로니트릴, 그리고 폴리올레핀을 포함할 수 있다. 고형 서포트는 또한, 탄수화물 중합체, 예를 들면, 아가로오스, 셀룰로오스, 히알루론산, 키틴, 아실 겔란, 덱스트란, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸 전분, 카르복시메틸 키틴, 폴리(락티드-co-에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있다. 고형 서포트는 예로써, 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오르화물 (PVDF) 또는 카르복실화된 폴리비닐리덴 (U.S. Patent No. 6,037,124)을 포함할 수 있다. 고형 서포트는 폴리비닐 벤질 디메틸 히드록시에틸 암모늄 염화물, 폴리비닐 벤질 벤조일 아미노에틸 디메틸 암모늄 염화물, 폴리비닐 벤질 트리부틸 암모늄 염화물, 폴리비닐 벤질 트리헥실 암모늄 염화물과 폴리비닐 벤질 트리부틸 암모늄 염화물의 공중합체, 폴리비닐 벤질 디메틸 암모늄 염화물과 폴리비닐 아미노에틸 디메틸 암모늄 염화물의 공중합체로 코팅될 수 있다 (U.S. Patent No. 5,336,596). 고형 서포트는 무기 산화물, 예를 들면, 실리카, 지르코니아, 예를 들면, 탄소 피막 지르코니아 (U.S. Patent No. 5,182,016), 티타니아, 산화세륨, 알루미나, 망간, 마그네시아 (즉, 산화마그네슘), 산화칼슘, 다공성 유리 (controlled pore glass, CPG)를 포함할 수 있다. 고형 서포트는 또한, 덱스트란-아크릴아미드가 포함되지만 이에 국한되지 않는, 전술한 서포트 중에서 일부의 조합을 포함할 수 있다. 고형 서포트는 예로써, 이를 하나 이상의 차단 단백질, 예를 들면, 알부민, 카세인 등을 코팅함으로써 비-특이적 상호작용을 최소화시키도록 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 리간드는 고형 서포트 및 검출가능 물질 둘 모두에 연결될 수 있다.

일부 구체예에서, 고형 서포트에 리간드의 공유 결합을 용이하게 하는 조건 하에 적절한 농도의 리간드와 구슬을 혼합함으로써, 리간드가 고형 서포트, 예를 들면, 구슬에 연결될 수 있다. 리간드 및 구슬의 적절한 농도는 대략 0.1 mg 리간드/구슬 ㎖ 내지 대략 20 mg 리간드/구슬 ㎖; 대략 0.5 mg 리간드/구슬 ㎖ 내지 대략 10 mg 리간드/구슬 ㎖; 대략 1.0 mg 리간드/구슬 ㎖ 내지 대략 5 mg 리간드/구슬 ㎖의 범위에서 변한다. 일부 구체예에서, 대략 1 mg 리간드/구슬 ㎖가 이용된다. 다른 구체예에서, 대략 2 mg 리간드/구슬 ㎖가 이용된다. 일부 구체예에서, 대략 3 mg 리간드/구슬 ㎖가 이용된다. 다른 구체예에서, 대략 4 mg 리간드/구슬 ㎖가 이용된다. 다른 구체예에서, 대략 5 mg 리간드/구슬 ㎖가 이용된다.

일부 구체예에서, 항체는 공지된 접합 화학, 예를 들면, EHS 에스테르의 형성을 이용하여 구슬에 직접적으로 연결될 수 있다. 다른 구체예에서, 항체의 특정한 결합 상대는 구슬에 직접적으로 연결될 수 있고, 그리고 항체는 차례로, 특정한 결합 상대에 결합하고, 따라서 이를 구슬에 연결시킬 수 있다. 특정한 결합 상대는 특정한 에피토프에 결합하지 않는 항체의 영역, 예를 들면, 항체의 비-가변 영역에 결합할 수 있다. 적절한 영역에는 항체의 Fc 영역이 포함될 수 있다. 항체의 Fc 영역에 결합하는 결합 상대의 실례에는 단백질 A와 단백질 G가 포함된다. 대안으로, 항체는 다른 분자, 예를 들면, 비오틴에 접합되고, 이후 스트렙타비딘과 접합된 구슬에 결합될 수 있다.

한 특정한 구체예에서, 리간드는 예로써, 구슬, 예를 들면, 자성 구슬에 공유 연결된 EpCAM에 대한 항체이다. 항체는 구슬에 직접적으로 연결되거나, 또는 앞서 단락에서 기술된 바와 같이 개입 분자, 예를 들면, 단백질 A, 단백질 G, 비오틴, 스트렙타비딘에 의해 간접적으로 연결될 수 있다. 대안으로, 짧은 링커가 항체를 구슬에 고정시키는 역할을 수행하고, 따라서 항체의 결합 접근성 (binding accessibility)을 증강시킬 수 있다. 링커는 예로써, 하나 이상의 아미노산으로 구성될 수 있다.

다른 특정한 구체예에서, 리간드는 예로써, 구슬, 예를 들면, 자성 구슬에 공유 연결된 TRA-1-60에 대한 항체이다. 항체는 구슬에 직접적으로 연결되거나, 또는 앞서 단락에서 기술된 바와 같이 개입 분자, 예를 들면, 단백질 A, 단백질 G, 비오틴, 스트렙타비딘에 의해 간접적으로 연결될 수 있다. 대안으로, 짧은 링커가 항체를 구슬에 고정시키는 역할을 수행하고, 따라서 항체의 결합 접근성 (binding accessibility)을 증강시킬 수 있다. 링커는 예로써, 하나 이상의 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, TRA-1-60에 대한 항체는 IgG 아이소타입을 갖는다. 다른 구체예에서, TRA-1-60에 대한 항체는 IgM 아이소타입을 갖는다.

일부 구체예에서, 상피 세포에 의해 발현된 마커에 대한 하나 이상의 항체의 조합이 무관계 표현형 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 고갈시키는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상피 세포에 의해 발현된 마커에 대한 하나 이상의 항체는 미분화된 세포에 의해 발현되는 마커에 대한 하나 이상의 항체와 합동될 수 있다.

일부 구체예에서, EpCAM에 대한 하나 이상의 항체 및 TRA-1-60에 대한 하나 이상의 항체의 조합이 무관계 표현형 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 고갈시키는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이용된 모든 항체는 IgG 아이소타입을 갖는다. 다른 구체예에서, 항체 중에서 적어도 하나는 IgG 아이소타입을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 항체 중에서 적어도 하나는 IgM 아이소타입을 갖는다.

세포 개체군

일정한 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군을 제시한다. 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형을 갖는 적어도 하나의 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 제거함으로써 표적화된 세포 유형에 대하여 강화될 수 있다.

1. 무관계 표현형

일부 구체예에서, 무관계 표현형 세포에는 예로써, 상피 형태를 갖는 세포, 상피 세포 내에서 또는 상에서 발현된 적어도 하나의 마커를 발현하는 세포, 개체 내로 이식될 때 군생 상피 구조를 형성할 수 있는 세포, 미분화된 다능성 세포, 미분화된 세포의 형태를 갖는 세포, 미분화된 세포 내에서 또는 상에서 발현된 적어도 하나의 마커를 발현하는 세포가 포함될 수 있다. 미분화된 세포 내에서 또는 상에서 발현된 마커의 실례에는 TRA-1-60, TRA-1-81; SSEA 3; SSEA 4; Oct 4가 포함된다. 상피 세포 내에서 또는 상에서 발현된 마커의 실례에는 EpCAM, 그리고 시토케라틴이 포함된다. 상피 세포 상에서 발현된 다른 적절한 마커에는 데스모콜린, 데스모글레인, 그리고 E-카데린이 포함될 수 있다. 이들 세포는 개체, 예를 들면, 설치류 내로 이식될 때, 상피 클러스터를 형성하는 능력을 가질 수 있다.

2. 표적화된 표현형

표적화된 표현형 세포는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손일 수 있는데, 여기에는 희소돌기아교세포, 신경 세포, 예를 들면, 뉴런 및 성상세포, 심근세포, 조혈 세포, 췌장 섬 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포가 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 세포는 성숙 표적 세포, 예를 들면, 성숙 심근세포, 성숙 희소돌기아교세포 등이다. 다른 구체예에서, 표적화된 세포 유형은 전구 세포, 예를 들면, 심근세포 전구체, 희소돌기아교세포 전구체, 신경 세포 전구체, 섬 세포 전구체, 조혈 세포 전구체, 간세포 전구체, 골아세포 전구체, 연골세포 전구체이다. 전구 세포는 상응하는 성숙 세포 유형에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하고; 및/또는 상응하는 성숙 세포 유형에서 관찰되는 하나 이상의 형태학적 특질 (feature)을 갖고 및/또는 생체내에서 또는 시험관내에서 상응하는 성숙 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는다. 표적화된 세포 유형에는 하기 세포 유형: 희소돌기아교세포, 뉴런 세포, 심근세포, 조혈 세포, 췌장 섬 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포 중에서 한 가지 상에서, 내에서 또는 이에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포가 포함될 수 있다 (적절한 마커의 실례는 하기 단락에서 제공된다). 마커는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 면역세포화학 (immunocytochemistry), 면역조직화학 (immunohistochemistry), FACS, 웨스턴 블롯, ELISA를 이용하여 검출되거나, 또는 qPCR이 표적 세포 상에서, 내에서 또는 이에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 검출하는데 이용될 수 있다.

시험관내에서 pPS 세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 방법은 U.S. Patent No. 7,285,415에서 보고되었는데, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 희소돌기아교세포는 예로써, pPS 세포를 성장 인자, 갑상선 호르몬 수용체에 대한 리간드 및 레티노산 수용체에 대한 리간드와 접촉시킴으로써, 시험관내에서 pPS 세포의 개체군으로부터 분화될 수 있다. 희소돌기아교세포 상에서, 내에서 또는 이들 세포에 의해 발현된 마커에는 대식세포와 희소돌기아교세포 전구체에 의해 발현된 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸, NG2; 수임된 (committed) 희소돌기아교세포에 대한 마커, 갈락토세레브로시드 (galactocerebroside, GalC); 성숙 미엘린의 마커, 미엘린 염기성 단백질 (myelin basic protein, MBP); CNS 세포에 대한 마커, 미세소관 연관된 단백질 2 (MAP-2); 희소돌기아교세포와 아교세포 전구체에서 발현되는 미엘린의 한 가지 성분, 미엘린 단백지질 단백질; 희소돌기아교세포, 성상세포, 그리고 이들 전구체에 대한 마커, O4 항체에 의해 정의된 에피토프; 타입 2 성상세포, 아교세포 전구체, 그리고 희소돌기아교세포 전구체 상에서 발현된 에피토프, A2B5; 희소돌기아교세포 및 그들의 과정을 염색하고, 그리고 척수와 소뇌 둘 모두에서 미엘린화된 축색 돌기 (axon)와 일치하는 RIP 항체에 의해 인식되는 에피토프가 포함된다.

시험관내에서 pPS 세포를 신경 세포로 분화시키는 방법은 예로써, U.S. Patent No. 6,833,269; U.S. Patent Publication No. 2005/0095707; 2005/0158855에서 기술되고, 이들 모두 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 신경 세포는 예로써, pPS 세포를 노긴 (noggin) 및/또는 폴리스타틴 (follistatin)과 접촉시키거나; pPS 세포를 TGFβ 길항약과 접촉시키거나, 또는 배양체 (EB)를 형성하고 이들 EB를 10 μM 레티노산과 함께 현탁 배양하고, 이후 이들 세포를 표피 성장 인자 (EGF), 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 혈소판 유래된 성장 인자 (PDGF), 그리고 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF1)로 보충된 규정된 배지 내로 도말함으로써, 시험관내에서 PS 세포의 개체군으로부터 분화될 수 있다. 신경 세포 상에서, 내에서 또는 이들 세포에 의해 발현된 마커에는 NCAM, A2B5, β 튜불린 III, 그리고 미세소관-연관된 단백질 2 (MAP 2)가 포함된다.

시험관내에서 pPS를 심근세포로 분화시키는 방법은 예로써, U.S. Patent No. 7,452,718; 7,425,448; U.S. Patent Publication No. 2005/0054092; 2007/0010012에서 기술되고, 이들 모두 본 발명에 참조로서 편입된다. pPS 세포는 이들 pPS 세포를 심근세포로 분화시키기 위하여 액티빈, 그 이후에 골 형태형성 단백질 (BMP)과 접촉될 수 있다. 심근세포 상에서, 내에서 또는 이들 세포에 의해 발현된 마커에는 가로무늬근 수축 (striated muscle contraction)의 조절을 위한 칼슘 민감성 분자 스위치 (molecular switch)를 제공하는 트로포닌 복합체의 아단위, 심장 트로포닌 I (cTnI); 심장 트로포닌 T (cTnT); 초기 배아 발달 동안 심장 중배엽에서 발현되고 발달 중인 심장에서 존속하는 심장 전사 인자, Nkx2.5; 발달 중인 심장 및 태아 심근세포에서 발현되지만 성체에서 하향 조절되는 호르몬, 심방 나트륨배설 인자 (atrial natriuretic factor, ANF)가 포함된다. 다른 적절한 마커에는 심장 특이적인 미오신 중쇄 (MHC), 특히 β 사슬; 티틴 (titin), 트로포미오신 (tropomyosin), α 근절 액티닌 (sarcomeric actinin), 그리고 데스민 (desmin); 심장 중배엽에서 고도로 발현되고 발달 중인 심장에서 존속하는 전사 인자, GATA-4가 포함된다. 또 다른 적절한 마커에는 심장 세포 간에 부착을 매개하는 MEF 2A, MEF 2B, MEF 2C, MEF 2D; N-카데린; 심근세포 간에 갭 연접 (gap junction)을 형성하는 코넥신 (connexin) 43; β1 아드레날린수용체 (β1 AR); 심근 경색후 혈청 내에서 상승되는 크레아틴 키나아제 MB (CK MB) 및 미오글로빈 (myoglobin); α 심장 액틴이 포함될 수 있다.

