KR20210133988A - 동종 요법을 위한 개선된 줄기세포 집단 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동종 줄기세포 요법, 특히 감작된 환자의 치료 및 재치료를 위한 개선된 줄기세포 집단에 관한 것이다. 또한, 상기 줄기세포 집단을 얻는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 상기 줄기세포 집단을 포함하는 약학적 조성물 및 동종 줄기세포 요법에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

동종 요법을 위한 개선된 줄기세포 집단

본 발명은 동종 줄기세포 요법, 특히 감작된 환자의 치료 및 재치료를 위한 개선된 줄기세포 집단에 관한 것이다. 추가로, 상기 줄기세포 집단을 얻는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 상기 줄기세포 집단을 포함하는 약학적 조성물 및 동종 줄기세포 요법에서의 그들의 용도에 관한 것이다.

연구 및 의료 응용 분야에 사용하기 위한 줄기세포는 배아, 태아 또는 성체 조직에서 유래할 수 있으며 배아 줄기세포(ESC), 탯줄 줄기세포, 유도 만능 줄기세포(iPSC) 및 다양한 출처의 성체 줄기세포를 포함한다. 누공, 백혈병, 림프종, 신경퇴행성 질환, 뇌 및 척수 손상, 심장 질환, 실명 및 시력 장애, 췌장 베타 세포 기능 상실, 연골 복구, 골관절염, 근골격계 질환, 상처, 불임, 자가면역 질환 및 염증성 장질환과 같은 염증성 질환의 치료에 대해 현재 수많은 임상 시험이 진행 중이거나 성공적으로 종료되었다. 다른 유형의 줄기세포에 대한 현재 의료 응용의 개요는 문헌(Mahla RS, International Journal of Cell Biology. 2016 (7): 1-24)에서 찾을 수 있다.

중간엽 줄기세포(MSC)는 조골세포, 연골세포, 근세포 및 지방세포를 포함한 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 기질 세포이다.

다양한 상태를 치료하기 위한 자가(autologous) 및 동종(allogeneic) MSC의 사용은, 손상된 위장관, 패혈증 및 이식편대숙주병(graft versus host disease)뿐만 아니라 여러 자가면역 및 염증성 질환의 치료에 촛점을 둔 것들을 포함하는 여러 임상 시험(Galipeau and Sensebe, (2018), Cell Stem Cell 22, 824-833, in particular Table S1)에 걸쳐 평가되어 왔다.

성체 MSC는 거의 모든 조직에서 발견될 수 있으며 주로 혈관주위 틈새에 위치한다. 대다수의 임상 시험이 골수 MSC(BM-MSC)를 사용하여 수행되었지만, 지방 조직과 같은 다른 출처의 MSC를 사용하는 시험이 증가하고 있다. BM-MSC와 지방유래 중간엽 줄기세포(ASC)는 유사한 효능과 복제 비율을 공유한다. 그러나 ASC는 더 쉽게 수확되고 배양용 샘플이 풍부(BM 조직에 비해 1g의 지방 조직에 100배 더 풍부)하다는 이점을 제공한다.

표준 면역학 교리는 외부 조직이 유기체에서 면역 반응을 유발할 것이라고 주장한다. 이 개념은 공격적인 면역 억제가 거부 반응으로부터 동종이식편(allografts)을 보호하는 표준인 고형 장기 및 조혈 이식에서 분명하다. 이식 거부 반응에서 항체의 역할에 대한 가장 강력한 증거는 신장 및 심장과 같이 주로 혈관이 있는 기관의 초급성 거부 반응이다. 이러한 반응을 보이는 수용자에게서 높은 역가의 항기증자(antidonor) 항체가 나타날 수 있다. 이 항체는 내피 세포 상의 HLA 항원과 결합하여 후속적인 보체 고정 및 다형핵(polymorphonuclear) 세포의 축적과 함께 한다. 그 다음 내피 손상은 아마도 다형핵 백혈구에서 방출된 효소의 결과로 발생하고; 그 다음 혈소판이 축적되고 혈전이 발생하며 그 결과 신장 피질 괴사 또는 심근 경색이 발생한다. 이러한 항-HLA-항체 매개된 반응을 피하기 위해 임상 장기 및 조직 이식에서 HLA 타이핑을 수행하여 이식 거부를 피하기 위해 가능한 한 기증자와 수용자가 가깝도록 한다.

세포 기반 치료 분야가 발전함에 따라 다양한 세포 유형(중간엽 줄기세포(MSC)가 프로토타입 임)이 면역 체계를 회피 및/또는 억제하는 능력을 가질 수 있어서 일부 연구에서 MSC가 동시 면역 억제 없이 적용되었음이 명백해졌다.

그리핀 등(Griffin et al., Immunol. & Cell Biol. (2012), 1-12)은 동종-MSC(allo-MSC)의 "면역 특권" 상태를 뒷받침하는 좋은 생체 내 증거가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 실험 데이터를 검토했다. 그들은 염증 자극에 의한 활성화 또는 분화 후 동종-MSC의 면역원성에 관한 출판된 연구를 고려했다. 저자들은 이러한 연구의 대부분이, 기증자 특이적 내성의 명백한 촉진에 대한 후속 동종 이식의 가속화된 거부를 갖는 조작되지 않은 IFN-γ 활성화 및 분화된 동종-MSC의 투여 후, 기증자 항원에 대한 특정 세포(T-세포) 및 체액(B-세포/항체) 면역 반응을 문서화했다고 요약한다. 이러한 연구 중 일부에서 이식 또는 투여된 MSC(Griffin 등의 표 1 및 2 참조)의 가속화된 거부가 관찰되었다. 저자들은 동종-MSCs의 면역 특권적 성질의 개념을 재고하고 동종-MSCs에 의해 유발된 항-기증자 면역 반응의 범위와 임상적 의미를 보다 정확하게 연구할 것을 권장한다. 결과적으로, 항-기증자 면역 반응은 동종-MSC의 개선된 제거 및/또는 인간 및 동물의 동종 요법에서 부작용으로 인하여 효능에 영향을 미칠 수 있다.

그 관점에서, 환자의 동종(allogeneic) 요법에 적합한 수단이 필요하며, 여기서 수단은 감작된 환자에 대한 동종 요법 및/또는 재치료에서 감소된 면역원성 및/또는 증가된 적합성을 나타낸다. 게다가, 그들을 획득하는 방법뿐만 아니라그들의 의학적 용도도 또한 제공되어야 한다.

본 발명의 기초가 되는 기술적 문제는 청구범위에 정의된 주제의 제공에 의해 해결된다

제1 측면에 따르면, 하기 단계를 포함하는, 동종 요법, 특히 감작된 환자의 치료 또는 동종 요법에 의한 환자의 재치료에 적합한 줄기세포(SC) 집단을 선택하기 위한 시험관 내 방법이 제공된다:

a) SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도의 존재 하에서 SC 집단의 샘플(시험 샘플)을 배양하고, IFN-γ의 부존재 하에서 SC 집단의 샘플(대조 샘플)을 별도로 배양하는 단계;

b) HLA-클래스 I 항체가 시험 샘플 및 대조 샘플에서 발현된 HLA-클래스 I에 결합하도록 하는 조건 하에서, 시험 샘플 및 대조 샘플을 상이한 농도 범위의 HLA-클래스 I 항체와 접촉시키는 단계;

c) 결합된 HLA-클래스 I 항체가 보체로 포화되고 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity; CDC)이 유도되도록 시험 샘플 및 대조 샘플에 보체를 첨가하는 단계;

d) 시험 샘플 및 대조 샘플에서 유도된 세포 용해를 측정하여 HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도 범위에 대한 CDC를 결정하는 단계;

e) 시험 샘플 및 대조 샘플에서 최대 CDC의 50%를 유도하는 HLA-클래스 I 항체의 농도(EC₅₀ 값)를 결정하는 단계; 및

f1) 대조 샘플의 EC₅₀ 값 대 시험 샘플의 EC₅₀ 값의 비가 1.25 미만, 바람직하게는 1.0 미만, 더 바람직하게는 0.5 미만, 특히 바람직하게는 0.25 미만인 경우 SC 집단을 동종 요법을 위한 것으로 선택하는 단계; 또는

f2) 시험 샘플의 EC₅₀ 값이 적어도 3.5 ng/ml, 바람직하게는 적어도 9 ng/ml, 더 바람직하게는 적어도 15 ng/ml, 특히 바람직하게는 적어도 20 ng/ml의 HLA-클래스 I 항체인 경우 SC 집단을 동종 요법을 위한 것으로 선택하는 단계.

제2 측면에 따르면, 하기 특성 중 임의의 것을 갖는, 동종 요법, 특히 감작된 환자의 치료 또는 동종 요법에 의한 재치료에 적합한 SC 집단이 제공된다:

i) 대조 샘플의 EC₅₀ 값 대 시험 샘플의 EC₅₀ 값의 비율이 1.25 미만, 바람직하게는 1.0 미만, 더 바람직하게는 0.5 미만, 그리고 특히 바람직하게는 0.25 미만임, 여기서 EC₅₀ 값은 본 발명에 따른 방법에 기재된 바와 같이 결정됨;

ii) 시험 샘플의 EC₅₀ 값이 적어도 3.5 ng/ml HLA-클래스 I 항체, 바람직하게는 적어도 9 ng/ml, 더 바람직하게는 적어도 15 ng/ml, 특히 바람직하게는 적어도 20 ng/ml HLA-클래스 I 항체임, 여기서 EC₅₀ 값은 본 발명에 따른 방법에 기재된 바와 같이 결정됨; 및/또는

iii) 시험 샘플에서의 CD46 발현 대 대조 샘플에서의 CD46 발현의 비율이 2.0 초과, 바람직하게는 2.5 초과, 특히 바람직하게는 3.0 초과이고, 여기서 CD46 발현은 본 발명에 따른 방법에 기재된 바와 같이 결정됨.

제3 측면에 따르면, 본 발명에 따른 SC 집단 및 임의의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

제4 측면에 따르면, 다음 단계를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법이 제공된다:

a) 본 발명에 따른 방법을 수행하는 단계;

b) 선택된 SC 집단을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화하는 단계.

제5 측면에 따르면, 이를 필요로 하는 환자, 바람직하게는 감작된 환자 또는 재치료를 받는 환자에서 동종 줄기세포 요법에서 본 발명에 따른 SC 집단의 용도가 제공된다.

제6 측면에 따르면, 본 발명에 따른 SC 집단을 이를 필요로 하는 환자, 바람직하게는 감작된 환자 또는 재치료를 받고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 동종 줄기세포 치료 방법이 제공된다.

본 발명자들은 ASC 집단이 크론병 및 치료 불응성 배액 복합 항문주위 누공(treatment-refractory, draining complex perianal fistulas)을 앓고 있는 환자에게 투여될 때 동종-감작(allo-sensitization)이 일어나는지 여부를 조사하였으며, 여기서 ASC 집단은 동종(allogeneic), 비-HLA-일치된(non-HLA-matched) 수용자에게 병변내(intra-lesionally) 투여된다. 시간 0에서 오직 4명의 환자만이 HLA-Cl클래스 I 분자에 대한 항체 반응성을 보인 반면, 22명의 환자는 치료 12주 후에 이 항체 반응성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 대조군에서는 6명의 환자(시간 0)로부터 12주 후에 9명의 환자로의 반응성 증가만이 관찰되었다. 그 후, 다른 기증자의 ASC 세포 집단을 조사했다. 감작된 환자 및 항-HLA 클래스 I 반응성을 발전시킨 환자의 혈장 샘플은 상이한 기증자들로부터의 IFN-γ 유도된 ASC 집단에서 그들의 결합 행동 및 그들의 보체-의존성 세포독성(CDC)을 유도하는 능력이 현저히 다르다는 것이 발견되었다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 추가로 상이한 기증자들로부터의 SC 집단이 그들의 HLA-클래스 I 결합 및 고전적 보체 경로(항체/보체 복합체 형성)의 활성화로 인한 세포 용해에 대한 감수성에 있어서 현저히 다르다는 것을 결정하였고, 여기서 시험관 내 동종반응성(alloreactivity)에 대해 더 저항성이 있는 SC 집단이 동종 요법의 목적을 위해서는 바람직하다. 이는 특히 환자가 HLA-클래스 I 항원에 감작된(presensitized), 예컨대 조기 임신에 의한 상황, 또는 동일한 기증자 SC 집단이 동일한 환자에게 여러 번 투여되는 재치료의 경우에 적용된다. 본 발명자들은 동종반응성에 대한 증가된 저항성이 CD46 발현에 의해 매개되고 ASC 세포에서 CD46 발현의 억제가 향상된 CDC 민감성과 상관관계가 있다는 것을 추가로 결정하였다.

도 1은 ADMIRE CD1에서 DSA 생성의 특성을 보여준다. A. 표시된 방문에 대한 랩스크린 혼합/랩스크린 단일 항원(Labscreen Mixed/ Labscreen Single Antigen; LSM/LSA)의 분포 결과 (Tait et al. (2013), Transplantation 95: 19-47): 치료 전(기준선), 두 위약에서 12주차 및 52주차(하위 차트) 및 Cx601(상단 차트) 연구 부문. 총 5명(Cx601 부문) 및 12명(위약 부문) 환자가 연구에서 탈퇴했으며, 따라서 이용 가능한 LSM/LSA 데이터가 없었다. B. 표시된 시점에서 LSM 분석으로 측정된 각 마이크로스피어로부터의 평균 형광 강도의 합(ΣMFI)으로 표시되는 항-HLA Abs 역가를 나타내는 동역학 곡선. 각 그래프의 점선은 양성 판정에 사용되는 MFI > 3,000 임계값을 나타낸다. 오른쪽 상단 패널의 원은 환자 92(Pat92)를 나타낸다. C. 각 환자와 ASCs 간의 HLA 비호환성을 나타내는 그래프. 비호환성의 상관관계를 위해 DSA를 생성한 개인의 백분율을, 불일치 eplet(좌위에서 발견되는 공유되지 않은 고유한 다형성 잔기 사슬)의 수(범위)에 대해 플롯팅했다(Duquesnoy (2002) Hum. Immunol. 63: 339-352). 선형 회귀의 경우 피어슨(Pearson) 테스트(r²)가 적용되었다. P 값은 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었다.
도 2는 ASC에서의 HLA 발현 및 시험관 내 항-HLA Ab 결합을 나타낸다. A. 미처리(검은색 원) 및 IFNγ(흰색 사각형) ASC로 사전 활성화된 클래스 I HLA(W6/32) Ab 및 클래스 II HLA(L243) Ab의 각 농도와 MFI 증가 간의 상관 관계를 보여주는 그래프. B. 음성 대조군(아이소타입), 양성 대조군(과다-면역화된 샘플, HI 풀) 및 환자 92(Pat92, 새로운(de novo) DSA를 생성한 나이브 환자) 혈청을 나타내는 FcTox(유세포 분석법에 의한 보체-의존성 세포독성)의 플롯. 왼쪽 하단 패널은 이소타입 대조군(밝은 회색), 과-면역화된 혈청(짙은 회색) 또는 Pat92 혈청(중간-어두운 회색)을 사용한 FACS 결합 강도 정량화(총 IgG+ 세포 수)를 보여준다. 오른쪽 아래 패널은 대조군 조건(토끼 보체 없음, 밝은 회색) 과-면역된 혈청 또는 Pat92 혈청(중간-어두운 회색)에서 FACS 세포 사멸 정량화(7-AAD+ 세포의 총 수)를 보여준다. P 값은 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었고 r²는 피어슨 검정에 의해 결정되었다.
도 3은 ADMIRE CD1 혈장 샘플이 시험관 내 ASCs에서 낮은 세포독성 사멸을 유도한다는 것을 보여준다. A. 표시된 시점(치료 전 WO 및 치료 후 W12)에서 10명의 사전 감작된(상단 패널) 및 17명의 새로운(de novo) DSA+ 환자(하단 패널)에서 HLA-I 결합의 정규화된 백분율 값을 보여주는 그래프. 결합 분석 DonA(ADMIRE CD1 시험에서 투여된 기증자) 및 DonB에 앞서, ASCs는 정상(기준) 조건 또는 3ng/mL IFNγ의 존재 하에 48시간 동안 성장되었다. B. 표시된 시점에서 10명의 사전-감작된(상단 패널) 및 17명의 새로운(de novo) DSA+ 환자(하단 패널)에서 7-AAD 양성 ASC의 정규화된 백분율 값을 보여주는 그래프. P 값은 스튜던트 T-검정에 의해 결정되었다.
도 4는 ASC가 높은 수준의 mCRP를 발현한다는 것을 보여준다. A. FACS 분석을 통해 7명의 ASC 기증자(검은색 막대)와 1명의 BM-MSC 기증자(흰색 막대)에서 CD46, CD55 및 CD59의 MFI 값을 보여주는 그래프. 세포를 48시간 동안 3ng/mL(IFNγ)의 존재 하에 성장시키거나 처리하지 않은 채로 두었다(기준). B. FACS 분석에 의해 결정된 7개의 ASC 기증자에서 CD46, CD55 및 CD59의 상이한 MFI 값들을 보여주는 그래프. 세포를 48시간 동안 3ng/mL IFNγ의 존재 하에 성장시키거나(IFNγ), 또는 처리하지 않은 채로 두었다(기준). C. 기준 조건(왼쪽 패널) 및 IFNγ와 함께(오른쪽 패널) 배양된 기증자 DonA, DonB, DonC, DonD, DonE, DonF 및 DonG에서 유래한 ASCs에 대한 항체 농도에 따른 항체 결합(상단 패널) 및 세포 사멸(하단 패널)을 보여주는 그래프. P-값은 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었다. 오른쪽 하단 패널에서 EC₅₀ 값을 결정할 수 있다.
도 5는 CD46이 ASCs에서 보체 세포독성을 매개한다는 것을 보여준다. A. W6/32 Ab의 증가된 농도 수준에 대한 7-AAD 양성 부모(parental) 및 CD46^KO DonB ASCs의 백분율을 보여주는 그래프. 분석 전에 부모(parental) 및 CD46^KO DonB ASC를 3ng/mL IFNγ의 존재 하에 48시간 동안 성장시키거나(IFNγ) 또는 처리하지 않은 채로 두었다(기준). B. W6/32 Ab의 농도에 대한 7-AAD 양성 부모(parental) 및 CD46^KO ASCs의 백분율을 표시하는 S자형 곡선(선형에서 log10으로 변환됨). P 값은 양방향 ANOVA 테스트에서 결정되었다.
도 6 A-B는 48시간 동안 3ng/mL IFNγ의 존재 하(흰색 사각형) 또는 기준 조건에서(검은 동그라미) 성장된 ASCs 기증자의 W6/32 (A) 및 CD46, CD55 및 CD59 (B)의 MFI 값의 상관관계와 관련이 있다. P 값은 선형 회귀에서 기울기 유의성을 보여준다. CD46 및 CD55(B)에 대한 IFNγ 조건에서 기울기의 유의성에 대한 R-제곱 값은 각각 0.74 및 0.71이었다. C. 부모(흰색 막대) 및 CD46^KO(검정색 및 회색 막대) ASCs에서 CD46 MFI 값을 보여주는 그래프. 분석 전에 부모 및 CD46^KO ASCs를 3ng/mL IFNγ와 함께 48시간 동안 성장시키거나(IFNγ) 또는 처리하지 않았다(기준). P 값은 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었다.

