WO2010107285A2 - 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법 - Google Patents

양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법 Download PDF

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이황희
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    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)

Definitions

  • the present invention relates to fetal mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid, and more specifically to fetal mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid, a method for preparing the same, and a conditioned medium composition prepared using the same and a mass production method of human growth factor. It is about.
  • Stem cells are capable of differentiating into various cells through suitable environment and stimulation, and have self-proliferation ability.
  • Embryonic stem cells isolated from early embryos
  • Three types of embryonic germ cells isolated from embryonic primordial germ cells and multipotent adult progenitor cells (MAPC cells) isolated from adult bone marrow are best known. Since stem cells have the potential to develop into cells having characteristic phenomena and specialized functions, they have been the subject of research as cell resources for functional recovery of various organs.
  • adult stem cells are known to have the ability to differentiate into various cells.
  • Adult stem cells include bone marrow ( Science 276, 71-74, 1997; Science 284, 143-147, 1999; Science 287, 1442-1446, 2000), skeletal muscle ( Proc. Natl Acad. Sci USA 96, 14482-14486, 1999; Nature 401, 390-394, 1999) and Fat tissue ( Tissue Eng 7, 211-228, 2001; J. Cell.Physiol . 206, 229-237, 2006 ), Each of which can differentiate into similar lines.
  • Mesenchymal stem cells derived from bone marrow a type of adult stem cell, have been used for a long time and have been proven to be effective.
  • recent studies have shown that cells isolated from adipose or other tissues have similar characteristics to bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • isolation and the acquisition of large amounts of cells are difficult, so there is an urgent need for other alternative sources.
  • the present inventors focused on the amniotic fluid that can be easily separated without harming the mother or the fetus.
  • amniotic fluid contains a mixture of substances from the fetus's body, the amniotic fluid can be analyzed to determine whether the fetus's chromosomes are abnormal or not infected with bacteria. Amniotic fluid not only keeps the fetus free to move, but also protects the fetus from external shocks and stimuli, prevents bacterial infections, and helps to regulate the body's body temperature.
  • amniotic fluid tests various information on the health of the fetus. At this point, the amniotic fluid can be extracted without harming the mother from the beginning of pregnancy until after the birth. The cells used in the test are discarded after the test. If the patient's consent is obtained, the cells can be used for research purposes.
  • amniotic cells have the advantage of easily obtaining a large amount of cells compared to other adult stem cells that have been studied previously.
  • phenomena that increase cell growth occur when ammonia-derived fetal-derived mesenchymal stem cells are cultured for a certain period of time, and the medium is extracted and put into fibroblasts.
  • mesenchymal stem cells from the amniotic fluid of fetal stem cells and characterized them.
  • identifying what components are in conditioned media made from amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells confirming the effect of conditioned media in fibroblasts, and establishing a method to mass-produce growth factors using them.
  • the invention has been completed.
  • One object of the present invention is to provide fetal mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing fetal mesenchymal stem cells derived from the amniotic fluid.
  • Still another object of the present invention is to provide a conditioned medium composition using the fetal-derived mesenchymal stem cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for mass production of human growth factors using the fetal-derived mesenchymal stem cells.
  • the present invention since a mesenchymal stem cell having a multipotency can be obtained by culturing from the amniotic fluid derived from amniotic fluid, another source other than bone marrow mesenchymal stem cells is possible.
  • the present invention suggests the feasibility of amniotic fetal-derived cells as multipotent mesenchymal stem cells and enables a method of producing a large amount of growth factors in conditioned medium of fetal-derived mesenchymal stem cells in amniotic fluid.
  • Figure 1 shows the fetal-derived cell line in the amniotic fluid has various shapes (heterogenous population; indicated by ad) and mesenchymal stem cells of the same shape (homogenous enrichment: e) through two or three sub-cultures. To change to.
  • Figure 2 is the result of karyotype of the amniotic fluid of fetal derived cells isolated from mother.
  • the sex chromosome came out as XY, indicating that it came from the amniotic fetus, not from the mother.
  • Figure 3 shows the results of analyzing the immunological phenotype of the cells through a flow cytometry that the amniotic fluid-derived fetal cells (B) have similar characteristics to human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (A).
  • Figure 4 shows that the fetal-derived cells in the amniotic fluid has a differentiation capacity similar to that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells with multipotency, through differentiation into fat (A), bone (B), cartilage (C). .
