CN102803472A - 去除了外来表型的由多能干细胞分化的子代细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从包含灵长类动物多能干细胞体外分化的子代细胞的混合细胞群中去除外来表型的方法。本发明还提供了富集用于靶细胞表型的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含灵长类动物胚胎干细胞体外分化的子代细胞。

Description

去除了外来表型的由多能干细胞分化的子代细胞
技术领域
本发明涉及干细胞生物学领域。
优先权
本申请要求享有2009年6月25日提交的第61/220,418号临时申请的优先权。
背景技术
多能干细胞具有培养时繁殖和在适宜的生长条件下分化成为代表所有3个原胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的谱系限制性细胞类型的能力(第5,843,780号、第6,200,806号、第7,029,913号美国专利；Shamblott等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726；Takahashi等，(2007)Cell131(5)：861；Yu等，(2007)Science 318：5858)。确定特定谱系限制性细胞类型的适宜生长条件将无限提供用于研究和治疗应用的细胞类型。
已知描述了使灵长类动物干细胞(pPS)分化成为多种靶细胞类型的方法，包括少突胶质细胞、神经元细胞、心肌细胞、造血细胞、胰岛细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞(参见例如第7,285,415号、第6,833,269号、第7,425,448号、第7,452,718号、第7,033,831号、第7,326,572号、第6,458,589号、第6,506,574号、第7,256,042号、第7,473,555号美国专利；第2005/0158855号、第2004/0224403号、第2005/0282272号、第2005/0282274号、2006/0148077号美国专利申请；第12/412,183号美国专利申请；PCT公开号WO 07/149182、WO 05/097980；Carpenter等，(2001)Exp Neurology 172：383；Chadwick等，(2003)Blood 102：906；Kierstad等，(2005)J Neuroscience 25：4694)；Laflamme等，(2007)Nature Biotechnology25：1015 Jiang等，(2007)Stem Cells 25：1940)。
pPS细胞分化成为靶表型细胞时会产生包含靶表型以及多种外来表型的混合细胞群。保留未分化胚胎干细胞的多能潜能的某些外来表型对受试者施用时可以形成畸胎瘤，参见例如Thomson 1998 Science 282：1145。其他外来表型仅仅通过稀释靶表型细胞的数量因而降低细胞制备品的总体效力，从而干扰靶表型的效力。因此，需要使包含pPS细胞靶向分化的子代细胞的细胞群中具有外来表型的细胞数量减少。此外还需要将外来表型细胞数量最少的pPS细胞分化子代细胞群用于治疗、诊断和/或研究应用中。本文中描述的本发明的多个实施方案满足这些需求以及其他需求。
发明概述
在一些实施方案中，本发明提供了包含pPS细胞体外分化的子代细胞的细胞群，其基本不含外来表型细胞类型。由pPS细胞体外分化的子代细胞可以包括选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞、造血细胞、软骨细胞和成骨细胞的靶表型。外来表型细胞的一个示例是上皮细胞谱系的细胞，即表达与上皮细胞相关的一种或多种标志物的细胞，所述标志物例如下列一种或多种标志物：细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)。当植入受试者(例如啮齿类动物)体内时，这些细胞能够形成上皮细胞簇结构。可以通过筛选与上皮细胞相关的标志物，获得基本不含外来表型细胞类型的细胞群，所述标志物例如下列一种或多种标志物：桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)、细胞角蛋白。例如可以使用任何一种或多种标志物的抗体。
在其他实施方案中，本发明提供了一种获得包含pPS细胞体外分化的子代细胞且基本不含外来表型细胞类型的细胞群的方法，包括：a)获得包含pPS细胞体外分化的子代细胞的细胞群；b)使a)中的细胞群和与上皮细胞结合的一种或多种配体接触和c)将b)中与配体结合的细胞移除，从而获得基本不含外来表型细胞的细胞群。将与配体结合的细胞移除可以包括物理地将与配体结合的细胞从剩余细胞群中分离。将与配体结合的细胞移除还可以包括将与配体结合的细胞杀死。例如可以使用与结合细胞的配体结合的毒素。在一个实施方案中，配体可以是抗体，并且可以使用补体作为使细胞裂解的试剂，因而从细胞群中将其移除。
在某些其他实施方案中，本发明提供了包含灵长类动物干细胞体外分化的子代细胞的混合细胞群。混合细胞群可以包括通过使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少而进行富集的靶表型细胞群，因此提供了与外来表型细胞数量未减少的混合细胞群相比更适于用作治疗或者研究产品的细胞群。通过减少表达特异性标志物的细胞数量，从而使靶细胞群富集，所述标志物与外来表型细胞相关，例如由上皮细胞表达的一种或多种标志物。移除外来表型可以包括物理地将外来表型从细胞群包含的其他细胞中分离。移除外来表型还可以包括对外来表型进行化学处理，以将与配体结合的细胞杀死，例如使用与结合外来表型细胞的配体特异性结合的化学试剂。
令人惊讶的是，与上皮细胞谱系中外来表型细胞相关的至少一种或多种标志物的表达和与未分化细胞相关的至少一种或多种标志物的表达相重叠，例如TRA-1-60。因此，通过将表达与上皮细胞谱系中外来表型细胞相关的标志物的细胞去除，未分化细胞的数量或者表达由混合群内未分化细胞(例如TRA-1-60)表达的至少一种标志物的细胞数量也可减少。
在一些实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与外来表型细胞特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与外来表型细胞特异性结合的一种或多种配体接触；和b)使与配体结合的外来表型细胞和将与配体结合的外来表型细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在某些实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与由上皮细胞表达的一种或多种标记物特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将a)中与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与由上皮细胞表达的一种或多种标记物特异性结合的一种或多种配体接触；和b)使a)中与配体结合的细胞与将a)中与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与上皮细胞特异性结合的一种或多种配体接触，并且使混合细胞群和与未分化的pPS细胞特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与上皮细胞特异性结合的一种或多种配体接触，并且使混合细胞群和与未分化的pPS细胞特异性结合的一种或多种配体接触；和b)使a)中与配体结合的细胞与将a)中与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种分子特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将a)中与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种分子特异性结合的一种或多种配体接触；和b)使a)中与配体结合的细胞与将a)中与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)的一种或多种配体接触；b)使混合细胞群和与未分化的pPS细胞特异性结合的一种或多种配体接触；和c)使a)或b)或者a)和b)中与配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)的一种或多种配体接触；b)使混合细胞群和与TRA-160特异性结合的配体接触；和c)将与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)的一种或多种配体接触；b)使混合细胞群和与TRA-160特异性结合的配体接触；和c)使a)或b)或者a)和b)中与配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在某些其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与上皮细胞特异性结合的一种或多种配体接触，并且使混合细胞群和与未分化的pPS细胞特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与配体结合的上皮细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与上皮细胞特异性结合的一种或多种配体接触和b)使a)中的细胞与将a)中与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与配体结合的上皮细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与配体结合的上皮细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与EpCAM配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与EpCAM配体结合的细胞和将与EpCAM配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与细胞角蛋白分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与细胞角蛋白配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与细胞角蛋白分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与细胞角蛋白配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与桥粒糖蛋白3分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与桥粒糖蛋白3配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与桥粒糖蛋白3分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与桥粒糖蛋白3配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与桥粒核心糖蛋白2分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与桥粒核心糖蛋白2配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与桥粒核心糖蛋白2分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与桥粒核心糖蛋白2配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与E-钙粘蛋白分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与E-钙粘蛋白配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与E-钙粘蛋白分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与E-钙粘蛋白配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD49f分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与CD49f配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD49f分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与CD49f配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EMA分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与EMA配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EMA分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与EMA配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与E-cad分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与E-cad配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与E-cad分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与E-cad配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD321分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与CD321配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD321分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与CD321配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD66分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与CD66配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD66分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与CD66配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD10分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与CD10配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD10分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与CD10配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD105分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与CD105配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD105分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与CD105配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中细胞角蛋白表达细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与EpCAM配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中细胞角蛋白表达细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在某些其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体以及与未分化细胞上表达的标志物特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将与EpCAM配体结合的细胞和与未分化细胞上所表达标志物的配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体以及与未分化细胞上表达的标志物特异性结合的一种或多种配体接触；和b)使与EpCAM配体结合的细胞和/或与未分化细胞上所表达标志物的配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体以及与TRA-1-60特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将与EpCAM配体结合的细胞和与TRA-1-60配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体以及与TRA-1-60特异性结合的一种或多种配体接触；和b)使与EpCAM配体结合的细胞和/或与TRA-1-60配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子特异性结合的一种或多种配体以及与未分化细胞上表达的标志物特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子的配体结合的细胞和与未分化细胞上所表达标志物的配