시험관내에서 pPS 세포를 조혈 세포로 분화시키는 방법은 예로써, U.S. Patent No. 7,247,480; U.S. Patent Application No. 12/412,480 및 U.S. Patent Publication No. 2005/0282272에서 기술되고, 이들 모두 본 발명에 참조로서 편입된다. 실례로써, pPS 세포는 이들 pPS 세포를 복수의 사이토킨, 예를 들면, BMP-4, 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 줄기 세포 인자 (SCF) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)와 접촉시켜 pPS 세포를 미성숙 수상돌기 세포로 분화시킴으로써 수상돌기 세포로 분화될 수 있다. 미성숙 수상돌기 세포는 이후, 성숙 수상돌기 세포를 산출하기 위하여 성숙 칵테일 (maturation cocktail), 예를 들면, GM-CSF, 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터류킨 1-β (IL-1β), 인터페론 γ (IFNγ), 그리고 프로스타글란딘 E2 (PGE2)와 접촉될 수 있다. 조혈 세포 내에서, 상에서 또는 이들 세포에 의해 발현된 마커에는 CD34, CD59, Thy1/CD90, CD38, C-kit/CD117, CD13, IL-3Rα (CD123), 그리고 CD45RA, CD64 CD14, CD45, CD11a, CD11b, CD15 CD11c, MHC I, MHC II, CD83, CCR7, CD205, CD86, CD40, MHC I, MHC II, CD8, CD4, CD119, CD74, CD71, CD75, CD51, CD56, CD65, CD10, CD66a, CD66b, CD44, 베타글로빈 (betaglobin) 및 미오글로빈이 포함된다.

시험관내에서 pPS 세포를 섬 세포로 분화시키는 방법은 예로써, U.S. Patent No. 7,033,831 및 U.S. Patent Application No. 12/303,895에서 기술되고, 이들 모두 본 발명에 참조로서 편입된다. 실례로써, pPS 세포는 이들 pPS 세포를 먼저, 액티빈 및 부티르산나트륨과 접촉시키고, 그 이후에 노긴, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린 유사 성장 인자 2 (IGF-2) 및 니코틴아미드와 접촉시킴으로써, 섬 세포로 분화될 수 있다. 섬 세포 (섬 세포 전구체 포함) 상에서, 내에서 또는 이들 세포에 의해 발현된 마커에는 인슐린, c-펩티드, Hlxb9, Pdx1, Neurogenin3, Pax4, NeuroD1, Isl1, Nkx2.2, 그리고 Nkx6.1; 췌장 폴리펩티드, 췌도 아밀로이드 폴리펩티드 (IAPP), Islet 1, Beta 2/NeuroD, HNF4a가 포함된다. 또한, Sox17과 HNF3β를 발현하는 특정 섬 세포 전구 세포인 완성 내배엽 세포가 포함된다.

시험관내에서 pPS 세포를 간세포로 분화시키는 방법은 예로써, U.S. Patent No. 6,458,589; 6,506,574; 7,256,042; 7,473,555; 그리고 U.S. Patent Application No. 12/303,104에서 기술되고, 이들 모두 본 발명에 참조로서 편입된다. 가령, pPS 세포는 이들 pPS 세포를 DMSO와 부티르산염, 그 이후에 EGF, TGFα, 간세포 성장 인자 (HGF), 그리고 부티르산염과 접촉시킴으로써 시험관내에서 간세포로 분화될 수 있다. 간세포 상에서, 내에서 또는 이들 세포에 의해 발현된 마커에는 α₁-안티트립신 (AAT), 알부민; 아시알로당단백질 수용체 (ASGR1 또는 ASGR2 아이소타입); Ck8, Ck18, Ck19, 시토크롬 p450, CYP1A1/2d CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2E1, CYP3A3-5 글루코오스-6-포스파타아제; HNF-4α, α-태아단백질, apoE, 글루코키나아제, 인슐린 유사 성장 인자 1과 2 수용체, 인슐린 수용체, 렙틴, apoAI, apoAII, apoB, apoCIII, apoCII, 알돌라아제 B, 페닐알라닌 히드록실라아제, L-타입 지방산 결합 단백질, 트랜스페린, 레티놀 결합 단백질, 에리트로포이에틴 (EPO), 그리고 NADPH-Cc가 포함된다.

시험관내에서 pPS 세포를 골아세포로 분화시키는 방법은 예로써, U.S. Patent Application No. 2005/028274에서 기술되고, 이는 본 발명에 참조로서 편입된다. 가령, pPS 세포는 이들 pPS 세포를 골 형태형성 단백질 (BMP), 인간 TGF-β 수용체에 대한 리간드, 또는 비타민 D 수용체에 대한 리간드와 접촉시킴으로써, 시험관내에서 골아세포로 분화될 수 있다. 이들 세포는 또한, 덱사메타손, 아스코르브산-2-인산염, 그리고 칼슘과 인산염의 공급원과 접촉될 수 있다. 골아세포 상에서, 내에서 또는 이들 세포에 의해 발현된 마커에는 오스테오칼신 (osteocalcin), 오스테오넥틴 (osteonectin), 1형 콜라겐, 알칼리성 포스파타아제, BMP 수용체, PTH 수용체, CD105 (endoglin), CD106 (VCAM), CD166 (ALCAM), CD29, CD44 및 GATA 4가 포함된다.

시험관내에서 pPS 세포를 연골세포로 분화시키는 방법은 예로써, U.S. Patent Application No 2006/0148077에서 기술된다. 가령, pPS 세포는 이들 pPS 세포를 전환 성장 인자 (TGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 성장과 분화 인자 (GDF), 골 형태형성 단백질 (BMP), 헤지호그 (hedgehog) 단백질 (HH), L-아스코르브산, 그리고 부갑상선 호르몬-관련된 단백질 (PTHrP)과 접촉시킴으로써, 시험관내에서 연골세포로 분화될 수 있다. 이들 세포는 분화 과정 동안 배양액에서 마이크로매스 (micromass)로서 유지될 수 있다. 연골세포 상에서, 내에서 또는 이들 세포에 의해 발현된 마커에는 II형 콜라겐 또는 아그레칸 (aggrecan)이 포함된다.

강화된 세포 개체군

앞서 언급된 바와 같이, 본 발명에서는 표적 표현형이 강화된 세포 개체군을 제시한다. 세포 개체군은 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축함으로써 강화될 수 있다. 무관계 표현형 세포는 하기에 기술된 바와 같이 상피 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현할 수 있다. 무관계 표현형 세포는 상피 세포의 형태를 가질 수 있다. 무관계 표현형 세포는 개체 내로 이식될 때, 군생 상피 구조를 형성하는 능력을 가질 수 있다. 무관계 표현형 세포는 미분화된 pPS 세포일 수 있다. 무관계 표현형 세포는 pPS 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커, 예를 들면, TRA-1-60, TRA-1-81, Oct4, SSEA3, SSEA4를 발현하는 세포일 수 있다. 무관계 표현형 세포는 본 단락에서 기술된 무관계 표현형 세포 중에서 한 가지 이상의 조합을 포함할 수 있다. 따라서 일정한 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형을 포함하는 세포의 강화된 개체군을 제시하고, 여기서 무관계 표현형 세포 중에서 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%는 표적 세포 표현형을 포함하는 세포 개체군으로부터 제거된다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 표적화된 표현형을 포함하는 혼성 세포 개체군을 제시하고, 여기서 무관계 표현형을 갖는 적어도 하나의 세포는 혼성 개체군으로부터 제거되고, 그리고 여기서 표적 표현형은 무관계 표현형을 갖는 적어도 하나의 세포가 제거된 이후, 개체군 내에 세포 중에서 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%를 구성한다. 표적화된 세포 유형은 희소돌기아교세포, 신경 세포, 심근세포, 조혈 세포, 췌장 섬 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서, 또는 희소돌기아교세포, 뉴런 세포, 심근세포, 조혈 세포, 췌장 섬 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택되는 세포 상에서, 내에서 또는 이에 의해 발현된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포에서 선택될 수 있다.

키트

일정한 구체예에서, 본 발명에서는 무관계 표현형을 갖는 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 고갈시키기 위한 키트를 제시하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형 세포 및 무관계 표현형 세포를 포함한다. 양쪽 세포 유형은 pPS 세포의 시험관내 자손일 수 있다. 가령, 표적화된 표현형 세포는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손으로 구성되고, 반면 무관계 표현형 세포는 pPS 세포의 분화된 자손, pPS 세포의 미분화된 자손 또는 양쪽의 조합을 포함한다. 키트는 무관계 표현형을 포함하는 세포에 의해 발현된 하나 이상의 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 리간드는 하나 이상의 용기에 담겨 제공될 수 있다. 리간드는 용액, 예를 들면, 수성 완충액, 예를 들면, 등장성 완충액, PBS 등에 담겨 제공될 수 있다. 대안으로, 하나 이상의 리간드는 동결 건조된 형태로 제공될 수 있다. 키트는 동결 건조된 리간드를 재구성하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다. 키트는 세포의 혼성 개체군을 리간드와 접촉시키기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다. 사용설명서에는 무관계 표현형을 고갈시키는데 이용되는 리간드의 적절한 농도가 포함된다. 선택적으로, 키트는 하나 이상의 대조, 예를 들면, 제공된 하나 이상의 리간드에 결합하는 양성 대조 세포 유형 및 제공된 하나 이상의 리간드에 결합하지 않는 음성 대조 세포 유형을 포함할 수도 있다.

일부 구체예에서, 키트 내에 제공된 리간드는 항체일 수 있다. 리간드는 무관계 표현형을 포함하는 세포에 의해 발현된 분자에 결합하는 항체일 수 있다. 적절한 항체의 실례에는 TRA-1-60 항체, EpCAM 항체, 시토케라틴 항체, 예를 들면, 범-시토케라틴 항체, TRA-1-81에 대한 항체, SSEA3에 대한 항체, 그리고 SSEA4에 대한 항체가 포함된다. 항체는 임의의 아이소타입, 예를 들면, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD일 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 EpCAM에 결합하는 IgG일 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 시토케라틴에 결합하는 IgG일 수 있다. 한 구체예에서, 복수의 시토케라틴 상에서 상이한 에피토프에 결합하는 복수의 IgG 항체가 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 TRA-1-60에 결합하는 IgM일 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 TRA-1-60에 결합하는 IgG일 수 있다. 한 구체예에서, 상이한 항체의 조합, 예를 들면, 본 단락에서 기술된 복수 유형의 항체가 이용될 수 있다. 따라서 단일 항원 (하지만 상이한 에피토프)에 지향되는 복수의 항체가 이용될 수 있다. 복수의 항원에 지향되는 복수의 항체가 이용될 수 있다.

키트는 리간드에 대한 고형 서포트를 포함할 수 있다. 고형 서포트는 하기에 상세하게 기술된다. 단일 용기 내에 고형 서포트에 이미 연결된 리간드가 제공될 수 있다. 대안으로, 키트는 서로 연결되지 않은 항체 및 고형 서포트를 제공할 수 있다. 따라서 고형 서포트 및 리간드는 별도의 용기에 담겨 제공될 수 있다. 키트는 사용설명서 및 리간드를 고형 서포트에 연결하기 위한 한 가지 이상의 시약을 제공할 수 있다.

키트는 키트 내에 제공된 하나 이상의 리간드에 연결될 수 있는 하나 이상의 검출가능 물질을 더욱 포함할 수 있다. 검출가능 물질은 하기에 상세하게 기술된다. 이들 하나 이상의 검출가능 물질은 각각, 하나 이상의 검출가능 물질을 하나 이상의 리간드에 연결하기 위한 사용설명서와 함께, 하나 이상의 별도 용기에 담겨 제공될 수 있다.

키트는 고형 서포트에 결합된 리간드와의 접촉 이후에, 세포의 혼성 개체군으로부터 리간드 결합된 무관계 표현형 세포의 분리가 용이해지도록 외력을 세포의 혼성 개체군에 적용하는 수단을 제공할 수 있다. 외력은 자기장일 수 있다.

한 구체예에서, 키트는 EpCAM에 대한 항체, 시토케라틴, 예를 들면, 범-시토케라틴에 대한 항체, 데스모콜린에 대한 항체, 데스모글레인에 대한 항체, 그리고 E-카데린에 대한 항체 및/또는 TRA-1-60에 대한 항체에서 선택되는 하나 이상의 항체를 포함할 수 있다. 하나 이상의 항체는 자성 구슬에 접합될 수 있다. 키트는 항체에 결합된 무관계 표현형 세포의 제거를 용이하게 하기 위하여 적합된 자기장 근원을 더욱 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 항체를 유지하는 하나 이상의 용기 및 자기장 근원을 포함할 수 있다. 키트는 세척 용액 및/또는 완충액, 그리고 항체와 자기장을 이용하기 위한 사용설명서를 선택적으로 포함할 수 있다.