  • FIG. 5 illustrates the use of DMEM / F12-serum free medium to produce conditioned medium using established amniotic fetal-derived mesenchymal stem cells (A), each of which shows 5 ⁇ 10 4 (a) and 1 ⁇ 10 cell appearances. 5 (b), 2.5x10 5 (c) and 5x10 5 (d) according to the number of cells observed under the microscope. (B) shows the results of CFU-assay when seeding each cell per cm 2 .
  • 6 to 8 show the effect of a large amount of growth factors present in the conditionally conditioned medium obtained from the established amniotic fetal-derived mesenchymal stem cells on the growth of fibroblasts.
  • Figure 9 shows that a large amount of growth factor is produced through the antibody arrary protein composition analysis through the production of conditioned medium from the established amniotic fetal-derived mesenchymal stem cells.
  • A DMEM / F12-serum free medium
  • B DMEM / F12-serum free conditioned medium.
  • the present invention as one embodiment relates to a method for producing fetal mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid. More specifically, the method for producing mesenchymal stem cells having the following characteristics, characterized in that the fetal stem cells derived from amniotic fluid in FBS (fetal bovaine serum) and bFGF (basic fibroblast growth factor) -containing medium, and then recovered It is about:
  • FBS fetal bovaine serum
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • (c) has the ability to differentiate into mesodermal derived cells.
  • MSCs meenchymal stem cells
  • Amniotic fluid from the mother contains many chemicals from the fetus's body that can produce most of the cells in the body and are easy to harvest.
  • heterologous (heterogenous) cells exist in the amniotic fluid, and the present inventors have confirmed that there are homogenous mesenchymal stem cells having the same shape as fibroblasts characteristic of mesenchymal stem cells.
  • culture media refers to a medium that enables the growth and survival of fetal-derived cells in amniotic fluid in vitro and is suitable for the culture of fetal-derived cells in amniotic fluid. It includes all conventional media used in the field. Depending on the type of cells, medium and culture conditions can be selected.
  • the medium used for the culturing is preferably a cell culture minimum medium (CCMM), and generally includes a carbon source, a nitrogen source and a trace element component.
  • CCMM cell culture minimum medium
  • Such cell culture minimal media include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basic Medium Eagle (BME), RPMI1640, F-10, F-12, ⁇ Minimal Essential Medium (GMEM) (Glasgow's Minimal essential Medium) and IMEM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), but are not limited thereto.
  • the medium may include antibiotics such as penicillin, streptomycin, or gentamicin.
  • fetal mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid can be obtained by culturing cells isolated from amniotic fluid in basal medium containing FBS and bFGF, preferably in low glucose DMEM medium containing 10% FBS. It can be obtained by incubating by adding 4ng / ml bFGF.
  • the low glucose DMEM medium may further comprise 4ng / ml bFGF solution with 10% FBS, 1% L-glutamine and 1% penicillin-streptomycin.
  • the present invention is characterized in that the amniotic cells are derived from the fetus.
  • the cells in the amniotic fluid are cells derived from the fetus through karyotyping. In the amniotic fluid, not only the fetus but also some maternal cells may be present. In the present invention, it was possible to confirm that the amniotic cells are male-derived cells through chromosome analysis (FIG. 2).
  • amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells prepared by the method of the present invention (a) show positive immunological characteristics with respect to CD13, CD29 and CD44, and (b) are attached to the cell culture dish to grow and grow fibroblasts. It is characterized by the morphological characteristics of the spindle-shape, which is a typical shape of, and (c) having the ability to differentiate into mesodermal derived cells.
  • the term “differentiation” refers to a phenomenon in which a cell's structure or function is specialized during cell division and proliferation.
  • Pluripotent mesenchymal stem cells can differentiate into lineage-defining progenitor cells (eg, mesodermal cells) and then further differentiate into other forms of progenitor cells (eg, osteoblasts, etc.), followed by specific tissues (eg, May be differentiated into terminal differentiated cells (eg, adipocytes, bone cells, chondrocytes, etc.) that play a characteristic role in bones, etc.
  • the amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells of the present invention have the ability to differentiate into adipocytes, osteoblasts and chondrocytes.
  • the differentiation medium into adipocytes is high glucose DMEM, 1 mM dexamethasone, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methyl-caffeine (3-isobutyl-1-methyl-xanthine). , 10 ng / ml insulin, 100 mM indomethacin and 10% FBS.
  • the differentiation medium into osteoblasts may be made of high glucose DMEM, 100 mM dexamethasone, 10 mM ⁇ -glycerophosphate, 0.2 mM ascorbate and 10% FBS. have.