용어 "포함하다" 또는 "포함하는"이라는 용어가 본 설명 및 청구항에서 사용되는 경우, 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, "~로 이루어진"이라는 용어는 "~를 포함하는"이라는 용어의 선택적인 구현예로 간주된다. 이하에서 그룹이 적어도 특정 수의 구현예를 포함하는 것으로 정의된다면, 이것은 또한 선택적으로 오직 이들 구현예로만 이루어진 그룹을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.

예컨대 "하나(a)" 또는 "하나(an)", "그(the)"와 같이 단수 명사를 언급할 때 부정관사나 정관사가 사용되는 경우, 이는 특별히 언급되지 않는 한 해당 명사의 복수형을 포함한다. 반대로 명사의 복수형이 사용될 때 그것은 또한 단수형도 지칭하는 것이다.

또한, 설명 및 청구항에서 제1, 제2, 제3 또는 (a), (b), (c) 등의 용어는 유사한 요소를 구별하기 위해 사용되며 반드시 순차적 또는 연대기적 순서를 설명하기 위한 것은 아니다. 그렇게 사용된 용어는 적절한 상황에서 상호교환 가능하며, 여기에 설명된 본 발명의 구현예들은 여기에 설명되거나 기술된 것과 다른 순서로 작동할 수 있음을 이해해야 한다.

본 발명의 맥락에서, 표시된 임의의 수치 값은 전형적으로 당해 기술 분야의 통상의 기술자가 문제의 특징의 기술적 효과를 여전히 보장하기 위해 이해할 수 있는 정확도의 간격과 연관된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 표시된 수치 값으로부터의 편차는 ±10% 범위 내, 바람직하게는 ±5%의 범위 내에 있다. 표시된 수치 간격으로부터의 전술한 편차 ±10%, 및 바람직하게는 ±5%는 수치 값과 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "약" 및 "대략"으로도 표시된다.

제1 측면에 따르면, 하기 단계를 포함하는, 동종 요법, 특히 감작된 환자의 치료 또는 동종 요법에 의한 환자의 재치료에 적합한 줄기세포(SC) 집단을 선택하기 위한 시험관 내 방법이 제공된다:

a) 상기 SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도의 존재 하에 SC 집단의 샘플(시험 샘플)을 배양하고 IFN-γ의 부재 하에 SC 집단의 샘플(대조 샘플)을 별도로 배양하는 단계;

b) HLA-클래스 I 항체가 시험 샘플 및 대조 샘플에서 발현되는 HLA-클래스 I에 결합하도록 하는 조건 하에서 시험 샘플 및 대조 샘플을 상이한 농도 범위의 HLA-클래스 I 항체와 접촉시키는 단계;

c) 결합된 HLA-클래스 I 항체가 보체로 포화되고 보체-의존성 세포독성(CDC)이 유도되도록 시험 샘플 및 대조 샘플에 보체를 첨가하는 단계;

d) 시험 샘플 및 대조 샘플에서 유도된 세포 용해를 측정하여 HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도 범위에 대한 CDC를 결정하는 단계;

e) 최대 CDC의 50%를 유도하는 시험 샘플 및 대조 샘플 내의 HLA-클래스 I 항체의 농도(EC₅₀ 값)를 결정하는 단계; 그리고

f1) 대조 샘플의 EC₅₀ 값 대 시험 샘플의 EC₅₀ 값의 비가 1.25 미만, 바람직하게는 1.0 미만, 더 바람직하게는 0.5 미만; 특히 바람직하게는 0.25 미만인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계; 또는

f2) 시험 샘플의 EC₅₀ 값이 적어도 3.5 ng/ml, 바람직하게는 적어도 9 ng/ml, 더 바람직하게는 적어도 15 ng/ml, 특히 바람직하게는 적어도 20 ng/ml의 HLA-클래스 I 항체인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계.

본 명세서에서 "줄기세포(SC) 집단"은 배아 만능 줄기세포(ESC), 태아 줄기세포 및 성체 줄기세포를 포함하는 임의의 줄기세포를 의미한다. 집단은 1차 세포 배양물, 세포주 또는 클론에서 유래된 것일 수 있다.

줄기세포의 집단은 만능 줄기세포의 집단 또는 중간엽 줄기세포(MSC)의 집단, 예를 들어 골수 유래, 제대 조직 유래, 혈액 유래(제대혈 포함), 월경, 치수 유래(dental pulp-derived), 태반 유래 또는 지방 유래 MSCs일 수 있다(Huang et al., J Dent. Res. (2009) 88(9): 792-806; Carvalho et al., Curr. Stem Cell Res. Ther. (2011) 6(3): 221-8; Harris et al., Curr Stem Cell Res Ther. (2013) 8(5): 394-9; Li et al., Ann. N YAcad. Sci. (2016) 1370(1): 109-18). 바람직한 구현예에서, 줄기세포는 인간 줄기세포(예를 들어, 인간 ASC)이다. 본 발명의 바람직한 구현예들에서, 줄기세포의 집단은 지방 유래 기질 줄기세포(adipose-derived stromal stem cells; ASCs)이다. ASC는 ASC의 확장된 집단일 수 있다.

줄기세포 집단을 생산하고 배양하는 방법은 잘 알려져 있다.

줄기세포의 집단은 실질적으로 순수할 수 있다. 줄기세포 집단(예를 들어, ASCs 집단과 같은 MSC 집단)과 관련하여 "실질적으로 순수한"이라는 용어는 적어도 약 75%, 전형적으로 적어도 약 85%, 더 전형적으로 적어도 약 90%, 그리고 가장 전형적으로 적어도 약 95% 균질한 줄기세포 집단을 지칭한다. 균질성은 형태 및/또는 세포 표면 마커 프로파일에 의해 평가될 수 있다. 형태 및 세포 표면 마커 프로파일을 평가하기 위한 기술이 본원에 개시되어 있다.

줄기세포는 미분화 상태에서 자가 재생 능력과 특수 세포 유형으로 분화하는 그들의 능력에 의하여 특성화된다. ESCs는 클론으로부터 공개적으로 사용가능하다. 성체 줄기세포는 조혈 줄기세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 간엽 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각 성체 줄기세포, 신경능 줄기세포(neural crest stem cells), 고환 세포를 포함하는 미분화된 세포이다. 바람직하게는, SC 집단은 중간엽 줄기세포(MSC), 더 바람직하게는 인간 MSC 집단이다.

만능 줄기세포(Pluripotent stem cells)

만능 줄기세포에는 두 가지 출처가 있다. 첫째, 배아 줄기세포(ESC)는 착상 전 배반포(pre-implantation blastocyst)의 내부 세포 덩어리에서 파생되며, 만능성은 핵심 전사 인자(core transcription factors), 옥타머 결합 전사 인자 4(octamer-binding transcription factor 4; OCT4), 성 결정 영역 Y-박스 2(sex determining region Y-box 2; SOX2) 및 나노그 호메오박스(Nanog homeobox; NANOG)의 내재(intrinsic) 조절 네트워크에 의해 제어된다. 둘째, 유도 만능 줄기세포(iPSC)는 체세포(somatic cells) 내 만능성의 유도를 위해 필수적인 4가지 전사 인자인 OCT4, SOX2, 크루펠 유사 인자 4(Kruppel like factor 4; KLF4) 및 MYC 원암 유전자(MYC proto-oncogene; C-MYC)의 이소성(ectopic) 또는 상승된 발현에 의해 유도된다.

인간 배아 줄기세포와 같은 배아 줄기세포의 안정적인(미분화된) 배양물을 분리하는 기술은 잘 확립되어 있다(예: US 5,843,780; Thomson et al., Science (1998) 282: 1145-1147; Turksen & Troy (2006) Human Embryonic Stem Cells. In: Turksen K. (eds) Human Embryonic Stem Cell Protocols. Methods in Molecular Biology, volume 331, Humana Press; Sevilla et al., Stem Cell Research (2017) 25: 217-220; and Mitalipova & Palmarini (2006) Isolation and Characterization of Human Embryonic Stem Cells. In: Turksen K. (eds) Human Embryonic Stem Cell Protocols. Methods in Molecular Biology, volume 331, Humana Press).

iPSC를 생산하는 기술은 2007년 야마나카(Yamanaka)의 그룹에 의한 2007년 그들의 발견 이후에 잘 확립되어 있다(예: Takahashi et al., Cell (2007) 131(5): 861-72). 그 이후로 비통합 및 피더 없는 방법론 및 자동화된 고-처리량 유도를 포함하여 iPSC 생성을 위한 새로운 개선된 방법들이 개발되었다(Paul et al., Nature Methods(2015) 12(9): 885 892).

iPSC는 다능성 마커 배터리의 발현을 특징으로 한다: NANOG, SOX2, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60 및 계통-특이적 마커의 결여. iPSC의 다능성은 면역조직화학((Paull et al., Nature Methods (2015) 12(9): 885 892)에 의한 Tuj1(외배엽 마커), SMA(중배엽 마커) 및 SOX17(내배엽 마커)의 3개의 배엽(germ layers)으로부터 유래한 분화 마커의 사후 분석과 함께, 배아체 분석에서 3개의 배엽으로 분화하는 그들의 능력에 의해 기술된다.

유도 만능 줄기세포(iPSC)는 체세포에서 만능 유도에 필수적인 4가지 전사 인자, OCT4, SOX2, 크루펠 유사 인자 4(Kruppel like factor 4; KLF4) 및 MYC 원암유전자(MYC proto-oncogene; C-MYC)의 이소성 또는 상승된 발현에 의해 유도된다.

MSCs

"중간엽 줄기세포"(본 명세서에서 "MSC"로도 지칭됨)는 다능성 기질 세포이다. 그들은 결합 조직에서 유래하는 전형이며 비조혈 세포이다. MSC의 집단(Dominici et al.(2006), Cytotherapy 8(4): 315-317에 따름)은 다음을 수행할 수 있다: (1) 표준 배양 조건(예: 최소 필수 배지 플러스 20% 소 태아 혈청) 하에서 플라스틱에 부착; (2) CD105, CD90, CD73 및 CD44를 발현(즉, MSC 집단의 80% 이상); (3) CD45, CD14 또는 CDIIb, CD790L 또는 CD19, 및 HLA-DR(HLA 클래스 II)의 발현 결여(예를 들어, MSC 집단의 5% 이하); (4) 조골세포(osteoblasts), 지방세포(adipocytes) 및 연골모세포(chondroblasts)로 분화할 수 있음.

MSCs는 예를 들어 골수, 탯줄 조직 및 혈액, 월경, 치수(dental pulp), 제대혈, 태반 및 지방 조직으로부터 표준 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 다른 조직으로부터 얻은 MSCs는 유사하더라도, 표현형 및 기능적 특성에서 일부 차이를 갖는다. 예를 들어, 세포 표면 마커 CD54 및 CD106의 발현 수준은 MSCs의 출처/기원에 따라 다를 수 있다. 이들은 유세포 분석으로 측정할 수 있다. SOX2, IL1알파, IL1베타, IL6 및 IL8과 같은 일부 유전자의 mRNA 수준은 다른 조직으로부터 유래한 MSCs에 의해 상이하게 발현될 수 있으며, 일상적인 방법으로 측정될 수 있다. IL6 및 PGE2 분비 또한 기원이 상이한 MSCs 사이에서 상이할 수 있고, 그에 따라 세포들은 상이한 조절 능력을 가질 수도 있다(예를 들어 Yang et al. PLoS ONE (2013) 8(3) e59354 참조).

골수 중간엽 줄기세포(Bone marrow derived MSCs; BM-MSCs)

골수 중간엽 줄기세포(BM-MSC)는 다른 조직 공급원으로부터 유래한 MSCs와 유사하다. 그러나 그들은 탯줄 MSC, 태반 MSC, 치수 MSC 및 월경 MSC와 같은 다른 조직 기원으로부터 유래한 MSCs와 비교하여 표현형 및 기능적 특성에서 약간의 차이가 있다. 플라스틱에 부착하는 그들의 능력, 최소한의 표면 식별 마커 및 뼈, 연골, 힘줄 및 지방 조직으로 분화하는 능력을 포함하여 최소 특성화 기준이 공통적임에도 불구하고, 그들은 모두 몇몇 약간의 차이점을 갖는다. 이러한 특성에는 CD105와 같은 일부 표면 마커의 다양한 발현 수준, 그들의 면역 조절 잠재력 및 재생 잠재력과 연루되는 분비된 가용성 인자의 상이한 수준, 및 일반적으로 각 소스 또는 기원을 특정 치료 적응증(therapeutic indications)에 더 적합하게 만들 수 있는 약간 상이한 기능적 특성이 포함된다((Miura et al., Int J Hematology (2016) 103(2): 122-128; Wuchter et al., Cytotherapy (2015) 17(2): 128-139; Wright et al., Stem Cells (2011) 29(2): 169-178).