강화된 세포 개체군의 용도

본 발명에서는 표적 표현형이 강화된 다수의 세포를 생산하는 방법을 제시한다. 표적 표현형에는 희소돌기아교세포, 신경 세포, 심근세포, 조혈 세포, 섬 세포, 간세포, 연골세포 및 골아세포가 포함된다. 이들 세포 개체군은 다수의 중요한 연구, 개발, 그리고 상업적 목적에 이용될 수 있다. 제공된 개체군이 표적 표현형에 대하여 강화되기 때문에, 이들은 이렇게 강화되지 않은 세포 개체군에 비하여, 하기에 기술된 모든 용도에 더욱 적합할 것이다.

스크리닝

본 발명의 강화된 표적 세포 개체군은 이런 세포 및 이들의 다양한 자손의 특징에 영향을 주는 인자 (가령, 용매, 소형 분자 약물, 펩티드, 올리고뉴클레오티드) 또는 환경 조건 (가령, 배양 조건 또는 조작)을 스크리닝하기 위하여 상업적으로 이용될 수 있다. 특징에는 세포의 표현형 또는 기능적 특성이 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 스크리닝 적용은 강화된 표적 세포 개체군에 대한 그들의 효과와 관련하여 제약학적 화합물의 검사에 관계한다. 스크리닝은 화합물이 세포에 대한 약리학적 효과를 갖도록 설계되기 때문에, 또는 다른 효과를 갖도록 설계된 화합물이 표적 표현형의 세포에 대한 의도하지 않은 부작용을 나타낼 수 있기 때문에, 수행된다. 다른 스크리닝 적용에는 발암성 또는 다른 독성 효과에 대하여 화합물을 스크리닝하는 것이 포함될 수 있다. 스크리닝은 표적 화합물이 표적 세포에 대한 유익한 또는 유해한 효과를 갖는 지를 결정하기 위하여, 본 발명의 전구 세포 또는 최종 분화된/성숙 세포 중에서 한 가지를 이용하여 수행될 수 있다. 하기에 기술된 강화된 표적 개체군을 이용하는 것은 더욱 정확한 스크리닝 결과를 제공할 것이다.

독자는 전반적으로, 표준 교재 In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997를 참고한다. 후보 제약학적 화합물의 활성의 평가는 일반적으로, 본 발명의 강화된 표적 세포를 단독으로 또는 다른 약물과 공동으로, 후보 화합물과 합동시키는 것을 필요로 한다. 본 발명자들은 화합물에 기인하는, 형태, 하기에 기술된 같은 마커 표현형, 또는 세포의 기능적 활성에서 임의의 변화 (처리되지 않은 세포 또는 비활성 화합물로 처리된 세포와 비교하여)를 결정하고, 이후 화합물의 효과를 관찰된 변화와 상관시킨다.

세포독성은 첫 번째 사례에서 세포 생존능, 생존, 형태, 그리고 일정한 마커와 수용체의 발현에 대한 효과에 의해 결정될 수 있다. 염색체 DNA에 대한 약물의 효과는 DNA 합성 또는 수복을 측정함으로써 결정될 수 있다. 특히, 세포 주기에서 예정에 없는 시점에, 또는 세포 복제에 요구되는 수준 이상으로 [³H]-티미딘 또는 BrdU 함입 (incorporation)은 약물 효과 (drug effect)와 일치한다. 원치않는 효과에는 중기 확장 (metaphase spread)에 의해 결정된, 자매 염색분체 교환 (sister chromatid exchange)의 비정상적 비율 역시 포함될 수 있다. 독자는 더욱 면밀한 검토를 위하여 A. Vickers (In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997에서 pp 375-410)를 참고한다.

효과가 관찰되는 경우에, 화합물의 농도는 중위수 효과 용량 (median effective dose, ED₅₀)을 결정하기 위하여 적정될 수 있다.

동물 검사

본 발명에서는 또한, 임의의 인식된 요구, 예를 들면, 대사 기능에서 선천적 오류, 질병 상태의 효과, 또는 현저한 외상의 결과로 인하여 조직 유지 또는 조직 기능의 수복을 증강시키기 위한 본 발명의 강화된 표적 세포의 용도를 제시한다.

치료적 투여를 위한 세포 조성물의 적합성을 결정하기 위하여, 강화된 표적 세포는 먼저, 적절한 동물 모형, 예를 들면, 쥐, 생쥐, 기니 피그, 토끼, 소, 말, 양, 돼지, 개, 영장류 또는 기타 포유동물에서 조사될 수 있다. 한 가지 수준에서, 세포는 생체내에서 그들의 표현형을 생존시키고 유지하는 능력에 대하여 평가된다. 세포 조성물은 면역결핍 동물 (가령, 누드 생쥐, 또는 화학적으로 또는 방사선에 의해 면역결핍된 동물)에 투여될 수 있다. 조직은 일정한 재생 기간후 수확되고, 그리고 다능성 줄기 유래된 세포가 여전히 존재하는 지에 대하여 평가된다. 당분야에 공지된 기능적 검사가 수행될 수 있다.

세포 생존은 검출가능 라벨 (가령, 녹색 형광 단백질, 또는 β-갈락토시다아제)을 발현하는 세포; 미리 표지된 (가령, BrdU 또는 [³H]티미딘으로) 세포를 투여함으로써, 또는 구조성 세포 마커 (가령, 인간-특이적 항체 이용)의 차후 검출에 의해 모니터링될 수 있다. 투여된 세포의 존재와 표현형은 인간-특이적 항체를 이용한 면역조직화학 또는 ELISA에 의해, 또는 공개된 서열 데이터에 따라, 증폭이 인간 폴리뉴클레오티드에 특이적이 되도록 하는 프라이머 및 혼성화 조건을 이용한 RT-PCR 분석에 의해 평가될 수 있다.

한 구체예에서, 강화된 표적 세포 개체군은 군생 상피 구조의 형성을 조사하기 위하여 동물에 투여될 수 있다. 동물은 설치류, 예를 들면, 생쥐 또는 쥐일 수 있다. 강화된 세포는 적절한 시간 길이, 예를 들면, 대략 1-12개월 동안 동물에 투여될 수 있다. 동물은 희생될 수 있고, 그리고 강화된 세포 개체군을 수용하는 조직은 상피 형태를 갖고 및/또는 상피 세포에서 관찰되는 하나 이상의 마커 및/또는 미분화된 pPS 세포에서 관찰되는 하나 이상의 마커를 표지하는 영장류 세포를 스크리닝하기 위하여 조직학적 검사 또는 ICC, 또는 둘 모두에 종속될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 강화된 표적 세포는 특정 질환에 대한 공지된 동물 모형을 이용하여 기능적으로 조사될 수 있다. 예로써, 표적 세포 유형이 심근세포이면, 심장 질환 및/또는 경색에 대한 여러 모형 중에서 한 가지가 이용될 수 있다. 심장은 예냉된 알루미늄 막대를 전방 좌심실 벽 (anterior left ventricle wall)의 표면과 접촉 배치함으로써 냉동손상 (cryoinjury)될 수 있다 (Murry et al., J. Clin . Invest. 98:2209, 1996; Reinecke et al., Circulation 100:193, 1999; U.S. Patent No. 6,099,832; Reinecke et al., Circ Res., Epub Mar 2004). 더욱 큰 동물에서, 냉동손상은 액체 N₂에서 냉각된 30-50 mm 구리 디스크 프로브를 ~20분 동안 좌심실의 전방 벽에 배치함으로써 달성될 수 있다 (Chiu et al., Ann . Thorac . Surg. 60:12, 1995). 경색은 좌주간부 관상동맥 (left main coronary artery)을 결찰함으로써 (Li et al., J. Clin . Invest. 100:1991, 1997), 또는 점진적으로 팽창하여 동맥을 폐쇄시키는 아메로이드 수축 장치 (ameroid constriction device)를 이용함으로써 유도될 수 있다. 손상된 부위는 본 발명의 세포 제조물로 처리되고, 그리고 심장 조직은 조직학에 의해, 손상된 부위 내에서 이들 세포의 존재에 대하여 조사된다. 심장 기능은 좌심실 이완기 말압 (left ventricular end-diastolic pressure), 생성압 (developed pressure), 압력 상승률, 그리고 압력 강하율과 같은 파라미터를 결정함으로써 모니터링될 수 있다.

표적 세포가 희소돌기아교세포인 경우에, 만성 미엘린제거의 영역은 성체 쥐 배 척수 (dorsal column)에서 유도될 수 있다 (Keirstead et al., J Neurosci. 19:7529, 1999). 척수는 노출된 세포의 DNA 내로 새김눈 (nick)을 유도하고, 따라서 분열하는 세포의 사멸을 유발하는 납 차폐 (lead shielding)를 이용하여, T9에 중심된 2 cm의 거리에서 40 G의 X 방사선에 노출된다. 2일후, T9에서 브롬화 에티듐의 직접적인 척수내 주사 (intraspinal injection)가 수행된다. 브롬화 에티듐은 그 자신에게 노출된 세포를 사멸시키고, 생존하는 희소돌기아교세포와 성상세포가 없는 만성 미엘린제거의 무세포 영역을 배 척수 부위의 ~60%까지 되게 하는 DNA 인터킬레이트화제 (interchelating agent)이다.

3일후, 이들 동물은 미엘린제거의 부위 내로 희소돌기아교세포 계통 세포의 강화된 개체군이 이식된다. 선택적으로, 이들 세포는 48시간 전에 배양 배지에 첨가된 브로모데옥시우리딘 (bromodeoxyuridine, BrdU)으로 미리 표지될 수 있다. 첫 번째 경우에, 세포는 ~30개 전구체의 클러스터로서 제조되고, ~60,000개 세포/㎕의 밀도로 농축될 수 있다. 1 ㎕의 세포가 끌어당겨진 유리 마이크로피펫 또는 대략 80 ㎛ 외부 직경 (outside diameter)의 주사기 바늘을 이용하여 대략 10분에 걸쳐 손상 부위 내로 투여된다. 대략 2-4주후, 조직 샘플은 1 mm 횡단 블록 (transverse block)으로 수지 또는 동결 절편법에 대비된다.

두정면 (coronal face)으로부터 절편은 톨루이딘 블루로 염색되고 전반적인 병리, 재미엘린화 (remyelination)의 증거, 그리고 세포 형태에 대하여 분석된다. 손상된 영역이 무세포성이기 때문에, 이식후 존재하는 세포는 투여된 세포로부터 유래된다. 동결 절편은 관련된 세포 유형의 마커, 예를 들면, GFAP (성상세포), CNP (희소돌기아교세포), RIP (희소돌기아교세포), 또는 NeuN (뉴런)에 대하여 염색될 수 있다. 극박 절편은 또한, 미엘린 박막층의 총수 및 세포 초미세구조 (ultrastructure)에 대하여 전자 현미경에 의해 분석될 수 있다. 미엘린제거 부위 전역에서 이식된 세포의 재분포, 그리고 성숙 미엘린화 세포로의 분화가 결정될 수 있다. 25%, 50%, 또는 75%의 수준에서 미엘린제거된 축색 돌기의 비율로서 재미엘린화는 증가된 생물학적 효능의 증거이다.

강화된 표적 세포는 타박 손상 (contusion injury) 및 척수 반절단 (dorsal hemisection)을 비롯한 SCI에 대한 모형에서 조사될 수 있다. 타박 손상의 경우에, 척추 코스 (spinal course)는 적절한 척추 타박 손상 장치 (spinal contusion injury device)를 이용하여 23 밀리세컨드(millisecond)에 걸쳐 대략 0.9 mm (중등도 손상) 이탈된다. 반절단 손상의 경우에, 척수의 절반은 정위고정성 조작기 (stereotactic manipulator)를 이용하여 뾰족한 수술용 칼날 (pointed scalpel blade)로 절단된다. 양쪽 절차는 적절한 수술후 관리가 뒤따른다. 이식된 세포의 이동을 촉진하고 미엘린-연관된 성장 저해물질을 제거하기 위하여, 척수는 선택적으로, 미엘린제거될 수도 있다 (Keirstead et al., Exp Neurol. 151:303, 1998). 척주관 (vertebra canal)과 미추 (caudal)의 중심에서 축색 돌기 손상의 부위에 2 mm 구멍이 만들어진다. 노출된 척수는 인산염 완충된 염수에서 33% 기니 피그 보체 (Harlan SeraLab, San Francisco, CA)로 1:2 희석된 대략 4 ㎕ 다중클론 anti GalC 항체 (Millipore Corp., Billerica, MA)가 주사된다.