  • the differentiation medium into chondrocytes is high glucose DMEM, 0.1 M dexamethasone, 50 g / ml AsA, 100 g / ml Sodium pyruvate, 40 g / ml Proline, 10 ng / ml TGF-1 and 50 mg / ml ITS premix [6.25 g / ml insulin, 6.25 g / ml transferrin, 6.25 g / ml selenius acid , 1.25 mg / ml BSA and 5.35 mg / ml linoleic acid].
  • the mesenchymal stem cells derived from the amniotic fluid in each differentiation medium were cultured for 7 to 28 days, and in this way, the amniotic fetal cells derived from the amniotic fluid have the characteristics of mesenchymal stem cells.
  • the fetal-derived cells in the amniotic fluid are cells having the properties of mesenchymal stem cells, and this can be used as a source of other cells other than bone marrow.
  • the present invention relates to amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells produced by the above method and exhibiting the following characteristics.
  • (c) has the ability to differentiate into mesodermal derived cells.
  • the present invention provides a method for treating a fetus, comprising: (a) isolating fetal derived cells in amniotic fluid obtained from a mother; (b) subcultured in medium containing FBS and bFGF to obtain fetal derived mesenchymal stem cells in amniotic fluid; And (c) culturing the obtained intrauterine fetal derived mesenchymal stem cells in a serum-free medium for 2 days to 7 days to prepare a conditioned medium. It relates to a method for producing a large amount.
  • the present invention is cultured in appropriate media and conditions for fetal derived mesenchymal stem cells extracted from human amniotic fluid human growth factors, such as Apo-1 / Fas, epidermal growth factor (EGF), IP-10 ( Interferon- ⁇ inducible protein-10), leptin, MIP4, MMP3, Rantes, interferon-gamma (IFN ⁇ ), human transforming growth factor-beta (TGF- ⁇ ), tumor necrosis factor-alpha ( TNF ⁇ ), tumor necrosis factor receptor I (TNFRI), tumor necrosis factor receptor II (TNFRII), cell adhesion factor-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion factor-1 (VCAM-1), vascular endothelial growth factor (VEGF), interleukin-1beta (IL-1 ⁇ ), interleukin-1 receptor alpha (IL-1R ⁇ ), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL- 7, IL-8, IL-12, IL
  • the mesenchymal stem cells obtained from amniotic fluid containing Ham's F-12 nutrient mixture containing amino acids or their analogues and vitamins or their analogs It is preferable to use a serum culture medium.
  • Serum-free medium containing Ham's F-12 nutrient mixture according to the present invention is based on DMEM without a pH indicator such as phenol red and Ham's F-12 nutrient mixture is added at a ratio of approximately 1: 0.5-2. .
  • an oxidative source such as L-glutamine
  • an energy metabolite such as sodium pyruvate
  • a carbon regulator such as sodium bicarbonate.
  • This mixed solution is used to help maintain the growth and homeostasis of cells and to secrete various minerals and amino acids that are involved in improving cell stability and maintenance in subculture after initial culture of mesenchymal stem cells. Vitamin-based nutrients and other factors, which can promote higher production of the factor, are formed in a proportion.
  • the embryo-derived cells isolated from the amniotic fluid obtained from the mother are passaged in medium containing FBS and bFGF to obtain the fetal-derived mesenchymal stem cells in the amniotic fluid, followed by DMEM / F-12 serum-free medium.
  • Conditioned medium was prepared by centrifugation and filtration of the culture solution obtained by culturing for 3 days with different numbers of amniotic cells at (FIG. 5).
  • the present invention relates to a conditioned medium composition of amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells.
  • conditioned medium refers to a cell growth suspension in which the cells are subjected to liquid suspension culture, and then, when the apoptotic growth phase is reached, the dividing cells are removed by centrifugation or filtration, and only the culture medium is collected and mixed with the culture substrate.
  • apoptotic growth phase is reached, the dividing cells are removed by centrifugation or filtration, and only the culture medium is collected and mixed with the culture substrate.
  • a badge This uses an unknown growth factor that is extracted in the medium from the dividing cells, and is widely used for low density cell plating or protoplast culture.
  • the conditioned medium composition of the present invention is a composition comprising a solution from which fetal-derived mesenchymal stem cells are removed from a medium in which fetal-derived mesenchymal stem cells are cultured, and derived from fetal-derived mesenchymal stem cells.