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子特异性结合的一种或多种配体以及与未分化细胞上表达的标志物特异性结合的一种或多种配体接触；和b)使与与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子特异性结合的配体结合的细胞和/或与未分化细胞上所表达标志物的配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子特异性结合的一种或多种配体接触和b)使a)中与配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与EpCAM配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与EpCAM配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与细胞角蛋白特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与细胞角蛋白配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与细胞角蛋白特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与细胞角蛋白配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与桥粒糖蛋白3特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与桥粒糖蛋白3配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与桥粒糖蛋白3特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与桥粒糖蛋白3配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与桥粒核心糖蛋白2特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与桥粒核心糖蛋白2配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与桥粒核心糖蛋白2特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与桥粒核心糖蛋白2配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与E-钙粘蛋白特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与E-钙粘蛋白配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与E-钙粘蛋白特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与E-钙粘蛋白配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD49f特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与CD49f配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD49f特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与CD49f配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EMA特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与EMA配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EMA特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与EMA配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与E-cad特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与E-cad配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与E-cad特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与E-cad配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD321特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与CD321配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD321特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与CD321配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD66特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与CD66配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD66特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与CD66配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD10特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与CD10配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD10特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与CD10配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD105特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与CD105配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与CD105特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与CD105配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括上皮细胞簇形成细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中未分化细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与未分化细胞特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与配体结合的未分化细胞从剩余混合细胞群中移除，从而减少混合细胞群中未分化细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。在一些实施方案中，配体可以包括抗体，例如与TRA-1-60特异性结合的IgG。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中表达由未分化细胞表达的一种或多种分子的细胞数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与上皮细胞特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将a)中与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中移除，从而减少混合细胞群中未分化细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中表达由未分化细胞表达的一种或多种分子的细胞数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与EpCAM配体结合的细胞从剩余混合细胞群中移除，从而减少混合细胞群中未分化细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中表达由未分化细胞表达的一种或多种分子的细胞数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体以及与TRA-1-60特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中移除，从而减少混合细胞群中未分化细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中表达由未分化细胞表达的一种或多种分子的细胞数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与细胞角蛋白特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与细胞角蛋白配体结合的细胞从剩余混合细胞群中移除，从而减少混合细胞群中未分化细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种使混合细胞群中表达由未分化细胞表达的一种或多种分子的细胞数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与细胞角蛋白特异性结合的一种或多种配体以及与TRA-1-60特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中移除，从而减少混合细胞群中未分化细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达上皮细胞上一种分子的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达上皮细胞上一种分子的至少一种细胞和表达未分化干细胞上一种分子的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子的至少一种细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达EpCAM的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达细胞角蛋白的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达桥粒糖蛋白3的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达桥粒核心糖蛋白2的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达E-钙粘蛋白的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达CD49f的至少一种细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达EMA的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达E-cad的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达CD321的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达CD166的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达CD105的至少一种细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子的至少一种细胞以及表达未分化的灵长类动物细胞上一种标志物的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达EpCAM的至少一种细胞以及表达未分化的灵长类动物细胞上一种标志物的至少一种细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达细胞角蛋白的至少一种细胞以及表达未分化的灵长类动物细胞上一种标志物的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达EpCAM的至少一种细胞以及表达TRA-1-60的至少一种细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达细胞角蛋白的至少一种细胞以及表达TRA-1-60的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了将包含具有靶表型的细胞的细胞群植入受试者体内的方法，其包括a)获得包含靶表型的细胞群，其中所述细胞群已经去除了具有外来表型的至少一种细胞；和b)对受试者施用a)中的细胞群。
在其他实施方案中，本发明提供了对需要细胞治疗的受试者进行治疗的方法，其包括a)获得包含靶表型细胞的细胞群，其中所述细胞群已经去除了具有外来表型的至少一种细胞；和b)对受试者施用a)中的细胞群。
在进一步的实施方案中，本发明提供了利用包含具有靶表型的细胞的细胞群对需要细胞治疗的受试者进行治疗的方法，其中所述细胞群已经去除了具有外来表型的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了将包含具有靶表型的细胞的细胞群植入受试者体内的方法，其包括a)获得包含具有靶表型的细胞的细胞群，其中所述细胞群已经去除了表达上皮细胞标志物的至少一种细胞；和b)对受试者施用a)中的细胞群。
在其他实施方案中，本发明提供了对需要细胞治疗的受试者进行治疗的方法，其包括a)获得包含具有靶表型的细胞的细胞群，其中所述细胞群已经去除了表达上皮细胞标志物的至少一种细胞；和b)对受试者施用a)中的细胞群。
在进一步的实施方案中，本发明提供了利用包含具有靶表型的细胞的细胞群对需要细胞治疗的受试者进行治疗的方法，其中所述细胞群已经去除了表达上皮细胞标志物的至少一种细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种从混合细胞群中去除具有外来表型的细胞的试剂盒，其包括a)上皮细胞上所表达一种或多种分子的配体；b)未分化细胞上所表达一种或多种分子的配体；和c)一个或者多个容器，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种从混合细胞群中去除具有外来表型的细胞的试剂盒，其包括a)选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子的配体；b)未分化细胞上所表达一种或多种分子的配体；和c)一个或者多个容器，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了从混合细胞群中去除具有外来表型的细胞的试剂盒，其包括EpCAM的配体、TRA-1-60的配体和一个或者多个容器，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供了从混合细胞群中去除具有外来表型的细胞的试剂盒，其包括细胞角蛋白的配体、TRA-1-60的配体和一个或者多个容器，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种从混合细胞群中去除具有外来表型的细胞的试剂盒，其包括a)选自细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)中一种或多种分子的配体；和b)一个或者多个容器，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了与TRA-1-60特异性结合的抗体，其中所述抗体具有IgG同种型。
附图简述
图1是显示上皮细胞簇结构的显微照片，其存在于施用了由hES细胞体外分化的少突胶质细胞祖细胞的少量大鼠中，具有上皮细胞样形态。
图2是一系列显微照片，其显示广谱细胞角蛋白抗体AE1/AE3标记人组织阵列中多种组织类型(左侧图)以及标记通过对小鼠肌内注射未分化的hES细胞所形成的小鼠畸胎瘤(右侧图)。
图3是显微照片，其显示Ber-EP4(EpCAM)抗体标记人组织阵列中多种组织类型(左侧图)以及标记通过对小鼠肌内注射未分化的hES细胞所形成的小鼠畸胎瘤(右侧图)。
图4是一系列显示上皮细胞簇结构的显微照片，其从施用了由hES细胞体外分化的少突胶质细胞祖细胞的3只大鼠中获得，在一些情况下用广谱细胞角蛋白抗体AE1/AE3标记为阳性。上图的放大倍数是24×。下图的放大倍数是400×。
图5是一系列显示上皮细胞簇结构的显微照片，其从施用了由hES细胞体外分化的少突胶质细胞祖细胞的1只大鼠中获得，在一些情况下用Ber-EP4EpCAM抗体标记为阳性。
图6是一系列显示上皮细胞簇结构的显微照片，其从施用了由hES细胞体外分化的少突胶质细胞祖细胞的1只大鼠中获得，在一些情况下用Ber-EP4EpCAM抗体和广谱细胞角蛋白抗体AE1/AE3同时标记为阳性。
图7是一系列显示上皮细胞簇结构的显微照片，其从施用了由hES细胞体外分化的少突胶质细胞祖细胞的1只大鼠中获得，在一些情况下用广谱细胞角蛋白抗体AE1/AE3标记为阳性，而Ber-EP4(EpCAM)抗体未标记。
图8是一系列显示上皮细胞簇结构的显微照片，其从施用了由hES细胞体外分化的少突胶质细胞祖细胞的1只大鼠中获得，其中细胞既不能用广谱细胞角蛋白抗体AE1/AE3标记，也不能用Ber-EP4(EpCAM)抗体标记。
图9显示流式细胞术获得的数据。使由人胚胎干细胞(hES)体外分化的两组不同的少突胶质细胞祖细胞标记EpCam、广谱细胞角蛋白和TRA-1-60。