이들 동물은 끌어당겨진 유리 마이크로피펫 또는 주사기 바늘을 통해 손상후 대략 24시간 시점에, 강화된 표적 표현형 희소돌기아교세포 계통 세포가 이식된다. 대안으로, 만성 손상 모형은 손상후 1-3개월 동안 치료를 보류함으로써 만들어질 수 있다. 이들 세포로 치료후, 기능적 반응은 비디오테이프에 의해 기록되고, 그리고 정기적으로 임상적 향상의 증거에 대하여 모니터링될 수 있다. 가령, 표면에 드러난 운동력 (overground locomotion)은 관절 움직임 (joint movement), 체중 지지 (weight support), 사지 협응 (limb coordination), 그리고 기타 특징에 기초된 21-점 등급인 BBB 등급을 이용하여 정량될 수 있다.

인간에서 치료적 용도

적절한 검사후, 본 발명의 강화된 표적 세포는 인간 환자에서 또는 이런 치료가 필요한 다른 개체에서 조직 재구성 또는 재생에 이용될 수 있다. 이들 세포는 그들이 의도된 조직 부위로 이식되거나 이동하여 기능적으로 결함 부위를 재구성하거나 재생하는 것을 가능하게 하는 방식으로 투여될 수 있다. 따라서 심근세포를 포함하는 강화된 표적 세포 개체군은 심장에 투여될 수 있다. 희소돌기아교세포를 포함하는 강화된 표적 세포 개체군은 척수에 투여될 수 있다. 간세포를 포함하는 강화된 표적 세포 개체군은 간에 투여될 수 있다. 조혈 세포를 포함하는 강화된 표적 세포 개체군은 정맥내 투여될 수 있다. 섬 세포를 포함하는 세포의 강화된 개체군은 신장 또는 췌장 인근에 투여될 수 있다. 대안으로, 섬 세포를 포함하는 강화된 세포의 개체군은 이들 세포를 자가면역 반응으로부터 보호하는 이식가능 장치에 담겨 피하 투여될 수 있다. 연골세포를 포함하는 세포의 강화된 개체군은 연골이 결핍되거나, 또는 연골 수복이 요구되는 관절에 투여될 수 있다. 골아세포의 강화된 개체군은 골절된 뼈에 투여될 수 있다.

세포의 개체군의 투여는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 가령, 이들 세포는 세포 이식이 필요한 장기 또는 조직에 외과적으로 직접 투여될 수 있다. 대안으로, 세포를 개체에 투여하기 위하여 비-침해성 절차 (non-invasive procedure)가 이용될 수도 있다. 비-침해성 전달 방법의 실례에는 세포 요법이 필요한 장기 또는 조직 내로 세포를 전달하기 위한 주사기 및/또는 카테터의 이용이 포함된다.

본 발명의 강화된 표적 세포의 동종이식편이 제공되는 환자는 이식된 세포의 면역 거부반응을 감소시키는 치료를 받을 수도 있다. 고려되는 방법에는 전통적인 면역 억제 약물, 예를 들면, 타크롤리무스, 시클로스포린 A의 투여 (Dunn et al., Drugs 61:1957, 2001), 또는 다능성 줄기 유래된 세포의 정합된 개체군을 이용한 면역관용 (immunotolerance) 유도 (WO 02/44343; U.S. Patent No. 6,280,718; WO 03/050251)가 포함된다. 대안으로, 소염 약물 (가령, 프레드니손) 및 면역억제 약물의 조합이 이용될 수 있다.

본 발명의 강화된 표적 세포는 인간 투여를 위하여 충분한 무균 조건 하에 제조된 등장성 부형제를 포함하는 제약학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 이식 (engraftment) 시에 세포 사멸의 위험을 감소시키기 위하여, 이들 세포는 열 충격에 의해 처리되거나, 또는 투여 ~24시간 전에 ~0.5 U/㎖ 에리트로포이에틴 (erythropoietin)과 함께 배양될 수 있다.

의학 제제에서 전반적인 원리에 관하여, 독자는 Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn & W. Sheridan, Eds., Cambridge University Press, 1996; 그리고 Hematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000을 참고한다. 세포 부형제의 선택 및 조성물의 임의의 동반되는 요소는 투여에 이용되는 경로와 장치에 따라서 적합될 것이다. 조성물은 또한, 강화된 표적 세포의 이식 또는 기능적 동원을 용이하게 하는 한 가지 이상의 다른 성분을 포함하거나 동반할 수 있다. 적절한 성분은 표적 표현형에 따라 달라지긴 하지만 표적 세포 유형의 부착을 지지하거나 촉진하는, 또는 이식된 조직의 혈관화 (vascularization)를 촉진하는 매트릭스 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명에는 또한, 제조, 분포, 또는 이용 동안 임의의 시점에 존재하는 일단의 조합의 세포를 포함하는 반응물 시스템이 포함된다. 이들 세포 세트는 종종 동일한 게놈을 공유하는 미분화된 영장류 다능성 줄기 세포 또는 기타 분화된 세포 유형과 공동으로, 분화된 다능성 줄기-유래된 세포의 유형으로 예시되지만 이에 국한되지 않는 본 명세서에서 기술된 2가지 이상의 세포 개체군의 임의의 조합을 포함한다. 이러한 세트에서 각 세포 유형은 동일한 시설에서, 또는 상이한 위치에서, 동일한 또는 상이한 시점에서, 동일한 실체 또는 비즈니스 관계를 공유하는 상이한 실체의 제어 하에 함께, 또는 별개의 용기에 포장될 수 있다.

본 발명의 제약학적 조성물은 선택적으로, 의도된 목적, 예를 들면, 심장 근육의 질병 상태 또는 기형, 또는 손상된 척수의 재미엘린화를 향상시키는 심근세포-계통 세포 기능의 재구성을 위하여 서면으로 된 사용설명서와 함께 적절한 용기 내에 포장될 수 있다.

본 발명의 강화된 표적 세포는 다른 계통으로부터 세포에서 우선적으로 발현되는 cDNA로 상대적으로 오염되지 않은 cDNA 라이브러리를 만드는데 이용될 수 있다. 가령, 강화된 표적 세포는 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 수집되고, 이후 mRNA가 준비되고 역전사된다. 강화된 표적 세포의 발현 패턴은 마이크로어레이 분석에 의해 다른 세포 유형과 비교될 수 있다 (Fritz et al. Science 288:316, 2000에서 전반적으로 검토됨). 이들 라이브러리는 그들이 유래된 미분화된 pPS 세포와 비교하여 표적 세포에서 유전자 발현을 연구하는데 특히 적합할 것이다. 이들 세포가 본질적으로 동일한 게놈을 공유하기 때문에, 예로써 감산 혼성화 (subtractive hybridization)를 이용한 유전자 발현에서 비교는 배경 잡음 (background noise)이 거의 또는 전혀 없이 달성될 수 있다. 세포 개체군 내에서 무관계 표현형 세포의 총수의 감축은 2가지 세포 개체군, 예를 들면, 분화된 표적 자손 및 분화된 표적 세포를 생산하는 부모 pPS 세포주에서 유전자 발현의 비교에서 향상된 신호 대 잡음 비율 (signal to noise ratio)을 제공할 것이다.

본 발명의 분화된 세포는 또한, 강화된 표적 세포의 마커에 특이적인 항체를 제조하는데 이용될 수 있다. 다중클론 항체는 척추동물에 본 발명의 세포를 면역원성 형태 (immunogenic form)로 주입함으로써 만들어질 수 있다. 단일클론 항체의 생산은 Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, U.S. Patent No. 4,491,632, 4,472,500 및 4,444,887, 그리고 Methods in Enzymology 73B:3 (1981)와 같은 표준 참고문헌에서 기술된다.

영장류 다능성 줄기 세포

본 발명에서는 시험관내에서 pPS 세포로부터 분화된 표적 세포를 강화 (enrichment)시키는 방법을 제시한다. pPS 세포에는 임의의 영장류 다능성 세포가 포함된다. 다능성 세포는 적절한 성장 조건 하에, 3가지 일차 배엽: 중배엽, 내배엽 및 외배엽 각각으로부터 적어도 하나의 세포 유형을 형성할 수 있을 것이다. pPS 세포는 전-배아, 배아 또는 태아 조직 또는 성숙 분화된 세포로부터 기원할 수 있다. 전형적으로, pPS 세포는 악성 종양 근원으로부터 유래되지 않는다. pPS 세포는 면역-결핍 생쥐, 예를 들면, SCID 생쥐에 이식될 때 기형종을 형성할 것이다. pPS 세포는 확립된 세포주로부터 획득될 수 있다. 확립된 세포주는 공공 세포 은행, 예를 들면, WiCell 및 UK Stem Cell Bank로부터 입수가능하다.

현미경 하에, pPS 세포는 높은 핵/세포질 비율, 현저한 핵소체, 그리고 거의 식별되지 않는 세포 연접을 갖는 밀집된 집락 형성을 나타낸다. pPS 세포는 전형적으로, 단계-특이적 배아 항원 (SSEA) 3과 4, 그리고 TRA-160과 TRA-181로 명명된 항체를 이용하여 검출되는 마커를 발현한다. 또한, 미분화된 인간 배아 줄기 세포는 전형적으로, RT-PCR에 의해 검출되는 전사 인자 Oct-3/4, Cripto, 가스트린-방출 펩티드 (GRP) 수용체, 포도칼릭신-유사 단백질 (PODXL), 나노그 (nanog), 그리고 텔로메라아제 역전사효소 (telomerase reverse transcriptase), 예를 들면, hTERT (US 2003/0224411 A1)를 발현한다.

본 발명의 임의의 구체예에서 이용될 수 있는 pPS 세포에는 배아 줄기 세포, 예를 들면, 인간 배아 줄기 세포 (hES)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명에서 이용된 배아 줄기 세포는 배아 줄기 세포주로부터 선택될 수 있다. H1, H7, H9, H13 또는 H14 (Thompson, (1998) Science 282:1145); hESBGN-01, hESBGN-02, hESBGN-03 (BresaGen, Inc., Athens, GA); HES-1, HES-2, HES-3, HES-4, HES-5, HES-6 (ES Cell International, Inc., Singapore); HSF-1, HSF-6 (University of California, San Francisco); I 3, I 3.2, I 3.3, I 4, I 6, I 6.2, J 3, J 3.2 (the Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel); UCSF-1과 UCSF-2 (Genbacev et al., (2005) Fertil. Steril. 83(5):1517); HUES 1-17 가계 (Cowan et al., (2004) NEJM 350(13):1353); 그리고 ACT-14 가계 (Klimanskaya et al., (2005) Lancet, 365(9471):1636)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다수의 배아 줄기 세포주가 확립되었다.

다른 영장류 다능성 줄기 세포 유형에는 WO 01/51610에서 기술된 원시 외배엽-유사 (EPL) 세포 및 인간 배아 생식 (hEG) 세포 (Shamblott et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명의 임의의 구체예에서 이용하기 적합한 pPS 세포에는 유도된 영장류 다능성 줄기 (iPS) 세포가 포함된다. iPS 세포는 예로써, 하나 이상의 적절한 벡터로 형질감염에 의해 유전적으로 변형되는 세포를 지칭하고, 따라서 이들 세포는 pPS 세포의 표현형을 획득한다 (Takahashi et al. (2007) Cell 131(5):861; Yu et al. (2007) Science 318:1917). 대안으로, iPS 세포는 이들 세포가 배반포 유래된 다능성 줄기 세포와 연관된 표현형 및 형태학적 특성을 갖도록 이들 세포의 재프로그래밍을 유도하는 단백질 칵테일과 그들을 접촉시켜 성체 세포를 재프로그래밍 (reprogramming) 함으로써 획득될 수 있다 (참조: Kim et al. (2009) Cell Stem Cell 4(6):472. 이들 재프로그래밍된 세포에 의해 달성된 표현형 특성에는 배반포로부터 분리된 다능성 줄기 세포와 유사한 형태, 그리고 pPS 세포에서 관찰되는 표면 항원의 발현, 유전자 발현 및 텔로메라아제 활성이 포함된다. 이들 iPS 세포는 일차 배엽: 외배엽, 내배엽 및 중배엽 각각으로부터 적어도 하나의 세포 유형으로 분화하는 능력을 가질 수 있다. iPS 세포는 또한, 면역결핍 생쥐, 예를 들면, SCID 생쥐 내로 주입될 때 기형종을 형성할 수 있다 (Takahashi et al., (2007) Cell 131(5):861; Yu et al., (2007) Science 318:1917).

영장류 다능성 줄기 세포에 대한 배양 조건

일정한 구체예에서, 본 발명에 이용되는 pPS 세포는 영양세포 (feeder)-없는 방식으로 유도될 수 있다 (참조: Klimanskaya et al., (2005) Lancet 365(9471):1636). 일정한 구체예에서, pPS는 혈청 없는 환경에 이용에 앞서 배양될 수 있다.

pPS 세포는 당분야에 공지된 다양한 기질, 배지, 그리고 다른 보조제와 인자를 이용하여 배양될 수 있다. 일부 구체예에서, 적절한 기질은 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 중에서 한 가지 이상을 포함하는 매트릭스로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 매트릭스는 Matrigel™ (BD Biosciences, San Jose, CA)으로서 상업적으로 가용한 뮤린 EHS 육종으로부터 기저 막의 가용성 추출물을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 매트릭스는 인간, 인간화, 또는 뮤린 기원의 하나 이상의 분리된 매트릭스 단백질, 예를 들면, CELLtart™ (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 적절한 기질은 하나 이상의 중합체, 예를 들면, 하나 이상의 아크릴레이트로 구성될 수 있다. 이들 중합체는 생체내에서 세포외 매트릭스에서 관찰되는 하나 이상의 단백질, 또는 단백질로부터 유래된 펩티드 단편을 포함할 수 있다. 한 가지 특정 구체예에서, 기질은 하나 이상의 아크릴레이트 및 접합된 비트로넥틴 펩티드로 구성된다 (참조: U.S Patent Publication No. 2009/0191633; U.S Patent Publication No. 2009/0191626; U.S Patent Publication No. 2009/0203065). pPS 세포는 분화를 저해하면서 증식을 촉진하는 배양 조건을 이용하여, 배양 동안 연속적으로 증식될 수 있다.