탯줄 유래 및 치수 유래 MSC(Umbilical cord derived and dental pulp derived MSCs)

후앙 등(Huang et al., J. Dent. Res. (2009) 88(9): 792-806)은 치수(dental pulp)로부터 유래한 MSCs에 대해 논의하고 그들의 특성을 다른 출처의 MSC와 비교한다. 카발호 등(Carvalho et al., Curr Stem Cell Res Ther. (2011) 6(3): 221-228) 및 해리스 등(Harris et al., Curr Stem Cell Res Ther. (2013) 8(5): 394-399)은 탯줄 유래 MSCs, 이들의 특성화(표현형 및 분비체 포함) 및 이의 적용에 대해 논의한다.

ASCS

지방 유래 MSCs(Adipose-derived MSCs; ASCs)는 보통 피하 지방 조직으로부터 분리되어 대량으로 획득할 수 있다. ASCs는 높은 세포 활성으로 빠르게 증식하여 MSCs를 얻기 위한 이상적인 공급원이 된다.

"지방 조직"은 모든 지방 조직을 의미한다. 지방 조직은 피하(subcutaneous), 대망/내장(omental/visceral), 유방(mammary), 생식선(gonadal) 또는 기타 지방 조직 부위에서 유래된 갈색 또는 흰색 지방 조직일 수 있다. 전형적으로 지방 조직은 피하 백색 지방 조직이다. 이러한 세포는 1차 세포 배양물 또는 불멸화 세포주를 포함할 수 있다. 지방 조직은 지방 조직을 갖는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 지방 조직은 포유동물이고, 가장 전형적으로 지방 조직은 인간이다. 지방 조직의 편리한 공급원은 지방흡입 수술로부터 유래하지만, 지방 조직의 공급원 또는 지방 조직의 분리 방법은 본 발명에 중요하지 않다.

바람직한 ASCs는 제품 "다르바드스트로셀(Darvadstrocel)"(상품명 "Alofisel^®")에서 승인된 인간 동종 지방 유래 줄기세포(human allogeneic adipose-derived stem cells; human eASCs)이다. 이러한 확장된(expanded) ASCs는 세포 표면 마커 CD29, CD73, CD90 및 CD105를 발현한다. 세포는 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 형질전환 성장 인자-베타 1(ransforming growth factor-beta 1; TGF-β1), 인터루킨 6(interleukin 6; IL-6), 기질 메탈로프로테이나제 억제제-1(matrix metalloproteinase inhibitor-l; TIMP-1) 및 인터페론-γ(interferon-gamma; IFN-γ) 및 유도성 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase; IDO)와 같은 인자를 발현할 수 있다. 따라서, ASCs의 집단은 적어도 약 50%, 적어도 약 60%; 적어도 약 70%; 적어도 약 80%; 적어도 약 85%; 약 90% 이상 또는 적어도 약 95% 또는 그 이상이 CD29, CD73, CD90 및/또는 CD105 중 하나 이상을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다. ASCs의 집단은 세포 집단의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%; 적어도 약 70%; 적어도 약 80%; 적어도 약 85%; 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 CD29, CD73, CD90 및 CD105 모두를 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다. 전형적으로, ASCs의 집단은 세포 집단의 적어도 약 80%가 CD29, CD73, CD90 및 CD105를 모두 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.

보우린 등(Bourin et al., Cytotherapy (2013) 15(6): 641-648)에 따르면, ASCs의 집단은 CD13, CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105의 발현에 대해 양성이고 CD31 및 CD45의 발현에 대해 음성인 것으로 정의될 수 있다. ASCs의 집단에서, 세포 집단의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%; 적어도 약 70%; 적어도 약 80%; 적어도 약 85%; 적어도 약 90%; 또는 적어도 약 95%는 CD13, CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105를 발현할 수 있고, ASCs 집단의 약 5%, 약 4%, 약 3% 또는 약 2% 미만은 CD31 및 CD45를 발현할 수 있다. 전형적으로, ASCs 집단에서, 세포 집단의 적어도 약 80%가 CD13, CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105를 발현할 수 있고, ASCs 집단의 약 5% 미만이 CD31 및 CD45를 발현할 수 있다.

ASCs는 표준 배양 조건에서 플라스틱에 부착성일 수 있다. 확장된 ASC(Expanded ASC; eASC)는 배양에서 브로블라스트(broblast)-유사 형태를 나타낸다. 구체적으로, 이 세포는 크고, 가늘고 긴 세포 돌기가 거의 없는 얕은 세포체에 의하여 형태학적으로 특징지어진다. 핵은 크고 둥글고 핵소체가 두드러져 핵이 선명하게 보인다. 대부분의 eASC는 이러한 방추형(spindle-shaped) 형태를 나타내지만 일부 세포는 다각형 형태를 취하는 것이 일반적이다(Zuk et al. Tissue Eng (2001) 7(2): 211-228).

ASCs는 표면 마커 HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 및 CD105에 대해 양성일 수 있다. 몇몇 구현예에서, ASCs의 집단은 ASCs 집단의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%; 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 표면 마커 HLA-1, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다. 전형적으로, eASC의 적어도 약 80%는 표면 마커 HLA 1, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 및 CD105를 발현한다.

ASCs는 표면 마커 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 및 CD86에 대해 음성일 수 있다. 일부 구현예에서, ASCs의 집단은 ASCs의 집단의 약 5% 미만이 표면 마커 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 및 CD86을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 전형적으로, ASCs 집단의 약 4%, 3% 또는 2% 미만이 표면 마커 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 및 CD86을 발현한다. 일 구현예에서, ASCs 집단의 약 1% 미만이 표면 마커 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 및 CD86을 발현한다.

일부 경우에, ASCs 집단에서 세포 집단의 적어도 약 80%가 CD29, CD73, CD90 및 CD105를 모두 발현하고 ASCs 집단의 약 5% 미만이 표면 마커 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 및 CD86을 발현한다.

일부 구현예에서 ASCs의 집단은 HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, 및 CD105 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 또는 7개)을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, eASC는 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 중 하나 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 또는 8개)을 발현하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, eASC는 HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 및 CD105 중 4개 이상을 발현하고 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 중 4개 이상을 발현하지 않는다.

CD34의 발현은 음성이거나 낮을 수 있는데, 예컨대 ASCs 집단의 0 ~ 약30%에 의해 발현된다. 따라서, 일부 경우에, 위에서 설명한 바와 같은 ASCs는 CD34를 낮은 수준으로, 예컨대 집단의 약 5 내지 약 30%에서, 발현할 수 있다. 대안적으로, 다른 경우에, 설명된 바와 같은 ASCs는 CD34를 발현하지 않는데, 예컨대 ASCs 집단의 약 5% 미만이 CD34를 발현한다.

일부 구현예에서, ASCs의 집단(예를 들어, 세포 집단의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%; 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%)는, 마커 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105의 하나 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상(예를 들어 13개 까지))을 발현할 수 있다. 예를 들어, ASCs는 마커 CD29, CD59, CD90 및 CD105 중 하나 이상(예: 2개, 3개 또는 모두), 예컨대 CD59 및/또는 CD90을 발현할 수 있다.

일부 구현예에서 ASCs의 집단은 마커 인자 VIII(Factor VIII), 알파-액틴, 데스민, S-100, 케라틴, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD45, STRO-1 및 CD133의 하나 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상(예: 15개 까지))을 발현하지 않을 수 있는데, 예를 들어 ASCs는 마커 CD45, CD31 및 CD14 중 하나 이상(예: 2개, 3개 또는 모두), 예컨대 CD31 및/또는 CD45를 발현하지 않는다.

특정 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 ASCs (i) 항원 제시 세포(antigen presenting cells; APC)에 특이적인 마커를 발현하지 않고; (ii) IDO를 구성적으로 표현하지 않고; 및/또는 (iii) MHC II를 구성적으로 현저하게 발현하지 않는다. 전형적으로 IDO 또는 MHC II의 발현은 IFN-γ를 사용한 자극에 의해 유도될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 ASCs는 Oct4를 발현하지 않는다.

ASCs 집단을 준비하는 방법

본 발명의 eASCs 및 줄기세포 집단, 및 본 발명의 줄기세포 집단을 포함하는 조성물을 제공하기 위한 ASCs의 단리 및 배양 방법은 당업계에 공지되어 있다. ASCs는 일반적으로 지방 조직의 기질 분획에서 준비되며 적절한 표면, 예컨대 플라스틱에의 부착에 의해 선별된다. 따라서, 본원에 개시된 줄기세포 동결보존(cryopreservation) 방법은 다음의 초기 단계를 (방법들 중 어느 하나의 단계 (a)에 앞서서) 포함할 수도 있다: (i) 환자로부터 수득한 지방 조직의 기질 분획으로부터 ASCs 집단을 분리하는 단계, 및 (ii) ASCs의 집단을 배양하는 단계. ASCs는 선택적으로 적절한 표면, 예를 들어, 플라스틱에의 부착에 대하여 단계 (i)에서 선별될 수 있다. 선택적으로 ASCs의 표현형은 배양 단계 (ii) 동안 및/또는 이후에 평가될 수 있다.

ASCs 집단을 준비하는 방법

본 발명의 eASCs 및 줄기세포 집단, 및 본 발명의 줄기세포 집단을 포함하는 조성물을 제공하기 위한 ASCs의 단리 및 배양 방법은 당업계에 공지되어 있다. ASCs는 일반적으로 지방 조직의 기질 분획에서 준비되며 적절한 표면, 예컨대 플라스틱에의 부착에 의해 선별된다. 따라서, 본원에 개시된 줄기세포 동결보존(cryopreservation) 방법은 다음의 초기 단계를 (방법들 중 어느 하나의 단계 (a)에 앞서서) 포함할 수도 있다: (i) 환자로부터 수득한 지방 조직의 기질 분획으로부터 ASCs 집단을 분리하는 단계, 및 (ii) ASCs의 집단을 배양하는 단계. ASCs는 선택적으로 적절한 표면, 예를 들어, 플라스틱에의 부착에 대하여 단계 (i)에서 선별될 수 있다. 선택적으로 ASCs의 표현형은 배양 단계 (ii) 동안 및/또는 이후에 평가될 수 있다.

ASCs는 당업계의 표준 수단에 의해 얻을 수 있다. 전형적으로, 상기 세포는 전형적으로 조직을 콜라게나제와 같은 소화 효소로 처리함으로써 공급원 조직(예를 들어, 리포아스피레이트 또는 지방 조직)으로부터 세포를 분리하여 수득된다. 소화된 조직 물질은 그 다음 일반적으로 약 20 마이크론에서 1 mm 사이의 필터를 통해 여과된다. 그런 다음 세포를 분리하고(일반적으로 원심분리에 의해) 부착 표면 상에서 배양한다(일반적으로 조직 배양 플레이트 또는 플라스트). 이러한 방법은 예를 들어 미국 특허 제6,777,231호에서 공개된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.

이 방법론에 따르면, 리포아스피레이트(lipoaspirates)는 지방 조직 및 이로부터 유래된 세포로부터 수득된다. 이 방법론의 과정에서, 바람직하게는 PBS로 세포를 세척하여 오염 파편 및 적혈구를 제거할 수 있다. 세포를 PBS에서 콜라게나제(예: 37℃에서 30분, 0.075% 콜라게나제; 타입 I, 인비트로겐, 칼스바드(Carlsbad), CA)로 소화시킨다. 남아 있는 적혈구를 제거하기 위해 소화된 샘플을 세척하고(예: 10% 소태아 혈청), 160 mmol/L NH4Cl로 처리하고, DMEM 완전 배지(10% FBS, 2mM 글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM)에 최종적으로 현탁시킬 수 있다. 세포는 40 μm 나일론 메쉬를 통해 여과될 수 있다.

배양된 인간 ASCs는 델라로사 등(DelaRosa et al., Tissue Eng Part A. (2009) 15(10): 2795-806), 로페즈-산탈라 등(Lopez-Santalla et al., Stem cells (2015) 33: 3493―3503)에 기술되어 있다. 일 구현예에서(상기 인용된 로페즈-산탈라 등(2015)에 기재된 바와 같이), 건강한 기증자들로로부터의 인간 지방 조직 흡인물(aspirates)을 인산염-완충된 식염수로 2회 세척하고 0.075% 콜라게나제(타입 I; 인비트로겐)로 소화시켰다. 소화된 샘플을 10% 소태아혈청(FBS)으로 세척하고, 160mM NH₄Cl로 처리하여 남아있는 적혈구를 제거하고, 배양배지(10% FBS가 포함된 둘베코의 변형된 이글스 배지(DMEM))에 현탁시켰다. 세포를 조직 배양 플라스크 내에 접종하고(2-3 x 10⁴ cells/cm²) 3-4일마다 배양 배지를 교체하면서 배양했다(37°C, 5% CO₂). 세포가 90% 컨플루언스에 도달했을 때 새로운 플라스크(10³ cells/cm²)로 세포를 옮겼다. 세포를 듀플리케이션 12-14까지 확장하고 동결시켰다.

다른 구현예에서(DelaRosa et al.(2009), Tissue Eng Part A 15(10): 2795-806에 의해 기술된 바와 같이), 건강한 성인 기증자들의 인간 지방 조직에서 얻은 지방흡입물(lipoaspirates)을 PBS로 두 번 세척하고, PBS에서 18 U/mL의 콜라게나아제 타입 I을 사용하여 30분 동안 37℃에서 소화시켰다. 콜라게나아제 1 단위는 37℃, pH 7.5(인비트로겐, Carlsbad, CA)에서 5시간 내에 콜라겐으로부터 1 mM의 L-류신 등가물을 유리한다. 소화된 샘플을 10% FBS(fetal bovine serum)로 세척하고, 160mM NH₄Cl로 처리하고, 배양 배지(10% FBS를 함유하는 DMEM)에 현탁시키고, 40-mm 나일론 메쉬를 통해 여과하였다. 세포를 조직 배양 플라스크에 접종하고(2-3x10⁴ cells/cm²), 배양 배지를 7일마다 교체하면서 37℃ 및 5% CO₂에서 확장시켰다. 세포는 배양물이 90%의 컨플루언스에 도달했을 때 새로운 배양 플라스크로 전달되었다. 세포는 연골-, 골- 및 지방생성 계통으로 분화하는 그들의 능력에 의해 표현형으로 특징지어졌다.

ASCs는 ASCs의 부착에 적합한 표면, 예컨대 플라스틱을 포함하는 적합한 조직 배양 용기 중에서 배양된다. 부착되지 않은 세포는 제거되는데, 예컨대 적절한 완충액으로 세척하여 부착성 기질 세포(예: ASC)의 분리된 집단을 제공한다. 이러한 방식으로 분리된 세포는 조직 배양 플라스크 상에 시딩되고(바람직하게는 2-3x10⁴ cells/cm²), 3-4일마다 배양 배지를 교체하면서 37°C 및 5% CO₂에서 확장될 수 있다. 세포는 바람직하게는 부착 표면으로부터 분리되고(예: 트립신 수단에 의해) 배양물이 약 90% 컨플루언스에 도달할 때 새로운 배양 플라스크(1,000개 세포/cm²)로 전달("계대")된다

ASCs는 적어도 약 15일, 적어도 약 20일, 적어도 약 25일, 또는 적어도 약 30일 동안 배양될 수 있다. 전형적으로 배양물에서 세포의 확장은 실질적으로 순수한 집단이 얻어지도록 집단에서 세포 표현형의 균질성을 향상시킨다.

일부 구현예에서, ASCs는 적어도 3회 배양 계대 동안 배양물에서 확장되거나 "적어도 3회 계대배양"된다. 다른 구현예에서, 세포는 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 또는 적어도 10회 계대된다. 세포 집단에서 세포 표현형의 균질성을 개선하기 위해 세포를 3회 이상 계대하는 것이 바람직하다. 실제로, 세포 표현형의 균질성이 개선되고 차별적 용량이 유지되는 한, 세포는 배양에서 무한히 확장될 수 있다.