  • composition containing abundant growth factors such as Apo-1 / Fas, epidermal growth factor (EGF), IP-10 (Interferon- ⁇ inducible protein-10), leptin, MIP4, MMP3, Rantes, Interferon-gamma (IFN ⁇ ), human transforming growth factor-beta (TGF- ⁇ ), tumor necrosis factor-alpha (TNF ⁇ ), tumor necrosis factor receptor I (TNFRI), tumor necrosis Factor Receptor II (TNFRII), Cell Attachment Factor-1 (ICAM-1), Vascular Attachment Factor-1 (VCAM-1), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Interleukin-1 Beta (IL-1 ⁇ ), Interleukin -1 receptor alpha (IL-1R ⁇ ), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 and IL-15 Include.
  • IFN ⁇ Interferon-gamma
  • TGF- ⁇ human transforming growth factor-beta
  • the present invention relates to a composition containing a large amount of growth factors, preferably ApoI / Fas, EGF, IP-10, Leptin, MIP4, MMP3, Rantes, IFN ⁇ , TGF ⁇ , TNF ⁇ , TNFRI, TNFRII, ICAM-1, VCAM-1, VEGF, IL-1 ⁇ , IL-1R ⁇ , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7 , To IL-8, IL-12 and IL-15.
  • growth factors preferably ApoI / Fas, EGF, IP-10, Leptin, MIP4, MMP3, Rantes, IFN ⁇ , TGF ⁇ , TNF ⁇ , TNFRI, TNFRII, ICAM-1, VCAM-1, VEGF, IL-1 ⁇ , IL-1R ⁇ , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7 , To IL-8, IL-12 and
  • the composition of the present invention was found to be useful as a medium for cell growth (FIGS. 6 to 8).
  • Example 1 Confirmation of allogeneic mesenchymal stem cell shape using culture and culture conditions of amniotic fetal stem cell line obtained from mother
  • Amniotic fetal-derived cell lines had a variety of shapes (heterogenous population) (FIG. 1A: a-d), and after two or three passages, only one fibroblast was shown (FIG. 1A: e).
  • the medium was changed every 2 to 3 days and the passage was cultured when the cell density of 80 ⁇ 90%.
  • Example 2 Identification of fetal stem cells from amniotic fluid through karyotyping
  • Karyotyping is the number, size, and shape of chromosomes, called karyotypes, and chromosome mutations and sex can be determined by examining the chromosomes of the fetus.
  • chromosomes were analyzed by stopping cell division with colcemid for 1 to 2 hours and observing by G-banding staining.
  • the fetal-derived cells in the amniotic fluid have normal chromosomes and the sex chromosomes are XY, indicating that the cells are derived from the fetus rather than the mother (FIG. 2).
  • amniotic fluid derived from amniotic fluid has the characteristics of multipotent mesenchymal stem cells.
  • Amniotic fetal-derived cells are differentiated like human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and bones are identified by osteopontin and osteocalcin, which are genes that are specifically expressed as bone forms.
  • the fetal-derived cells in the amniotic fluid are cells having characteristics similar to those of the bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • the conditions for production of conditioned media by cell number from established amniotic fetal derived mesenchymal stem cells were established.
  • the established mesenchymal stem cells were trypsinized in a 100 mm cell culture dish and separated from the bottom. Collected cells were collected in a 15ml tube and centrifuged. The collected cells were released in 5 ⁇ 10ml medium and mixed well. 20 ⁇ l of the cell suspension in the tube was measured using a hematocytometer, and then, low glucose DMEM was composed of 10% FBS, 1% L-glutamine, 1% penicillin-streptomycin and 4 ng / ml bFGF. the 5x10 4, 1x10 5, 2.5x10 5 , 5x10 5 cells in the basal medium were seeded in 100mm cell culture dish.
  • the dogs were changed to each DMEM / F12 serum-free medium and cultured for 3 days to make a conditioned medium to examine the effect on the growth of fibroblasts.
  • the growth rate of the cells was compared with that of CM (2.5x10). 5 It was confirmed that the growth of the cells is the highest) in Figure 6).
  • the growth cycle of the cells when they were cultured by treating the skin-derived fibroblasts was confirmed by PI staining.
  • CM (2.5x10) 5 ) was found to be the highest 13.83% in the S phase (proliferation period) (Fig. 7).
  • Real-time PCR confirmed the expression of genes related to S phase during the growth cycle of the cells, and showed that the gene expression of the cells of the CM-treated group showed an increased pattern.