图10显示流式细胞术获得的数据。不表达EpCAM的细胞(HEK 293)与EpCAM+细胞混合，以产生混合细胞群。接着利用与EpCAM特异性抗体偶联的磁珠将混合细胞群分离。通过流式细胞术对得到的级分进行分析，其中或者利用EpCAM特异性抗体随后利用已标记的第二抗体(A647)，或者利用同种型对照抗体随后利用相同的第二抗体。
图11显示流式细胞术获得的数据。利用与磁珠偶联的EpCAM特异性抗体，将EpCAM阳性细胞从由hES细胞体外分化的单组少突胶质细胞祖细胞中去除。对得到的细胞级分进行TRA-1-60和广谱细胞角蛋白的标记，其中利用各自的特异性抗体。还用第二抗体对标记TRA-1-60的细胞进行染色。
定义
本文中使用的“大约”是指指定的量或者数值+或-5％的量或者数值。
本文中使用的“心肌细胞”包括成熟的心肌细胞(具有心肌细胞(从未成年或者成年灵长类动物中分离)功能的细胞)和/或心肌细胞前体(表达心肌细胞上、心肌细胞中或者由心肌细胞表达的一种或多种标志物，和/或具有与心肌细胞相关的一个或者多个形态学属性，以及在体外或者当植入受试者体内时能够分化成为成熟心肌细胞的细胞)。
本文中使用的“细胞培养物”是于体外培养一段时间的多个细胞。细胞培养物可以来源于多个pPS细胞或者来源于单个pPS细胞，其包括所来源细胞的所有子代细胞，不论1)在培养物生命周期中细胞培养物经过传代或者分裂的次数；和2)在培养物生命周期中培养物中一个或者多个细胞的任何表型变化。因此，如本文中所使用，细胞培养物起始于将至少一个pPS细胞接种到一个或者多个适宜的容器中，当初始接种物的最后存活的子代细胞被收集或者死亡时结束。用初始接种细胞的子代细胞接种到一个或者多个适宜的容器中也被认为是初始细胞培养物的一部分。
本文中使用的“软骨细胞”包括成熟的软骨细胞(具有软骨细胞(从未成年或者成年灵长类动物中分离)功能的细胞)和/或软骨细胞前体(表达软骨细胞上、软骨细胞中或者由软骨细胞表达的一种或多种标志物，和/或具有与软骨细胞相关的一个或者多个形态学属性，以及在体外或者当植入受试者体内时能够分化成为成熟软骨细胞的细胞)。
本文中使用的“上皮细胞簇结构”是指当将上皮细胞谱系的外来表型细胞(存在于包含pPS细胞体外分化的子代细胞的混合细胞群中)植入受试者体内时形成的结构。这些结构具有上皮细胞的形态，并且表达下文描述的上皮细胞中表达的至少一种分子标志物。在一些情况下，该结构可以具有囊或者泡的形式。
本文中使用的“细胞角蛋白”是指上皮组织胞质内细胞骨架中的中间丝角蛋白。细胞角蛋白有两种类型：I型酸性细胞角蛋白和II型碱性或中性细胞角蛋白。细胞角蛋白通常成对出现，其包含一个I型细胞角蛋白和一个II型细胞角蛋白。II型细胞角蛋白(碱性或中性细胞角蛋白)包括亚型CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6a、CK6b、CK6c、CK7和CK80。I型细胞角蛋白(酸性细胞角蛋白)包括亚型CK9、CK10、CK12、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、CK19、CK20、CK23和CK24。所有的细胞角蛋白均含有富含α-螺旋的中央结构域(同型细胞角蛋白之间具有50-90％的序列一致性，不同型细胞角蛋白之间为大约30％)以及非α-螺旋的N末端和C末端结构域。
本文中使用的“去除”是指人为地使混合细胞群中含有的外来表型细胞数量相对于细胞群中其他表型细胞类型减少的行为。包括将外来表型细胞与细胞群中剩余的其他细胞分离的方法，例如通过使外来表型细胞免疫沉淀。还包括用化学方法将外来表型细胞从剩余细胞群中移除的方法，例如利用化学试剂(例如毒素、补体等)特异地靶向外来表型细胞。因此，去除了具有外来表型的一种或多种细胞的细胞群被认为是已去除。通常通过比较人为行为之前和之后具有外来表型的细胞的数量，来测定去除情况，具有外来表型的细胞群相对数量的任何减少(人为行为导致)均被认为是去除。从混合细胞群中去除外来表型可以使混合细胞群中靶细胞群富集。
本文中使用的“桥粒糖蛋白3”是一种上皮细胞标志物，其是钙依赖性糖蛋白，是钙粘蛋白超家族的桥粒糖蛋白亚族成员。这些桥粒家族成员，包括桥粒核心糖蛋白，主要存在于上皮细胞中，其在上皮细胞中构成桥粒细胞-细胞连接的粘附蛋白，是细胞粘附和桥粒形成所需蛋白。桥粒家族成员在第18号染色体上排列为两个簇，总共占据少于650kb。选择性剪接产生编码不同亚型的两个转录变体。
本文中使用的“桥粒核心糖蛋白2”是一种上皮细胞标志物。桥粒核心糖蛋白2是植物上皮细胞桥粒中的一种钙结合性跨膜糖蛋白组分。桥粒是上皮细胞、心肌细胞和其他某些细胞类型之间的细胞-细胞连接。目前，已经鉴定出3个桥粒核心糖蛋白亚族成员，全部是钙粘蛋白细胞粘附分子亚族的成员。这些桥粒核心糖蛋白基因家族成员位于第18号染色体的一个簇中。该第二家族的成员表达于结肠、结肠癌以及其他单层和复层的上皮衍生细胞中。
本文中使用的“E-钙粘蛋白”(CD324)是细胞表达表达的一种上皮细胞标志物。其是钙依赖性细胞-细胞粘附糖蛋白，由5个胞外钙粘蛋白重复区、1个跨膜区和1个高度保守的胞质末端组成。该基因的突变与胃癌、乳腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌和卵巢癌相关。认为其功能的丧失会通过促进增殖、侵入和/或转移而导致癌症进展。该蛋白的胞外结构域介导细菌对哺乳细胞的粘附，胞质结构域是内化所需要的。
本文中使用的“富集”是指人为地使混合细胞群中含有的外来表型细胞数量相对于细胞群中其他表型细胞类型增加的行为。通常通过比较人为行为之前和之后具有外来表型的细胞的数量，来测定富集情况，靶细胞群相对数量的任何增加(人为行为导致)均被认为是富集。
本文中使用的“类胚体”是指异质簇，其包含当允许灵长类动物多能干细胞在悬浮培养物或者聚集体中以非特异性方式分化时出现的未分化、已分化和部分分化的细胞。
本文中使用的“胚胎干细胞”(ES)是指多能干细胞，其1)来源于胚泡，随后基本分化成为3个胚层或者2)可选地从构建的细胞系中获得。除非另有明确要求，该术语包括具有ES细胞表型特征的原代组织和构建的细胞系，以及具有多能表型的这些细胞系的子代细胞。ES细胞可以是人ES细胞(hES)。“人胚胎干细胞”(hES细胞)原型由Thomson等描述(Science282：1145，1998；第6,200,806号美国专利)，其可以从几个建成的干细胞库的任何一个库中获得，例如UK Stem Cell Bank(Hertfordshire，England)和the National Stem Cell Bank(Madison，WI)。
本文中使用的“EpCAM”是指上皮细胞粘附分子，一种上皮细胞标志物。其是一种广谱上皮细胞分化抗原，表达于上皮细胞和几乎所有的癌上。
本文中使用的“上皮细胞”是指具有选自下列形态并且表达与上皮细胞相关的至少一种标志物的细胞：a)鳞片状(扁平)；b)立方形(立方形样)；c)柱形(长)；d)假复层(所有细胞均触及基底膜，一些一直延伸到表面，而其他则不能)；e)变形(例如在膀胱中发现的)，其中细胞在一些情况下呈现鳞片状，在其他条件下呈现圆形。示例性上皮细胞标志物包括EpCAM、细胞角蛋白、桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)。
本文中使用的“外来表型”是指混合细胞群中含有的不希望有的一种或多种细胞类型。因此，在包含靶表型细胞群的混合细胞群中，具有与靶细胞群不同表型的任何细胞均被认为是外来的。外来表型细胞可以是去除的对象。外来表型细胞的一个示例是当对受试者施用时可能形成上皮细胞簇结构并且表达由上皮细胞表达的至少一种或多种标志物的细胞。
本文中使用的“造血细胞”包括成熟的造血细胞(具有造血细胞(从未成年或者成年灵长类动物中分离)功能的细胞)，例如树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞(包括CD8+和CD4+淋巴细胞)、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤(NK)细胞、血小板、红血细胞和柱状细胞)，和/或造血细胞前体(表达造血细胞上、造血细胞内或者由造血细胞表达的一种或多种标志物，和/或具有与造血细胞相关的一个或者多个形态学属性，以及在体外或者当植入受试者体内时能够分化成为成熟造血细胞的细胞)。
本文中使用的“肝细胞”包括成熟的肝细胞(具有肝细胞(从未成年或者成年灵长类动物中分离)功能的细胞)和/或肝细胞前体(表达肝细胞上、肝细胞内或者由肝细胞表达的一种或多种标志物，和/或具有与肝细胞相关的一个或者多个形态学属性，以及在体外或者当植入受试者体内时能够分化成为成熟肝细胞的细胞)。
本文中使用的“胰岛细胞”(“Islet cell”或“pancreatic islet cell”)包括成熟的胰岛细胞(具有胰岛细胞(从未成年或者成年灵长类动物中分离)功能的细胞)和/或胰岛细胞前体(表达胰岛细胞上、胰岛细胞内或者由胰岛细胞表达的一种或多种标志物，和/或具有与胰岛细胞相关的一个或者多个形态学属性，以及在体外或者当植入受试者体内时能够分化成为成熟胰岛细胞的细胞)。
本文中使用的体外分化的子代细胞是指通过人为地将一种或多种生长因子、细胞因子、成形素等加入到pPS细胞培养物或者已经开始向一种或多种特定途径分化的pPS细胞培养物中，从而由pPS细胞体外分化的细胞。可以用于使pPS分化的额外的适宜试剂包括微小RNA分子、siRNA分子和小分子，例如IDE1、IDE2、-(-)Indolactan和Stauplimide(参见Borowick等，(2009)Cell Stem Cell 4：348；Chen等，(2009)Nature Chem Biol4：258；Zhu(2009)Cell Stem Cell 4：416)。该定义不包括通过仅形成类胚体或者仅允许pPS细胞培养物在含有它们的容器中过度生长而未加入一种或多种生长因子、细胞因子、成形素等(除了市售培养基或者市售血清制品或血清替代品中含有的以外)而发生的随机或者自发分化事件。但是，如果已经将一种或多种生长因子、细胞因子、成形素等加入到培养物中以促进向一种或多种特定途径分化从而获得靶表型细胞，那么由类胚体分化的细胞也包含在该定义中。
本文中使用的“配体”是指与第二分子特异性相互作用以形成化学键的第一分子。通常所述键是非共价键，例如离子相互作用、氢键或者由Vander Waals力介导的相互作用。配体对(即上述第一和第二分子)的示例包括表位和与该表位特异性结合的抗体，以及与酶特异性结合的底物。两个分子之间的解离常数(Kd)是配体和其特异性结合伴侣之间亲和力的一种判定值。特异性相互作用通常表征为相对较小的Kd。相互结合的亲和力非常高(Kd值非常小)的配体对的一个示例是生物素/抗生物素蛋白。相比而言，两个分子之间的非特异性结合涉及基于电荷和疏水性形成的化学键，但是与特异性结合不同，其相互作用不是基于两个分子的严谨结构。
本文中使用的“混合细胞群”是指包含多于一种表型的细胞体外培养物。
本文中使用的“少突胶质细胞”包括成熟的少突胶质细胞(具有少突胶质细胞(从未成年或者成年灵长类动物中分离)功能的细胞)和/或少突胶质细胞前体(表达少突胶质细胞上、少突胶质细胞内或者由少突胶质细胞表达的一种或多种标志物，和/或具有与少突胶质细胞相关的一个或者多个形态学属性，以及在体外或者当植入受试者体内时能够分化成为成熟少突胶质细胞的细胞)。
本文中使用的“成骨细胞”包括成熟的成骨细胞(具有成骨细胞(从未成年或者成年灵长类动物中分离)功能的细胞)和/或成骨细胞前体(表达成骨细胞上、成骨细胞内或者由成骨细胞表达的一种或多种标志物，和/或具有与成骨细胞相关的一个或者多个形态学属性，以及在体外或者当植入受试者体内时能够分化成为成熟成骨细胞的细胞)。
本文中使用的“广谱细胞角蛋白”是指与至少多数细胞角蛋白家族成员上表达的表位结合的一种抗体或者抗体混合物。
本文中使用的“灵长类动物多能干细胞”(pPS)是指来源于任何来源并且在适宜条件下能够产生所有3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)衍生的灵长类动物不同子代细胞类型的细胞。pPS细胞在8-12周龄的年老SCID大鼠中能够形成畸胎瘤和/或在组织培养中能够形成所有3个胚层的可辨认细胞。灵长类动物多能干细胞的定义包括多种胚胎细胞类型，包括人胚胎干(hES)细胞(参见例如Thomson等，(1998)Science 282：1145)和人胚胎生殖(hEG)细胞(参见例如Shamblott等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726)、来源于其他灵长类动物的胚胎干细胞(恒河猴干细胞(参见例如Thomson等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844)，绒猴干细胞(参见例如(1996)Thomson等，Biol.Reprod.55：254))、通过核转移技术产生的干细胞(第2002/0046410号美国专利申请公开)以及诱导型多能干细胞(参见例如Yu等，(2007)Science 318：5858)；Takahashi等，(2007)Cell 131(5)：861)。可以将pPS细胞建成细胞系，因而提供了pPS细胞的稳定来源。本文中描述的本发明任何实施方案可以通过用下列一种或多种pPS细胞亚族替代pPS细胞而实施：人胚胎干细胞、人胚胎生殖细胞、恒河猴干细胞、绒猴干细胞、核转移干细胞和/或诱导型多能干细胞。
本文中使用的“靶表型”或者“靶向表型”是指由pPS细胞体外分化的期望细胞类型。
本文中使用的“未分化的灵长类动物多能干细胞”是细胞群中大多数灵长类动物多能干细胞和其衍生物显示未分化细胞的形态学特征并且保持能够产生来源于3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)中每个胚层的至少一种细胞类型的细胞培养物。可以理解的是，细胞群中未分化细胞集落可以被部分分化的邻近细胞所包围。
本文中使用的“治疗”(Treat，treatment，treating)是指下列任何一种：疾病或者病症的严重程度降低、疾病持续期缩短、与疾病或者病症相关的一个或者多个症状有所改善、为患有疾病或者病症的受试者提供有益效果、未必治愈疾病或者病症、预防产生与疾病或者病症相关的一个或者多个症状。
发明详述
本发明至少部分地涉及发现包含pPS细胞体外分化的子代细胞的细胞培养物中有时存在外来表型。通常这些外来表型是罕见和以低水平存在的。例如当对受试者施用由pPS细胞体外分化的子代细胞时，外来表型可以例如通过体内繁殖而显现出来。外来表型细胞的一个示例是当植入受试者体内时能够发展成为上皮细胞簇结构的细胞。当植入受试者体内时能够发展成为上皮细胞簇结构的细胞能常表达由上皮细胞表达的一种或多种标志物。
已经发现可以通过上皮细胞标志物的存在鉴定某些外来表型细胞，所述标志物例如EpCAM、桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66、CD105(endoglin)、细胞角蛋白等。外来表型细胞细胞表面表达的上皮细胞标志物为鉴定外来表型细胞的存在和将这些细胞靶向去除提供了适宜的标志物。这种标志物的一个示例是EpCAM。可以将EpCam单独或者与下文描述的一种或多种标志物同时靶向去除。因此可以将EpCAM与未分化细胞上的标志物(例如TRA-160)同时靶向去除。其他示例包括一种或多种下列标志物：桥粒糖蛋白3、桥粒核心糖蛋白2、E-钙粘蛋白CD49f、EMA、E-cad、CD321(Jam1)、CD10、CD66和CD105(endoglin)。因此，可以利用下文描述的标志物将这些细胞从混合细胞群中靶向移除/去除，所述混合细胞群中包含具有外来表型的细胞或者包含例如当植入受试者体内时能够发展成为具有外来表型的细胞的细胞。
令人惊讶的是，还发现表达这些上皮细胞标志物的某些细胞亚群还表达未分化pPS细胞上的标志物，例如TRA-1-60。因此，用合适配体靶向表达上皮细胞标志物的细胞不仅可以使细胞群中外来表型细胞的数量减少，还有助于使包含多能干细胞的细胞培养物中表达与未分化pPS细胞相关标志物的细胞数量降至最低。
使混合细胞群中外来表型细胞减少的方法
在某些实施方案中，本发明提供了使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，其包括使混合细胞群和与具有外来表型的细胞结合的一种或多种配体接触，接着将外来表型细胞从细胞群中分离。所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
可以在适宜的缓冲液中使混合细胞群与配体接触。适宜的缓冲液可以包括磷酸盐缓冲液(PBS)或者有助于混合细胞群存活的任何市售细胞培养基。通常缓冲液是等渗缓冲液，其pH值范围是大约6.8至大约7.7、大约6.9至大约7.6、大约7.0至大约7.5。在一些实施方案中，缓冲液的pH值将是生理pH值。
该方法适用于广泛的样品体积，其范围从微孔板的单个孔中获得的样品大小到大规模生物反应器中获得的样品。使混合细胞群接触的适宜体积的范围是大约50μL至大约10,000升。在一些实施方案中，使细胞混合物接触的适宜体积是大约100μL、大约200μL、大约500μL、大约1mL、大约10mL、大约50mL、大约100mL、大约1L、大约10L、大约50L、大约100L、大约1000L、大约2000L、大约5000L、大约8000L、大约10,000L或者更多。
可以使用配体与混合细胞群中所包含细胞数量的任何适宜比率。例如配体与细胞数量的适宜比率可以是大约1∶1、大约10∶1、大约100∶1、大约1000∶1、大约10,000∶1、大约105∶1、大约106∶1、大约107∶1、大约108∶1、大约109∶1、大约1010∶1。
在一些实施方案中，可以将配体连接到固体负载体上，例如珠。可以使用多种连接配体的珠，以减少混合细胞群中存在的外来表型细胞的数量。例如，珠的适宜数量范围可以是从大约每个细胞1个珠、大约每个细胞5个珠、大约每个细胞10个珠、大约每个细胞15个珠、大约每个细胞20个珠、大约每个细胞25个珠、大约每个细胞30个珠、大约每个细胞35个珠、大约每个细胞40个珠、大约每个细胞45个珠、大约每个细胞50个珠、大约每个细胞60个珠、大约每个细胞70个珠、大约每个细胞80个珠、大约每个细胞90个珠、大约每个细胞100个珠。每个珠连接至少10个配体、至少100个配体、至少1000个配体、至少10,000个配体、至少105个配体、至少106个配体、至少107个配体、至少108个配体、至少109个配体、至少1010个配体、至少1020个配体、至少1030个配体、至少1040个配体、至少1050个配体、