일부 구현예에서, ASC는 적어도 3개의 집단 배가를 위해 배양물에서 증식되고, 예를 들어, 세포는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 집단 배가 동안 배양물에서 증식된다. 일부 구현예에서, 세포는 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개 미만의 집단 배가 동안 배양물에서 확장된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 5 내지 10개 집단 배가 동안 배양물에서 확장된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 10 내지 15개 집단 배가 동안 배양물에서 확장된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 15 내지 20개 집단 배가, 예를 들어 약 16개 집단 배가 동안 배양물에서 확장된다. ASC 분리는 바람직하게는 멸균 또는 GMP 조건 하에서 수행된다.

본 명세서에서 "동종 요법(Allogeneic therapy)"은 기증자가 세포의 수용자와 다른 사람인 세포 기반 요법을 의미한다. 바람직하게는, 동종 요법은 기증자와 수용자 사이의 HLA 매칭을 수반하지 않는다. 제약 제조에서 동종 방법론은 유망한데, HLA-비매칭(HLA-unmatched) 동종 요법이 "기성품(off the shelf)" 제품의 기초를 형성할 수 있기 때문이다.

본 명세서에서 "감작(presensitization)"은 환자가 SC 집단의 실제 투여 전에 주어진 SC 집단에 대한 기존 면역성을 나타내는 것을 의미한다. 기존 면역은 기증자-특이적 항체(donor-specific antibodies; DSA)의 존재와 관련될 수 있으며, 특히 DSA는 HLA-클래스 I 분자에 특이적이다. 이는 분광광도법, 유세포분석 교차매치(FCXM), 형광 또는 발광 분석(예: HLA-클래스 I 분자가 플레이트에 결합된 ELISA(효소 결합 면역흡착 분석))과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 기존 면역은 예를 들어 조기 수혈로 인한 것일 수 있거나 여성의 경우 조기 임신으로 인한 것일 수 있다.

본 명세서에서 "재치료(retreatment)"는 환자에게 첫 번째 기증자로부터 첫 번째 SC 집단의 첫 번째 용량을 투여한 후 첫 번째 기증자로부터 첫 번째 SC 집단의 다른 용량을 받거나 또는 두 번째 기증자로부터 두 번째 SC 집단의 용량을 받는 것을 의미한다. 단회 투여에 비해 치료 효과를 높이기 위해 재치료가 필요할 수 있다.

"SC 집단의 샘플을 배양하는 것"은 본 명세서에서 SC 집단이 SC 집단의 생존력을 유지하기에 적합한 세포 배양 배지에 함유된다는 것을 의미한다. 적합한 세포 배양 배지는 아미노산, 탄수화물, 비타민 및/또는 염과 같은 SC 집단을 위한 필수 영양소를 포함할 수 있다. pH는 완충액을 사용하여 적절한 조건에 맞게 조정된다. 바람직하게는, 세포 배양 배지는 RPMI(Gibco로부터 입수가능) 또는 DMEM(예를 들어, Sigma-Aldrich로부터 입수가능)으로부터 선택된다.

"상기 SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도"는 본원에서 상기 SC 집단의 표면 상에 HLA-클래스 I 분자의 최대량을 제공할 수 있는 IFN-γ 농도를 의미한다. 상기 SC 집단의 표면 상에 있는 HLA-클래스 I 분자의 양은 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)에 의해, 또는 발색단 또는 형광단에 직접적으로 연결된 또는 표지된 이차 항체로 간접적으로 연결된 HLA-클래스 I 항체를 사용하는 샌드위치 분석 형식과 같은 ELISA 분석 형식으로 결정할 수 있다. 더 높은 IFN-γ 농도로 세포를 처리했을 때 HLA-클래스 I의 발현이 더 이상 증가하지 않는 경우, 최대 HLA-Class I 발현이 유도된다.

IFN-γ는 HLA-클래스 I 분자의 발현 및 제시를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도는 약 0.5 내지 약 30 ng/ml, 바람직하게는 약 1 내지 약 15 ng/ml, 더 바람직하게는 약 2 내지 약 4 ng/ml, 및 가장 바람직하게는 3 ng/ml이다. 바람직하게는, IFN-γ는 12 내지 72시간의 기간 동안, 바람직하게는 24 내지 60시간의 기간 동안, 더욱 바람직하게는 30 내지 54시간의 기간 동안, 및 가장 바람직하게는 48시간 동안 SC 집단과 함께 인큐베이션된다. 가장 바람직하게는, 상기 SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도는 3ng IFN-γ/ml이고 IFN-γ는 48시간의 기간 동안 SC 집단과 함께 인큐베이션된다.

"HLA-클래스 I 항체"는 본 명세서에서 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 이 문맥에서 "특이적으로"는 바인딩이 비특이적이지 않음을 의미한다. "특이적으로"라는 용어는 또한 관련된 항원들에 대한 항체의 교차 반응성을 허용하는 에피토프를 공유하는 항원들에 대한 결합을 포함한다. 항체는 IgG 및 IgM을 포함하는 임의의 아형일 수 있다. 항체는 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 항체는 뮤린, 토끼, 양 또는 염소 항체, 바람직하게는 뮤린 항체이다. 항체는 바람직하게는 보체 시스템의 단백질과 상호작용할 수 있는 불변 영역(Fc 영역)을 포함한다.

바람직한 구현예에서 HLA-클래스 I 항체는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C에 특이적으로 결합한다. 따라서 항체는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 중쇄 중에서 보존되는 에피토프를 인식하는 범-HLA-클래스 I(pan-HLA-Class I) 항체인 것이 바람직하다.

더 바람직한 구현예에서, ATCC(명칭: HB-95) 또는 ECACC(No.: 84112003)로부터 수득 가능한 하이브리도마 클론 w6/32에 의해 생성된 항체로서, HLA-클래스 I 항체는 HLA-A, 바람직하게는 HLA-A2, 가장 바람직하게는 HLA-A*0201에 대한 본질적으로 동일한 결합 친화도를 갖는다. 바람직하게는, 결합 친화도는 ELISA 방법을 사용하여 결정된다. "본질적으로 동일한 결합 친화도"는 HLA-클래스 I 항체의 결합 친화도가 하이브리도마 클론 w6/32에 의해 생성된 항체의 결합 친화도와 10% 미만, 바람직하게는 8% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만으로 상이한 것을 의미한다.

더욱 더 바람직한 구현예에서 항체는 하이브리도마 클론 w6/32에 의해 생산된다. 이 하이브리도마 클론은 ATCC(명칭: HB-95) 또는 ECACC(No.: 84112003)에서 얻을 수 있다.

"HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도의 범위"는 본 명세서에서 시험 샘플 및 대조 샘플이 세포 용해에 의해 결정된 바와 같이 상이한 CDC 값을 초래하는 상이한 농도의 HLA-클래스 I 항체로 처리됨을 의미한다. 상이한 CDC 값은 HLA-클래스 I 항체의 농도에 따라 테스트 곡선에 표시될 수 있다.

일 구현예에서, HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도는 약 1 내지 약 50 ng/ml의 범위 내에 있다. 일 구현예에서, 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 HLA-클래스 I 항체의 2개 또는 3개의 상이한 농도가 사용된다. 일 구현예에서, 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 HLA-클래스 I 항체의 4개 또는 5개의 상이한 농도가 사용된다. 일 구현예에서에서, 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 HLA-클래스 I 항체의 6개 또는 7개의 상이한 농도가 사용된다. 일 구현예에서에서, 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 HLA-클래스 I 항체의 8개 또는 9개의 상이한 농도가 사용된다.

일 구현예에서 하이브리도마 클론 w6/32에 의해 생성된 HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도는 약 1 내지 약 50 ng/ml의 범위 내에 있다. 일 구현예에서, 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 하이브리도마 클론 w6/32에 의해 생성된 HLA-클래스 I 항체의 2개 또는 3개의 상이한 농도가 사용된다. 일 구현예에서, 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 하이브리도마 클론 w6/32에 의해 생성된 4개 또는 5개의 상이한 농도의 HLA-클래스 I 항체가 사용된다. 일 구현예에서, 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 하이브리도마 클론 w6/32에 의해 생성된 HLA-클래스 I 항체의 6개 또는 7개의 상이한 농도가 사용된다. 일 구현예에서, 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 하이브리도마 클론 w6/32에 의해 생성된 HLA-클래스 I 항체의 8개 또는 9개의 상이한 농도가 사용된다.

추가의 바람직한 구현예에서, HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도의 범위는 1 ng/ml, 3 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml 및 50 ng/ml로부터 선택된 적어도 2 또는 3, 바람직하게는 4 또는 5, 더 바람직하게는 6 또는 7, 및 가장 바람직하게는 7 또는 8개의 농도이다.

"HLA-클래스 I 항체가 시험 샘플 및 대조 샘플에서 발현된 HLA-클래스 I에 결합하는 조건 하에서"는 본 명세서에서 시험 샘플 및 대조 샘플의 SC 집단이 줄기세포에 대한 항체의 결합을 허용하는 적합한 배지 내에 함유됨을 의미한다. 따라서 배지는 항체 및/또는 세포를 변성시키지 않는 pH 및 염 농도를 갖는다. 바람직하게는, 배지는 인간 혈액의 생리학적 pH(pH 7.35 내지 7.45)와 유사한 pH를 제공하기에 적합한 완충 시스템을 함유한다. 더 바람직하게는 배지는 pH 7.4이고 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄를 함유하는 인산-완충된 식염수(PBS) 용액이다.

본 명세서에 사용된 "보체(complement)"는 혈장 또는 혈청을 포함하는 임의의 혈액 공급원으로부터 유래된 보체를 의미한다. 보체는 또한 정제되거나 합성된 보체 단백질의 혼합물로서 사용될 수 있다. 보체 시스템은 간에서 합성되고 비활성 전구체로서 순환하는 혈액에서 발견되는 다수의 작은 단백질로 구성된다. 여러 트리거 중 하나에 의해 자극되면 시스템의 프로테아제가 특정 단백질을 절단하여 사이토카인을 방출하고 추가 절단의 증폭 캐스케이드를 시작한다. 이 보체 활성화 또는 보체 고정 캐스케이드의 최종 결과는 외부 및 손상된 물질을 제거하기 위한 식세포의 자극, 추가 식세포를 유인하는 염증, 공격받은 세포의 세포 용해를 초래하는 세포-사멸 막 공격 복합체(membrane attack complex; MAC)의 활성화이다. 동종인식 동안, 고전적 경로의 개시 매개자인 C1q가 HLA 클래스-I 항원-결합 항체의 Fc 부분에 결합되어 C1q 및 후속 보체 캐스케이드 신호의 활성화를 초래하는 경우 보체 의존성 세포독성(CDC)이 시작된다.

본 명세서에서 "보체로 포화된"은 본 발명에 따른 방법에 첨가된 보체의 양이 IFN-γ 유도된 SC 집단(시험된 샘플)의 표면 상에 결합된 HLA-클래스 I 항체의 양보다 몰 과량임을 의미한다. 보체를 사용한 포화는 다양한 농도의 보체를 사용하여 분석을 수행하여 실험적으로 결정할 수 있다. CDC 활동이 최대치에 도달하면 포화 상태가 되며 더 높은 농도의 보체를 추가해도 더 이상 증가할 수 없다.

바람직한 구현예에서, 청구항 1의 단계 (c)에서 사용되는 보체는 혈청으로부터의 것이다. 바람직하게는, 혈청은 열로 처리되지 않았다. 열-비활성화는 보체 단백질을 변성시켜 MAC 복합체를 형성할 수 없도록 할 수 있다. 또한 바람직하게는, 혈청은 소태아 혈청이 아니다. 보다 바람직하게는, 혈청은 토끼, 염소 또는 양으로부터의 것이다. 가장 바람직하게는, 혈청은 토끼로부터의 것이다. 이러한 혈청은 원 람다(One Lambda)에서 얻을 수 있다.

바람직한 구현예에서, 보체를 사용한 결합된 HLA-1 항체의 포화를 초래하는 혈청 농도는 50 내지 83.33%(v/v)이고, 바람직하게는 보체를 사용한 결합된 HLA-1 항체의 포화를 초래하는 혈청 농도는 66.66 내지 83.33%(v/v)이고, 더 바람직하게는 보체를 사용한 결합된 HLA-1 항체의 포화를 초래하는 혈청 농도는 75 내지 83.33%(v/v)이고, 그리고 가장 바람직하게는 보체를 사용한 결합된 HLA-1 항체의 포화를 초래하는 혈청 농도는 83.33%(v/v)이다.

"보체 의존적 세포독성(CDC)"은 IgG 및 IgM 항체의 이펙터 기능이다. 이들이 표면 항원에 결합하면 고전적 보체 경로가 촉발되어 막 공격 복합체(MAC)의 형성 및 표적 세포 용해가 초래된다. 본 발명의 맥락에서 CDC는 SC 집단 상에서 발현된 HLA 클래스 I 분자에 대한 HLA-클래스 I 항체의 결합에 의해 SC 집단에서 유도된 세포 용해를 측정함으로써 결정된다.

바람직한 구현예에서, 세포 용해는 생존 또는 용해된 세포에 대해 선택적인 화학발광 또는 형광 염료, 또는 용해된 세포로부터 방출된 방사성 제제를 측정함으로써 결정된다. 온전한 세포막을 갖는 생존 세포는 상이한 유형의 제제를 사용하여 당업계에 공지된 방법에 의해 용해된 세포와 구별될 수 있다.

살아있는 세포를 죽은 세포로부터 구별하는 방사성 방법으로서 크롬 방출 분석법(Chromium release assay)이 확립되었다. 방사성 분석의 대안으로 형광 염료가 개발되었다. 예를 들어, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide), DAPI, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D; 7-AAD), TO-PRO-3과 같은 DNA 결합을 위한 고정-불가능한 생존 염료를 사용할 수 있다. 샘플 고정이 필요한 경우 인비트로겐(Invitrogen)의 아민 반응성 염료 또는 이바이오사이언스(eBioscience)의 고정가능한 생존 염료(Fixable Viability Dye; eFluor450, eFluor660, eFluor780) 또는 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)의 바이올렛 고정 염료(BD Horizon VD450)를 샘플에 추가하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 고정 전에 구별할 수 있다. 추가 염료는 에스테라제 활성이 필요한 염료(예: eBioscience/Invitrogen의 Calcein AM) 또는 미토콘드리아 내에 축적되는 염료(JC-1, Rhodamine 123)와 같은 세포 기능에 의한 세포 생존력 평가에 적합하다.

추가 대안으로 화학발광 기반 분석 또는 생물발광 기반 분석이 개발되었다(예: 메나디온-촉매된 H₂O₂ 생산). 이들 모두는 세포 용해를 측정함으로써 CDC를 결정하기 위해 본 발명에 의해 고려된다. 바람직한 구현예에서 CDC 활성은 실시예에 추가로 기재된 바와 같이 FACS 분석에서 염료로서 7-아미노액티노마이신 D를 사용함으로써 결정된다.

청구범위에서 정의된 "EC₅₀ 값"은 시험 샘플 및 대조 샘플에서 최대 CDC의 50%(EC₅₀ 값)를 유도하는 HLA-Class I 항체의 농도이다. "EC₅₀ 값 결정"은 상이한 HLA-클래스 I 항체 농도에 대해 결정된 CDC 값을 사용하여 생물학적 데이터 분석을 위해 시각적으로 또는 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 선형 회귀 분석이 가능한 소프트웨어를 사용할 수 있다. 적합한 소프트웨어는 FCS 익스프레스 버전 5(DeNovo 소프트웨어)일 수 있다.

바람직한 구현예에서, 대조 샘플의 EC₅₀ 값 대 시험 샘플의 EC₅₀ 값의 비가 약 0.1 내지 약 1.25, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1.0, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.5, 특히 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.25인 경우, 동종 요법을 위한 SC 집단은 단계 f1)에 따라 선택된다.

추가의 바람직한 구현예에서, 시험 샘플의 EC₅₀ 값이 약 3.5 ng/ml 내지 약 30 ng/ml, 바람직하게는 약 9 ng/ml 내지 약 25 ng/ml, 더 바람직하게는 약 10 ng/ml 내지 약 20ng/ml의 HLA-클래스 I 항체인 경우, 동종 요법을 위한 SC 집단은 단계 f2)에 따라 선택된다.