  • CM derived from 250,000 amniotic fluid cells was confirmed to increase the growth of the cells (Fig. 8). Based on the results of these experiments, it was possible to establish the optimal culture conditions by confirming that the expression of proteins involved in the proliferation of cells increased.
  • the amount of the protein was measured by using antibody arrary. Growth factor and protein were not expressed in DMEM / F12 serum-free medium but not in conditioned medium (FIG. 9A), and the components of DMEM / F12 serum-free conditioned medium were analyzed for cell growth factor and proliferation. A total of 36 proteins involved in TGF ⁇ , VEGF, EGF, TNF ⁇ , IL8, IL6, MMP3 were analyzed to contain many growth factor factors (FIG. 9B).

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Abstract

본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포, 이의 제조방법, 이를 이용하여 제조한 컨디션드 배지 조성물 및 인간 성장인자의 대량생산 방법에 관한 것이다.

Description

양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법
본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포, 이의 제조방법, 이를 이용하여 제조한 컨디션드 배지 조성물 및 인간 성장인자의 대량생산 방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 적합한 환경 및 자극을 통해 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며, 자가증식 능력을 갖추고 있는 세포로서, 초기 배아에서 분리한 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ES 세포), 배아기의 원시 생식세포에서 분리한 배아 생식세포(embryonic germ cell. EG 세포), 및 성체의 골수에서 분리한 다능성 성체줄기세포(multipotent adult progenitor cell, MAPC 세포)의 3종이 가장 잘 알려져 있다. 줄기세포는 특징적인 현상과 특화된 기능을 가지는 세포로 발달하는 잠재력을 가지고 있으므로, 각종 장기에 대한 기능회복을 위한 세포자원으로서 연구의 대상이 되고 있다.
지금까지 알려진 바에 의하면 성체줄기세포는 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진다고 알려져 있다. 성체줄기세포는 골수(bone marrow) (Science 276, 71-74, 1997; Science 284, 143-147, 1999; Science 287, 1442-1446, 2000), 골격근(skeletal muscle) (Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 14482-14486, 1999; Nature 401, 390-394, 1999)와 지방조직(Fat tissue) (Tissue Eng 7, 211-228, 2001; J. Cell. Physiol. 206, 229-237, 2006)에서 분리하였으며, 이들은 각각 유사한 계통으로 분화가 가능하다.
성체 줄기세포의 종류인 골수에서 유래한 중간엽줄기세포는 오래전부터 사용되어 오고 있고 효과도 입증이 된 세포이다. 또한, 최근에는 지방조직이나 다른 조직에서 분리한 세포들도 골수유래 중간엽줄기세포와 비슷한 특성을 가지고 있다는 연구 결과가 나오고 있다. 그러나 분리 및 다량의 세포 획득이 어려워 다른 대체할 수 있는 소스가 시급히 필요하다.
이에, 본 발명자들은 산모나 태아에게 해롭지 않게 쉽게 분리 가능한 양수에 초점을 맞추어 연구하였다.
수정란이 수정 후 자궁벽에 착상한 다음 수일이 지나게 되면 배아는 양수로 채워진 양막낭에 둘러싸이게 된다. 양수에는 태아의 몸으로부터 나온 여러 물질들이 섞여 있으므로, 양수를 분석함으로써 태아의 염색체에 이상이 있는지, 세균에 감염되지 않았는지 등을 알 수 있다. 또한 양수는 태아가 자유롭게 움직이게 할 뿐만 아니라, 외부에서 오는 충격과 자극으로부터 태아를 보호하고, 세균 감염을 막으며, 또한 태아의 체온 조절을 도와준다.
태아가 태어나기 전에 양수를 통하여 태아의 건강에 대한 여러 가지 정보를 알아보는 검사를 하는데, 이 때 임신이 시작되는 순간부터 출산 직후까지 모체에 해를 끼치지 않고 양수를 추출할 수 있다. 이렇게 검사에 사용된 세포는 검사 후 폐기하게 되는데 환자의 동의를 얻을 경우 폐기하지 않고 연구용 목적으로 사용할 수 있다. 따라서 양수 세포는 기존에 연구되어 오던 다른 성체줄기세포에 비해 쉽게 다량의 세포를 획득할 수 있다는 장점을 가진다. 그러나 아직까지 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 일정기간 동안 배양하여 배지를 추출하고 이를 섬유아세포에 넣어주었을 때 세포 성장을 증가시키는 현상이 일어나는지에 대해 개시된 바가 없다.