通常本发明的方法包括将配体和混合细胞群共孵育的步骤，以促使配体与表达配体的结合伴侣的外来表型细胞结合。配体和混合细胞群可以在大约3℃至大约40℃范围的温度下孵育。在一些实施方案中，配体和混合细胞群在大约4℃、大约20℃、大约37℃下孵育。配体和混合细胞群孵育的适宜时间长度从大约1分钟至大约60分钟、大约5分钟至大约50分钟、大约10分钟至大约40分钟。在一些实施方案中，配体和混合细胞群可以孵育大约10分钟、大约15分钟、大约20分钟、大约25分钟、大约30分钟、大约60分钟。使混合细胞群和配体接触后，用适宜的缓冲液将细胞清洗一次或者多次，以洗去非特异性结合的配体。适宜的缓冲液包括PBS、任何市售的等渗缓冲液或者培养基。
可以通过混合物分离领域中已知的任何方法将与配体结合的细胞分离出来。例如，配体可以带有下文描述的可检测物质的标签，并且可以利用荧光激活细胞分选仪(FACS)通过细胞分选来分离。作为另一个示例，可以将配体连接到下文描述的固体负载体上。可以通过重力使与配体结合的细胞沉淀。可选地，对与配体结合的细胞使用外力，以使与配体结合的细胞从混合细胞群中包含的其他细胞中分离出来。例如，可以将配体连接到磁化的固体负载体(例如磁珠)上，并且使含有与配体结合的细胞的混合细胞群接触磁场，以使与配体结合的细胞从混合细胞群中包含的其他细胞中分离出来。
在其他实施方案中，可以使细胞和与被认为是外来表型的细胞所表达的一种分子特异性结合的一种或多种配体接触。在一些实施方案中，配体在与细胞接触之前与化学试剂偶联。在其他实施方案中，配体首先与细胞结合，接着与化学试剂接触。因此，可以利用与与配体结合的细胞结合的化学试剂靶向与配体结合的细胞，例如与配体特异性结合的试剂。在一些实施方案中，可以使用一种或多种介入配体。因此，第一配体可以与细胞结合。第二配体与第一配体结合等。化学试剂结合与细胞结合的任何配体。该试剂可以是毒素，因而其与与配体结合的细胞的结合可以杀死细胞。适宜毒素的示例包括白喉毒素、破伤风毒素等。该试剂可以是小分子、蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质。在一个实施方案中，当配体是免疫球蛋白时，化学试剂可以是补体。
进行分离后，可以通过从配体中移除或者洗脱，从而收集外来表型细胞。可以通过改变一种或多种结合条件，将外来表型细胞洗脱下来，所述结合条件例如含有已结合细胞的缓冲液的pH值或者含有已结合细胞的缓冲液的盐浓度。配体
可以使用与由具有外来表型的细胞所表达的标志物特异性结合的任何适宜配体。配体可以包括蛋白或者全长蛋白的肽片段。适宜的蛋白将包括与外来表型细胞表面上表达的分子特异性结合的蛋白或者肽，但是在一些实施方案中，配体可以与细胞内的靶物结合。配体还可以包括核酸、糖、脂质、糖蛋白或者凝集素或者这些物质的任意组合或者蛋白或肽与这些物质的任意组合。因此，可以使用包含特异性结合对的配体，只要其与由包含外来表型的细胞所表达的分子特异性结合并且不能与靶表型细胞结合。
在一些实施方案中，可以使用一种或多种配体。因此，第一配体可以与由外来表型细胞所表达的标志物直接结合，接着第二配体与第一配体结合。还涉及与第二或者任何随后的配体结合的额外的配体。第二(或者随后的)配体可以带有标签，其有助于根据本领域已知的任何方法将与第一配体结合的细胞分离出来，例如通过FACS进行细胞分选、使与固体负载体结合的配体沉淀、对与磁性底物结合的配体进行磁性分离、对连接到固体负载体上的配体进行柱层析。当然，由外来表型细胞所表达的多个分子中的每个分子可以与不同的配体结合，这些配体中的每个接着与一种或多种额外的配体接触。
在一些实施方案中，配体可以是抗体。本文中使用的抗体包括免疫球蛋白或者其部分，其包括包含抗原结合位点的任何多肽，不管其来源、生产方法或者其他特征如何。该术语包括例如多克隆、单克隆、单一特异性、多特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂交、突变和CDR移植抗体，以及包含两条重链和两条轻链的分子。抗体的一部分可以包括仍然能够与抗原结合的任何片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv。在一些实施方案中，抗体可以包含与外来表型细胞上的表位特异性结合的可变区和至少一部分Fc区，以有助于与固体负载体或者第二配体结合。可以将抗体连接到下文描述的固体负载体上。在一些实施方案中，固体负载体可以是珠。在特定的实施方案中，所述珠可以是磁化的。
在某些实施方案中，适宜的配体可以是上皮细胞或者上皮谱系细胞表面上表达的表位的抗体。表位可以包括上皮细胞表面上表达的蛋白、碳水化合物、糖和/或脂质。适宜的表位存在于表达一种或多种下列分子的细胞上：EpCAM、桥粒糖蛋白(例如桥粒糖蛋白3)、桥粒核心糖蛋白(例如桥粒核心糖蛋白2)、E-钙粘蛋白。因此，与EpCAM、桥粒糖蛋白(例如桥粒糖蛋白3)、桥粒核心糖蛋白(例如桥粒核心糖蛋白2)、E-钙粘蛋白结合的抗休整是实施下文描述的方法的适宜配体。这些抗体可以单独使用或者与一种或多种额外的配体结合使用。额外的配体可以包括与由上皮细胞所表达的分子特异性结合的配体。可选地，该配体可以和与由未分化pPS细胞所表达的一种或多种分子结合的配体联合使用。例如，与未分化细胞上的表位结合的抗体可以和与表达一种或多种上皮细胞标志物的细胞结合的配体联合使用。因此，除了与由上皮细胞所表达的一种或多种标志物结合的配体之外，可以用于使混合细胞群中外来表型细胞数量减少的方法中的适宜抗体的示例可以包括TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA 3、SSEA4的抗体(参见Thomson 1998，Science 282：1145)、Cripto、促胃泌素释放肽(GRP)受体和podocalyxin样蛋白(参见第10/388,578号美国专利申请)。
配体可以与可检测物质共价或者非共价偶联或者连接，以有助于对已结合的细胞进行鉴定和/或分离。可检测物质可以包括当连接到配体上时能够识别该配体存在的任何化合物。所述化合物可以包括例如放射性分子、荧光分子、半抗原、载体、酶、介入分子(例如生物素)或者染料。例如，可检测物质可以是化学发光材料或者生物发光材料。配体还可以与毒素相连，例如诱导细胞死亡、细胞裂解等的任何分子。
在某些实施方案中，配体可以与固体负载体偶联或者连接。固体负载体可以包括珠、凝胶、monolith或者膜。固体负载体可以包含能够与目标配体相连的任何材料(例如聚苯乙烯、琼脂糖、交联葡聚糖)。固体负载体可以包含任何合成的有机聚合物，例如聚丙烯酸乙烯基聚合物、丙烯酸脂、聚甲基丙烯酸脂、聚丙烯酰胺、polyacylonitriles和聚烯烃。固体负载体还可以包含碳水化合物聚合物，例如琼脂糖、纤维素、透明质酸、木质素、酰基胶凝糖、葡萄聚糖、羟甲基纤维素、羟甲基淀粉、羟甲基木质素、聚(丙交酯-co-乙二醇)。固体负载体还可以包含例如硝化纤维、尼龙、聚偏二氟乙烯(PVDF)或者羧酸化的聚偏二乙烯(第6,037,124号美国专利)。固体负载体还可以涂有聚乙烯苯甲基二乙基羟乙基氯铵、聚乙烯苯甲基苯酰基氨乙基二甲基氯铵、聚乙烯苯甲基三丁基氯铵、聚乙烯苯甲基三己基氯铵和聚乙烯苯甲基三丁基氯铵的共聚物、聚乙烯苯甲基二甲基氯铵和聚乙烯氨乙基二甲基氯铵的共聚物(第5,336,596号美国专利)。固体负载体还可以包含无机氧化物，例如二氧化铝、二氧化锆(例如碳涂覆的二氧化锆，第5,182,016号美国专利)、二氧化钛、二氧化铈、氧化铝、锰、氧化镁(例如氧化镁)、氧化钙、可控多孔玻璃(CPG)。固体负载体还可以包含上述负载体中一些的组合物，包括但不限于葡萄聚糖-丙烯酰胺。可以将固体负载体制备为使非特异性相互作用最小化，例如通过涂覆一种或多种封闭蛋白，例如白蛋白、酪蛋白等。在一些实施方案中，配体同时与固体负载体和可检测物质相连。
在一些实施方案中，可以通过在有助于配体与固体负载体共价连接的条件下将适宜浓度的配体和珠混合，从而使配体连接到固体负载体上。配体和珠的适宜浓度范围是大约0.1mg配体/mL珠至大约20mg配体/mL珠、大约0.5mg配体/mL珠至大约10mg配体/mL珠、大约1mg配体/mL珠至大约5mg配体/mL珠。在一些实施方案中，可以使用1mg配体/mL珠。在其他实施方案中，可以使用2mg配体/mL珠。在其他实施方案中，可以使用3mg配体/mL珠。在其他实施方案中，可以使用4mg配体/mL珠。在其他实施方案中，可以使用5mg配体/mL珠。
在一些实施方案中，可以利用已知的化学偶联方法使抗体与珠直接连接，例如形成EHS酯。在其他实施方案中，可以使抗体的特异性结合伴侣与珠直接连接，接着抗体与特异性结合伴侣结合，从而将其连接到珠上。特异性结合伴侣可以与抗体的一个区域结合，所述区域不与其特异性表位结合，例如抗体的非可变区。适宜的区域可以包括抗体的Fc区。与抗体Fc区结合的结合伴侣的示例包括蛋白A和蛋白G。可选地，抗体可以与另外一个分子偶联，例如生物素，接着结合到偶联了链菌素的珠上。
在一个特定的实施方案中，配体是EpCAM的抗体，其连接(例如共价地)到珠(例如磁珠)上。抗体可以与珠直接连接或者通过前文中描述的介入分子(例如蛋白A、蛋白G、生物素、链菌素)间接连接。可选地，可以使用短接头将抗体锚定到珠上，从而增强抗体结合的可接近性。接头可以包含例如一个或者多个氨基酸。
在另一个特定的实施方案中，配体可以是共价连接到例如珠(例如磁珠)上的TRA-1-60抗体。抗体可以与珠直接连接或者通过前文中描述的介入分子(例如蛋白A、蛋白G、生物素、链菌素)间接连接。可选地，可以使用短接头将抗体锚定到珠上，从而增强抗体结合的可接近性。接头可以包含例如一个或者多个氨基酸。在一些实施方案中，TRA-1-60抗体具有IgG同种型。在其他实施方案中，TRA-1-60抗体具有IgM同种型。
在一些实施方案中，可以利用由上皮细胞所表达标志物的一种或多种抗体的组合将外来表型细胞从混合细胞群中去除。在一些实施方案中，由上皮细胞所表达标志物的一种或多种抗体可以与由未分化细胞所表达标志物的一种或多种抗体联合使用。
在一些实施方案中，可以联合使用EpCAM的一种或多种抗体和TRA-1-60的一种或多种抗体将外来表型细胞从混合细胞群中去除。在一些实施方案中，所使用的所有抗体均具有IgG同种型。在其他实施方案中，至少一种抗体具有IgG同种型。在其他实施方案中，至少一种抗体具有IgM同种型。
细胞群
在某些实施方案中，本发明提供了经靶表型富集的混合细胞群。可以通过从混合细胞群中清除具有外来表型的至少一种细胞，对混合细胞群中的靶细胞类型进行富集。
1.外来表型
在一些实施方案中，外来表型细胞可以包括例如具有上皮细胞形态的细胞、表达上皮细胞中或者上皮细胞上至少一种标志物的细胞、当植入受试者体内时能够形成上皮细胞簇结构的细胞、未分化的多能细胞、具有未分化细胞形态的细胞、表达未分化细胞中或者未分化细胞上至少一种标志物的细胞。未分化细胞中或者未分化细胞上表达的标志物的示例包括TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA 3、SSEA 4、Oct 4。上皮细胞中或者上皮细胞上表达的标志物的示例包括EpCAM和细胞角蛋白。上皮细胞上表达的其他适宜的标志物可以包括桥粒糖蛋白、桥粒核心糖蛋白和E-钙粘蛋白。当植入受试者(例如啮齿类动物)体内时，这些细胞能够形成上皮细胞簇。
2.靶表型
靶表型细胞可以是由pPS细胞体外分化的子代细胞，其可能包括下列任何一种：少突胶质细胞、神经细胞(例如神经元和星形胶质细胞)、心肌细胞、造血细胞、胰岛细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以是成熟的靶细胞，例如成熟的心肌细胞、成熟的少突胶质细胞等。在其他实施方案中，靶细胞类型可以是前体细胞，例如心肌细胞前体、少突胶质细胞前体、神经细胞前体、胰岛细胞前体、造血细胞前体、肝细胞前体、成骨细胞前体、软骨细胞前体。前体细胞可以表达由其相应的成熟细胞类型所表达的一种或多种标志物，和/或具有其相应成熟细胞类型的一个或者多个形态学性质和/或能够于体内或者体外分化成为其相应的成熟细胞类型。靶细胞类型可以包括表达下列一种细胞类型上、下列一种细胞类型中或者由下列一种细胞类型所表达的一种或多种标志物的细胞：少突胶质细胞、神经元细胞、心肌细胞、造血细胞、胰岛细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞(适宜标志物的示例列于后面段落中)。可以利用本领域已知的任何方法对标志物进行检测，例如可以利用免疫细胞化学、免疫组织化学、FACS、western印迹、ELISA或者qPCR对靶细胞上、靶细胞内或者由靶细胞表达的一种或多种标志物进行检测。
使pPS细胞体外分化成为少突胶质细胞的方法已经描述于第7,285,415号美国专利中，其作为整体通过引用并入本文。可以例如通过使pPS细胞与生长因子、甲状腺激素受体的配体和视黄酸受体的配体接触，从而使pPS细胞群体外分化成为少突胶质细胞。少突胶质细胞上、少突胶质细胞内或者由少突胶质细胞表达的标志物包括NG2(由巨噬细胞和少突胶质细胞祖细胞表达的一种硫酸软骨素蛋白聚糖)、半乳糖脑苷脂(GalC，定向少突胶质细胞的标志物)、髓鞘碱性蛋白(MBP，成熟髓磷脂的标志物)、微管相关蛋白2(MAP-2，CNS细胞的标志物)、髓磷脂蛋白脂蛋白(少突胶质细胞和神经胶质细胞前体上表达的髓磷脂的一种组分)、由O4抗体限定的表位(少突胶质细胞、星形胶质细胞和其前体的标志物)、A2B5(II型星形胶质细胞、神经胶质祖细胞和少突胶质细胞祖细胞上表达的表位)、由RIP抗体识别的表位(其能够对少突胶质细胞和其过程进行染色，并与脊髓和小脑中有髓鞘的轴突表现一致)。
已经描述了使pPS细胞体外分化成为神经细胞的方法，参见例如第6,833,269号美国专利、第2005/0095707号、第2005/0158855号美国专利申请，所有这些作为整体通过引用并入本文。可以例如通过使pPS细胞与noggin和/或卵泡抑素接触、通过使pPS细胞与TGFβ拮抗剂接触或者通过形成类胚体(EBs)并在含有10μM视黄酸的悬浮液中培养EBs接着将细胞置于添加了表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生细胞因子(PDGF)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的限定性培养基中，从而使pPS细胞群体外分化成为神经细胞。神经细胞上、神经细胞内或者由神经细胞表达的标志物包括NCAM、A2B5、β微管蛋白III和微管相关蛋白2(MAP-2)。
已经描述了使pPS细胞体外分化成为心肌细胞的方法，参见例如第7,452,718号、第7,425,448号美国专利、第2005/0054092号、第2007/0010012号美国专利申请，所有这些作为整体通过引用并入本文。可以使pPS细胞与活化素接触，随后与骨形成蛋白(BMP)接触，从而使pPS细胞分化成为心肌细胞。心肌细胞上、心肌细胞内或者由心肌细胞所表达的标志物包括心肌肌钙蛋白I(cTnI)，心肌肌钙蛋白复合体的一个亚基，其为调节条纹肌收缩提供钙敏感型分子开关)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、Nkx2.5(早期胚胎发育过程中心肌中胚层中表达的一种心肌转录因子，其在发育的心脏中持续表达)、心房利钠因子(ANF，发育的心脏和胎儿心肌细胞中表达的一种激素，其在成年人中表达下调)。其他适宜的标志物包括肌球蛋白重链(MHC)(特别是心肌特异性的β链)、肌联蛋白、原肌球蛋白、α辅肌动蛋白和结蛋白、GATA-4(在心肌中胚层中大量表达并且在发育的心脏中持续表达的一种转录因子)。而其他适宜的标志物可以包括MEF 2A、MEF 2B、MEF 2C、MEF 2D、N-钙粘蛋白(介导心肌细胞间的粘附)、连接蛋白43(形成心肌细胞之间的间隙连接)、β1肾上腺素受体(β1AR)、肌酸激酶MB(CK MB)和肌球素(心肌梗塞后的血清中二者表达上调)、α心肌肌动蛋白。
已经描述了使pPS细胞体外分化成为造血细胞的方法，参见例如第7,247,480号美国专利、第12/412,480号美国专利申请和第2005/0282272号美国专利申请，所有这些作为整体通过引用并入本文。作为示例，可以通过使pPS细胞与多种细胞因子接触，从而使pPS细胞分化成为树突状细胞，所述细胞因子例如BMP-4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)和血管内皮生长因子(VEGF)，以使pPS细胞分化成为未成熟的树突状细胞。接着使未成熟的树突状细胞与成熟混合物(cocktail)接触，以产生成熟的树突状细胞，所述成熟混合物例如GM-CSF、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素1-β(IL-1β)、干扰素γ(IFNγ)和前列腺素E2(PGE2)。造血细胞内、造血细胞上或者由造血细胞表达的标志物包括CD34、CD59、Thy1/CD90、CD38、C-试剂盒/CD117、CD13、IL-3Rα(CD123)和CD45RA、CD64 CD14、CD45、CD11a、CD11b、CD15CD11c、MHC I、MHC II、CD83、CCR7、CD205、CD86、CD40、MHCI、MHC II、CD8、CD4、CD119、CD74、CD71、CD75、CD51、CD56、CD65、CD10、CD66a、CD66b、CD44、β球蛋白和肌球素。
已经描述了使pPS细胞体外分化成为胰岛细胞的方法，参见例如第7,033,831号美国专利和第12/303,895号美国专利申请，二者作为整体通过引用并入本文。作为示例，可以通过首先使pPS细胞与活化素和丁酸钠接触，接着与noggin、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)和烟碱接触，从而使pPS细胞分化成为胰岛细胞。胰岛细胞(包括胰岛细胞前体)内、胰岛细胞上或者由胰岛细胞表达的标志物包括胰岛素、c-肽、Hlxb9、pdx1、Neurogenin3、Pax4、NeuroD1、Isl1、Nkx2.2和Nkx6.1、胰腺多肽、胰岛淀粉样多肽(IAPP)、Islet 1、β2/NeuroD、HNF4a。还包括限制性内胚层细胞，一种表达Sox17和HNF3β的特定的胰岛前体细胞。