예시적인 배지는 80% DMEM (가령, 적중 DMEM, Gibco), 20%의 규정된 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone) 또는 혈청 대체제 (US 2002/0076747 A1, Life Technologies Inc.), 1% 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민, 그리고 0.1 mM β-메르캅토에탄올로 만들어질 수 있다. 다른 적절한 배지에는 혈청 없는 규정된 배지, 예를 들면, X-VIVO™ 10 (Lonza, Walkersville, MD)이 포함된다. 본 발명의 일정한 구체예에서 이용될 수 있는 또 다른 상업적으로 가용한 배지 제제에는 X-VIVO™ 15 (Lonza, Walkersville, MD); mTeSR™ (Stem Cell Technologies, Vancouver, CA); hTeSR™ (Stem Cell Technologies, Vancouver, CA); StemPro™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 Cellgro™ DC (Mediatech, Inc., Manassas, VA)가 포함된다.

일정한 구체예에서, pPS 세포는 영양세포 첨가 없이 미분화된 상태로 유지될 수 있다 (참조: (2004) Rosler et al., Dev . Dynam. 229:259). 영양세포-없는 배양액은 전형적으로, 분화 없이 세포의 증식을 촉진하는 인자를 내포하는 영양 배지에 의해 지지된다 (참조: U.S. Patent No. 6,800,480). 일정한 구체예에서, 이들 인자를 내포하는 조건 배지가 이용될 수 있다. 조건 배지는 이들 인자를 분비하는 세포와 함께 배지를 배양함으로써 획득될 수 있다. 적절한 세포에는 방사선 조사된 (~4,000 rad) 일차 생쥐 배아 섬유아세포, 텔로머화 (telomerization)된 생쥐 섬유아세포, 또는 pPS 세포로부터 유래된 섬유아세포-유사 세포가 포함된다 (U.S. Patent No. 6,642,048). 배지는 혈청 없는 배지, 예를 들면, 20% 혈청 대체제 및 4 ng/㎖ bFGF로 보충된 KO DMEM에서 영양세포를 도말함으로써 조건화 (conditioning)될 수 있다. 12일 동안 조건화된 배지는 추가의 bFGF로 보충되고, 그리고 12일 동안 pPS 세포 배양을 지지하는데 이용될 수 있다 (참조: WO 01/51616; Xu et al., (2001) Nat. Biotechnol. 19:971).

대안으로, 새로운 또는 비-조건 배지가 이용될 수 있는데, 이것은 미분화된 형태에서 세포의 증식을 촉진하는 추가의 인자 (가령, 섬유아세포 성장 인자 또는 포스콜린)로 보충된다. 실례는 40-80 ng/㎖에서 bFGF 및/또는 TGF-β로 보충되고, 그리고 SCF (15 ng/㎖), 또는 Flt3 리간드 (75 ng/㎖)를 선택적으로 내포하는 X-VIVO^TM 10 (Lonza, Walkersville, MD) 또는 QBSF™-60 (Quality Biological Inc. Gaithersburg, MD)과 같은 기초 배지이다 (참조: Xu et al., (2005) Stem Cells 23(3):315). 이들 배지 제제는 다른 시스템에서 비율의 2-3배로 세포 성장을 지지하는 이점을 갖는다 (참조: WO 03/020920). 일부 구체예에서, pPS 세포, 예를 들면, hES 세포는 bFGF 및 TGFβ를 포함하는 배지에서 배양될 수 있다. bFGF의 적절한 농도에는 대략 80 ng/㎖가 포함된다. TGFβ의 적절한 농도에는 대략 0.5 ng/㎖가 포함된다.

일부 구체예에서, 영장류 다능성 줄기 세포는 >15,000 세포 cm^-2 (최적으로, 90,000 cm^-2 내지 170,000 cm^-2)로 도말될 수 있다. 전형적으로, 효소 절단 (enzymatic digestion)은 세포가 완전하게 분산되기 이전에 (가령, 콜라게나아제 IV로 대략 5분) 중단된다. 이후, 대략 10개 내지 대략 2,000개 세포의 덩어리가 추가 분산 없이 적절한 기질 상에 직접적으로 도말될 수 있다. 대안으로, 세포는 PBS에서 0.5 mM EDTA의 용액에서 대략 5분 동안 이들 세포를 배양함으로써, 또는 물리적으로, 예를 들면, 미세한 피펫 또는 세포 스크레이퍼로 긁음 또는 분리로 평판으로부터 원하는 세포를 단순히 분리함으로써, 평판이 합류 수준 (confluence)에 도달하기 이전에 효소 없이 수확될 수 있다. 배양 용기로부터 세척 이후에, 세포는 추가 분산 없이 새로운 배양액 내로 도말될 수 있다. 다른 예시에서, 영양세포의 부재에서 배양된 합류 인간 배아 줄기 세포는 37℃에서 5-15분 동안 0.05% (wt/vol) 트립신 (Gibco®, Carlsbad, CA)과 0.05 mM EDTA의 용액과 함께 배양함으로써 평판으로부터 제거될 수 있다. 평판 내에 남아있는 세포는 이전될 수 있고, 그리고 이들 세포는 단일 세포 및 소형 클러스터를 포함하는 현탁액 내로 분쇄되고, 이후 생존을 촉진하고 분화를 제한하기 위하여 50,000-200,000개 세포 cm^-2의 밀도로 도말될 수 있다.

일정한 구체예에서, pPS 세포는 영양세포, 전형적으로, 배아 또는 태아 조직으로부터 유래된 섬유아세포의 층에서 배양될 수 있다 (Thomson et al. (1998) Science 282:1145). 일정한 구체예에서, 이들 영양세포는 인간 또는 뮤린 공급원으로부터 유래될 수 있다. 인간 영양세포는 다양한 인간 조직으로부터 분리되거나, 또는 인간 배아 줄기 세포의 섬유아세포로의 분화에 의해 유도될 수 있다 (참조: WO 01/51616). 일정한 구체예에서, 이용될 수 있는 인간 영양세포에는 태반 섬유아세포 (참조: Genbacev et al. (2005) Fertil. Steril. 83(5):1517), 나팔관 상피 세포 (참조: Richards et al. (2002) Nat. Biotechnol., 20:933), 포피 섬유아세포 (참조: Amit et al. (2003) Biol. Reprod. 68:2150), 자궁 내막 세포 (참조: Lee et al. (2005) Biol. Reprod. 72(1):42)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명의 실시에서, 세포의 배양에 이용될 수 있는 다양한 고형 표면이 존재한다. 이들 고형 표면에는 상업적으로 구입가능한 표준 세포 배양 평판, 예를 들면, 6-웰, 24-웰, 96-웰, 또는 144-웰 평판이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다른 고형 표면에는 마이크로담체 및 디스크가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 마이크로담체는 세포의 부착을 위한 교반된-탱크 생물반응기에 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 마이크로담체는 구슬이다. 구슬은 다양한 형태, 예를 들면, 세포 부착을 증대시키는 양성 전하 기를 갖는 Cytodex 덱스트란 마이크로담체 구슬, 세포 부착을 위한 젤라틴/콜라겐-코팅된 구슬, 그리고 세포의 부착을 위한 상이한 다공성 (porosity)을 갖는 거대다공성 마이크로담체 구슬이다. Cytodex 덱스트란, 젤라틴-코팅된 및 거대다공성 마이크로담체 구슬은 상업적으로 구입가능하다 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 또는 Solohill Engineering Inc., Ann Arbor, MI). 일정한 구체예에서, 구슬은 90-200 ㎛ 크기 및 350-500 cm²의 면적을 갖는다. 구슬은 다양한 물질, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로 구성될 수 있다. 디스크는 제조업체, 예를 들면, New Brunswick Scientific Co, Inc. (Edison, NJ)에 의해 판매된다. 일정한 구체예에서, 디스크는 Fibra-cel 디스크이고, 이들은 폴리에스테르/폴리프로필렌 디스크이다. 1 g의 디스크는 1200 cm²의 표면적 (surface area)을 제공한다.

pPS 세포를 성장시키는데 적합한 고형 표면은 유리 또는 플라스틱, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리비닐염화물, 폴리카보네이트, 폴리테트라플루오르에틸렌, 멜리넥스 (melinex), 또는 써마녹스 (thermanox)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 물질로 만들어질 수 있다. 본 발명의 일정한 구체예에서, 고형 표면은 형상에서 3-차원일 수 있다. 예시적인 3-차원 고형 표면은 예로써, US 2005/0031598에서 기술된다.

일정한 구체예에서, 세포는 본 발명의 방법 동안 단일-세포 현탁액 내에 존재한다. 이러한 단일-세포 현탁액은 회전 플라스크 (spinner flask), 쉐이커 플라스크 (shaker flask), 또는 발효기 (fermentor)에서 배양이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 방법으로 미리 형성될 수 있다. 이용될 수 있는 발효기에는 Celligen Plus (New Brunswick Scientific Co, Inc., Edison, NJ), 그리고 STR 또는 교반된-탱크 반응기 (Applikon Inc., Foster City, CA)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 생물반응기는 배지로 연속적으로 관류되거나, 또는 유가식 (fed-batch mode)으로 이용될 수 있다. 다른 적절한 생물반응기에는 Wave Bioreactor 봉지 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)가 포함된다. 생물반응기는 2.2 리터, 5 리터, 7.5 리터, 14 리터 또는 20 리터, 100 리터, 100 리터, 10,000 리터 또는 그 이상이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 상이한 크기를 갖는다.

일반적인 기술

본 발명의 실시에 유용한 일반적인 기술의 추가 상술을 위하여, 전문가는 세포 생물학, 조직 배양, 발생학, 발생 생물학, 면역학, 신경 생물학, 내분비학, 심장학 등에서 표준 교재와 비평을 참고할 수 있다.

조직과 세포 배양액 및 배아 줄기 세포에 관하여, 독자는 당분야에 가용한 다수의 간행물 중에서 한 가지, 예를 들면, Teratocarcinomas and Embryonic Stem cells: A Practical Approach (E.J. Robertson, Ed., IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P.M. Wasserman et al., Eds., Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Properties and Uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P.D. Rathjen et al., Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998; 그리고 R.I. Freshney, Culture of Animal Cells, Wiley-Liss, New York, 2000을 참고할 수 있다.

pPS 세포의 확립된 가계로부터 유래되는 경우에, 본 발명의 세포 개체군 및 분리된 세포는 그들이 유래되는 가계와 동일한 게놈을 갖는 것으로 특징될 수 있다. 이것은 염색체 DNA가 RFLP 또는 SNP 분석에 의해, pPS 세포 및 분화된 자손 세포 (이들 세포는 인간 손에 의해 유전적으로 조작되지 않은 것으로 가정) 사이에 본질적으로 동일하다는 것을 의미한다. 게놈 내에서 상대적으로 미세한 변화가 예로써, 비-코딩 영역에서 시간의 흐름에서 발생할 수 있지만, 전체적으로 유전적 동일성 (genetic identity)은 부모 세포주 및 임의의 자손, 예를 들면, 분화된 자손 사이에 실질적으로 유지될 것으로 고려된다. 전형적으로, 유전적 동일성의 수준은 일란성 쌍둥이 간에 관찰되는 유전적 동일성과 유사할 것이다.

분화된 세포의 유전적 변경

본 발명의 세포는 분화 전후에 유전자 조작 (genetic engineering)에 의해 하나 이상의 유전적 변경을 내포하도록 만들어질 수 있다 (US 2002/0168766 A1). 가령, 일부 구체예에서, 이들 세포는 한정된 발달 계통 세포 또는 최종 분화된 세포로 진화하기 이전에 또는 진화한 이후에, 텔로메라아제 역전사효소를 발현하도록 유전적으로 변경함으로써 그들의 복제 잠재력이 증가하도록 가공될 수 있다 (US 2003/0022367 A1).

본 발명의 세포는 또한, 특정 치료 기능을 조절하는데 관여하거나, 또는 치료 유전자를 투여 부위로 전달하는 그들의 능력을 증강시키기 위하여 유전적으로 변경될 수 있다. 모든 세포 유형에서 활성인, 또는 분화된 세포 유형에서 특이적으로 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된, 원하는 유전자에 대한 공지된 인코딩 서열을 이용하는 벡터가 설계된다. 대안으로, 프로모터는 유전적 변경의 시의적절한 발현을 가능하게 하는 유도성 프로모터일 수 있다. 가령, 세포는 심장 기능을 조절하는 사이토킨을 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다.