"CD46 발현 수준"은 노던 블롯 및 RT-qPCR과 같은 당업계의 표준 기술에 의해 핵산 수준에서 결정될 수 있다. CD46 mRNA 서열은 공개 데이터베이스(NCBI 참조 서열: NM_002389.4)에서 입수할 수 있다. 적합한 프라이머는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. CD46 발현 수준은 또한 단백질 수준에서 결정될 수 있다. 적합한 방법에는 표지된 HLA-클래스 I 항체 분자를 사용한 웨스턴 블롯 및 FACS 분석이 포함된다.

추가 측면에 따르면, 하기 특성 중 임의의 것을 갖는, 동종 요법, 특히 감작된 환자의 치료 또는 동종 요법에 의한 재치료에 적합한 SC 집단이 제공된다:

i) 대조 샘플의 EC₅₀ 값 대 시험 샘플의 EC₅₀ 값의 비율이 1.25 미만, 바람직하게는 1.0 미만, 더 바람직하게는 0.5 미만, 그리고 특히 바람직하게는 0.25 미만임, 여기서 EC₅₀ 값은 본 발명에 따라 결정됨;

ii) 시험 샘플의 EC₅₀ 값이 적어도 3.5 ng/ml HLA-클래스 I 항체, 바람직하게는 적어도 9 ng/ml, 더 바람직하게는 적어도 15 ng/ml, 특히 바람직하게는 적어도 20 ng/ml HLA-클래스 I 항체임, 여기서 EC₅₀ 값은 본 발명에 따라 결정됨; 또는

iii) 시험 샘플에서의 CD46 발현 대 대조 샘플에서의 CD46 발현의 비율이 2.0 초과, 바람직하게는 2.5 초과, 특히 바람직하게는 3.0 초과이고, 여기서 CD46 발현은 본 발명에 따라 결정된다.

바람직한 구현예에서 SC 집단은 본 발명에 따른 방법에 의해 선택된다. 또한 바람직한 SC 집단은 중간엽 줄기 세포(MSC) 집단, 바람직하게는 BM-MSC 집단 또는 ASC 집단, 바람직하게는 인간 BM-MSC 또는 인간 ASC이다.

추가 측면에 따르면, 본 발명에 따른 SC 집단 및 임의로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

본 명세서에서 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 SC 세포 집단의 생존성 또는 효능에 불리한 영향을 미치지 않는 당업계에 공지된 임의의 약학적으로 허용되는 담체를 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 아미노산, 염 및 비타민을 함유하는 세포 배양 배지일 수 있다. 바람직하게는, 세포 배양 배지는 RPMI 또는 DMEM이고, 더 바람직하게는 세포 배양 배지는 DMEM이다. 세포 배양 배지에는 약 5%(v/v) 내지 약 30%(v/v) 농도의 인간 혈청 알부민(HSA)이 보충될 수 있으며, 더 바람직하게는 HSA 농도는 20%(v/v)일 수 있다. 일 구현예에서 약학적으로 허용되는 담체는 20%(v/v) HSA를 갖는 DMEM이다.

약학적 조성물은 주입용 현탁액의 형태일 수 있다. 현탁액 중 SC 집단의 농도는 1 x 10⁵ 내지 8 x 10⁶ 세포/ml, 바람직하게는 1 x 10⁶ 내지 6 x 10⁶ 세포/ml 범위일 수 있다. 가장 바람직하게는, 농도는 5 x 10⁶ 세포/ml이다. 약학적 조성물은 주입에 의해 투여될 수 있다.

추가 측면에 따르면, 다음의 단계들을 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법이 제공된다:

a) 본 발명에 따른 방법을 수행하는 단계;

b) 선택된 SC 집단을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화하는 단계.

추가 측면에서, 본 발명에 따른 SC 집단은 이를 필요로 하는 환자, 바람직하게는 감작된 환자 또는 재치료를 받고 있는 환자에서 동종 줄기 세포 요법에 사용하기 위해 제공된다. 더 바람직한 구현예에서, 이를 필요로 하는 환자는 누공(fistulas), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases), 뇌 및 척수 손상(brain and spinal cord injury), 심장 질환(heart diseases), 실명 및 시력 장애(blindness and vision impairment), 췌장 베타 세포 기능 상실(pancreatic beta cell loss of function), 연골 복구(cartilage repair), 골관절염(osteoarthritis), 근골격 질환(musculoskeletal diseases), 상처(wounds), 불임(infertility), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)과 같은 자가면역 질환(autoimmune diseases) 및 염증성 질환(inflammatory diseases)으로부터 선택되는 질환을 앓고 있고, 바람직하게는 질환은 누공이고, 보다 바람직하게는 질환은 복합 항문주위 누공이다.

추가 측면에 따르면, 본 발명에 따른 SC 집단을 이를 필요로 하는 환자, 바람직하게는 감작된 환자 또는 재치료를 받는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 동종 줄기 세포 치료 방법이 제공된다. 환자는 위에서 언급한 질병으로 고통받을 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 동종 요법, 특히 감작된 환자의 치료 또는 동종 요법으로 환자의 재치료에 적합한 줄기 세포(SC) 집단을 선택하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것이다:

a) 상기 SC 집단(시험 샘플)에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도의 존재 하에 SC 집단의 샘플을 배양하고(시험 샘플) IFN-γ의 부재 하에 SC 집단의 샘플을 별도로 배양하는(대조 샘플) 단계, 여기서 SC 집단은 ASC 집단이고 IFN-γ 농도는 48시간에 걸쳐 적용된 3 ng/ml임;

b) HLA-클래스 I 항체가 시험 샘플 및 대조 샘플에서 발현된 HLA-클래스 I에 결합하도록 하는 조건 하에 시험 샘플 및 대조 샘플을 HLA-클래스 I 항체의 다양한 농도 범위와 접촉시키는 단계, 여기서 HLA-클래스 I 항체는 w6/32이고, 여기서 항체 농도는 1 ng/ml, 3 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40ng/ml 및 50ng/ml임;

c) 결합된 HLA-클래스 I 항체가 보체로 포화되고 보체-의존성 세포독성(CDC)이 유도되도록 시험 샘플 및 대조 샘플에 보체를 첨가하는 단계, 여기서 보체는 토끼 혈청 형태로 첨가됨;

d) 시험 샘플 및 대조 샘플에서 유도된 세포 용해를 측정하여 HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도 범위에 대한 CDC를 결정하는 단계;

e) 시험 시료 및 대조 시료에서 최대 CDC의 50%를 유도하는 HLA-Class I 항체의 농도(EC₅₀ 값)를 결정하는 단계; 그리고

f1) 대조 샘플의 EC₅₀ 값 대 시험 샘플의 EC₅₀ 값의 비가 1.25 미만, 바람직하게는 1.0 미만, 더 바람직하게는 0.5 미만; 특히 바람직하게는 0.25 미만인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계; 또는

f2) 시험 샘플의 EC₅₀ 값이 적어도 3.5 ng/ml, 바람직하게는 적어도 9ng/ml, 더 바람직하게는 적어도 15 ng/ml, 특히 바람직하게는 적어도 20ng/ml의 HLA-클래스 I 항체인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계.

일 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 동종 요법, 특히 감작된 환자의 치료 또는 동종 요법으로 환자의 재치료에 적합한 줄기세포(SC) 집단을 선택하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것이다:

a) 상기 SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도의 존재 하에 SC 집단의 샘플을 배양하고(시험 샘플) IFN-γ의 부재 하에 SC 집단의 샘플을 별도로 배양하는 단계(대조 샘플), 여기서 SC 집단은 ASC 집단이고 IFN-γ 농도는 48시간에 걸쳐 적용된 3 ng/ml임;

b) HLA-클래스 I 항체가 시험 샘플 및 대조 샘플에서 발현된 HLA-클래스 I에 결합하도록 하는 조건 하에 시험 샘플 및 대조 샘플을 HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도들과 접촉시키는 단계, 여기서 HLA-클래스 I 항체는 w6/32이고 여기서 항체 농도는 1 ng/ml, 3 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml 및 50 ng/ml임;

c) 결합된 HLA-클래스 I 항체가 보체로 포화되고 보체-의존성 세포독성(CDC)이 유도되도록 시험 샘플 및 대조 샘플에 보체를 첨가하는 단계, 여기서 보체는 토끼 혈청 형태로 첨가됨;

d) 시험 샘플 및 대조 샘플에서 유도된 세포 용해를 측정하여 HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도 범위에 대한 CDC를 결정하는 단계;

e) 시험 샘플 및 대조 샘플에서 최대 CDC의 50%를 유도하는 HLA-클래스 I 항체의 농도(EC₅₀ 값)를 결정하는 단계; 그리고

f1) 대조 샘플의 EC₅₀ 값 대 시험 샘플의 EC₅₀ 값의 비가 약 0.1 내지 약 1.25, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1.0, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.5, 특히 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.25인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계; 또는

f2) 시험 샘플의 EC₅₀ 값이 약 3.5 ng/ml 내지 약 30 ng/ml, 바람직하게는 약 9 ng/ml 내지 약 25 ng/ml, 더 바람직하게는 약 10 ng/ml 내지 약 20 ng/ml의 HLA-클래스 I 항체인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계.

본 발명의 일부 실시예는 다음과 관련된다:

1. 동종 요법(allogeneic therapy), 특히 감작된(presensitized) 환자의 치료 또는 동종 요법을 이용한 환자의 재치료에 적합한 줄기세포(stem cell; SC) 집단을 선택하기 위한 시험관 내(in vitro) 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 것인 방법:

a) SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도의 존재 하에서 SC 집단의 샘플을 배양하고(시험 샘플), IFN-γ의 부존재 하에서 SC 집단의 샘플을 별도로 배양하는 단계(대조 샘플);

b) HLA-클래스 I 항체가 시험 샘플 및 대조 샘플에서 발현된 HLA-클래스 I에 결합하도록 하는 조건 하에서, 시험 샘플 및 대조 샘플을 상이한 농도 범위의 HLA-클래스 I 항체와 접촉시키는 단계;

c) 결합된 HLA-클래스 I 항체가 보체로 포화되고 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity; CDC)이 유도되도록 시험 샘플 및 대조 샘플에 보체를 첨가하는 단계;

d) 시험 샘플 및 대조 샘플에서 유도된 세포 용해를 측정하여 HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도 범위에 대한 CDC를 결정하는 단계;

e) 시험 샘플 및 대조 샘플에서 최대 CDC의 50%를 유도하는 HLA-클래스 I 항체의 농도(EC⁵⁰ 값)를 결정하는 단계; 및

f1) 대조 샘플의 EC₅₀ 값 대 시험 샘플의 EC₅₀ 값의 비(the ratio of the EC₅₀ value of the control sample to the EC₅₀ value of the test sample)가 1.25 미만, 바람직하게는 1.0 미만, 더 바람직하게는 0.5 미만, 특히 바람직하게는 0.25 미만인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계; 또는

f2) 시험 샘플의 EC₅₀ 값이 적어도 3.5 ng/ml, 바람직하게는 적어도 9 ng/ml, 더 바람직하게는 적어도 15 ng/ml, 특히 바람직하게는 적어도 20 ng/ml의 HLA-클래스 I 항체인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계.

2. 항목 1에 있어서, 상기 방법은 시험 샘플 및 대조 샘플에서 CD46 발현 수준을 결정하는 단계; 및 시험 샘플에서의 CD46 발현 대 대조 샘플에서의 CD46 발현의 비가 2.0 초과, 바람직하게는 2.5 초과, 특히 바람직하게는 3.0 초과인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계를 더 포함하는 것인 시험관 내 방법.

3. 항목 1 또는 2에 있어서, SC 집단이 중간엽 줄기세포(MSC) 집단, 바람직하게는 인간 MSC 집단인 시험관 내 방법.

4. 항목 3에 있어서, 중간엽 줄기세포 집단이 골수-유래 줄기세포(BM-MSC) 집단인 것인 시험관 내 방법.

5. 항목 3에 있어서, 중간엽 줄기세포 집단이 지방 조직-유래 줄기세포(ASC) 집단인 것인 시험관 내 방법.

6. 항목 5에 있어서, ASC 집단이 CD29, CD73, CD90 및/또는 CD105를 발현하는 것인 시험관 내 방법.

7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도가 약 0.5 내지 약 30 ng/ml, 바람직하게는 약 1 내지 약 15ng/ml, 더 바람직하게는 약 2 내지 약 4 ng/ml인 것인 시험관내 방법.

8. 항목 7에 있어서, 상기 SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도가, 바람직하게는 48시간에 걸쳐 적용되는, 3ng IFN-γ/ml인 것인 시험관 내 방법.

9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, HLA 클래스 I 항체가 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C에 특이적으로 결합하는 것인 시험관 내 방법.

10. 항목 9에 있어서, HLA 클래스 I 항체가 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 HLA 클래스 I 항체가 뮤린 단일클론 항체인 것인 시험관 내 방법.

11. 항목 9 또는 10에 있어서, HLA-클래스 I 항체가 ATCC(명칭: HB-95) 또는 ECACC(No.: 84112003)로부터 입수가능한 하이브리도마 클론 w6/32에 의하여 생산된 항체와 본질적으로 동일한 HLA-A에 대한 결합 친화도를 갖는 것인 시험관 내 방법.

12. 항목 9 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 항체가 ATCC(명칭: HB-95) 또는 ECACC(No.: 84112003)로부터 입수가능한 하이브리도마 클론 w6/32에 의해 생산되는 것인 시험관 내 방법.

13. 항목 1 내지 항목 12 중 어느 하나에 있어서, 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 2개 또는 3개의 상이한 농도의 HLA-클래스 I 항체가 사용되고, 바람직하게는 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 4개 또는 5개의 상이한 농도의 HLA-클래스 I 항체가 사용되고, 더 바람직하게는 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 6개 또는 7개의 상이한 농도의 HLA-클래스 I 항체가 사용되고, 더욱 더 바람직하게는 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 8개 또는 9개의 상이한 농도의 HLA-클래스 I 항체가 사용되는 것인 시험관 내 방법.

14. 항목 13에 있어서, HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도 범위가 1 ng/ml, 3 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml 및 50ng/ml인 것인 시험관 내 방법.

15. 항목 1 내지 항목 14 중 어느 하나에 있어서, 제1항의 단계 (c)에서 사용된 보체가 혈청으로부터 유래한 것인 시험관 내 방법.

16. 제15항에 있어서, 혈청이 열 처리되지 않은 것인 시험관 내 방법.

17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 혈청이 토끼, 염소 또는 양으로부터 유래하고, 바람직하게는 토끼로부터 유래하는 것인 시험관 내 방법.

18. 제15항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 혈청 농도가 50 내지 83.33 %(v/v)이고, 바람직하게는 혈청 농도가 66.66 내지 83.33 %(v/v)인 것인 시험관 내 방법.

19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 용해가 생존 또는 용해된 세포에 대해 선택적인 화학발광 또는 형광 염료 또는 용해된 세포로부터 방출된 방사성 제제를 측정함으로써 결정되는 것인 시험관 내 방법.

20. 동종 요법, 특히 감작된 환자의 치료 또는 동종 요법을 이용한 재치료에 적합한 SC 집단으로서, 하기 특성 중 어느 하나를 갖는 것인 SC 집단:

i) 대조 샘플의 EC₅₀ 값 대 시험 샘플의 EC₅₀ 값의 비율(a ratio of the EC₅₀ value of the control sample to the EC₅₀ value of the test sample)이 1.25 미만, 바람직하게는 1.0 미만, 더 바람직하게는 0.5 미만, 그리고 특히 바람직하게는 0.25 미만임, 여기서 EC₅₀ 값은 항목 1에 기재된 바와 같이 결정됨;

ii) 시험 샘플의 EC₅₀ 값이 적어도 3.5 ng/ml HLA-클래스 I 항체, 바람직하게는 적어도 9 ng/ml, 더 바람직하게는 적어도 15 ng/ml, 특히 바람직하게는 적어도 20 ng/ml HLA-클래스 I 항체임, 여기서 EC₅₀ 값은 항목 1에 기재된 바와 같이 결정됨; 및/또는

iii) 시험 샘플에서의 CD46 발현 대 대조 샘플에서의 CD46 발현의 비율(a ratio of CD46 expression in the test sample to the CD46 expression in the control sample)이 2.0 초과, 바람직하게는 2.5 초과, 특히 바람직하게는 3.0 초과이고, 여기서 CD46 발현은 항목 2에 기재된 바와 같이 결정됨.