已经描述了使pPS细胞体外分化成为肝细胞的方法，参见例如第6,458,589号、第6,506,574号、第7,256,042号、第7,473,555号美国专利和第12/303,104号美国专利申请，所有这些作为整体通过引用并入本文。例如可以通过使pPS细胞与DMSO和丁酸盐接触，随后与EGF、TGF-α、肝细胞生长因子(HGF)和丁酸盐接触，从而使pPS细胞体外分化成为肝细胞。肝细胞内、肝细胞上或者由肝细胞表达的标志物包括α1-抗胰蛋白酶(AAT)、白蛋白、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGR-1或者ASGR-2型)、Ck8、Ck18、Ck19、细胞色素p450、CYP1A1/2d CYP2A6 CYP2B6、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A3-5、葡萄糖-6-磷酸酶、HNF-4α、α-胎蛋白、apoE、葡萄糖激酶、胰岛素样生长因子1和2受体、胰岛素受体、leptin、apoAI、apoAII、apoB、apoCIII、apoCII、醛缩酶B、苯丙氨酸羟化酶、L型脂肪酸结合蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白、促红细胞生成素(EPO)和NADPH-Cc。
已经描述了使pPS细胞体外分化成为成骨细胞的方法，参见例如第2005/028274号美国专利申请，其作为整体通过引用并入本文。例如可以通过使pPS细胞与骨形成蛋白(BMP)、人TGF-β受体的配体或者维生素D受体的配体接触，从而使pPS细胞体外分化成为成骨细胞。还可以使细胞与地塞米松、抗坏血酸-2-磷酸以及钙和磷酸盐来源接触。成骨细胞内、成骨细胞上或者由成骨细胞表达的标志物包括骨钙蛋白、骨连接素、I型胶原、碱性磷酸酶、BMP受体、PTH受体、CD105(endoglin)、CD106(VCAM)、CD166(ALCAM)、CD29、CD44和GATA4。
已经描述了使pPS细胞体外分化成为软骨细胞的方法，参见例如第2006/0148077号美国专利申请。例如可以通过使pPS细胞与转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、生长和分化因子(GDF)、骨形成蛋白(BMP)、hedgehog蛋白(HH)、L-抗坏血酸和甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)接触，从而使pPS细胞体外分化成为软骨细胞。分化过程中可以使细胞保持微团培养。软骨细胞内、软骨细胞上或者由软骨细胞表达的标志物包括II型胶原或者聚集蛋白聚糖。
经富集的细胞群
如上面所讨论，本发明提供了经靶表型富集的细胞群。可以通过减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，从而使细胞群富集。外来表型细胞可以表达如下文所讨论由上皮细胞表达的一种或多种标志物。外来表型细胞可以具有上皮细胞形态。当植入受试者体内时，外来表型细胞能够形成上皮细胞簇结构。外来表型细胞可以是未分化的pPS细胞。外来表型细胞可以是表达由pPS细胞所表达一种或多种标志物的细胞，所述标志物例如TRA-1-60、TRA-1-81、Oct4、SSEA3、SSEA4。外来表型细胞可以包括本段中描述的一种或多种外来表型细胞的组合物。因此在某些实施方案中，本发明提供了包含靶表型的经富集的细胞群，其中至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％的外来表型细胞已知从包含靶表型细胞的细胞群中移除。
在其他实施方案中，本发明提供了包含靶表型的混合细胞群，其中具有外来表型的至少一种细胞已经从混合细胞群中移除，并且具有外来表型的至少一种细胞已经移除后，靶表型包含细胞群中至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％的细胞。靶细胞类型可以选自少突胶质细胞、神经细胞、心肌细胞、造血细胞、胰岛细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞，或者选自表达细胞上、细胞内或者由细胞所表达一种或多种标志物的细胞，所述细胞选自少突胶质细胞、神经元细胞、心肌细胞、造血细胞、胰岛细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
试剂盒
在某些实施方案中，本发明提供了将具有外来表型的细胞从混合细胞群中去除的试剂盒，其中所述混合细胞群包含靶表型细胞和外来表型细胞。这两种细胞类型均可以是由pPS细胞体外的子代细胞。例如，靶表型细胞可以包含pPS细胞体外分化的子代细胞，而外来表型细胞可以包含pPS细胞分化的子代细胞、pPS细胞未分化的子代细胞或者其组合。试剂盒可以包括与由包含外来表型的细胞表达的一种或多种分子特异性结合的一种或多种配体。一种或多种配体可以提供于一个或者多个容器中。配体可以以溶液形式提供，例如缓冲液，例如等渗缓冲液、PBS等。或者，一种或多种配体可以以冻干形式提供。试剂盒可以包括使冻干的配体复原的说明。试剂盒可以包括使混合细胞群与配体接触的说明。试剂盒可以包括用于去除外来表型的适宜浓度的配体。可选地，试剂盒可以包括一种或多种对照，例如与所提供的一种或多种配体结合的阳性对照细胞类型和不与所提供的一种或多种配体结合的阴性对照细胞类型。
在一些实施方案中，试剂盒中提供的配体可以是抗体。配体可以是与由包含外来表型的细胞表达的分子结合的抗体。适宜抗体的示例包括TRA-1-60抗体、EpCAM抗体、细胞角蛋白抗体(例如广谱细胞角蛋白抗体)、TRA-1-81抗体、SSEA3抗体和SSEA4抗体。抗体可以是任何同种型，例如IgG、IgM、IgA、IgE、IgD。在一个实施方案中，抗体可以是与EpCAM结合的IgG。在一个实施方案中，抗体可以是与细胞角蛋白结合的IgG。在一个实施方案中，可以使用与多种细胞角蛋白上的不同表位结合的多种IgG抗体。在一个实施方案中，抗体可以是与TRA-1-60结合的IgM。在一个实施方案中，抗体可以是与TRA-1-60结合的IgG。在一个实施方案中，可以使用不同抗体的组合，例如本段中描述的多种类型的抗体。因此，可以使用靶向单个抗原(但是不同表位)的多种抗体。可以使用靶向多种抗原的多种抗体。
试剂盒可以包括用于配体的固体负载体。固体负载体详细描述于下文中。可以在单个容器中提供已经连接到固体负载体上的配体。或者，试剂盒可以提供未相连的抗体和固体负载体。因此可以在不同容器中提供固体负载体和配体。试剂盒可以提供说明书以及用于将配体连接到固体负载体上的一种或多种试剂。
试剂盒可以进一步包括可以与试剂盒中提供的一种或多种配体连接的一种或多种可检测物质。可检测物质详细描述于下文中。可以将一种或多种可检测物质分别提供于一个或者多个容器中，其中附有将一种或多种可检测物质与一种或多种配体连接的说明书。
试剂盒可以提供混合细胞群与结合到固体负载体上的配体接触后对混合细胞群施加外力的工具，以有助于将与配体结合的外来表型细胞从混合细胞群中分离。外力可以是磁场。
在一个实施方案中，试剂盒可以包括一种或多种抗体，其选自EpCAM抗体、细胞角蛋白抗体(例如广谱细胞角蛋白抗体)、桥粒糖蛋白抗体、桥粒核心糖蛋白抗体、E-钙粘蛋白抗体和/或TRA-1-60抗体。一种或多种抗体可以与磁珠偶联。试剂盒可以进一步包括磁场源，其有助于移除与抗体结合的外来表型细胞。试剂盒可以包括储存一种或多种抗体和磁场源的一个或者多个容器。试剂盒可选地可以包括清洗溶液和/或缓冲液以及抗体和磁场的使用说明书。
经富集的细胞群的用途
本发明提供了产生经靶表型富集的大量细胞的方法。靶表型包括少突胶质细胞、神经细胞、心肌细胞、造血细胞、胰岛细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。这些细胞群可以用于多项重要研究、开发和商业目的。由于所提供的细胞群是经靶表型富集的，因此其与未经富集的细胞群相比更适用于下文描述的所有用途中。
筛选
本发明的经富集的靶细胞群可以商用于筛选影响这些细胞和其多种子代细胞的特征的因子(例如溶剂、小分子药物、肽、寡核苷酸)或者环境条件(例如培养条件或者操作)。所述特征可以包括细胞的表型或者功能性质。
本发明的其他筛选应用涉及测定药物化合物对经富集的靶细胞群的作用。或者因为化合物设计为对细胞有药理学作用，或者其他因为化合物设计为对靶表型细胞有作用有不期望的副作用，所以要进行筛选。其他筛选应用可以包括对化合物的致癌或者其他毒性作用进行筛选。可以利用本发明的任何前体细胞或者终末分化/成熟细胞进行筛选，以确定靶化合物对靶细胞是否具有有益或者有害作用。利用下文描述的经富集的靶细胞群将提供更加精确的筛选结果。
读者一般参考标准教科书In vitro Methods in Pharmaceutical Research，Academic Press，1997。评估候选药物化合物的活性一般包括使本发明的经富集的靶细胞与候选化合物(单独或者联合其他药物)混合。研究人员确定由该化合物导致的表型、标志物表型(如下文所描述)或者细胞功能活性的任何变化(与未处理细胞或者用惰性化合物处理的细胞相比)，接着将化合物的作用与所观察到的变化相关联。
通过对细胞活力、存活、形态以及某些标志物和受体表达的作用，首先确定细胞毒性。可以通过对DNA合成或者修复进行测定，从而确定药物对染色体DNA的影响。[3H]-胸腺嘧啶在细胞周期的非预定时间掺入或者掺入水平高于细胞复制所需水平与药物的作用相符。不期望的作用还可以包括由中期染色体铺展测定的非正常比率的姐妹染色体交换。关于进一步的细节，读者可以参考A.Vickers(pp 375-410 in In vitro Methods inPharmaceutical Research，Academic Press，1997)。
观察到有作用时，可以用滴定法测定化合物的浓度，以确定有效剂量中位值(ED50)。
动物试验
本发明还提供了本发明的经富集的靶细胞在任何需要增强组织维持和组织功能修复中的用途，例如代谢功能先天性障碍、疾病情形的影响或者重大创伤的结果。
为了测定细胞组合物用于治疗施用的适用性，可以首先在合适的动物模型中对经富集的靶细胞进行试验，例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、牛、马、羊、猪、狗、灵长类动物或者其他哺乳动物。在一个水平上，对细胞在体内存活和维持其表型的能力进行评估。可以对免疫缺陷动物(例如裸鼠，或者用化学方法或辐射致使免疫缺陷的动物)施用细胞组合物。再生长一段时间后，取出组织，并对多能干细胞衍生细胞是否仍然存在进行评估。可以进行本领域已知的功能测试。
可以通过施用表达可检测标记(例如绿色荧光蛋白或者β-半乳糖苷酶)的细胞、用BrdU或[3H]-胸腺嘧啶预先标记的细胞，或者通过随后检测组成型细胞标志物(例如利用人特异性抗体)，从而监测细胞存活情况。可以利用人特异性抗体通过免疫组化或者ELISA，或者根据已公开的序列数据利用特异性扩增人多聚核苷酸的引物和杂交条件通过RT-PCR分析，对所施用细胞的存在和表型进行测定。
在一个实施方案中，可以对动物施用经富集的靶细胞群，以检测上皮细胞簇结构的形成。所述动物可以是啮齿类动物，例如小鼠或者大鼠。经富集的细胞可以对动物施用适宜的一段时间，例如大约1-12个月。杀死动物，并对接受经富集细胞群的组织进行组织学检测或者ICC或者二者，以筛选具有上皮细胞形态和/或标记有上皮细胞上一种或多种标志物和/或未分化的pPS细胞上一种或多种标志物的哺乳动物细胞。
在其他实施方案中，可以利用针对特定疾病的已知动物模型对本发明的经富集的靶细胞进行功能测试。例如如果靶细胞类型是心肌细胞，可以使用心脏疾病和或心肌梗死的几种模型之一。可以通过将预冷的铝杆放置于与左心室前壁接触，使心脏发生冷冻心肌梗死(Murry等，J.Clin.Invest.98：2209，1996；Reinecke等，Circulation 100：193，1999；第6,099,832号美国专利；Reinecke等，Circ Res.，Epub Mar 2004)。在较大动物中，可以通过将液氮中冷冻的30-50mm铜盘在左心室前壁上放置～20分钟，造成冷冻心肌梗死(Chiu等，Ann.Thorac.Surg.60：12，1995)。可以通过连接左冠状动脉主干(Li等，J.Clin.Invest.100：1991，1997)或者通过利用逐渐膨胀从而堵塞动脉的ameroid缩窄器，诱导心肌梗死。用本发明的细胞制备品处理损伤位点，并对心脏组织进行组织学检测，检测其受损区域中细胞的存在。可以通过测定例如左心室舒张末期压、形成压、升压速率和降压速率等参数监测心脏功能。
当靶细胞是少突胶质细胞时，可以在成年大鼠脊柱中诱导慢性髓鞘脱失区域(Keirstead等，J Neurosci.19：7529，1999)。可以使脊髓暴露于距离为2cm的40G X光照射下，利用铅屏蔽使其集中于T9，这使得向暴露细胞的DNA中引入缺口，因而导致正在分裂的细胞死亡。2天后，在T9直接脊柱内注射溴化乙锭。溴化乙锭是一种DNA交联螯合剂，其杀死与其接触的细胞，导致产生慢性髓鞘脱失的非细胞区域，其中～60％的脊柱区域内没有有活力的少突胶质细胞和星形胶质细胞。
3天后，将经富集的少突胶质细胞谱系的细胞群移植入动物体内的髓鞘脱失位点。可选地，提前48小时将溴脱氧尿苷(BrdU)加入到培养基中，对细胞进行预标记。首先，制备～30个前体细胞的细胞簇，将其浓缩至每μL～60,000个细胞的密度。利用外直径大约80um的拉制玻璃微管或者注射器针头将1μL细胞施用至损伤位点，时间大约10分钟。大约2-4周后，利用树脂或者冷冻切片制片将组织样品制备成1mm的横截块。
用甲苯胺蓝对冠状面的切片进行染色，并对普通病理、髓鞘再生的证据和细胞形态进行分析。由于受损区域是非细胞的，因此移植后存在的细胞来源于所施用的细胞。可以对冷冻切片进行相关细胞类型标志物的染色，例如GFAP(星形胶质细胞)、CNP(少突胶质细胞)、RIP(少突胶质细胞)或者NeuN(神经元)。还可以利用电子显微镜分析超薄切片中髓鞘板层的数量和细胞的超微结构。对移植的细胞在髓鞘脱失区域的再分布和其分化成为成熟的成髓鞘细胞的情况进行测定。髓鞘再生占髓鞘脱失轴突的百分比处于25％、50％或者75％的水平证明生物学效能增加。
可以在SCI模型中对经富集的靶细胞进行测试，包括挫伤和背部半侧切除。对于挫伤，利用适宜的脊髓挫伤设备使脊髓移位大约0.9mm(中度损伤)超过23毫秒。对于半侧切除损伤，利用立体定位操作器用尖刃手术刀片将脊髓的背部一半切除。两个步骤后均进行适宜的手术后护理。为了促进植入细胞的迁移并且消除髓鞘相关的生长抑制因子，可选地还使脊髓发生髓鞘脱失(Keirstead等，Exp Neurol.151：303，1998)。在轴突损伤位点脊椎椎管和椎尾的中心制造一个2mm的孔。对暴露的脊髓注射大约4μL抗GalC的多克隆抗体(Millipore Corp.，Billerica，MA)，所述抗体用磷酸盐缓冲液中的33％豚鼠补体(Harlan SeraLab，San Francisco，CA)以1∶2稀释。
损伤后大约24小时，通过拉制玻璃微管或者注射器针头将经富集的少突胶质细胞谱系靶表型细胞移植入动物体内。或者，可以通过损伤后拒绝给予治疗1-3个月，产生慢性损伤模型。用细胞治疗后，用录像带记录功能性反应，并定期监测改善的临床证据。例如，可以利用BBB评分(基于关节活动、承重、肢体协调性和其他性质的21分评分系统)对地上位移进行定量。
人类中的治疗用途
进行足够试验后，可以利用本发明的经富集的靶细胞在需要进行这种治疗的人类患者或者其他受试者中进行组织重建或者再生。细胞以允许其漂移或者迁移至期望组织位点并且使功能缺陷区域重建或者再生的方式施用。因此包含心肌细胞的经富集的靶细胞群可以施用至脊髓。包含肝细胞的经富集的靶细胞群可以施用至肝脏。包含造血细胞的经富集的靶细胞群可以静脉内施用。包含胰岛细胞的经富集的靶细胞群可以施用至肾脏附近或者胰脏。或者，包含胰岛细胞的经富集的靶细胞群可以在保护细胞远离自身免疫应答的可植入设备中经皮下施用。包含软骨细胞的经富集的靶细胞群可以施用至软骨缺陷或者需要进行软骨修复的关节。经富集的成骨细胞群可以施用至折断的骨。
可以通过本领域已知的任何方法施用细胞群。例如，可以通过外科手术将细胞直接施用至需要进行细胞移植的器官或者组织。或者，可以使用非侵入性步骤对受试者施用细胞。非侵入性递送方法的示例包括使用注射器和/或导管将细胞递送至需要进行细胞治疗的器官或者组织。
对接受本发明的经富集的靶细胞同种异体移植的患者进行治疗，以减少对移植细胞的免疫排斥。所涉及的方法包括施用传统的免疫抑制药物(例如他克莫司(tacrolimus)、环孢菌素A(cyclosporin A))(Dunn等，Drugs 61：1957，2001)，或者利用配对的多能干细胞衍生细胞群诱导免疫耐受(WO 02/44343；和6,280,718号美国专利；WO 03/050251)。或者，可以联合使用抗免疫药物(例如强的松(prednisone))和免疫抑制药物。
本发明的经富集的靶细胞可以以药物组合物的形式提供，其包括在充分消毒条件下制备的用于人类施用的等渗赋形剂。为了减少移植物移入时细胞死亡的风险，对细胞进行热休克处理，或者施用前用0.5U/mL促红细胞生成素培养～24小时。
对于药物制剂的一般原理，读者参见Cell Therapy：Stem CellTransplantation，Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy，G.Morstyn & W.Sheridan，Eds.，Cambridge University Press，1996和Hematopoietic Stem CellTherapy，E.D.Ball，J.Lister & P.Law，Churchill Livingstone，2000。根据施用途径和设备调整对组合物中细胞赋形剂和任何附带成分的选择。组合物还可以包含或者附带有助于经富集的靶细胞移入或者功能活化的一种或多种其他成分。适宜的成分将根据靶表型而变化，其可以包括支持或者促进靶细胞类型粘附或者促进移入组织形成血管的基质。
本发明还包括一个试剂系统，其包含生产、分配或者使用过程中任何时间均存在的一组细胞或者细胞组合物。该细胞组包含本文中描述的两种或者多种细胞群的任意组合，例如但不限于已分化的多能干细胞衍生细胞和未分化的灵长类动物多能干细胞或者属于相同基因组的其他已分化细胞类型，。组中的每种细胞类型可以包装在一起，或者包装于相同装置中的不同容器中，或者在具有商业关系的相同实体或者不同实体控制下同时或者于不同时间包装于不同地点。