본 발명의 추가적인 측면

본 발명의 추가적인 측면은 하기를 포함한다:

1. 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 무관계 표현형 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

2. 제 1항의 방법, 여기서 무관계 표현형 세포는 상피 세포이다.

3. 제 2항의 방법, 여기서 상피 세포는 시토케라틴을 발현한다.

4. 제 2항의 방법, 여기서 상피 세포는 EpCAM을 발현한다.

5. 제 4항의 방법, 여기서 EpCAM을 발현하는 세포 중에서 하나 이상은 TRA-1-60 역시 발현한다.

6. 제 1항의 방법, 여기서 리간드는 항체이다.

7. 제 6항의 방법, 여기서 항체는 EpCAM에 특이적으로 결합한다.

8. 제 1항의 방법, 여기서 리간드는 고형 서포트에 결합된다.

9. 제 8항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

10. 제 9항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

11. 제 1항의 방법, 여기서 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하는 것은 세포의 혼성 개체군에 외력을 적용함으로써 수행된다.

12. 제 11항의 방법, 여기서 외력은 자기장에 의해 제공된다.

13. 제 1항의 방법, 여기서 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형을 포함한다.

14. 제 13항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

15. 제 14항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

16. 제 14항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

17. 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) a)의 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

18. 제 17항의 방법, 여기서 상피 세포에 의해 발현된 마커는 시토케라틴이다.

19. 제 17항의 방법, 여기서 상피 세포에 의해 발현된 마커는 EpCAM이다.

20. 제 19항의 방법, 여기서 EpCAM을 발현하는 세포는 TRA-1-60 역시 발현한다.

21. 제 17항의 방법, 여기서 리간드는 항체이다.

22. 제 21항의 방법, 여기서 항체는 EpCAM에 특이적으로 결합한다.

23. 제 17항의 방법, 여기서 리간드는 고형 서포트에 결합된다.

24. 제 17항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

25. 제 24항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

26. 제 17항의 방법, 여기서 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하는 것은 세포의 혼성 개체군에 외력을 적용함으로써 수행된다.

27. 제 26항의 방법, 여기서 외력은 자기장에 의해 제공된다.

28. 제 17항의 방법, 여기서 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형을 포함한다.

29. 제 28항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

30. 제 28항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

31. 제 28항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

32. 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키고 이러한 세포의 혼성 개체군을 미분화된 pPS 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

33. 제 32항의 방법, 여기서 상피 세포에 의해 발현된 마커는 시토케라틴이다.

34. 제 32항의 방법, 여기서 상피 세포에 의해 발현된 마커는 EpCAM이다.

35. 제 34항의 방법, 여기서 EpCAM을 발현하는 세포는 TRA-1-60 역시 발현한다.

36. 제 32항의 방법, 여기서 리간드는 항체이다.

37. 제 36항의 방법, 여기서 항체는 EpCAM에 특이적으로 결합한다.

38. 제 36항의 방법, 여기서 리간드는 고형 서포트에 결합된다.

39. 제 38항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

40. 제 39항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

41. 제 32항의 방법, 여기서 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하는 것은 세포의 혼성 개체군에 외력을 적용함으로써 수행된다.

42. 제 41항의 방법, 여기서 외력은 자기장에 의해 제공된다.

43. 제 32항의 방법, 여기서 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형을 포함한다.

44. 제 43항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

45. 제 43항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

46. 제 43항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

47. 제 32항의 방법, 여기서 미분화된 pPS 세포에 결합하는 리간드는 항체이다.

48. 제 47항의 방법, 여기서 항체는 TRA-1-60에 결합한다.

49. 제 48항의 방법, 여기서 TRA-1-60에 결합하는 항체는 IgG이다.

50. 제 48항의 방법, 여기서 TRA-1-60에 결합하는 항체는 IgM이다.

51. 제 32항의 방법, 여기서 무관계 표현형 세포에 결합하는 리간드는 EpCAM에 특이적으로 결합하는 항체이고, 그리고 미분화된 pPS 세포에 결합하는 리간드는 TRA-1-60에 결합하는 항체이다.

52. 제 51항의 방법, 여기서 EpCAM에 결합하는 항체는 자성 구슬에 연결되고, 그리고 TRA-1-60에 결합하는 항체는 자성 구슬에 연결된다.

53. 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

54. 제 53항의 방법, 여기서 EpCAM에 결합하는 리간드는 항체이다.

55. 제 54항의 방법, 여기서 EpCAM 항체는 고형 서포트에 연결된다.

56. 제 55항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

57. 제 56항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

58. 제 53항의 방법, 여기서 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하는 것은 세포의 혼성 개체군에 외력을 적용함으로써 수행된다.

59. 제 58항의 방법, 여기서 외력은 자기장에 의해 제공된다.

60. 제 53항의 방법, 여기서 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형을 포함한다.

61. 제 60항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

62. 제 43항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

63. 제 43항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

64. 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드 및 TRA-1-60에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM에 대한 리간드에 결합된 세포 및 TRA-1-60의 리간드에 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

65. 제 64항의 방법, 여기서 EpCAM에 결합하는 리간드는 항체이다.

66. 제 64항의 방법, 여기서 EpCAM에 결합하는 리간드는 고형 서포트에 연결된다.

67. 제 66항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

68. 제 67항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

69. 제 64항의 방법, 여기서 TRA-1-60에 결합하는 리간드는 항체이다.

70. 제 69항의 방법, 여기서 항체는 IgG이다.

71. 제 69항의 방법, 여기서 항체는 IgM이다.

72. 제 64항의 방법, 여기서 TRA-1-60에 결합하는 리간드는 고형 서포트에 연결된다.

73. 제 72항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

74. 제 73항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

75. 제 64항의 방법, 여기서 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하는 것은 세포의 혼성 개체군에 외력을 적용함으로써 수행된다.

76. 제 75항의 방법, 여기서 외력은 자기장에 의해 제공된다.

77. 제 64항의 방법, 여기서 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형을 포함한다.

78. 제 77항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

79. 제 77항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

80. 제 77항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

81. 세포의 혼성 개체군에서 군생 상피 형성 세포의 총수를 감축하는 방법, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) EpCAM 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 군생 상피 형성 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

82. 제 81항의 방법, 여기서 EpCAM에 결합하는 리간드는 항체이다.

83. 제 82항의 방법, 여기서 EpCAM 항체는 고형 서포트에 연결된다.

84. 제 83항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

85. 제 84항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

86. 제 81항의 방법, 여기서 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하는 것은 세포의 혼성 개체군에 외력을 적용함으로써 수행된다.

87. 제 81항의 방법, 여기서 외력은 자기장에 의해 제공된다.

88. 제 88항의 방법, 여기서 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형을 포함한다.

89. 제 88항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

90. 제 88항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

91. 제 88항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

92. 세포의 혼성 개체군에서 미분화된 세포에 의해 발현된 하나 이상의 분자를 발현하는 세포의 총수를 감축하는 방법, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) a)의 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 미분화된 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

93. 제 92항의 방법, 여기서 리간드는 항체이다.

94. 제 92항의 방법, 여기서 항체는 EpCAM에 특이적으로 결합한다.

95. 제 92항의 방법, 여기서 항체는 시토케라틴에 특이적으로 결합한다.

96. 제 92항의 방법, 여기서 항체는 고형 서포트에 연결된다.

97. 제 96항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

98. 제 97항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

99. 제 92항의 방법, 여기서 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하는 것은 세포의 혼성 개체군에 외력을 적용함으로써 수행된다.

100. 제 99항의 방법, 여기서 외력은 자기장에 의해 제공된다.

101. 제 92항의 방법, 여기서 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형을 포함한다.

102. 제 101항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

103. 제 101항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

104. 제 101항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

105. 제 92항의 방법, 여기서 미분화된 세포에 의해 발현된 분자는 TRA-1-60이다.

106. 세포의 혼성 개체군에서 미분화된 세포에 의해 발현된 하나 이상의 분자를 발현하는 세포의 총수를 감축하는 방법, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 EpCAM 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 미분화된 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

107. 제 106항의 방법, 여기서 미분화된 세포에 의해 발현된 분자는 TRA-1-60이다.

108. 제 106항의 방법, 여기서 EpCAM에 결합하는 리간드는 항체이다.

109. 제 108항의 방법, 여기서 EpCAM 항체는 고형 서포트에 연결된다.

110. 제 108항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

111. 제 110항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

112. 제 106항의 방법, 여기서 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하는 것은 세포의 혼성 개체군에 외력을 적용함으로써 수행된다.

113. 제 112항의 방법, 여기서 외력은 자기장에 의해 제공된다.

114. 제 106항의 방법, 여기서 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형을 포함한다.

115. 제 114항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

116. 제 114항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

117. 제 114항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

118. 세포의 혼성 개체군에서 미분화된 세포에 의해 발현된 하나 이상의 분자를 발현하는 세포의 총수를 감축하는 방법, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 EpCAM에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드 및 TRA-1-60에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 미분화된 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

119. 제 118항의 방법, 여기서 EpCAM에 결합하는 리간드는 항체이다.

120. 제 119항의 방법, 여기서 EpCAM에 결합하는 리간드는 고형 서포트에 연결된다.

121. 제 120항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

122. 제 121항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

123. 제 118항의 방법, 여기서 TRA-1-60에 결합하는 리간드는 항체이다.

124. 제 118항의 방법, 여기서 항체는 IgG이다.

125. 제 118항의 방법, 여기서 항체는 IgM이다.

126. 제 118항의 방법, 여기서 TRA-1-60에 결합하는 리간드는 고형 서포트에 연결된다.

127. 제 126항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

128. 제 127항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

129. 제 118항의 방법, 여기서 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하는 것은 세포의 혼성 개체군에 외력을 적용함으로써 수행된다.

130. 제 129항의 방법, 여기서 외력은 자기장에 의해 제공된다.

131. 제 118항의 방법, 여기서 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형을 포함한다.

132. 제 131항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

133. 제 131항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

134. 제 131항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

135. 무관계 표현형 세포가 본질적으로 없는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 세포의 개체군을 획득하는 방법, 상기 방법은 a) pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 세포의 개체군을 획득하는 단계; b) a)의 세포 개체군을 상피 세포에 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 c) b)의 리간드 결합된 세포를 제거하여 무관계 표현형 세포가 본질적으로 없는 세포의 개체군을 획득하는 단계를 포함한다.

136. 제 135항의 방법, 여기서 상피 세포에 결합하는 리간드는 EpCAM이다.

137. 제 135항의 방법, 여기서 EpCAM에 결합하는 리간드는 항체이다.

138. 제 135항의 방법, 여기서 EpCAM에 결합하는 리간드는 고형 서포트에 연결된다.

139. 제 138항의 방법, 여기서 고형 서포트는 구슬이다.

140. 제 139항의 방법, 여기서 구슬은 자성 구슬이다.

141. 제 135항의 방법, 여기서 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 제거하는 것은 세포의 혼성 개체군에 외력을 적용함으로써 수행된다.

142. 제 141항의 방법, 여기서 외력은 자기장에 의해 제공된다.

143. 제 135항의 방법, 여기서 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형을 포함한다.

144. 제 143항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

145. 제 143항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

145. 제 143항의 방법, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

146. 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 세포 상에서 관찰되는 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

147. 제 146항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 상피 세포 상에서 관찰되는 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포는 EpCAM을 발현한다.

148. 제 143항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

149. 제 146항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

150. 제 146항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

151. 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 상피 세포 상에서 관찰되는 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포 및 미분화된 다능성 줄기 세포에서 관찰되는 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

152. 제 151항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 상피 세포 상에서 관찰되는 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포는 EpCAM을 발현한다.

153. 제 151항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

154. 제 151항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

155. 제 151항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

156. 제 151항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 미분화된 세포에서 관찰되는 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포는 TRA-1-60을 발현한다.

157. 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 EpCAM을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

158. 제 157항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

159. 제 157항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

160. 제 157항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

161. 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 시토케라틴을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

162. 제 161항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

163. 제 161항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

164. 제 161항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

165. 제 161항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 시토케라틴을 발현하는 적어도 하나의 세포는 EpCAM 역시 발현한다.

166. 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 시토케라틴을 발현하는 적어도 하나의 세포 및 미분화된 세포에서 관찰되는 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

165. 제 166항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 시토케라틴을 발현하는 적어도 하나의 세포는 EpCAM 역시 발현한다.

167. 제 166항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 미분화된 세포에서 관찰되는 분자를 발현하는 적어도 하나의 세포는 TRA-1-60을 발현한다.

168. 제 166항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

169. 제 166항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

170. 제 166항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

171. 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 EpCAM을 발현하는 적어도 하나의 세포 및 TRA-1-60을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

172. 제 171항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

173. 제 171항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

174. 제 171항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

175. 표적화된 표현형이 강화된 세포의 혼성 개체군, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하고, 그리고 여기서 세포의 혼성 개체군은 시토케라틴을 발현하는 적어도 하나의 세포 및 TRA-1-60을 발현하는 적어도 하나의 세포가 고갈된다.

176. 제 175항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 시토케라틴을 발현하는 적어도 하나의 세포는 EpCAM 역시 발현한다.

177. 제 175항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택된다.

178. 제 175항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포이다.

179. 제 175항의 세포의 혼성 개체군, 여기서 표적화된 표현형은 심근세포이다.