21. 항목 20에 있어서, SC 집단은 항목 1 내지 19 중 어느 하나의 방법에 의해 선택되는 것인 SC 집단.

22. 항목 21 또는 22에 있어서, SC 집단이 중간엽 줄기세포(MSC) 집단, 바람직하게는 BM-MSC 집단 또는 ASC 집단, 바람직하게는 인간 BM-MSC 또는 인간 ASC인 것인 SC 집단.

23. 항목 20 내지 22 중 어느 하나에 따른 SC 집단 및 임의의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.

24. 다음 단계를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법:

a) 항목 1 내지 항목 19 중 어느 하나의 방법을 수행하는 단계;

b) 선택된 SC 집단을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화하는 단계.

25. 항목 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 이를 필요로 하는 환자, 바람직하게는 감작된 환자 또는 재치료를 받고 있는 환자에서 동종 줄기세포 요법에 사용하기 위한 SC 집단.

26. 항목 25에 있어서, 이를 필요로 하는 환자는 누공(fistulas), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases), 뇌 및 척수 손상(brain and spinal cord injury), 심장 질환(heart diseases), 실명 및 시력 장애(blindness and vision impairment), 췌장 베타 세포 기능 상실(pancreatic beta cell loss of function), 연골 복구(cartilage repair), 골관절염(osteoarthritis), 근골격 질환(musculoskeletal diseases), 상처(wounds), 불임(infertility), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)과 같은 자가면역 질환(autoimmune diseases) 및 염증성 질환(inflammatory diseases)으로부터 선택되는 질환을 앓고 있고, 바람직하게는 질환은 누공(fistula)이고, 더 바람직하게는 질환은 복합 항문주위 누공(complex perianal fistula)인 것인 SC 집단.

27. 항목 20 내지 22 중 어느 하나의 SC 집단을 이를 필요로 하는 환자, 바람직하게는 감작된 환자 또는 재치료 중인 환자에게 투여하는 것을 포함하는 동종 줄기세포 치료 방법.

28. 항목 27에 있어서, 필요한 환자가 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases), 뇌 및 척수 손상(brain and spinal cord injury), 심장 질환(heart diseases), 실명 및 시력 장애(blindness and vision impairment), 췌장 베타 세포 기능 상실(pancreatic beta cell loss of function), 연골 복구(cartilage repair), 골관절염(osteoarthritis), 근골격 질환(musculoskeletal diseases), 상처(wounds), 불임(infertility), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)과 같은 자가면역 질환(autoimmune diseases) 및 염증성 질환(inflammatory diseases)으로부터 선택되는 질환을 앓고 있고, 바람직하게는 질환은 누공(fistula)이고, 더 바람직하게는 질환은 복합 항문주위 누공(complex perianal fistula)인 것인 동종 줄기세포 치료 방법.

본 발명은 단지 본 발명의 특정 구현예들을 기술하기 위한 목적이며 또한 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.

실시예

물질 및 방법

ADMIRE CD1에서 DSA 생성 모니터링

환자

123명 환자의 하위 그룹(subgroup)은 무작위, 이중 맹검, 병렬 그룹, 위약 대조 연구, ADMIRE CD1(Panes et al. (2016), Lancet 388, 1281-1290)으로부터 왔다. 간단히 말해서, 모두 CD 및 치료-불응성 배액, 복합 항문주위 누공이 있는 성인 환자(≥ 18세)였으며 1억 2천만 ASCs 또는 24mL 식염수 용액(위약)의 단일 병변 내 주입을 받도록 선택되었다. 총 60명 및 63명의 환자가 각각 위약 또는 ASC 주입을 받았으며, 이 중 105명(58명 ASCs, 47명 위약)이 투여 후 최대 52주 동안 성공적으로 추적되었다.

ASC 기증자

건강한 기증자의 인간 지방 조직 흡인물은 다른 문헌(상기 인용한 Lopez-Santalla et al., 2015)에서 설명한 대로 처리하였다. 본 연구를 위해 7명의 다른 기증자의 ASC가 사용되었다; DonA는 ADMIRE CD1 임상 시험에 사용된 기증자였다. DonA와 DonB는 ADMIRE CD2 임상 시험(NCT03279081)(두 명의 다른 기증자를 활용함)에서 나온 것이었다. 또한 DonC, DonD, DonE, DonF 및 DonG 기증자들로부터 유래한 ASC를 분석했다. 모든 ASC 기증자는 국제 지방 치료 연맹(International Federation for Adipose Therapeutics) 및 국제 세포 치료 학회(International Society for Cellular Therapy)에서 설정한 동일성 및 순도 기준을 준수했다(Bourin et al., (2013), Cytotherapy (2013) 15(6): 641-648). ASC 배양은 다른 문헌(상기 인용한 DelaRosa et al., 2009)에 기술되어 있다.

항-HLA 검출

에틸렌디아민테트라아세트산(Vacutainer^® 스프레이-코팅된 K2EDTA 튜브, BD)으로 말초혈액 튜브를 원심분리하여 혈장 샘플을 얻었으며, 위약 또는 ASC 투여 후 기준선 및 12주 및 52주에 모든 환자로부터 수집했다. 항-HLA 항체는 제조사의 지침에 따라 LabscreenMixed^TM 키트(One Lambda Inc.® Canoga Park, CA, US)를 사용하여 루미넥스(Luminex) 플랫폼에서 검출되었다. 형광 강도 중앙값(MFI)의 800 단위보다 큰 신호(a signal >800 units)를 갖는 모든 샘플은 양성으로 간주되었고 HLA 항체의 특이성은 랩스크린 싱들 항원(Labscreen Single Antigen)® 키트(One Lambda Inc.® Canoga Park, CA, US)를 사용하여 결정되었다. 모든 신호는 >20,000 표준 형광 강도 단위가 관련된 것으로 간주되는 퀀티플렉스(Quantiplex)^TM 비드 형광에 따라 정규화되었다. 정성적으로 HLA 항체 역가는 랩스크린 믹스드(Labscreen Mixed) 키트에 포함된 HLA 클래스 I 분자로부터 유래한 모든 결정인자 비드의 결과 MFI 합계로서 정의되었다. 이것은 제시된 항-HLA 특이성과 독립적으로 생성된 체액성 반응 수준을 비교할 수 있게 하였다.

HLA 유형화

각 환자에서 발현된 HLA 대립유전자(allele)의 할당은 화학 DNA 블러드250 키트(chemagic DNA Blood250 KIT; PerkinElmer)를 사용하여 말초 혈액 샘플에서 얻은 DNA 샘플에서 결정되었다. A260/280 흡광도 비율 검사를 통해 순도를 확인한 후, DNA 농도가 20 ng/μL 이상인 모든 샘플을 제조업체 지침에 따라 특히 HLA의 로커스(loci) A, B 및 C에 대하여 랩타입(LABType)® SSO 분석(One Lambda, Canoga Park, CA)을 사용하여 시험하였다. 환자와 기증자 ASC 사이의 비호환성의 특성화는 이후에 에플렛(eplets)(Duquesnoy (2002), Hum Immunol 63, 339-352)이라고 언급되는 알고리즘 HLA 매치메이커를 사용하여 공유되지 않은 고유한 다형성 잔기 사슬로 정의되었다.

재조합 항-HLA 항체(rHLA)를 사용한 유세포 분석 크로스매치(flow cytometry crossmatch; FCXM) 결합의 표준화

표준 곡선

클래스 I 및 클래스 II HLA 발현 수준은 기본 조건에서 DonA 및 DonB(클래스 I) 및 DonA(클래스 II)의 ASC에서 결정되었으며 ASC는 인터페론 IFNγ(3 ng/mL, 48시간 동안)를 사용하여 사전 활성화되었다. 50,000개의 ASC를 항-인간 클래스 I HLA Ab(클론 W6/32)로 표지된 PE(피코에리트린) 및 항-인간 클래스 II HLA Ab(클론 L243)로 표지된 PerCP(페리디닌-클로로필-단백질)(Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, US)를 사용하여 농도를 증가(클론 W6/32의 경우 0에서 15 ng/mL까지, 클론 L243의 경우 0에서 3 ng/mL까지)시키면서 염색하고, 실온의 암실에서 30분 동안 인큐베이션했다.

혈장 샘플 FCXM 결합 강도

이전에 56℃에서 30분 동안 비보완(de-complemented)되고 자기 활성화 세포 분류(Magnetic-activated cell sorting; MACS) 완충액으로 한 번 세척된, ASC를 투여한 모든 환자의 치료 전 12주차(W12) 및 52주차(W52) 혈장 샘플을 시험하였다. 50 μL의 비보완된(de-complemented) 혈장을 실온에서 30분 동안 50,000 ASC(최종 부피는 100 μL)와 함께 인큐베이션했다. FACS-포르테사(Fortessa) X20 세포 분석기는 샘플당 P1 게이트(ASC의 총 모집단)에서 10,000개의 이벤트를 수집하여 HLA-클래스 I 및 HLA-클래스 II의 MFI를 결정하는 데 사용되었다. 분석을 위해 BD 팩스디바(FacsDiva)® 소프트웨어(BD)가 사용되었다.

혈장 샘플 CDC 분석

세포독성 측정을 위해, 보체 항-인간 클래스 I HLA(CABC-1D, One Lambda Inc® Canoga Park, CA, US)의 공급원으로서 250 μL의 토끼 혈청을 1시간 동안 세포에 첨가하였다. 그런 다음 세포를 두 번 세척하고 20분 이내에 20μL FITC 항-인간 IgG와 함께 인큐베이션했다. 마지막으로, 세척 후, LSR 포르테사(Fortessa) 유세포 분석기(BD)에서 획득하여 5 μL의 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD) 생존 염료를 첨가한 후 세포독성을 결정했다.

FACS를 통한 mCRP 정량

ASC는 48시간 동안 정상 또는 3ng/mL IFNγ 조건에서 성장했다. 그런 다음 ASC를 트립신 처리하고 계수했다. 총 50,000개의 세포를 100μL MACS 완충액에 재현탁했다. 염색을 위해 CD46(cat number 564253, BD), CD55(MCA1614PE, Serotec) 및 CD59(BRA-10G, Novus Biologicals) Ab와 대조군으로서 각각의 이소타입(BD의 IgG2a-APC, IgG1-PE 및 IgG2b-PE)을 사용했다. 20분 얼음 인큐베이션 후, ASC를 MACS로 세척하고 1,500rpm에서 4분 동안 원심분리했다. 마지막으로, ASC를 100 μL MACS에 재현탁하고 세포측정 튜브로 옮기고 LSR 포르테사(Fortessa) 유세포분석기(BD)에서 획득하고 BD 팩스디바(FacsDiva)^TM(BD)를 사용하여 분석했다.

CD46 녹아웃 세포주의 생성

가이드(Guide) RNA는 www.genome.ucsc.edu 및 www.www.ncbi.nlm.nih.gov/gene과 같은 공개 게놈 도구를 사용하여 CD46 엑손 3을 표적으로 하도록 설계되었다. CRISPR RNA(crRNA) 전달을 위해 Alt-R® CRISPR-Cas9 시스템(IDT Integrated DNA Technologies)을 제조업체의 지침에 따라 사용했다. 간단히 말해서, ASC를 해동하고 밤새 방치했다. 그 다음, 리보핵단백질 복합체 혼합물을 제조하고 리포펙타민(Lipofectamine)® RNAiMAX(Thermo-Fisher)를 사용하여 전달했다. crRNA 및 트랜스(trans)-활성화 crRNA(tracrRNA)는 1μM의 최종 올리고 듀플렉스 작업 농도에서 멸균 마이크로 원심분리 튜브 내에서 등몰(equimolar) 농도로 혼합되었다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, ASC 현탁액을 첨가하기 전에 형질감염 복합체를 배양 플레이트에 첨가하였다. 24시간 후 ASC 배지를 교체하고 형광 tracrRNA-ATTO⁵⁵⁰을 사용하여 현미경 하에서 리포펙션 효능을 확인했다.

결과

ADMIRE CD1 치료 환자에서 장기간 DSA 존재

문헌(Panes, J. et al. (2016), Lancet 388, 1281-1290)에 보고된 ADMIRE CD1 시험의 123명의 환자로부터 혈액 샘플을 수집했는데, 이들은 기준선 및 치료 투여 후 12주에서 63 ASC 및 60 위약 이었다. 치료 투여 후 52주에 105명의 환자(58 ASC 및 47 위약)가 혈액 샘플을 제공했다(도 1A). 루미넥스(Luminex) 기술을 사용한 고체상 분석으로 분석한 결과 23명의 환자에서 치료 12주 후에 DSA가 생성된 것으로 나타났다. 예상대로 위약을 투여받은 환자는 DSA가 포함된 샘플을 생성하지 않았다(도 1A, 오른쪽 차트). 추가로, 결과는 ASC 환자의 16%(10/63)와 위약 환자의 15%(9/60)가 기준선에서 사전-감작(pre-sensitized) 되었음을 나타냈다. 치료 경험이 없는(치료-나이브) 53명의 환자 중 17명은 12주차에 ASC DSA를 생성했으며 10명의 사전-감작 환자 중 6명은 12주차에 ASC DSA를 생성했다(도 1A, 왼쪽 차트). 모든 경우에 DSA의 특이성은 HLA 클래스 I 분자에 대해서만 검출되었고 HLA 클래스 II 분자에 대해서는 검출되지 않았다. 장기 추적 관찰 결과 52주차에 DSA의 추가 생성이 감지되지 않은 것으로 나타났다; 환자의 30%(7/23)가 이 시점에서 DSA를 제거했다. 흥미롭게도 12주차에 DSA를 생성한 치료 경험이 없는 환자 그룹은 35%(6/17) 제거율을 표시한 반면, 12주차에 DSA를 생성하는 사전 감작 환자는 52주차에 17%(1/6) 제거율을 나타냈다. 흥미롭게도 사전 감작된 환자는 52주차에 체액 반응이 지속되는 경향이 있었다. 대조적으로, DSA를 생성한 치료 경험이 없는 환자는 기준 DSA 수준으로 되돌아가는 경향을 보였다. 요약하면, 위의 관찰은 이러한 ADMIRE CD1 환자에서 ASC에 대한 반응이 1차 면역 반응 속도론을 따른다는 것을 시사한다.