可选地，本发明的药物组合物可以包装于适宜的容器中，其中附有用于期望目的的说明书，例如心肌细胞谱系细胞功能重建，以改善疾病情形或者心肌异常或者促进损伤脊髓髓鞘再生。
本发明的经富集的靶细胞可以用于制备cDNA文库，所述文库相对不含其他谱系细胞中优先表达的cDNA。例如，通过以1000rpm离心5分钟，收集经富集的靶细胞，接着制备mRNA，并进行逆转录。可以通过微阵列分析比较经富集的靶细胞与其他细胞类型的表达模式，其概括综述于Fritz等，Science 288：316，2000。这种文库特别适用于研究靶细胞与其来源的未分化pPS细胞相比的基因表达。由于这些细胞具有基本一致的基因组，因此利用例如消减杂交进行基因表达的比较可以几乎无或者无背景噪声。对两个细胞群进行基因表达的比较时，减少细胞群中外来表型细胞的数量将提供改进的信噪比，所述细胞群例如已分化的靶子代细胞和产生已分化的靶细胞的亲代pPS细胞系。
本发明的已分化细胞还可以用于制备经富集靶细胞的标志物的特异性抗体。可以通过对脊椎动物注射免疫原形式的本发明的细胞，从而制备多克隆抗体。单克隆抗体的产生描述于标准参考文献中，例如Harlow &Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，第4,491,632号、第4,472,500号和第4,444,887号美国专利，以及Methods in Enzymology 73B：3(1981)。
灵长类动物多能干细胞
本发明提供了对由pPS细胞体外分化的靶细胞进行富集的方法。pPS细胞包括任何灵长类动物多能细胞。在适宜的生长条件下，多能细胞将能够形成来源于3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)中每个胚层的至少一种细胞类型。pPS细胞可以起源于胚前期、胚胎期或胎儿组织或者成熟的已分化细胞。通常pPS细胞不是从恶性来源获得。当植入免疫缺陷小鼠(例如SCID小鼠)中时，pPS细胞将形成畸胎瘤。可以从已构建的细胞系中获得pPS细胞。已构建的细胞系可从公共细胞库中获得，例如WiCell和theUK Stem Cell Bank。
在显微镜下，pPS细胞呈现较高的核/胞质比，核仁突出，形成紧密集落，细胞连接很难辨认。pPS细胞通常表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及利用名称为TRA-1-60和TRA-1-81的抗体可检出的标志物。如RT-PCR所检测，未分化的人胚胎干细胞通常还表达转录因子Oct-3/4、Cripto、促胃泌素释放肽(GRP)受体、podocalyxin样蛋白(PODXL)、nanog和端粒酶逆转录酶，例如hTERT(US 2003/0224411 A1)。
可以用于本发明任何实施方案的pPS细胞包括但不限于胚胎干细胞，例如人胚胎干细胞(hES)。本发明中使用的胚胎干细胞可以选自胚胎干细胞系。已经构建了大量的胚胎干细胞系，包括但不限于H1、H7、H9、H13或者H14(Thompson，(1998)Science 282：1145)，hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03(BresaGen，Inc.，Athens，GA)，HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6(来源于ES Cell International，Inc.，Singapore)，HSF-1、HSF-6(来源于University of Califomia at San Francisco)，I 3、I 3.2、I 3.3、I 4、I 6、I 6.2、J 3、J 3.2(来源于the Technion-Israel Institute of Technology，Haifa，Israel)，UCSF-1和UCSF-2(Genbacev等，(2005)Fertil.Steril.83(5)：1517)，细胞系HUES 1-17(Cowan等，(2004)NEJM 350(13)：1353)和细胞系ACT-14(Klimanskaya等，(2005)Lancet，365(9471)：1636)。
其他灵长类动物多能干细胞类型包括但不限于描述于WO 01/51610中的原始外胚层样(EPL)细胞和人胚胎生殖(hEG)细胞(Shamblott等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726)。
适用于本发明任何实施方案的pPS细胞还包括诱导性灵长类动物多能干细胞(iPS)。iPS细胞是指经基因修饰的细胞，例如通过用一种或多种适宜的载体进行转染，以使其获得pPS细胞的表型(Takahashi等，(2007)Cell 131(5)：861；Yu等，(2007)Science 318：1917)。或者，可以通过使细胞与诱导细胞发生重编程的蛋白混合物接触，使成年细胞重编程，以使其具有与来源于囊胚的多能干细胞相关的表型和形态特点，从而获得iPS细胞(参见Kim等，(2009)Cell Stem Cell 4(6)：472)。这些重编程细胞获得的表型特点包括与从囊胚中分离的多能干细胞相似的形态，以及表面抗原表达、基因表达和pPS细胞中发现的端粒酶活性。iPS细胞能够分化成为来源于3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)中每个胚层的至少一种细胞类型。当植入免疫缺陷小鼠(例如SCID小鼠)中时，iPS细胞还可以形成畸胎瘤(Takahashi等，(2007)Cell 131(5)：861；Yu et al.，(2007)Science318：1917)。
灵长类动物多能干细胞的培养条件
在某些实施方案中，本发明中使用的pPS细胞已经以无饲养层方式得到(参见例如Klimanskaya等，(2005)Lancet 365(9471)：1636)。在某些实施方案中，使用前在无血清环境中对pPS细胞进行培养。
可以利用本领域已知的多种底物、培养基以及其他添加剂和因子对pPS细胞进行培养。在一些实施方案中，适宜的底物包含包括下列一种或多种的基质：层粘连蛋白、胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖。在一些实施方案中，基质可以包含小鼠EHS肉瘤基底膜的可溶性提取物，其市售为MatrigelTM(BD Biosciences，San Jose，CA)。在其他实施方案中，基质可以包含人、人源化或者小鼠来源的一种或多种分离的基质蛋白，例如CELLstartTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在其他实施方案中，适宜的底物可以包含一种或多种聚合物，例如一种或多种丙烯酸脂。聚合物可以包括一种或多种蛋白或来源于体内胞外基质中的蛋白的肽片段。在一个特定的实施方案中，底物包含一种或多种丙烯酸脂和偶联的玻连蛋白肽(参见例如第2009/0191633号美国专利公开、第2009/0191626号美国专利公开、第2009/0203065号美国专利公开)。利用促进增殖同时抑制分化的条件，可以使pPS细胞在培养基中持续繁殖。
示例性培养基可以由80％DMEM(例如Knock-Out DMEM，Gibco)、20％的限定性胎牛血清(FBS，Hyclone)或者血清替代品(US 2002/0076747 A1，Life Technologies Inc.)、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇组成。其他适宜的培养基包括无血清的限定性培养基，例如X-VIVOTM 10(Lonza，Walkersville，MD)。可以用于本发明某些实施方案中的其他市售培养基制剂包括X-VIVOTM 15(Lonza，Walkersville，MD)、mTeSRTM(Stem Cell Technologies，Vancouver，CA)、hTeSRTM(Stem Cell Technologies，Vancouver，CA)、StemProTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)和CellgroTM DC(Mediatech，Inc.，Manassas，VA)。
在某些实施方案中，可以在不添加饲养细胞的情况下使pPS细胞保持未分化状态(参见例如(2004)Rosler等，Dev.Dynam.229：259)。无饲养层的培养物通常由含有促进细胞增殖而不分化的因子的营养培养基供给(参见例如第6,800,480号美国专利)。在某些实施方案中，可以使用含有这种因子的条件培养基。可以通过在培养基中培养分泌这种因子的细胞，获得条件培养基。适宜的细胞包括经照射的(～4,000rad)原代小鼠胚胎成纤维细胞、telomerized小鼠成纤维细胞或者来源于pPS细胞的成纤维样细胞(第6,642,04号美国专利)。可以通过将饲养细胞置于添加了20％血清替代品和4ng/ml bFGF的无血清培养基(例如KO DMEM)中，使培养基条件化。已经进行条件化1-2天的培养基中可以添加额外的bFGF，并用其供给pPS细胞1-2天(参见例如WO 01/51616；Xu等，(2001)Nat.Biotechnol.19：971)。
或者，可以使用新鲜的或者非条件培养基，其中已经添加了促进细胞以未分化形式增殖的因子(例如成纤维细胞生长因子或者福斯高林(forskolin))。示例是例如X-VIVOTM 10(Lonza，Walkersville，MD)或者QBSFTM-60(Quality Biological Inc.Gaithersburg，MD)的基础培养基，其中添加40-80mg/ml bFGF以及可选地含有SCF(15ng/mL)或者Flt3配体(75ng/mL)(参见例如Xu等，(2005)Stem Cells 23(3)：315)。这些培养基制剂具有的优势是细胞生长速度是其他系统中的2-3倍(参见例如WO 03/02092)。在一些实施方案中，pPS细胞(例如hES细胞)可以培养于包含bFGF和TGFβ的培养基中。bFGF的适宜浓度包括大约80ng/ml。TGFβ的适宜浓度包括大约0.5ng/ml。
在一些实施方案中，可以使灵长类动物多能干细胞以＞15,000 cells cm-2(可选地90,000cm-2至170,000cm-2)覆盖。通常在细胞开始完全分散前停止酶消化(例如用胶原酶IV消化大约5分钟)。接着将大约10至大约2,000个细胞的细胞团直接覆盖于适宜的负载体上，不进行进一步分散。或者，在板到达融合度前，不利用酶而是通过使细胞在PBS中的0.5mMEDTA溶液中孵育大约5分钟，或者通过用小型移液器或细胞刮将细胞刮落或脱离从而机械地使期望细胞从板上分离，从而收集细胞。从培养容器中清洗下后，将细胞放置入新培养基中，不进行进一步分散。在进一步的阐述中，通过与0.05％(wt/vol)胰蛋白酶(Gibco
Figure BDA0000131284980000521
Carlsbad，CA)和0.05mMEDTA于37℃孵育5-15分钟，将无饲养细胞的情况下培养的融合的人胚胎干细胞从板上移去。移去板中的剩余细胞，将细胞打散成包含单个细胞和小簇的悬液，接着使其以50,000-200,000个细胞cm-2的密度覆盖，以促进存活并且限制分化。
在某些实施方案中，可以在饲养细胞层上培养pPS细胞，所述饲养细胞通常是来源于胚胎或者胎儿组织的成纤维细胞(Thomson等，(1998)Science 282：1145)。在某些实施方案中，饲养细胞可以来源于人或者小鼠来源。人饲养细胞可以从多种人体组织中分离，或者通过使人胚胎干细胞分化成为成纤维细胞而获得(参见例如01/51616)。在某些实施方案中，可以使用的人饲养细胞包括但不限于胎盘成纤维细胞(参见例如Genbacev等，(2005)Fertil.Steril.83(5)：1517)、输卵管上皮细胞(参见例如Richards等，(2002)Nat.Biotechnol.，20：933)、包皮成纤维细胞(参见例如Amit等，(2003)Biol.Reprod.68：2150)、子宫内膜细胞(参见例如Lee等，(2005)Biol.Reprod.72(1)：42)。
实施本发明时，培养细胞时可以使用多种固体表面。那些固体表面包括但不限于市售标准细胞培养板，例如6孔、24孔、96孔或者144孔板。其他固体表面包括但不限于微载体和盘。在某些实施方案中，微载体可以用于搅拌生物反应器中，以使细胞附着。在某些实施方案中，微载体是珠。那些珠可以以多种形式出现，例如具有正电荷基团以增强细胞附着的细胞角蛋白dex葡萄聚糖微载体珠、用于细胞附着的明胶/胶原涂覆的珠和用于细胞附着的具有不同多孔性的大孔微载体珠。细胞角蛋白dex葡萄聚糖、明胶/胶原涂覆的和大孔微载体珠均是市售的(Sigma-Aldrich，St.Louis，MOor Solohill Engineering Inc.，Ann Arbor，MI)。在某些实施方案中，珠的大小是90-200μm，面积为350-500cm2。珠可以由多种材料组成，例如但不限于玻璃或者塑料。盘由公司出售，例如New Brunswick Scientific Co，Inc.(Edison，NJ)。在某些实施方案中，盘是Fibra-cel盘，其是聚酯/聚丙烯盘。每克这些盘提供1200cm2的表面面积。
适于使pPS细胞生长的固体表面可以由多种物质组成，例如但不限于玻璃或者塑料，例如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚酯薄膜或者thermanox。在本发明的某些实施方案中，固体表面可以是三维形状的。示例性三维固体表面描述于例如US 2005/0031598中。
在某些实施方案中，本发明方法中的细胞是单细胞悬液。可以以多种方式制备单细胞悬液，包括但不限于在旋转瓶中、振荡瓶中或者在发酵罐中培养。可以使用的发酵罐包括但不限于Celligen Plus(New BrunswickScientific Co，Inc.，Edison，NJ)和STR或者Stirred-Tank Reactor(ApplikonInc.，Foster City，CA)。在某些实施方案中，生物反应器可以持续地灌注培养基或者以分批补料的模式使用。其他适宜的生物反应器包括WaveBioreactor bags(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。生物反应器以不同大小出现，包括但不限于2.2升、5升、7.5升、14升或者20升、100升、100升、10,000升或者更大。
常规技术
对于用于实施本发明的常规技术的进一步详细阐述，实施者可以参考细胞生物学、组织培养、胚胎学、发育生物学、免疫学、神经学、内分泌学、心脏病学等的标准教科书和综述。
对于组织和细胞培养以及胚胎干细胞，读者可以参考本领域可获得的大量出版物中的任何一个，例如Teratocarcinomas and Embryonic Stem cells：A Practical Approach(E.J.Robertson，Ed.，IRL Press Ltd.1987)；Guide toTechniques in Mouse Development(P.M.Wasserman等，Eds.，Academic Press1993)；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900，1993)；Properties and Uses of Embryonic Stem Cells：Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy(P.D.Rathjen等，Reprod.Fertil.Dev.10：31，1998和R.I.Freshney，Culture of Animal Cells，Wiley-Liss，New York，2000)。
当来源于已构建的pPS细胞系时，本发明的细胞群和分离的细胞可以表征为具有与其来源的细胞系相同的基因组。这意味着通过pPS细胞和分化的子代细胞之间的RFLP或者SNP分析，染色体DNA基本一致(假设细胞未经人为的基因改造)。基因组中随着时间会发生相对微小的变化，例如在非编码区，但是总的来说，亲代细胞系和任何子代细胞(例如分化的子代细胞)之间基本保持基因一致性。通常基因一致性的水平与同卵双胞胎之间观察到的基因一致性类似。
已分化细胞的基因改变
可以通过分化前或者分化后对细胞进行基因工程，从而使本发明的细胞含有一个或者多个基因改变(US 2002/0168766 A1)。例如在一些实施方案中，可以通过在细胞进展成为定向分化的发育谱系细胞或者终末分化细胞之前或者之后使细胞发生基因改变以表达端粒酶逆转录酶，对细胞进行处理，以增强其复制潜能(US 2003/0022367 A1)。
还可以对本发明的细胞进行基因改变，以增强其参与调节特定的治疗性功能的能力或者递送治疗性基因至施用位点的能力。利用期望基因的已知编码序列设计载体，所述序列与在所有细胞类型中活跃或者在分化的细胞类型中特异性活跃的启动子可操作连接。或者，启动子可以是允许基因改变定时表达的诱导型启动子。例如，可以对细胞进行基因工程，以表达调节心脏功能的细胞因子。
本发明的附加方面
本发明的附加方面包括下列：
1.一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与外来表型细胞特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
2.1的方法，其中所述外来表型细胞是上皮细胞。
3.2的方法，其中所述上皮细胞表达细胞角蛋白。
4.2的方法，其中所述上皮细胞表达EpCAM。
5.4的方法，其中所述表达EpCAM的一种或多种细胞还表达TRA-1-60。
6.1的方法，其中所述配体是抗体。
7.6的方法，其中所述抗体与EpCAM特异性结合。
8.1的方法，其中所述配体连接到固体负载体上。
9.8的方法，其中所述固体负载体是珠。
10.9的方法，其中所述珠是磁珠。
11.权利要求1的方法，其中所述将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离是通过对混合细胞群施加外力而进行。
12.11的方法，其中所述外力由磁场提供。
13.1的方法，其中所述混合细胞群包含靶表型。
14.13的方法，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