181. 무관계 표현형을 갖는 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 고갈시키기 위한 키트, 상기 키트는 a) 상피 세포에서 발현된 하나 이상의 분자에 대한 리간드; b) 미분화된 세포에서 발현된 하나 이상의 분자에 대한 리간드; 그리고 c) 하나 이상의 용기를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

182. 무관계 표현형을 갖는 세포를 세포의 혼성 개체군으로부터 고갈시키기 위한 키트, 상기 키트는 EpCAM에 대한 리간드, TRA-1-60에 대한 리간드 및 하나 이상의 용기를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함한다.

도면의 간단한 설명
도 1은 시험관내에서 hES 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 전구 세포가 투여된 쥐의 적은 비율에서 존재하는 군생 상피 구조가 상피-유사 형태를 갖는다는 것을 보여주는 현미경사진이다.
도 2는 범 (pan)-시토케라틴 항체 AE1/AE3이 인간 조직 어레이에서 관찰되는 다양한 조직 유형 (왼쪽 패널)을 표지 (labeling)하고, 또한 미분화된 hES 세포를 생쥐에 근육내 주입함으로써 형성된 뮤린 기형종 (오른쪽 패널)을 표지한다는 것을 보여주는 일련의 현미경사진이다.
도 3은 Ber-EP4 (EpCAM) 항체가 인간 조직 어레이에서 관찰되는 다양한 조직 유형 (왼쪽 패널)을 표지하고, 또한 미분화된 hES 세포를 생쥐에 근육내 주입함으로써 형성된 뮤린 기형종 (오른쪽 패널)을 표지한다는 것을 보여주는 현미경사진이다.
도 4는 시험관내에서 hES 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 전구 세포의 제조물이 투여된 3마리 쥐로부터 획득된 군생 상피 구조가 일부 경우에, 범-시토케라틴 항체 AE1/AE3으로 양으로 표지된다는 것을 보여주는 일련의 현미경사진이다. 위쪽 패널 확대도는 24X이다. 아래쪽 패널 확대도는 400X이다.
도 5는 시험관내에서 hES 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 전구 세포의 제조물이 투여된 1마리 쥐로부터 획득된 군생 상피 구조가 일부 경우에, Ber-EP4 EpCAM 항체로 표지된다는 것을 보여주는 일련의 현미경사진이다.
도 6은 시험관내에서 hES 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 전구 세포의 제조물이 투여된 1마리 쥐로부터 획득된 군생 상피 구조가 일부 경우에, Ber-EP4 EpCAM 항체 및 범-시토케라틴 항체 AE1/AE3 둘 모두로 표지된다는 것을 보여주는 일련의 현미경사진이다.
도 7은 시험관내에서 hES 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 전구 세포의 제조물이 투여된 1마리 쥐로부터 획득된 군생 상피 구조가 일부 경우에, 범-시토케라틴 항체 AE1/AE3으로 표지되지만, Ber-EP4 (EpCAM) 항체로 표지되지 않는다는 것을 보여주는 일련의 현미경사진이다.
도 8은 시험관내에서 hES 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 전구 세포의 제조물이 투여된 1마리 쥐로부터 획득된 군생 상피 구조가 범-시토케라틴 항체 AE1/AE3 및 Ber-EP4 (EpCAM) 항체 중에서 어느 것으로도 표지되지 않는다는 것을 보여주는 일련의 현미경사진이다.
도 9에서는 유세포분석법 (flow cytometry)에 의해 획득된 데이터를 도시한다. 시험관내에서 인간 배아 줄기 (hES) 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 전구 세포의 2개의 상이한 로트 (lot)는 EpCAM, 범-시토케라틴 및 TRA-1-60에 대하여 표지되었다.
도 10에서는 유세포분석법에 의해 획득된 데이터를 도시한다. EpCAM을 발현하지 않는 세포 (HEK 293)는 혼성 개체군을 산출하기 위하여 EpCAM+ 세포가 첨가 (spiking)되었다. 이후, 혼성 개체군은 EpCAM-특이적 항체에 접합된 자성 구슬 (자성 구슬)를 이용한 분리에 종속되었다. 결과의 분획물 (fraction)은 EpCAM 특이적 항체, 그 이후에 표지된 이차 항체 (A647), 또는 아이소타입 대조, 그 이후에 동일한 이차 항체를 이용한 유세포분석법에 의해 분석되었다.
도 11에서는 유세포분석법에 의해 획득된 데이터를 도시한다. 시험관내에서 hES 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 전구 세포의 단일 로트는 자성 구슬에 접합된 EpCAM-특이적 항체를 이용하여 EpCAM 양성 세포가 고갈되었다. 결과의 세포 분획물은 TRA-1-60 및 범-시토케라틴 각각에 특이적인 항체를 이용하여 TRA-1-60 및 범-시토케라틴에 대하여 표지되었다. 이들 TRA-1-60 표지된 세포는 또한, 이차 항체로 염색되었다.

아래의 실시예에서, 인간 배아 세포 (hES) 세포를 이용하는 모든 실험은 확립된 공개적으로 가용한 hES 세포주를 이용하여 수행되었다.

실시예

실시예 1: 상피 세포 마커는 시험관내에서 영장류 다능성 줄기 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포에서 무관계 표현형과 상관한다.

전체 RNA는 시험관내에서 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 전구 세포로부터, Qiagen RNAEasy 키트 (Qiagen, Valencia CA)를 이용한 제조업체의 사용설명서에 따라 추출되었다. 각각 7.5 x 10⁶개 희소돌기아교세포 전구 세포를 내포하는 바이알이 이용되었다. 이들 바이알은 생체내에서 높은 숫자의 군생 상피 구조 (CES)를 산출하는 3개의 로트 (lot), 그리고 생체내에서 낮은 수준의 CES를 갖는 3개의 로트로부터 비롯하였다. RNA 완전성 (integrity)은 Agilent bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA)를 이용하여 확증되고, 그리고 이용된 모든 샘플은 9.8 초과의 RNA 완전성 번호 (integrity number, RIN)를 가졌다. 이러한 RNA로부터 cDNA를 산출하기 위하여 3' IVT Express 키트 (Affymetrix, Santa Clara, CA)가 제조업체의 사용설명서에 따라 이용되었다. 마이크로어레이 분석은 Affymetrix U133+2.0 게놈 어레이 (Affymetrix, Santa Clara, CA)를 이용하여 이들 cDNA 샘플로 제조업체의 사용설명서에 따라 수행되었다. 이러한 어레이는 54,000개 이상의 프로브 세트 (probe set)를 내포하는 포괄적 인간 게놈 발현 어레이이다. 높은 CES 로트 및 낮은 CES 로트의 군 간에 발현에서 2-배 이상의 차이를 나타내는 유전자는 더욱 조사되었다. 표 1에서는 상피 세포 마커의 증가된 발현이 GRNOPC1의 로트에서 CES의 증가된 발현과 상관한다는 것을 증명한다.

실시예 2: 쥐 척수에서 상피 구조의 확인

시험관내에서 hES 세포로부터 분화된 인간 희소돌기아교세포 전구 세포가 투여된 쥐는 드문 경우에, 군생 상피 구조가 발달하였다. 도 1에서는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 군생 상피 구조를 보여준다. 이들 구조는 형태학에 기초하여 상피 세포로서 확인되었다.

이들 군생 상피 구조를 더욱 특성화하기 위하여, 범-시토케라틴에 대한 항체 또는 EpCAM에 대한 항체를 이용한 면역조직화학 (IHC)이 수행되었다. 범-시토케라틴 항체 (Millipore, Billerica, MA)는 2가지 항체: anti-AE1 및 anti-AE3의 혼합물이었다. AE1 항체는 케라틴 CK19 뿐만 아니라 케라틴 CK10, CK14, CK15와 CK16을 인식한다. AE3 항체는 케라틴 CK7과 CK8 뿐만 아니라 케라틴 CK1, CK2, CK3, CK4, CK5와 CK6을 인식한다. 케라틴 CK10은 편평 케라틴화된 피부 및 일부 장 세포에서 발현된다. 케라틴 CK19는 분비 상피, 대부분의 선 (gland), 거짓중층 상피 (pseudostratified epithelia), 분비 장 및 호흡 상피에서 발현된다. 케라틴 CK8은 전형적으로, 케라틴 CK18과 공동-발현되고 대부분의 선, 분비 장, 그리고 대부분의 분비 상피에서 발견된다.

이용된 EpCAM 항체는 Ber-Ep4 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이었다. EpCAM은 대부분의 상피 조직과 상피 계통 세포의 기저측면 막 (basolateral membrane)에서 발현된다. 이것은 편평 상피 (squamous epithelium)에서 발현되지 않는다. 이것은 세포 증식과 관련하여 일시적으로 발현될 수도 있다.

섹션 (section)은 상피 세포를 표지하는 범-시토케라틴 항혈청으로 (IHC)를 이용하여 조사되었다. 슬라이드는 자일렌 및 감소하는 순차적 에탄올 시리즈를 이용하여 탈파라핀화 (deparaffinization)되었다. 항원 회수 전처리는 슬라이드를 37℃에서 30분 동안 DPBS에서 4% 펩신과 함께 항온처리하고, 그 이후에 주변 온도로 냉각하는 것으로 구성되었다. 슬라이드는 DPBS에서 헹굼되고, 주변 온도에서 1시간 동안 차단 완충액 (0.3% Triton X-100, 10% 정상 염소 혈청, 1% 소 혈청 알부민, DPBS에서 3% H₂O₂)과 함께 항온처리되고, 그 이후에 주변 온도에서 24시간 동안 1:400 희석된 범-시토케라틴에 대한 일차 항혈청 (카탈로그 #mAB 3412 클론 AE1/AE3) (Millipore, Billerica, MA)과 함께 항온처리되었다. 이들 섹션은 세척되고, 주변 온도에서 1시간 동안 1:500 희석된 비오틴화된 이차 항체 (카탈로그 #BA-1000) (Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 함께 항온처리되고, 세척되고, 그리고 주변 온도에서 1시간 동안 DPBS에서 1:1000 희석된 스트렙타비딘-HRP (Vectastain Elite ABC kit, Vector Laboratories)와 함께 항온처리되었다. Ni-DAB (Vector Laboratories)가 HRP 시각화에 이용되었다. 슬라이드는 증가하는 순차적 에탄올 시리즈를 통해 탈수되고, 자일렌에서 탈지되고, 그리고 Permount^™ (Fisher Scientific, Hampton, NH)로 커버슬립 (coverslip)되었다. 이들 슬라이드는 광학 현미경 하에 조사되었다.

섹션 (section)은 상피 세포를 표지하는 EpCAM 항혈청으로 IHC를 이용하여 조사되었다. 슬라이드는 자일렌 및 감소하는 순차적 에탄올 시리즈를 이용하여 탈파라핀화 (deparaffinization)되었다. 항원 회수 전처리는 슬라이드를 37℃에서 30분 동안 DPBS에서 4% 펩신과 함께 항온처리하고, 그 이후에 주변 온도로 냉각하는 것으로 구성되었다. 슬라이드는 DPBS에서 헹굼되고, 주변 온도에서 1시간 동안 차단 완충액 (0.3% Triton X-100, 10% 정상 염소 혈청, 1% 소 혈청 알부민, DPBS에서 3% H₂O₂)과 함께 항온처리되고, 그 이후에 주변 온도에서 24시간 동안 1:100 희석된 EpCAM에 대한 일차 항혈청 (Ber-EP4; 카탈로그 # mAB84 클론; Dako; Carpinteria, CA)과 함께 항온처리되었다. 이들 섹션은 세척되고, 주변 온도에서 1시간 동안 1:500 희석된 비오틴화된 이차 항체 (카탈로그 #BA-1000) (Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 함께 항온처리되고, 세척되고, 그리고 주변 온도에서 1시간 동안 DPBS에서 1:1000 희석된 스트렙타비딘-HRP (Vectastain Elite ABC kit, Vector Laboratories)와 함께 항온처리되었다. Ni-DAB (Vector Laboratories)가 HRP 시각화에 이용되었다. 슬라이드는 증가하는 순차적 에탄올 시리즈를 통해 탈수되고, 자일렌에서 탈지되고, 그리고 Permount^™ (Fisher Scientific, Hampton, NH)로 커버슬립 (coverslip)되었다. 이들 슬라이드는 광학 현미경 하에 조사되었다.

도 2에서는 인간 조직 어레이 (간, 소장, 비장, 위, 결장 및 피부 세포 포함) 모두 범-시토케라틴에 대하여 표지된다는 것을 증명한다. 도 2의 오른쪽은 뮤린 근육내 기형종 (SKID/bg 생쥐에서) 역시 범-시토케라틴에 대하여 표지된다는 것을 증명한다. 도 3에서는 EpCAM 항체에 대한 유사한 결과를 보여준다.