방법(항-HLA 검출 섹션)에 명시된 바와 같이, 단일 항원 결과, 즉, 범주 값(주어진 컷오프에 대해 예 또는 아니오)에 따른, 가장 제한적인 역치를 사용하여 주어진 샘플에 대한 DSA 양성 수준을 선택했다. 그럼에도 불구하고, 정제된 HLA 코팅된 비드(Luminex® 기술에 사용되는 마이크로스피어)에 존재하는 총 항원에 대해 결합된 항체의 양은 MFI HLA 클래스 I LSM(최소 제곱 평균) 마이크로스피어의 합으로 정량화할 수도 있다. 시간 경과(치료 전 및 치료 후 12-52주)에 따른 혈장 DSA 역가를 측정하는 시간-경과 곡선을 계산했다; 반응 역학을 설명하고 DSA 수준을 감소시킬 가능성을 결정하였다(도 1B). 환자는 DSA의 존재에 따라 다음 그룹으로 분류되었다. DSA를 생성하지 않은 나이브 환자(기준 수준이 비교에 사용됨) 동종(allo)-ASC 투여 후 DSA를 생성한 나이브 환자; 투여된 기증자 ASC의 특이성을 가진 사전-감작 환자; 및 사용된 기증자 세포에 대해 특이성이 없는 사전-감작 환자. 예상대로 DSA를 생성하지 않는 나이브 환자는 연구 과정 전반에 걸쳐 HLA 클래스 I 항체를 나타내지 않았다(도 1B, 왼쪽 상단 패널). 대조적으로, DSA를 생성한 나이브 환자는 증가된 항체 역가를 나타냈다. 또한 기준선으로부터 12주차까지의 MFI 수정은 모든 환자에서 유사하지 않았으며, 실제로 특정 환자에서는 반응이 다른 환자보다 더 집중적으로 보였다; 환자 92(Pat92)는 가장 동종-반응성(allo-reactive)이었다(도 1B, 원). 그러나 52주차에 MFI가 모든 경우에서 감소한 것이 분명했으며, 이는 부스터 효과 후에 항체 역가의 증가가 감소하는 고전적인 1차 반응의 항체 프로파일과 일치한다. ASC와 특이성을 공유하는 사전-감작 환자 그룹에서 이차 또는 기억 반응과 일치하는 프로필이 발견되었다; 항체 역가는 12주차와 52주차 둘 모두에서 기준선 수준을 초과했다(도 1B, 왼쪽 아래 패널). 이 환자들은 이 경우 기간과 강도가 제한되는 경향이 있는 부스터 반응의 프로필을 가지고 있다. 흥미롭게도, 무반응 프로필을 나타내는 기준선(도 1B, 오른쪽 아래 패널)에서 ASC 특이성을 나타내지 않은 치료 경험이 없는(치료-나이브) 환자 그룹과 사전에 감작된 환자에서 유사한 동역학이 나타났다.

기증자-환자 HLA 일치 등급과 DSA 생성 확률 사이의 가능한 연관성을 조사했다. 환자에게 없는 ASC 기증자 HLA 유형(eplets)에 존재하는 다형성 잔기를 식별하여 동종 인식의 전구체를 식별하는 것이 목적이었다. 각 환자의 에플렛(eplet)은 불일치 정량화를 위해 ASC 기증자 HLA 대립유전자(allele)와 정렬되었다. 현재 연구에서 동종-감작(allo-sensitization)은 주로 HLA 클래스 I에 대해 발생했다; 따라서 HLA 클래스 I의 유전자좌(loci) A와 B를 특성화하는 데 중점을 두었다. 에플렛(eplets)의 총 수는 DSA를 생성하는 환자의 감수성과 상관관계가 있었다(도 1C). 선형 회귀 분석은 투여 후 12주 에플렛(eplets) 불일치와 환자 DSA 생성 사이에 유의미한 상관관계가 없음을 보여주었다.

ASC에 대한 항-HLA 항체의 시험관내 결합

다른 조직에서 발견되는 MSC는 면역 조절 특성 또는 식별 마커를 포함한 공통 특징을 공유하지만, 생체 내 모델에서 차등 면역원성 반응이 보고되었다. ASC의 면역원성 반응을 특성화하기 위해 FACS 분석을 사용하여, ASC 상의 HLA-클래스 I 및 HLA-클래스 II 분자의 발현과 환자의 항-HLA Abs에 결합하는 그들의 능력을 정량화하기 위한 것이었다(도 2A). ASC는 HLA-클래스 I(6주 및 32주) 또는 HLA-클래스 II(L243) 재조합 Abs로 표지된 형광 농도를 증가시키면서 IFNγ로 사전-자극되거나 또는 그렇지 않고 배양되고 염색 후 MFI를 정량화했다. 예상대로 ASC는 기본 수준에서 HLA-클래스 I을 발현하여 IFNγ 자극 후 강한 과발현을 나타냈다(도 2A). 반대로 HLA-클래스 II 수준은 기준선에서 음성이었고 IFNγ 자극 후에 약간 증가했다.

혈장 샘플 Pat92(도 1B, 원)는 처리 후 가장 큰 DSA 역가를 가지고 있었다. 기준 조건에서 DSA의 결합 강도 또는 보체 의존성 독성 분석에서 유의한 증가는 감지되지 않았다. 그러나, ASC가 IFNγ로 자극되었을 때, 양성 대조군(과다 면역화된 샘플의 풀, HI 풀) 및 Pat92 샘플(도 2B, 왼쪽 하단 패널) 둘 모두에서 ASC 결합 강도의 상당한 상향 조절이 관찰되었다. 결합의 증가는 Pat92에서 높은 비율의 세포독성 사멸(34%)을 동반했다(도 2B, 밝은 회색). 이 백분율은 테스트된 다른 22명의 환자에서 정량화된 사멸 백분율(3.3-9.3% 범위)보다 상당히 높았으며, 이는 Pat92가 가장 동종-반응성인 샘플임을 확인시켜 준다. 흥미롭게도 Pat92는 투여된 ASC와 가장 높은 수준의 불일치를 나타내는 하나의 샘플이었지만 W52에서 항체 제거를 나타냈다. 동종(Allogeneic) ASC 요법의 안전성과 면역원성 독성을 이해하면 재치료 가능성을 평가하는 데 도움이 될 것이다. 또한, 사전-감작된 환자 및/또는 악화된 새로운(de novo) DSA 생성(예: Pat92)이 있는 환자에서 그들의 잠재적 영향을 결정하는 데 도움이 될 것이다.

혈장 DSA는 ASC에 결합하여 시험관 내에서 중간 정도의 사멸을 유도함

위의 결과에서 63명의 ADMIRE CD1 환자 코호트로부터 10명은 기존 HLA-클래스 I Ab를 갖고 17명은 새로운(de novo) DSA를 생성한 것으로 나타났다. 또한 ASC가 HLA-클래스 I 항원을 발현하고 rHLA-클래스 I Ab에 결합한다는 것이 기술되었다; 그러나 환자의 DSA가 결합하고, 그 결과 ASC의 세포독성 사멸을 유도할 수 있는 능력이 있는지 여부는 알려져 있지 않다. 이를 테스트하기 위해 시험관 내에서 HLA 클래스 I 항원을 ASC에 결합하기 위한 사전-감작된 그룹 및 새로운(de novo) DSA 양성(DSA+) 그룹의 차등 친화도를 정량화하기 위한 것이었다. 원래 기증자 DonA(ADMIRE CD1 시험에서 투여됨)에 더하여, 추가 기증자 DonB가, 환자에게 투여되지 않았기 때문에 DSA 특이성에 대한 대조군 기능을 위해 포함되었다(도 3A). FCXM을 통한 기준선 및 W12 샘플 및 기준 조건에서 배양되거나 IFNγ로 사전 자극된 ASC에 대한 HLA-I 결합 강도를 측정했다(도 3A, 상단 패널). 기준 조건 하 기증자 ASC에 있어서 사전-감작된 또는 새로운 DSA+ 환자의 샘플에서 높은 결합 능력은 관찰되지 않았다. ASC가 IFNγ로 사전 자극되었을 때 사전 감작된 환자는 오직 DonA만 있는 0주(W0) 및 12주(W12) 두 방문 모두에서 높고 유사한 결합 친화도를 갖는 것으로 관찰되었다(도 3A, 상단 패널). ASC 기증자의 멤브레인에서 기준 조건 및 이에 따른 낮은 HLA-I 항원 발현은 DonA 및 DonB 둘 모두에서 낮은 결합 친화도와 상관관계가 있었다(도 3A, 하부 패널). 놀랍게도, 12주차에 DonA에서 파생된 환자의 샘플을 새로운 DSA+ 샘플 내 기준선과 비교했을 때 결합 친화도의 상당한 증가가 관찰되었다(도 3A, 하단 패널). 위의 데이터는 기저 ASC에서 HLA의 농도가 시험관 내에서 DSA의 유의한 결합을 나타내기에 충분하지 않음을 시사한다. 또한, 대부분의 환자에서 DSA의 농도는 활성화되지 않은 ASC 또는 활성화된 ASC 둘 모두에서 유의한 결합 강도를 나타내기에 충분하지 않은 것으로 보인다. 이러한 결과는 기증자와 면역 특이성을 공유하는 DSA 수치가 높은 환자만이 상당한 HLA-Class I 결합을 초래한 장기 이식 연구로부터 유래한 고체(solid) 이식 유세포 분석 크로스-매칭 관찰과 일치한다.

다음으로 동종(allogenic) 투여 후 생성된 기존 HLA-1 항체 및 DSA가 보체를 고정할 수 있는지, 그리하여 시험관 내 CDC를 유발할 수 있는지 여부를 이해하는 것이 목적이었다. 유세포 분석(FCtox)을 통한 CDC 분석은 7-AAD 통합이 세포 사멸 판독으로 확립된 곳에서 최적화되었다. DonA 및 DonB ASC가 있는 사전-감작된 및 새로운 DSA+ 환자(기준선 및 12주차)의 혈장 샘플을 기준 조건에서 또는 IFNγ 자극 전에 토끼 C3 보체의 존재 하에 인큐베이션했다. 사전-감작된 환자의 코호트에서 W12 샘플은 기저 및 IFNγ 조건 둘 모두에서 DonB(0-5% 7-ADD+ 세포)에서 적당한 세포독성 사멸을 유도했다. DonA ASC에서 볼 수 있듯이 동일한 샘플의 배양은 기저(2명의 환자) 및 IFNγ(3명의 환자) 조건에서 더 높은 세포독성 사멸을 유도했다(도 3B). 새로운(De novo) DSA+ W12 샘플은 또한 기준 조건에서 보체를 고정하고 세포독성 사멸을 유도할 수 있었다. 예상대로 IFNγ로 자극될 때 오직 DonA ASC에서만 더 높은 비율의 세포 사멸이 얻어졌다(도 3B). 이러한 데이터는 기존 HLA-클래스 I Abs와 DSA가 ASCs에 결합할 수 있고 DonA ASCs에서 특이적으로 적당한 CDC를 유도할 수 있음을 시사한다. 흥미롭게도 DonB는 사전-감작된 코호트나 새로운 DSA+ 코호트 모두에서 유의미한 세포 독성 비율을 유도하지 않았지만, 기준선에 비해 12주차에 세포 사멸이 증가하는 경향이 관찰되었다. 이에 대한 한 가지 가능한 설명은 이 연구에 사용된 두 기증자 사이에 공유된 HLA 다형성 대립유전자(alleles)의 존재일 수 있다. HLA 타이핑이 수행되었고 DonB가 DonA와 공통된 대립유전자(allele)를 공유한다는 것을 발견했다.

DonA 및 DonB의 DNA를 정제하고 HLA 대립유전자 특성화를 위해 LABType^®SSO 분석으로 테스트했다. 굵은 글씨로 DonA와 DonB가 공유하는 HLA-A 대립유전자가 표시된다(표 1 참조).

DonA typing	DonB typing
A*02:05 A*24:02	A*02:01 A*02:05
B*15:01 B*49:01	B*44:03 B*51:01
C*03:03 C*07:01	C*15:02 C*16:01
DRB1*01:01 DRB1*11:01 DQB1*03:01 DQB1*05:01 DQA1*01:01 DQA1*05:05	DRB1*07:01 DRB1*07:01 DQB1*02:02 DQB1*02:02 DQA1*02:01 DQA1*02:01

이 공유된 HLA 대립유전자는 DonB의 W12 샘플에서 증가된 세포독성 수준을 향한 경향에 대한 책임이 있을 수 있다.

ASC에서 mCRP의 높은 발현

DSA에 의해 영향을 받는 ASCs의 중간 정도의 사멸을 이해하기 위해 ASC가 세포독성 사멸에 대처 및/또는 회피할 수 있도록 하는 보체 억제 전략을 확인하기 위한 것이었다. 보체 신호전달 억제를 위한 한 가지 고전적인 메커니즘은 mCRPs CD46, CD55 및 CD59의 유도이다(Gancz and Fishelson, 2009;Ricklin et al., 2010;Tegla et al., 2011). 일부 저자들은 MSCs가 낮은 수준의 CD46 및 CD55를 발현하고 높은 수준의 CD59를 발현한다는 것을 보여주었지만, 다른 저자들은 MSCs가 모든 mCRPs의 중간 수준을 발현한다고 제안한다. 이 논쟁을 해결하기 위해 CD46, CD55 및 CD59 발현 수준을 IFNγ로 자극되거나 자극되지 않은 ASCs 패널에서 분석하고 발현 수준을 상업용 BM-MSCs와 비교했다(도 4A). CD46, CD55 및 CD59의 기준 수준은 BM-MSCs에 비해 ASCs에서 더 높은 것으로 관찰되었다. 이 생리학적으로 관련된 시나리오를 반복하기 위해 mCRP 수준을 ASC 면역 조절 반응의 중요한 매개체인 IFNγ(호-염증성 환경; pro-inflammatory environment)가 있는 상태에서 테스트했다. BM-MSCs에서 mCRP의 유의한 조절은 관찰되지 않은 반면, ASC는 IFNγ 자극 후에 강력하게 mCRP를 유도하는 것으로 나타났다. CD46 유도는 BM-MSCs에 비해 대략 2.14배 증가하는 ASCs에서 특히 두드러졌다. 위의 결과는 ASC가 기준 조건 하에서 mCRPs를 강력하게 발현하고 IFNγ의 존재하에 발현이 더욱 향상됨을 시사한다. 이것은 CDC의 음성적 조절에서 mCRP의 두드러진 역할을 제안하고 DSA-유도된 세포독성에 대처하기 위한 ASCs의 세포 보호 메커니즘을 암시한다. 이것은 DSA에 의해 부과된 적당한 살상 수준을 설명할 수 있다.

다른 ASC 기증자들에서 mCRP의 발현 패턴은 비슷했지만 일부 기증자들은 특정 mCRP의 특정 발현을 나타냈다(도 4B). 구체적으로, DonC는 다른 기증자들에 비해 더 높은 CD46 및 CD55 수준을 나타냈다; DonE 및 DonF는 우선적으로 CD55를 과-발현했다. mCRPs의 차등적 발현이 CDC에 대한 차등적 민감도에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 추가로 조사했다. 이에 답하기 위해, 이 ASC 기증자들 패널 사이에서 HLA-I 항원 발현의 동역학 및 그의 결합 친화도를 조사하였다. 이를 테스트하기 위해 ASC 기증자들은 rHLA-Class I W6/32의 증가된 농도에 처해졌다. 다음으로, 그들의 결합 친화도는 FACS를 통해 측정되었다(도 4C). 기준 조건(즉, DonC와 DonG를 10ng/mL W6/32로 비교할 때 12배 차이)에서 기증자들 간의 서로 다른 결합 친화도가 주목되었다. IFNγ 자극 후 HLA-1 항원은 증가된 W6/32 결합에 의해 지시된 바와 같이 ASC 기증자들에서 유도되었다(도 4C). 다시, 기증자들 간의 다양한 결합 친화도(DonB와 DonG를 비교할 때 10ng/mL에서 6.25배 차이)가 관찰되었다. 동시에, CDC 분석에 대한 다양한 ASC 기증자들의 민감도를 테스트했다. 기준 조건에서 DonE는 가장 높은 W6/32 농도에서 ~25%의 세포 사멸을 보였고, 나머지 기증자들에서는 더 낮은 비율을 나타내는 DonD 및 DonG를 제외하고 약 ~15%였다(도 4C). 예측한 바와 같이, IFNγ 자극 후 CDC 민감도 수준은 모든 ASC 기증자들에서 극적으로 증가했지만 CDC-매개된 세포 사멸에 상대적으로 내성을 유지한 DonB 및 DonC에서는 더 적은 정도로 증가했다(도 4C).