15.14的方法，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
16.14的方法，其中所述靶表型是心肌细胞。
17.一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与由上皮细胞表达的一种或多种标记物特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将a)中与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，pPS细胞包括外来表型细胞。
18.17的方法，其中所述由上皮细胞表达的标志物是细胞角蛋白。
19.17的方法，其中所述由上皮细胞表达的标志物是EpCAM。
20.19的方法，其中所述表达EpCAM的细胞还表达TRA-1-60。
21.17的方法，其中所述配体是抗体。
22.21的方法，其中所述抗体与EpCAM特异性结合。
23.17的方法，其中所述配体连接到固体负载体上。
24.17的方法，其中所述固体负载体是珠。
25.24的方法，其中所述珠是磁珠。
26.17的方法，其中所述将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离是通过对混合细胞群施加外力而进行。
27.26的方法，其中所述外力由磁场提供。
28.17的方法，其中所述混合细胞群包含靶表型。
29.28的方法，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
30.28的方法，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
31.28的方法，其中所述靶表型是心肌细胞。
32.一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与上皮细胞特异性结合的一种或多种配体接触，并且使混合细胞群和与未分化的pPS细胞特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
33.32的方法，其中所述由上皮细胞表达的标志物是细胞角蛋白。
34.32的方法，其中所述由上皮细胞表达的标志物是EpCAM。
35.34的方法，其中所述表达EpCAM的细胞还表达TRA-1-60。
36.32的方法，其中所述配体是抗体。
37.36的方法，其中所述抗体与EpCAM特异性结合。
38.36的方法，其中所述配体连接到固体负载体上。
39.38的方法，其中所述固体负载体是珠。
40.39的方法，其中所述珠是磁珠。
41.32的方法，其中所述将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离是通过对混合细胞群施加外力而进行。
42.41的方法，其中所述外力由磁场提供。
43.32的方法，其中所述混合细胞群包含靶表型。
44.43的方法，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
45.43的方法，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
46.43的方法，其中所述靶表型是心肌细胞。
47.32的方法，其中所述与未分化的pPS细胞特异性结合的配体是抗体。
48.47的方法，其中所述抗体与TRA-1-60结合。
49.48的方法，其中所述与TRA-1-60结合的抗体是IgG。
50.48的方法，其中所述与TRA-1-60结合的抗体是IgM。
51.32的方法，其中所述与外来表型细胞结合的配体是与EpCAM特异性结合的抗体，所述与未分化的pPS细胞结合的配体是与TRA-1-60结合的抗体。
52.51的方法，其中所述与EpCAM结合的抗体连接到磁珠上，与TRA-1-60结合的抗体连接到磁珠上。
53.一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与EpCAM配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
54.53的方法，其中所述与EpCAM结合的配体是抗体。
55.54的方法，其中所述EpCAM抗体连接到固体负载体上。
56.55的方法，其中所述固体负载体是珠。
57.56的方法，其中所述珠是磁珠。
58.53的方法，其中所述将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离是通过对混合细胞群施加外力而进行。
59.58的方法，其中所述外力由磁场提供。
60.53的方法，其中所述混合细胞群包含靶表型。
61.60的方法，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
62.43的方法，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
63.43的方法，其中所述靶表型是心肌细胞。
64.一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体以及与TRA-1-60特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将与EpCAM配体结合的细胞和与TRA-1-60配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而减少混合细胞群中外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
65.64的方法，其中所述与EpCAM结合的配体是抗体。
66.64的方法，其中所述与EpCAM结合的配体连接到固体负载体上。
67.66的方法，其中所述固体负载体是珠。
68.67的方法，其中所述珠是磁珠。
69.64的方法，其中所述与TRA-1-60结合的配体是抗体。
70.69的方法，其中所述抗体是IgG。
71.69的方法，其中所述抗体是IgM。
72.64的方法，其中所述与TRA-1-60结合的配体连接到固体负载体上。
73.72的方法，其中所述固体负载体是珠。
74.73的方法，其中所述珠是磁珠。
75.64的方法，其中所述将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离是通过对混合细胞群施加外力而进行。
76.75的方法，其中所述外力由磁场提供。
77.64的方法，其中所述混合细胞群包含靶表型。
78.77的方法，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
79.77的方法，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
80.77的方法，其中所述靶表型是心肌细胞。
81.一种使混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体接触和b)使与EpCAM配体结合的细胞和将与配体结合的细胞杀死的化学试剂接触，从而减少混合细胞群中上皮细胞簇形成细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
82.81的方法，其中所述与EpCAM结合的配体是抗体。
83.82的方法，其中所述EpCAM抗体连接到固体负载体上。
84.83的方法，其中所述固体负载体是珠。
85.84的方法，其中所述珠是磁珠。
86.81的方法，其中所述将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离是通过对混合细胞群施加外力而进行。
87.81的方法，其中所述外力由磁场提供。
88.88的方法，其中所述混合细胞群包含靶表型。
89.88的方法，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
90.88的方法，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
91.88的方法，其中所述靶表型是心肌细胞。
92.一种使混合细胞群中表达由未分化细胞表达的一种或多种分子的细胞数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与上皮细胞特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将a)中与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中移除，从而减少混合细胞群中未分化细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
93.92的方法，其中所述配体是抗体。
94.92的方法，其中所述抗体与EpCAM特异性结合。
95.92的方法，其中所述抗体与细胞角蛋白特异性结合。
96.92的方法，其中所述抗体连接到固体负载体上。
97.96的方法，其中所述固体负载体是珠。
98.97的方法，其中所述珠是磁珠。
99.92的方法，其中所述将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离是通过对混合细胞群施加外力而进行。
100.99的方法，其中所述外力由磁场提供。
101.92的方法，其中所述混合细胞群包含靶表型。
102.101的方法，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
103.101的方法，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
104.101的方法，其中所述靶表型是心肌细胞。
105.92的方法，其中所述由未分化细胞表达的分子是TRA-1-60。
106.一种使混合细胞群中表达由未分化细胞表达的一种或多种分子的细胞数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与EpCAM配体结合的细胞从剩余混合细胞群中移除，从而减少混合细胞群中未分化细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
107.106的方法，其中所述由未分细胞表达的分子是TRA-1-60。
108.106的方法，其中所述与EpCAM结合的配体是抗体。
109.108的方法，其中所述EpCAM抗体连接到固体负载体上。
110.108的方法，其中所述固体负载体是珠。
111.110的方法，其中所述珠是磁珠。
112.106的方法，其中所述将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离是通过对混合细胞群施加外力而进行。
113.112的方法，其中所述外力由磁场提供。
114.106的方法，其中所述混合细胞群包含靶表型。
115.114的方法，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
116.114的方法，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
117.114的方法，其中所述靶表型是心肌细胞。
118.一种使混合细胞群中表达由未分化细胞表达的一种或多种分子的细胞数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与EpCAM特异性结合的一种或多种配体以及与TRA-1-60特异性结合的一种或多种配体接触和b)将与配体结合的细胞从剩余混合细胞群中移除，从而减少混合细胞群中未分化细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
119.118的方法，其中所述与EpCAM结合的配体是抗体。
120.119的方法，其中所述与EpCAM结合的配体连接到固体负载体上。
121.120的方法，其中所述固体负载体是珠。
122.121的方法，其中所述珠是磁珠。
123.118的方法，其中所述与TRA-1-60结合的配体是抗体。
124.118的方法，其中所述抗体是IgG。
125.118的方法，其中所述抗体是IgM。
126.118的方法，其中所述与TRA-1-60结合的配体连接到固体负载体上。
127.126的方法，其中所述固体负载体是珠。
128.127的方法，其中所述珠是磁珠。
129.118的方法，其中所述将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离是通过对混合细胞群施加外力而进行。
130.129的方法，其中所述外力由磁场提供。
131.118的方法，其中所述混合细胞群包含靶表型。
132.131的方法，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
133.131的方法，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
134.131的方法，其中所述靶表型是心肌细胞。
135.一种获得包含pPS细胞体外分化的子代细胞且基本不含外来表型细胞类型的细胞群的方法，包括：a)获得包含pPS细胞体外分化的子代细胞的细胞群；b)使a)中的细胞群和与上皮细胞结合的一种或多种配体接触和c)将b)中与配体结合的细胞移除，从而获得基本不含外来表型细胞的细胞群。
136.135的方法，其中所述与上皮细胞结合的配体是EpCAM。
137.135的方法，其中所述与EpCAM结合的配体是抗体。
138.135的方法，其中所述与EpCAM结合的配体连接到固体负载体上。
139.138的方法，其中所述固体负载体是珠。
140.139的方法，其中所述珠是磁珠。
141.135的方法，其中所述将与配体结合的外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离是通过对混合细胞群施加外力而进行。
142.141的方法，其中所述外力由磁场提供。
143.135的方法，其中所述混合细胞群包含靶表型。
144.143的方法，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
145.143的方法，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
145.143的方法，其中所述靶表型是心肌细胞。
146.经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达上皮细胞上一种分子的至少一种细胞。
147.146的混合细胞群，其中所述表达上皮细胞上一种分子的至少一种细胞表达EpCAM。
148.143的混合细胞群，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
149.146的混合细胞群，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
150.146的混合细胞群，其中所述靶表型是心肌细胞。
151.经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达上皮细胞上一种分子的至少一种细胞和表达未分化多能干细胞上一种分子的至少一种细胞。
152.151的混合细胞群，其中所述表达上皮细胞上一种分子的至少一种细胞表达EpCAM。
153.151的混合细胞群，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
154.151的混合细胞群，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
155.151的混合细胞群，其中所述靶表型是心肌细胞。
156.151的混合细胞群，其中所述表达未分化多能干细胞上一种分子的至少一种细胞表达TRA-1-60。
157.经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达EpCAM的至少一种细胞。
158.157的混合细胞群，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
159.157的混合细胞群，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
160.157的混合细胞群，其中所述靶表型是心肌细胞。
161.经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达细胞角蛋白的至少一种细胞。
162.161的混合细胞群，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
163.161的混合细胞群，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
164.161的混合细胞群，其中所述靶表型是心肌细胞。
165.161的混合细胞群，其中所述表达细胞角蛋白的至少一种细胞还表达EpCAM。
166.经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达细胞角蛋白的至少一种细胞以及表达未分化细胞上一种分子的至少一种细胞。
165.166的混合细胞群，其中所述表达细胞角蛋白的至少一种细胞还表达EpCAM。
167.166的混合细胞群，其中所述表达未分化细胞上一种分子的至少一种细胞表达TRA-1-60。
168.166的混合细胞群，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
169.166的混合细胞群，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
170.166的混合细胞群，其中所述靶表型是心肌细胞。
171经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达EpCAM的至少一种细胞以及表达TRA-1-60的至少一种细胞。
172.171的混合细胞群，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
173.171的混合细胞群，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