도 4에서는 3마리 상이한 동물에서 군생 상피 구조가 범-시토케라틴에 대하여 양으로 표지된다는 것을 보여준다. 제시된 확대도는 24X (위쪽 패널) 및 400X (아래쪽 패널)이다. 도 5에서는 1마리 동물에서 군생 상피 구조가 EpCAM 항체로 표지된다는 것을 보여준다. 제시된 확대도는 24X (위쪽 좌측 패널) 및 400X (아래쪽 패널)이다. 도 6에서는 1마리 동물에서 군생 상피 구조가 범-시토케라틴 및 EpCAM 둘 모두에 대하여 표지된다는 것을 보여준다. 제시된 확대도는 24X (위쪽 패널) 및 400X (아래쪽 패널)이다. 도 7에서는 1마리 동물에서 군생 상피 구조가 범-시토케라틴에 대하여 표지되지만 EpCAM에 대하여 그렇지 않다는 것을 보여준다. 제시된 확대도는 24X (위쪽 패널) 및 400X (아래쪽 패널)이다. 도 8에서는 1마리 동물에서 군생 상피 구조가 범-시토케라틴 및 EpCAM 중에서 어느 것에 대하여도 표지되지 않는다는 것을 보여준다. 제시된 확대도는 24X (위쪽 패널) 및 400X (아래쪽 패널)이다.

실시예 3: 희소돌기아교세포를 포함하는 세포의 혼성 개체군의 특성화

hES 세포는 상기에서 및 U.S. Patent No.7,285,415에서 기술된 바와 같이, 희소돌기아교세포 및 희소돌기아교세포 전구체로 분화되었다. 2가지 별개의 로트 (M07D1A 및 2008-05A-ms)가 산출되었다. 양쪽 제조물에서 세포는 하기 상피 마커: ALexa fluor 647(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 접합된 EpCAM (클론 BER-Ep4) 및 영장류 미분화된 다능성 줄기 세포와 연관된 마커: TRA-1-60 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 대한 항체로 세포를 표지함으로써 유세포분석법에 의해 특성화되었다. TRA-1-60에 대하여 이용된 이차 항체는 Alexa Fluor®과 접합된 항-생쥐 IgM A488 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이었다.

간단히 말하면, 5x10⁵개 세포는 100 ㎕의 부피에서 반응마다 표지되었다. 일차 항체의 경우에, 라벨당 500 ng이 이용되었다. 이들 세포는 얼음 위에서 15분 동안 배양되고, 이후 염색 완충액 (staining buffer) (0.5% 인간 혈청 알부민 PBS)으로 2회 세척되었다. 이차 항체는 1:400 희석되고 얼음 위에서 15분 동안 표지되었다. 이들 세포는 염색 완충액으로 2회 세척되고, 이후 요오드화프로피디엄 염색 완충액 (5 ㎍/㎖ 최종 농도의 요오드화프로피디엄을 위하여 2 ㎖의 염색 완충액에 10 ㎕의 1.0 mg/㎖ 스톡의 요오드화프로피디엄을 첨가함으로써 제조됨)에서 재현탁되었다. 이들 세포는 세포 여과기 (cell strainer)가 구비된 FACS 튜브 (BD Bioscience, San Jose, CA)를 이용하여 여과되었다. 세포는 요오드화프로피디엄 vs. 전방 산란 (forward scatter)에 대하여 게이팅 (gating)되고, 이후 전방 산란 (forward scatter) vs. 측방 산란 (side scatter)에 대하여 다시 한 번 게이팅되었다. 이들 게이트 (gate) 내에서, 20,000개의 사건 (event)이 수집되었다. 획득된 결과는 도 9에 도시되고, 그리고 적은 비율의 개체군이 범-시토케라틴 (양쪽 로트) 및 EpCAM (왼쪽 패널)을 발현한다는 것을 지시한다. EpCAM을 발현하는 세포 중에서 대부분은 또한, 범-시토케라틴에 대하여 표지되었다. 이중 양성 세포는 명백하게 나타난다.

실시예 4: EpCAM 항체는 세포의 혼성 개체군으로부터 EpCAM+ 세포를 성공적으로 제거한다

본 실험에서, EpCAM 음성 세포주 (인간 배아 신장 293 세포)는 10% EpCAM+인 혼성 개체군을 산출하기 위하여 EpCAM 양성 세포주 (인간 선암종 세포주 SW480)가 첨가 (spiking)되었다. 이들 세포는 자성 Dynal 구슬 (CELLection 상피 강화 구슬) (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 접합된 BER-Ep4 EpCAM 항체 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 표지되고, 그리고 이들 세포는 하기 프로토콜에 따라 Dynal CELLection 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 분리되었다.

Dynabead (Invitrogen, Carlsbad, CA)는 바이알에서 재현탁되었다. 50 ㎕ / 2e7 세포의 Dynabead는 15 ㎖ 튜브로 이전되었다. 동일한 부피의 완충액 1 (PBS/0.1% 인간 혈청 알부민), 또는 적어도 1 ㎖가 튜브에 첨가되고 혼합되었다. 튜브는 자석에서 1분 동안 배치되고, 그리고 상층액은 폐기되었다. 튜브는 자석으로부터 이전되고 세척되었다. Dynabead는 Dynabead의 최초 부피와 동일한 부피의 완충액 1에서 재현탁되었다.

샘플을 준비하기 위하여, 2e7/㎖ 세포는 차가운 완충액 2 (PBS/0.1% 인간 혈청 알부민/2mM EDTA)에서 재현탁되었다. EpCAM+ 세포를 강화 (enrichment)하기 위하여, 50 ㎕의 Dynabead가 1 ㎖의 준비된 샘플에 첨가되고, 이후 부드러운 회전에 설정된 MACSmix (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 2-8℃에서 30분 동안 배양되었다. 튜브는 자석에서 2분 동안 배치되었다. EpCAM-고갈된 세포를 내포하는 상층액은 얼음 위에서 보존되었다.

EpCAM+ 구슬-결합된 세포는 예열된 (37℃) 완충액 3 (RPMI/0.1% HSA/1mM CaCl₂/ 4 mM MgCl₂)에서 3x 세척 (세척마다 5 ㎖)되고 자석에 배치되었다. 모든 세척액은 단일 튜브에 모아졌다. 이들 세포는 200 ㎕ (2e7 세포당) 예열된 (37℃) 완충액 3에서 재현탁되었다. 이들 구슬로부터 EpCAM+ 세포를 방출하기 위하여, 4 ㎕의 방출 완충액 (DNAse) (키트에 담겨 제공됨) (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 튜브에 첨가되었다. 튜브는 부드러운 회전에 설정된 MACSmix (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 실온에서 15분 동안 배양되었다. 튜브의 내용물은 1 ㎖ 피펫으로 적어도 5-10회 활발하게 피펫팅 (pipetting)되고, 이후 자석에서 2분 동안 배치되었다. 방출된 세포를 내포하는 상층액은 RPMI 배지로 미리 코팅된 15 ㎖ 튜브 내로 이전되었다. 샘플은 모아졌다. 구슬은 완충액 3 (200 ㎕)에서 재현탁되고, 그리고 이들 구슬은 다시 한 번 활발하게 피펫팅되고 2분 동안 자석에 반송되었다. 상층액은 결합되지 않은 EpCAM+ 세포를 내포하였다.

세포 분획물은 실시예 3에서 기술된 프로토콜을 이용하여 EpCAM에 대하여 표지되었다. EpCAM 항체에 대한 아이소타입 대조 (뮤린 IgG1) (eBioscience, San Diego, CA)가 이용되었다. 획득된 결과는 도 10에 제시된다. 이들 데이터는 EpCAM+ 세포가 세포의 혼성 개체군으로부터 성공적으로 고갈될 수 있음을 증명하였다 (도 9 아래쪽 3번째와 4번째 패널 참조). EpCAM 음성 세포의 회수 효율은 93%인 것으로 계산되었다. EpCAM 양성 세포의 회수 효율은 9%인 것으로 계산되었다.

실시예 5: EpCAM+ 세포의 고갈은 범-시토케라틴+ 세포 및 TRA-1-60 세포를 동시에 고갈시킨다

본 실험에서, anti-EpCAM Dynabead (Invitrogen, Carlsbad, CA)는 바이알에서 재현탁되고, 그리고 표적 EpCAM 발현 세포당 25개 구슬은 15 ㎖ 튜브로 이전되었다 (표적 개체군 중에서 5%인 것으로 추정됨 - 5%는 개체군 내에 EpCAM+ 세포의 총수의 추정치로서 선택되었다. 5%는 시험관내에서 hES 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 전구체의 이전 개체군에서 관찰된 상한선보다 높다). 동일한 부피의 완충액 1 (PBS/0.1% 인간 혈청 알부민), 또는 적어도 1 ㎖가 사용에 앞서 구슬을 세척하기 위하여 튜브에 첨가되고 혼합되었다. 튜브는 자석에서 1분 동안 배치되고, 그리고 상층액은 폐기되었다. 튜브는 자석으로부터 이전되고 세척되었다. Dynabead는 Dynabead의 최초 부피와 동일한 부피의 완충액 1에서 재현탁되었다.

샘플을 준비하기 위하여, 2e7/㎖ 세포 (시험관내에서 hES 세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 전구 세포를 포함하는 세포의 혼성 개체군)는 차가운 완충액 2 (PBS/0.1% 인간 혈청 알부민/2mM EDTA)에서 재현탁되었다. EpCAM+ 세포를 고갈시키기 위하여, Dynabead가 준비된 샘플에 첨가되고, 이후 부드러운 회전에 설정된 MACSmix (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 2-8℃에서 30분 동안 배양되었다. 튜브는 자석에서 2분 동안 배치되었다. EpCAM-고갈된 세포를 내포하는 상층액은 얼음 위에서 보존되었다.

세포 분획물은 실시예 3에서 기술된 프로토콜을 이용하여 EpCAM, TRA-1-60 및 PCK에 대하여 표지되었다. 이들 항체에 대한 아이소타입 대조 (뮤린 IgG1, 뮤린 IgM) (eBioscience, San Diego, CA)가 이용되었다. 획득된 결과는 도 11에 제시된다. 이들 데이터는 EpCAM+ 세포가 세포의 혼성 개체군으로부터 성공적으로 고갈될 수 있음을 증명하였다 (도 11 아래쪽 3번째와 4번째 패널). EpCAM 음성 세포의 회수 효율은 96%인 것으로 계산되었다. 이에 더하여, EpCAM 고갈은 TRA-1-60+ 및 PCK+ 세포 개체군 둘 모두의 비율을 감소시켰다.

실시예 6: EpCAM/ TRA 1-60 고갈된 인간 희소돌기아교세포 전구 세포는 쥐 척수에서 더욱 적은 상피 구조를 형성하였다

본 실험에서는 쥐를 동물 모형으로서 이용하여, 생체내에서 군생 상피 형성에 대한 무관계 표현형의 고갈의 효과를 조사하였다. 군생 상피 구조에서 높을 것으로 예상되는 인간 희소돌기아교세포 전구체의 로트가 본 연구를 위하여 특정하게 선택되었다. 흉부 (thoracic) 수준에서 척수 타박상을 입은 쥐의 2가지 군은 EpCAM+/TRA 1-60+ 세포가 고갈되거나 고갈되지 않은 인간 희소돌기아교세포 전구 세포의 척수내 주입 (intraspinal cord injection)이 제공되었다. 6개월후, 동물은 관류되고, 그리고 척수가 제거되고 세로면 (longitudinal plane)으로 절단되었다. 손상 부위에 대략 1 cm 부리 (rostral) 및 1 cm 꼬리 (caudal) 확장하는 척수 조직은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되고 군생 상피 구조에 대하여 조사되었다. 획득된 결과는 표 2에 제시된다.

당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 많은 개변이 만들어질 수 있다. 본 명세서에서 기술된 특정 구체예는 단지 실례로써 제공되고 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서 및 실시예는 단지 실례인 것으로 간주되고, 그리고 본 발명의 진정한 범위와 사상은 하기 특허청구범위에 의해 지시되는 것으로 의도된다.

Claims (18)

1. 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법에 있어서, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 무관계 표현형 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 무관계 표현형 세포는 상피 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상피 세포는 시토케라틴을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2항에 있어서, 상피 세포는 EpCAM을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, EpCAM을 발현하는 세포 중에서 하나 이상은 TRA-1-60 역시 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 리간드는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 항체는 EpCAM에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 리간드는 고형 서포트에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 고형 서포트는 구슬인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 구슬은 자성 구슬인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항에 있어서, 리간드 결합된 무관계 표현형 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하는 것은 세포의 혼성 개체군에 외력을 적용함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 외력은 자기장에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1항에 있어서, 세포의 혼성 개체군은 표적화된 표현형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포, 심근세포, 섬 세포, 조혈 세포, 간세포, 골아세포 및 연골세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 표적화된 표현형은 희소돌기아교세포인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 14항에 있어서, 표적화된 표현형은 심근세포인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법에 있어서, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 의해 발현된 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) a)의 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 무관계 표현형 세포를 내포하는 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
18. 세포의 혼성 개체군에서 무관계 표현형 세포의 총수를 감축하는 방법에 있어서, 상기 방법은 a) 세포의 혼성 개체군을 상피 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키고, 그리고 이러한 세포의 혼성 개체군을 미분화된 pPS 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 리간드와 접촉시키는 단계; 그리고 b) 리간드 결합된 세포를 세포의 나머지 혼성 개체군으로부터 분리하여 무관계 표현형 세포의 총수를 세포의 혼성 개체군으로부터 감축하는 단계를 포함하고, 여기서 세포의 혼성 개체군은 pPS 세포의 시험관내 분화된 자손을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

Images