본 발명자들은 양수 내 태아 유래 세포에서 중간엽줄기세포을 분리하였으며 그 특징을 규명하였다. 또한, 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용하여 만든 컨디션드 배지에 어떠한 성분들이 있는지 밝히고 섬유아세포에서 컨드션드 배지의 효과를 확인하고 이를 이용하여 성장인자를 대량생산 할 수 있는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 컨디션드 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용하여 인간 성장인자를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 양수 내 태아 유래 세포로부터 배양을 하여 다분화능이 있는 중간엽줄기세포를 얻을 수 있기 때문에 골수 중간엽줄기세포 이외의 또 하나의 원천이 가능하도록 한다. 즉, 본 발명은 양수 내 태아 유래 세포는 다분화성 중간엽줄기세포로서의 가능성을 제시하고 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지내의 성장인자를 대량으로 생산 하는 방법을 가능하게 한다.
도 1은 양수 내 태아 유래 세포주는 다양한 모양의 (heterogenous population; 화살표 표시: a-d)형태를 나타내며 2~3번의 계대배양(sub-culture)을 통하여 동일한 모양(homogenous enrichment: e)의 중간엽줄기세포로 바뀌는 것을 나타낸 것이다.
도 2는 산모에서의 분리한 양수내 태아 유래 세포의 핵형분석(karyotype)한 결과이다. 성염색체가 XY로 나왔으며 이것은 산모가 아닌 양수 내 태아에게서 유래된 것임을 보여주는 결과이다.
도 3은 세포의 면역학적 표현형을 유세포 분석기를 통해 양수 내 태아 유래 세포(B)가 인간 골수유래 중간엽줄기세포(A)와 비슷한 특징을 가지고 있음을 분석한 결과를 보여주는 것이다.
도 4는 양수 내 태아 유래 세포가 다분화능을 가진 골수유래 중간엽줄기세포와 비슷한 분화능을 가지고 있음을, 지방(A), 뼈(B), 연골(C)로의 분화를 통해서 확인한 결과를 보여주는 것이다.
도 5는 확립된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용하여 컨디션드 배지를 생산을 하기 위해 DMEM/F12-serum free 배지를 사용하였고(A), 각각, 세포 모습을 5x104 (a), 1x105 (b), 2.5x105 (c)와 5x105 (d) 개의 세포 수에 따라 현미경으로 관찰한 모습을 나타낸 것이다. (B)는 cm2당 각각의 세포를 seeding을 하였을 때의 CFU-assay 결과를 나타낸 것이다.
도 6 내지 도 8은 확립된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에서 얻은 조건별 컨디션드 배지에 존재하는 다량의 성장인자들이 섬유아세포의 성장에 미치는 효과를 보여주는 것이다.
도 9은 확립된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포로부터 컨디션드 배지의 생산을 통해 단백질 성분 분석을 antibody arrary을 통해 다량의 성장인자가 생산되고 있는 것을 보여주는 것이다. (A) DMEM/F12-serum free 배지 (B) DMEM/F12-serum free 컨드션드 배지.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 양수 내 태아 유래 세포를 FBS(fetal bovaine serum) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor) 함유 배지에서 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, 다음과 같은 특성을 나타내는 중간엽줄기세포의 제조방법에 관한 것이다 :
(a) CD13, CD29 및 CD44 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타냄;
(b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및
(c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
본 발명에서 용어, "중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)"라 함은 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다.
산모로부터 얻은 양수에는 태아의 몸으로부터 나온 여러 가지 화학물질들이 포함되어 인체에 있는 대부분의 세포를 생성할 수 있고 채취가 쉬운 편이다. 또한, 양수에는 이종(heterogenous) 모양의 세포들이 존재하는데, 본 발명자들은 그 중에서 중간엽줄기세포의 특징인 섬유아세포와 같은 모양을 가지는 동종(homogenous) 의 중간엽줄기세포가 존재한다는 것을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "배지(culture media)"는 인 비트로(in vitro)에서 양수 내 태아 유래 세포들의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 양수 내 태아 유래 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 및 IMEM( Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포는 양수에서 분리한 세포들을 FBS 및 bFGF 를 함유하는 기본 배지에서 배양함으로써 수득할 수 있으며, 바람직하게는 10% FBS가 포함된 로우 글루코즈 DMEM 배지에 4ng/ml bFGF를 첨가하여 배양함으로써 수득할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예로서, 상기 로우 글루코즈 DMEM 배지는 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토 마이신과 4ng/ml bFGF 용액을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 양수 내 세포가 태아에서 유래하였음을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 양수 내 세포를 핵형분석을 통하여 태아에서 유래한 세포임을 확인이 가능하다. 양수에는 태아의 것 뿐만 아니라 산모의 세포도 일부 존재할 수 있어, 본 발명에서는 양수 내 세포가 태아에서 유래한 세포라는 것이 염색체 분석을 통하여 남성임을 확인함으로써 가능하였다 (도 2).