174.171的混合细胞群，其中所述靶表型是心肌细胞。
175.经靶表型富集的混合细胞群，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞并且其中所述混合细胞群已经去除了表达细胞角蛋白的至少一种细胞以及表达TRA-1-60的至少一种细胞。
176.175的混合细胞群，其中所述表达细胞角蛋白的至少一种细胞还表达EpCAM。
177.175的混合细胞群，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
178.175的混合细胞群，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
179.175的混合细胞群，其中所述靶表型是心肌细胞。
181.从混合细胞群中去除具有外来表型的细胞的试剂盒，其包括a)上皮细胞上所表达一种或多种分子的配体；b)未分化细胞上所表达一种或多种分子的配体；和c)一个或者多个容器，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
182.从混合细胞群中去除具有外来表型的细胞的试剂盒，其包括EpCAM的配体、TRA-1-60的配体和一个或者多个容器，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
在下列实施例中，利用公众可获得的已构建hES细胞系进行利用人胚胎干细胞(hES)的所有实验。
实施例
实施例1：由灵长类动物多能干细胞体外分化的少突胶质细胞中上皮细胞标志物与外来表型相关
利用Qiagen RNAEasy试剂盒(Qiagen，Valencia CA)根据厂商说明从由人胚胎干细胞体外分化的少突胶质细胞祖细胞中提取总RNA。使用每个含有7.5×106个少突胶质细胞祖细胞的小瓶。这些小瓶来源于体内产生大量上皮细胞簇结构(CES)的3个组和体内CES水平较低的3个组。利用Agilent生物分析仪(Agilent，Santa Clara，CA)证实RNA的完整性，所使用的所有样品均具有9.8以上的RNA完整性指数(RIN)。利用3’IVTExpress试剂盒(Affymetrix，Santa Clara，CA)根据厂商说明由RNA产生cDNA。利用Affymetrix U133+2.0基因组阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA)根据厂商说明对这些cDNA样品进行微阵列分析。该阵列是一种综合性人类基因组表达阵列，其包含多于54,000个探针组。对这些高水平CES组和低水平CES组之间表达差异大于2倍的基因进行进一步检测。表1显示GRNOPC1组中上皮细胞标志物的表达增加与CES表达增加相关。
表1
Figure BDA0000131284980000651
实施例2：鉴定大鼠脊髓中的上皮结构
施用了由hES细胞体外分化的人少突胶质细胞祖细胞的大鼠几乎不会产生上皮细胞簇结构。图1显示用苏木精和署红染色的上皮细胞簇结构。基于其形态，该结构被鉴定为上皮细胞。
为了进一步表征这些上皮细胞簇结构，利用广谱细胞角蛋白抗体或者EpCAM抗体进行免疫组化(IHC)。广谱细胞角蛋白抗体(Millipore，Billerica，MA)是两种抗体的混合物：抗AE1抗体和抗AE3抗体。AE1抗体识别角蛋白CK10、CK14、CK15和CK16以及角蛋白CK19。AE3抗体识别角蛋白CK1、CK2、CK3、CK4、CK5和CK6以及角蛋白CK7和CK8。角蛋白CK10表达于鳞状角质化皮肤和一些内脏细胞中。角蛋白CK19表达于分泌型上皮细胞、大部分腺体、假复层上皮细胞、分泌型内脏和呼吸道上皮细胞中。角蛋白CK8通常与角蛋白CK18共表达，其存在于大部分腺体、分泌型内脏和大部分分泌型上皮细胞中。
所使用的EpCAM抗体是Ber-Ep4(Invitrogen，Carlsbad，CA)。EpCAM在大部分上皮组织和上皮谱系细胞的基底外侧膜中表达。其在鳞状上皮细胞中不表达。其可以在细胞增殖过程中瞬时表达。
利用标记上皮细胞的广谱细胞角蛋白抗血清通过IHC对切片进行检测。利用二甲苯和浓度依次降低的一系列乙醇使切片脱蜡。抗原修复预处理包括使切片与DPBS中的4％胃蛋白酶于37℃孵育30分钟，接着冷却至室温。在DPBS中漂洗切片，并与封闭缓冲液(DPBS中的0.3％TritonX-100、10％正常山羊血清、1％胎牛血清、3％H2O2)于室温孵育1小时，随后与以1∶400稀释的抗广谱细胞角蛋白第一抗血清(产品目录#mAB 3412clone AE1/AE3)(Millipore，Billerica，MA)于室温孵育24小时。清洗切片，并与以1∶500稀释的生物素化第二抗体(产品目录#BA-1000)(VectorLaboratories，Burlingame，CA)于室温孵育1小时，清洗并与在DPBS中以1∶1000稀释的抗生物素蛋白链菌素-HRP(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories)于室温孵育1小时。使用Ni-DAB(Vector Laboratories)进行HRP显像。使切片通过浓度依次增加的一系列乙醇脱水，在二甲苯中脱脂，并利用PermountTM(Fisher Scientific，Hampton，NH)封片。在光学显微镜下对切片进行检测。
利用标记上皮细胞的EpCAM抗血清通过IHC对切片进行检测。利用二甲苯和浓度依次降低的一系列乙醇使切片脱蜡。抗原修复预处理包括使切片与DPBS中的4％胃蛋白酶于37℃孵育30分钟，接着冷却至室温。在DPBS中漂洗切片，并与封闭缓冲液(DPBS中的0.3％Triton X-100、10％正常山羊血清、1％胎牛血清、3％H2O2)于室温孵育1小时，随后与以1∶100稀释的抗EpCAM第一抗血清(Ber-EP4；产品目录#mAB84 clone；Dako；Carpinteria，CA)于室温孵育24小时。清洗切片，并与以1∶500稀释的生物素化第二抗体(产品目录#BA-1000)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)于室温孵育1小时，清洗并与在DPBS中以1∶1000稀释的抗生物素蛋白链菌素-HRP(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories)于室温孵育1小时。使用Ni-DAB(Vector Laboratories)进行HRP显像。使切片通过浓度依次增加的一系列乙醇脱水，在二甲苯中脱脂，并利用PermountTM(Fisher Scientific，Hampton，NH)封片。在光学显微镜下对切片进行检测。
图2显示所有均标记广谱细胞角蛋白的人组织阵列(含有肝脏、小肠、脾、胃、结肠和皮肤细胞)。图2的右侧显示也标记广谱细胞角蛋白的小鼠肌内畸胎瘤(以SKID/bg小鼠表示)。图3显示用EpCAM抗体得到的类似结果。
图4显示广谱细胞角蛋白标记为阳性的3只不同动物中的上皮细胞簇结构。所显示的放大倍数是24×(上图)和400×(下图)。图5显示用EpCAM抗体标记的一只动物中的上皮细胞簇结构。所显示的放大倍数是24×(上面左图)和400×(下图)。图6显示标记广谱细胞角蛋白和EpCam的一只动物中的上皮细胞簇结构。所显示的放大倍数是24×(上图)和400×(下图)。图7显示标记广谱细胞角蛋白但不标记EpCAM的一只动物中的上皮细胞簇结构。所显示的放大倍数是24×(上图)和400×(下图)。图8显示既不标记广谱细胞角蛋白也不标记EpCAM的一只动物中的上皮细胞簇结构。所显示的放大倍数是24×(上图)和400×(下图)。
实施例3：包含少突胶质细胞的混合细胞群的特征
如上面和第7,285,415号美国专利中所描述，使hES细胞分化成为少突胶质细胞和少突胶质细胞前体。产生两个不同的组(M07D1A和2008-05A-ms)。利用下列上皮细胞标志物：与ALexa fluor 647(Invitrogen，Carlsbad，CA)偶联的EpCAM(BER-Ep4克隆)以及与灵长类动物未分化的多能干细胞相关的标志物TRA-1-60(Invitrogen，Carlsbad，CA)的抗体，通过流式细胞术对两个制备品中的细胞进行表征。用于TRA-1-60的第二抗体是与Alexa Fluor
Figure BDA0000131284980000671
(Invitrogen，Carlsbad，CA)偶联的抗小鼠IgM A488。
简单地讲，每100μL反应体积标记5×105个细胞。对于第一抗体，每个标记使用500ng。细胞于冰上孵育15分钟，接着用染色缓冲液(0.5％的人血清白蛋白，PBS)清洗2次。第二抗体以1∶400稀释，并在冰上标记15分钟。细胞用染色缓冲液清洗2次，接着重悬于碘化丙啶染色缓冲液(通过将10μL 1.0mg/ml的碘化丙啶贮存液加入到2ml染色缓冲液中，使碘化丙啶终浓度为5μg/mL而制备)中。利用带有细胞过滤网的FACS管(BDBioscience，San Jose，CA)对细胞进行过滤。以碘化丙啶对前向角散射对细胞进行设门，接着以前向角散射对侧向角散射再次设门。在这些门中，收集到20,000个event。结果显示于图9中，其显示细胞群中小比例的细胞表达广谱细胞角蛋白(两个组均表达)和EpCAM(左图)。表达EpCAM的大部分细胞也标记广谱细胞角蛋白。双阳性细胞非常明显。
实施例4：EpCAM抗体成功地将EpCAM+细胞从混合细胞群中移除
在本实验中，将EpCAM阴性细胞系(人胚肾293细胞)加入到EpCAM阳性细胞系(人腺癌细胞系SW480)中，以产生含有10％EpCAM+的混合细胞群。用与Dynal磁珠(CELLection Epithelial Enrich Bead)(Invitrogen，Carlsbad，CA)偶联的BER-Ep4EpCAM抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)对细胞进行标记，并利用Dynal CELLection试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据下面的步骤将细胞分离。
将Dynabeads(Invitrogen，Carlsbad，CA)重悬于小瓶中。将50μL/2×107个细胞的Dynabeads转移至15mL管中。将等体积或者至少1mL Buffer 1(PBS/0.1％人血清白蛋白)加入到管中并混合。将管在磁体中放置1分钟，并弃掉上清液。使管从磁体中移出并进行清洗。将Dynabeads重悬于体积与初始Dynabeads体积相等的Buffer1中。
为了制备样品，将2×107/mL细胞重悬于冰冷的Buffer 2(PBS/0.1％人血清白蛋白/2mM EDTA)中。为了使EpCAM+细胞富集，将50μL Dynabeads加入到1mL所制备的样品中，接着在设定为温和旋转的MACS混合细胞群(Invitrogen，Carlsbad，CA)中于2-8℃孵育30分钟。将管在磁体中放置2分钟。含有已去除EpCAM的细胞的上清液储存于冰上。
在预热的(37℃)Buffer 3(RPMI/0.1％HSA/1mM CaCL2/4mM MgCl2)中将与珠结合的EpCAM+细胞清洗3次(每次清洗5mL)并放置于磁体中。将所有清洗液集中于单个管中。将细胞重悬于200μL(每2×107个细胞)预热的(37℃)Buffer 3中。为了使EpCAM+细胞从珠上释放，将4μL释放缓冲液(DNAse)(试剂盒中提供)(Invitrogen，Carlsbad，CA)加入到管中。管在设定为温和旋转的MACS混合细胞群(Invitrogen，Carlsbad，CA)中于室温孵育15分钟。用1mL移液管将管中的内含物剧烈吹打至少5-10次，接着在磁体中放置2分钟。将含有已释放的细胞的上清液转移至预先覆盖RPMI培养基的15mL管中。将样品集中。将珠重悬于Buffer 3(200μL)中，并再次剧烈吹打珠，返回磁体中放置2分钟。上清液含有未结合的EpCAM+细胞。
利用实施例3中描述的步骤使细胞级分标记EpCAM。使用EpCAM抗体的同种型对照(小鼠IgG1)(eBioscience，San Diego，CA)。结果显示于图10中。该数据显示能够成功地将EpCAM+细胞从混合细胞群中去除(参见图9下面第3幅和第4幅图)。EpCAM阴性细胞的回收效率计算为93％。EpCAM阳性细胞的回收效率计算为9％。
实施例5：去除EpCAM+细胞的同时去除广谱细胞角蛋白+细胞和TRA-1-60细胞
在本实验中，将抗EpCAM Dynabeads(Invitrogen，Carlsbad，CA)重悬于小瓶中，并将每个表达EpCAM的靶细胞25个珠转移至15mL管中(假设为靶细胞群的5％-选择5％作为细胞群中EpCAM+细胞数量的估测值。5％高于之前在由hES细胞体外分化的少突胶质细胞祖细胞群中所看到的上限值)。将等体积或者至少1mL Buffer 1(PBS/0.1％人血清白蛋白)加入到管中并混合，以使用前对珠进行清洗。将管在磁体中放置1分钟，并弃掉上清液。使管从磁体中移出并进行清洗。将Dynabeads重悬于体积与初始Dynabeads体积相等的Buffer 1中。
为了制备样品，将2×107/mL细胞(包含hES细胞体外分化的少突胶质细胞祖细胞的混合细胞群)重悬于冰冷的Buffer 2(PBS/0.1％人血清白蛋白/2mM EDTA)中。为了去除EpCAM+细胞，将Dynabeads加入到所制备的样品中，接着在设定为温和旋转的MACS混合细胞群(Invitrogen，Carlsbad，CA)中于2-8℃孵育30分钟。将管在磁体中放置2分钟。含有已去除EpCAM的细胞的上清液储存于冰上。
利用实施例3中描述的步骤使细胞级分标记EpCAM、TRA-1-60和PCK。使用抗体的同种型对照(小鼠IgG1，小鼠IgM)(Bioscience，San Diego，CA)。结果显示于图11中。该数据显示能够成功地将EpCAM+细胞从混合细胞群中去除(参见图11下面第3幅和第4幅图)。EpCAM阴性细胞的回收效率计算为96％。此外，EpCAM的去除使得TRA-1-60+和PCK+细胞群的百分比均减少。
实施例6：去除EpCAM/TRA-1-60的人少突胶质细胞祖细胞在大鼠脊髓中形成较少的上皮结构
本实验利用大鼠作为动物模型研究了去除外来表型对体内形成上皮细胞簇的作用。特别选择预期产生大量上皮细胞簇结构的人少突胶质细胞祖细胞lots of进行本研究。胸部脊髓挫伤的两组大鼠接受脊髓内注射已经去除或者未去除EpCAM+/TRA-1-60+细胞的人少突胶质细胞祖细胞。6个月后，对动物进行灌注，并取出脊髓，在纵断面上切片。用苏木精和曙红对从损伤区域头端延伸大约1cm和尾端延伸大约1cm的脊髓组织进行染色，并检测上皮细胞簇结构。结果显示于表2中。
表2：去除EpCAM+/TRA-1-60+细胞后形成上皮细胞的频率
Figure BDA0000131284980000701
本领域技术人员将清楚的是，可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行多种修饰和改变。本文中描述的特定实施方案仅以示例方式提供，并不意味着以任何方式限定本发明。说明书和实施例被认为是仅示例性的，下列权利要求说明本发明的真实范围和精神。

Claims (18)

1.一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使所述混合细胞群和与所述外来表型细胞特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将与所述配体结合的所述外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离，从而从所述混合细胞群中减少所述外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，所述pPS细胞包括所述外来表型细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中所述外来表型细胞是上皮细胞。
3.权利要求2所述的方法，其中所述上皮细胞表达细胞角蛋白。
4.权利要求2所述的方法，其中所述上皮细胞表达EpCAM。
5.权利要求4所述的方法，其中所述表达EpCAM的一种或多种细胞还表达TRA-1-60。
6.权利要求1所述的方法，其中所述配体是抗体。
7.权利要求6所述的方法，其中所述抗体与EpCAM特异性结合。
8.权利要求1所述的方法，其中所述配体结合固体负载体。
9.权利要求8所述的方法，其中所述固体负载体是珠。
10.权利要求9所述的方法，其中所述珠是磁珠。
11.权利要求1所述的方法，其中所述将与所述配体结合的所述外来表型细胞从剩余混合细胞群中分离是通过对所述混合细胞群施加外力而进行。
12.权利要求11所述的方法，其中所述外力由磁场提供。
13.权利要求1所述的方法，其中所述混合细胞群包含靶表型。
14.权利要求13所述的方法，其中所述靶表型选自少突胶质细胞、心肌细胞、胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、成骨细胞和软骨细胞。
15.权利要求14所述的方法，其中所述靶表型是少突胶质细胞。
16.权利要求14所述的方法，其中所述靶表型是心肌细胞。
17.一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使所述混合细胞群和与由上皮细胞表达的一种或多种标记物特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将a)中与所述配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而从所述混合细胞群中减少外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞，所述pPS细胞包括所述外来表型细胞。
18.一种使混合细胞群中外来表型细胞的数量减少的方法，包括：a)使混合细胞群和与上皮细胞特异性结合的一种或多种配体接触，并且使所述混合细胞群和与未分化的pPS细胞特异性结合的一种或多种配体接触；和b)将与所述配体结合的细胞从剩余混合细胞群中分离，从而从所述混合细胞群中减少外来表型细胞的数量，其中所述混合细胞群包含pPS细胞体外分化的子代细胞。
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