다음으로, 높은 W6/32 결합 친화도가 향상된 CDC 민감도와 상관관계가 있는지 여부를 결정하기 위한 것이었다. 이 상관 관계 분석을 수행하기 위해 W6/32 농도는 10 ng/mL로 설정되었는데, 이는 곡선의 전환 단계(transitional phase)를 구동하는 Ab 양이기 때문이다(지수 후 및 안정기 전; after exponential and before plateau). 기준 조건이나 IFNγ 자극된 시나리오에서 유의한 상관관계는 관찰되지 않았다(도 6A). 놀랍게도, 우리는 상대적으로 낮은 W6/32 Ab MFI 수준(낮은 결합)을 발현했음에도 불구하고 CDC에 대한 높은 민감도를 나타내는 ASC 기증자 그룹을 확인했다. 이것은 W6/32 Ab 결합과 CDC에 대한 민감성 사이에 절대적인 상관관계가 없음을 시사한다. 3개의 mCRPs 중 어느 것이 ASCs의 CDC 억제에 기여하는지 결정하기 위해 우리는 기준 및 IFNγ 조건 둘 모두에서 MFI 발현 수준과 10 ng/mL의 W6/32에 도달한 세포 사멸 수준을 연관시켰다(도 6B). 테스트한 mCRP 분자 중 어떤 것과도 기준 조건에서 양의 상관관계가 관찰되지 않았다. 그러나, IFNγ 자극 후, 더 낮은 CD46 및 CD55 수준이 더 높은 세포 사멸 수준과 유의하게 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 마지막으로, CD46 기울기 유의성은 CD55에 비해 약간 더 높았다.

CD46 고갈은 시험관 내 ASCs의 CDC 민감성을 증가시킴

CD55 또는 CD59와 비교하여 IFNγ 자극 후 CD46의 강력한 유도 및 CD46 대 CD55의 감소된 기증자 간(inter-donor) 가변성과 함께 세포독성 상관관계의 더 높은 중요성은 우리로 하여금 CD46 및 ASCs에 있어 CDC 민감도에 대한 그의 잠재적 영향에 대한 심층 분석을 수행하도록 촉발했다. 공개 게놈 브라우저를 사용하여 CD46(ncbi.nlm.nih.gov/gene 및 crispr.mit.edu)을 녹다운하기 위한 최상위 gRNA 서열을 확인했다. 최적의 가이드 RNA(gRNA) 서열은 높은 특이성과 낮은 표적 외(off-target) 점수의 두 가지 매개변수를 기반으로 선택되었다. 엑손 3을 표적으로 하는 2개의 최적 crRNAs(crRNA 1 및 crRNA2)가 효능 스크리닝을 위해 선택되었다. crRNA:tracrRNA-ATTO⁵⁵⁰:Cas9 복합체의 전달을 현미경 하에서 조사하였다. 24시간의 리포트랜스펙션 후 대다수의 ASCs가 높은 Cas9-매개된 이중-가닥 파손 이벤트와 상관관계가 있는 리보핵-단백질 복합체를 통합한 것으로 관찰되었다(도 6C). CRISPR-매개된 녹다운 효능을 확인하기 위해 ASC를 IFNγ의 존재 또는 부재하에 배양하고 FACS를 통해 CD46 발현을 분석했다. crRNA1의 효능은 정상 및 IFNγ 조건 둘 모두에서 crRNA2와 비슷했기 때문에 ASCs-CD46^KO 클론 생성을 위해 crRNA1을 선택했다(도 6D).

녹다운 특이성을 확인한 후, CD46의 선택적 고갈이 이를 세포독성 사멸에 민감하게 할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 낮은 CDC 민감도를 가진 한 기증자를 선택했다. DonB를 선택하고 기준 및 IFNγ 조건에서 W6/32-매개된 세포독성 분석을 수행했다(도 5A). CD46 녹-다운은 낮은 HLA-I 결합 및 후속 보체 고정으로 인한 것 같은 기준 조건(도 5A, 왼쪽 그래프)에서 세포독성 사멸의 적당한 증가를 유도했다. IFNγ 자극 후 부모(parental) ASCs에서 세포독성 사멸 비율의 상당한 부스트가 관찰되었으며, 이는 CD46^KO ASCs에서 더욱 강화되었다(도 5A, 오른쪽 그래프). 10 ng/mL W6/32의 생리학적 용량에서 부모(parental) ASCs에서 ~50% 7-AAD 양성 세포가 관찰되었으며 CD46 녹-다운은 사멸 비율을 최대 ~95%까지 증가시켰으며, 이는 CD46이 적어도 DonB에서는 세포독성 사멸을 방지하는 중요한 기능을 한다는 것을 시사한다.

CD46 세포독성 억제 기능이 다른 ASC 기증자들에서 효과적인지 여부를 테스트하기 위해 7명의 기증자의 패널에서 세포독성 분석을 수행하고 기준 조건(도 5B, 왼쪽 그래프)과 ASC IFNγ 자극 전(도 5B, 오른쪽)에서 평균 곡선을 플로팅했다. 그래프). 두 테스트 조건 모두에서 CD46^KO ASC 기증자들은 부모(parental) 대조군들과 비교하여 CDC에 대한 향상된 민감도를 나타냈다. 절반 최대 유효 농도(EC₅₀) 곡선의 왼쪽으로의 이동은 CDC를 유도하기 위해 W6/32 Ab 농도의 감소가 필요함을 의미하며, 이는 CDC에 대한 민감도 증가와 상관 관계가 있다. 다음으로, 곡선의 이동을 정량화하기 위해 W6/32 Ab의 EC₅₀을 계산했다(도 5C).

다음 표 2는 기준 및 IFNγ 조건에서 7개의 부모(parental) 및 해당 CD46^KO ASCs의 W6/32 Ab (ng/mL)의 최대 유효 농도의 절반을 보여준다. 4열과 7열에서 배수-변화 차이(CD46^KO EC₅₀/부모 EC₅₀)가 계산되었다.

		기준				IFNγ-유도
W6/32 EC 50 (ng/mL)		부모(parental)	CD46 KO	배수 변화		부모(parental)	CD46 KO	배수 변화
DonA		8.2	4.3	0.5		3.5	1.6	0.4
DonB		10.3	3.3	0.3		9.7	1.4	0.1
DonC		6.0	3.9	0.6		24.7	1.5	0.1
DonD		17.0	3.4	0.2		2.8	3.1	1.1
DonE		4.5	3.6	0.8		3.7	0.6	0.2
DonF		6.9	5.1	0.7		1.5	1.4	0.9
DonG		7.7	5.4	0.7		0.6	2.1	3.8

기준 조건에서 CD46^KO 기증자들은 부모(parental) 기증자들과 비교하여 감소된 EC₅₀을 나타내어 W6/32에 대한 더 높은 민감도를 시사한다(도 5C, 네 번째 열). IFNγ 조건에서 유사한 효과가 관찰되었으며(도 5C, 일곱 번째 열), 이는 CD46 발현이 시험관 내 ASCs에 대한 CDC 내성을 부여한다는 것을 확인시켜준다. 이 데이터는 CD46이 CDC를 매개하고 ASCs의 고갈이 향상된 CDC 민감도와 상관관계가 있음을 확인한다.

Claims (15)

1. 동종 요법(allogeneic therapy), 특히 감작된(presensitized) 환자의 치료 또는 동종 요법을 이용한 환자의 재치료에 적합한 줄기세포(stem cell; SC) 집단을 선택하기 위한 시험관 내(in vitro) 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
   a) SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도의 존재 하에서 SC 집단의 샘플(시험 샘플)을 배양하고, IFN-γ의 부존재 하에서 SC 집단의 샘플(대조 샘플)을 별도로 배양하는 단계;
   b) HLA-클래스 I 항체가 시험 샘플 및 대조 샘플에서 발현된 HLA-클래스 I에 결합하도록 하는 조건 하에서, 시험 샘플 및 대조 샘플을 상이한 농도 범위의 HLA-클래스 I 항체와 접촉시키는 단계;
   c) 결합된 HLA-클래스 I 항체가 보체로 포화되고 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity; CDC)이 유도되도록 시험 샘플 및 대조 샘플에 보체를 첨가하는 단계;
   d) 시험 샘플 및 대조 샘플에서 유도된 세포 용해를 측정하여 HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도 범위에 대한 CDC를 결정하는 단계;
   e) 시험 샘플 및 대조 샘플에서 최대 CDC의 50%를 유도하는 HLA-클래스 I 항체의 농도(EC⁵⁰ 값)를 결정하는 단계; 및
   f1) 대조 샘플의 EC₅₀ 값 대 시험 샘플의 EC₅₀ 값의 비(the ratio of the EC₅₀ value of the control sample to the EC₅₀ value of the test sample)가 1.25 미만, 바람직하게는 1.0 미만, 더 바람직하게는 0.5 미만, 특히 바람직하게는 0.25 미만인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계; 또는
   f2) 시험 샘플의 EC₅₀ 값이 적어도 3.5 ng/ml, 바람직하게는 적어도 9 ng/ml, 더 바람직하게는 적어도 15 ng/ml, 특히 바람직하게는 적어도 20 ng/ml의 HLA-클래스 I 항체인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 시험 샘플 및 대조 샘플에서 CD46 발현 수준을 결정하는 단계; 및 시험 샘플에서의 CD46 발현 대 대조 샘플에서의 CD46 발현의 비(the ratio of CD46 expression in the test sample to the CD46 expression in the control sample)가 2.0 초과, 바람직하게는 2.5 초과, 특히 바람직하게는 3.0 초과인 경우 동종 요법을 위한 SC 집단을 선택하는 단계를 더 포함하는 것인 시험관 내 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, SC 집단이 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC) 집단, 바람직하게는 인간 MSC 집단, 더 바람직하게는 중간엽 줄기세포 집단이 골수-유래 줄기세포(bone-marrow-derived stem cell; BM-MSC) 집단이거나, 또는 중간엽 줄기세포 집단이 지방조직-유래 줄기세포(adipose tissue-derived stem cell; ASC) 집단이고, 더욱 더 바람직하게는 ASC 집단은 CD29, CD73, CD90 및/또는 CD105를 발현하는 것인 시험관 내 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도가 약 0.5 내지 약 30 ng/ml, 바람직하게는 약 1 내지 약 15 ng/ml, 더 바람직하게는 약 2 내지 약 4 ng/ml, 바람직하게는 상기 SC 집단에서 최대 HLA-클래스 I 발현을 유도할 수 있는 IFN-γ 농도는, 바람직하게는 48시간의 기간에 걸쳐 적용되는, 3 ng IFN-γ/ml인 것인 시험관 내 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, HLA-클래스 I 항체가 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 HLA-클래스 I 항체가 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C에 특이적으로 결합하고, 더 바람직하게는 HLA-클래스 I 항체가 뮤린 단일클론 항체이고, 더욱 더 바람직하게는 HLA-클래스 I 항체가 HLA-A에 대하여 ATCC(명칭: HB-95) 또는 ECACC(No.: 84112003)로부터 입수가능한 하이브리도마 클론 w6/32에 의하여 생산된 항체와 본질적으로 동일한 결합 친화도를 가지고, 가장 바람직하게는 항체가 ATCC(명칭: HB-95) 또는 ECACC(No.: 84112003)로부터 입수가능한 하이브리도마 클론 w6/32에 의하여 생산되는 것인 시험관 내 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 2개 또는 3개의 상이한 농도의 HLA-클래스 I 항체가 사용되고, 바람직하게는 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 4개 또는 5개의 상이한 농도의 HLA-클래스 I 항체가 사용되고, 더 바람직하게는 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 6개 또는 7개의 상이한 농도의 HLA-클래스 I 항체가 사용되고, 더욱 더 바람직하게는 약 1 내지 약 50 ng/ml 범위 내에서 8개 또는 9개의 상이한 농도의 HLA-클래스 I 항체가 사용되고, 가장 바람직하게는 HLA-클래스 I 항체의 상이한 농도 범위는 1 ng/ml, 3 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml 및 50ng/ml인 것인 시험관 내 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1항의 단계 (c)에서 사용되는 보체가 혈청으로부터 유래한 것이고, 바람직하게는 혈청이 열로 처리되지 않은 것이고, 더 바람직하게는 혈청이 토끼, 염소 또는 양으로부터 유래한 것이고, 가장 바람직하게는 혈청은 토끼로부터 유래한 것인 시험관 내 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 보체가 혈청으로부터 유래하고 생성된 혈청 농도가 50 내지 83.33 %(v/v)이고, 바람직하게는 생성된 혈청 농도가 66.66 내지 83.33 %(v/v)인 것인 시험관 내 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나 항에 있어서, 세포 용해가 생존 또는 용해된 세포에 대해 선택적인 화학발광 또는 형광 염료 또는 용해된 세포로부터 방출된 방사성 제제를 측정함으로써 결정되는 것인 시험관 내 방법.
10. 동종 요법, 특히 감작된 환자의 치료 또는 동종 요법을 이용한 재치료에 적합한 SC 집단으로서, 하기 특성 중 어느 하나를 갖는 것인 SC 집단:
    i) 대조 샘플의 EC₅₀ 값 대 시험 샘플의 EC₅₀ 값의 비율(a ratio of the EC₅₀ value of the control sample to the EC₅₀ value of the test sample)이 1.25 미만, 바람직하게는 1.0 미만, 더 바람직하게는 0.5 미만, 그리고 특히 바람직하게는 0.25 미만임, 여기서 EC₅₀ 값은 제1항에 기재된 바와 같이 결정됨;
    ii) 시험 샘플의 EC₅₀ 값이 적어도 3.5 ng/ml HLA-클래스 I 항체, 바람직하게는 적어도 9 ng/ml, 더 바람직하게는 적어도 15 ng/ml, 특히 바람직하게는 적어도 20 ng/ml HLA-클래스 I 항체임, 여기서 EC₅₀ 값은 제1항에 기재된 바와 같이 결정됨; 및/또는
    iii) 시험 샘플에서의 CD46 발현 대 대조 샘플에서의 CD46 발현의 비율(a ratio of CD46 expression in the test sample to the CD46 expression in the control sample)이 2.0 초과, 바람직하게는 2.5 초과, 특히 바람직하게는 3.0 초과이고, 여기서 CD46 발현은 제2항에 기재된 바와 같이 결정됨.
11. 제10항에 있어서, SC 집단이 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 선택되고, 바람직하게 SC 집단이 중간엽 줄기세포(MSC) 집단이고, 더 바람직하게 SC 집단이 BM-MSC 집단 또는 ASC 집단이고, 더욱 더 바람직하게는 SC 집단이 인간 BM-MSC 집단 또는 인간 ASC 집단인 것인 SC 집단.
12. 제10항 또는 제11항에 따른 SC 집단 및 임의의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
13. 다음 단계를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법:
    a) 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 방법을 수행하는 단계;
    b) 선택된 SC 집단을 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화하는 단계.
14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 이를 필요로 하는 환자, 바람직하게는 감작된 환자 또는 재치료를 받고 있는 환자에서 동종 줄기세포 요법에 사용하기 위한 SC 집단으로서, 바람직하게는 이를 필요로 하는 환자는 누공(fistulas), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases), 뇌 및 척수 손상(brain and spinal cord injury), 심장 질환(heart diseases), 실명 및 시력 장애(blindness and vision impairment), 췌장 베타 세포 기능 상실(pancreatic beta cell loss of function), 연골 복구(cartilage repair), 골관절염(osteoarthritis), 근골격 질환(musculoskeletal diseases), 상처(wounds), 불임(infertility), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)과 같은 자가면역 질환(autoimmune diseases) 및 염증성 질환(inflammatory diseases)으로부터 선택되는 질환을 앓고 있고, 더 바람직하게는 질환은 누공(fistula)이고, 더욱 더 바람직하게는 질환은 복합 항문주위 누공(complex perianal fistula)인 것인 SC 집단.
15. 제10항 또는 제11항에 따른 SC 집단을 이를 필요로 하는 환자, 바람직하게는 감작된 환자 또는 재치료를 받고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 동종(allogeneic) 줄기세포 치료 방법으로서, 바람직하게는 이를 필요로 하는 환자는 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases), 뇌 및 척수 손상(brain and spinal cord injury), 심장 질환(heart diseases), 실명 및 시력 장애(blindness and vision impairment), 췌장 베타 세포 기능 상실(pancreatic beta cell loss of function), 연골 복구(cartilage repair), 골관절염(osteoarthritis), 근골격 질환(musculoskeletal diseases), 상처(wounds), 불임(infertility), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)과 같은 자가면역 질환(autoimmune diseases) 및 염증성 질환(inflammatory diseases)으로부터 선택되는 질환을 앓고 있고, 더 바람직하게는 질환은 누공(fistula)이고, 더욱 더 바람직하게는 질환은 복합 항문주위 누공(complex perianal fistula)인 것인 동종 줄기세포 치료 방법.

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