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포는 (a) CD13, CD29 및 CD44 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타내고 (b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며 섬유아세포의 전형적인 모양인 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, 및 (c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어,“분화(differentiation)”란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 다능성 중간엽줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 중배엽성 세포)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고(예컨대, 골모세포 등), 그 뒤 특정 조직(예컨대, 뼈 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 지방세포, 골세포, 연골세포 등)로 분화될 수 있다. 바람직한 양태로서, 본 발명의 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포는 지방세포(Adipocyte), 골세포(Osteoblast) 및 연골세포(Chondrocyte)로의 분화능을 가진다.
본 발명의 구체적인 실시예로서, 상기 지방세포로의 분화 배지는 하이 글루코우즈 DMEM, 1 mM 덱사메타손(dexamethasone), 0.5 mM 3-아이소부틸-1-메틸-카페인(3-isobutyl-1-methyl-xanthine), 10 ng/ml 인슐린(insulin), 100 mM 인도메타신(indomethacin)과 10% FBS를 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예로서, 상기 골세포로의 분화 배지는 하이 글루코우즈 DMEM, 100 mM 덱사메타손(dexamethasone), 10 mM β-글리세로포스페이트, 0.2 mM 아스코르베이트와 10% FBS를 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예로서, 상기 연골세포로의 분화 배지는 하이 글루코우즈 DMEM, 0.1 M 덱사메타손(dexamethasone), 50g/ml AsA, 100 g/ml 소디윰 퓨로베이트(sodium pyruvate), 40 g/ml 프롤린(proline), 10 ng/ml TGF-1과 50 mg/ml ITS프리믹스[6.25 g/ml 인슐린(insulin), 6.25 g/ml 트랜스페린(transferrin), 6.25 g/ml 셀레니어스 엑시드(selenius acid), 1.25 mg/ml BSA와 5.35 mg/ml 리놀레릭 엑시드(linoleic acid)]를 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명에서는 상기 각 분화별 배지에서의 양수 내 태아 유래의 중간엽줄기세포를 7일 내지 28일 동안 배양하였으며, 이러한 방법으로 양수 내 태아 유래 세포가 중간엽줄기세포의 성격을 가지고 있음을 확인할 수 있었다 (도 4). 따라서, 본 발명에서는 양수 내 태아 유래 세포가 중간엽줄기세포의 성질을 가진 세포이며, 이를 골수 이외의 또 다른 세포의 원천으로 이용하는 것이 가능해진다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 방법에 의하여 제조되고, 다음과 같은 특성을 나타내는 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에 관한 것이다.
(a) CD13, CD29 및 CD44 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타냄;
(b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및
(c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 산모로부터 얻은 양수 내에서 태아 유래 세포를 분리하는 단계; (b) FBS 및 bFGF 함유 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 무혈청 배지에 2일 내지 7일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계를 포함하는, 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포로부터 인간 성장인자를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명은 인간의 양수에서 추출된 태아 유래 중간엽줄기세포를 적정한 배지 및 조건에서 배양하여 인간 성장인자, 예를 들어 Apo-1/Fas, 표피세포 성장인자(EGF), IP-10(Interferon-γ inducible protein-10), 렙틴(Leptin), MIP4, MMP3, 란테스(Rantes), 인터페론-감마(IFNγ), 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNFα), 종양괴사인자 수용체 Ⅰ(TNFRⅠ), 종양괴사인자 수용체Ⅱ(TNFRⅡ), 세포부착인자-1(ICAM-1), 혈관세포부착인자-1(VCAM-1), 맥관내피세포 성장인자(VEGF), 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-1 수용체 알파(IL-1Rα), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 및 IL-15 등을 합성할 수 있도록 조작하는 방법을 제공한다. 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지를 이용하여 이차원 항체 어레이(antibody arrary)을 통하여 성분을 밝히고 인비트로(in vitro) 상에서 확인이 가능하다.
본 발명에서는 태아 유래 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지를 얻기 위하여, 양수에서 분리하여 수득한 중간엽줄기세포를 아미노산 또는 그 유사체와 비타민 또는 그 유사체를 포함하는 Ham's F-12 영양소 혼합액을 함유하는 무혈청 배양배지를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 Ham's F-12 영양소 혼합액을 함유하는 무혈청배지는 페놀 레드 등의 pH 지시약이 첨가되지 않은 DMEM을 기본으로 하고 Ham's F-12 영양소 혼합액을 대략 1: 0.5 ~ 2의 비율로 첨가한다. 이 때 L-글루타민 등의 산화영양원, 소디움 피루베이트 등 에너지 대사물질, 소디움 바이카보네이트 등의 탄소조절원을 첨가하는 것이 가능하다. 본 혼합액은 세포의 성장과 항상성 유지를 돕고 중간엽줄기세포의 초기배양 후 계대배양에 있어 세포의 안정성과 유지력 증진에 관여되는 여러 가지의 무기질과 아미노산들, 태아 유래 중간엽줄기세포에서 분비되는 성장인자의 더 높은 생산을 촉진할 수 있는 비타민 계열의 영양소들과 다른 인자들이 일정한 비율로 혼합하여 형성된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 산모로부터 얻은 양수 내에서 분리한 태아 유래 세포를 FBS 및 bFGF 함유 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 수득한 후, DMEM/F-12 무혈청 배지에서 양수 세포의 수를 다르게 하여 3일 동안 배양하여 얻은 배양액을 원심분리 및 여과하여 컨디션드 배지를 제조하였다 (도 5).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "컨디션드 배지(conditioned medium)" 란 세포를 액체현탁배양하여 세포분열최성기인 대수성장기에 도달했을 때 분열세포를 원심분리 또는 여과하여 제거하고 배양액만 채취하여 이를 배양기질에 혼합한 배지를 말한다. 이는 분열중인 세포로부터 배지 내에서 추출되어 나오는 미지의 성장요소(growth factor)를 이용하는 것으로서, 저밀도의 세포 플레이팅이나 원형질체 배양에 많이 이용된다.
본 발명의 목적상, 본 발명에서의 컨디션드 배지 조성물이란 태아 유래 중간엽줄기세포를 배양한 배지에서 태아 유래 중간엽줄기세포를 제거한 용액을 포함하는 조성물로서, 태아 유래 중간엽줄기세포에서 유래한 성장인자 등의 물질이 풍부하게 함유되어 있는 조성물을 말하며, 바람직하게는 Apo-1/Fas, 표피세포 성장인자(EGF), IP-10(Interferon-γ inducible protein-10), 렙틴(Leptin), MIP4, MMP3, 란테스(Rantes), 인터페론-감마(IFNγ), 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNFα), 종양괴사인자 수용체 Ⅰ(TNFRⅠ), 종양괴사인자 수용체Ⅱ(TNFRⅡ), 세포부착인자-1(ICAM-1), 혈관세포부착인자-1(VCAM-1), 맥관내피세포 성장인자(VEGF), 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-1 수용체 알파(IL-1Rα), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 및 IL-15 을 포함한다.
따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 다량의 성장인자를 함유한 조성물에 관한 것으로, 바람직하게는, ApoI/Fas, EGF, IP-10, Leptin, MIP4, MMP3, Rantes, IFNγ, TGFβ, TNFα, TNFRⅠ, TNFRⅡ, ICAM-1, VCAM-1, VEGF, IL-1β, IL-1Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 및 IL-15 를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 컨디션드 배지의 효과를 확인하기 위하여, 상기와 같은 방법으로 제조된 컨디션드 배지에 피부 유래 섬유아세포를 처리하여 배양한 결과 세포의 성장주기 중 S 기와 관련된 유전자의 발현이 증가하였고, 따라서 본 발명의 조성물이 세포성장용 배지로 유용함을 알 수 있었다 (도 6 내지 도 8).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 산모로부터 얻은 양수 내 태아 유래 세포주의 배양 및 배양 조건을 이용한 동종의 중간엽줄기세포 모양을 확인
산모로부터 얻은 양수 내에는 많은 부유물들이 많이 있다. 그것을 분리하기 위하여 양수를 T-flask에 담고 37℃에서 배양(incubation)을 하였다. 다음날 바닥에 붙은 세포만 제외하고 나머지는 제거를 하였다. 바닥에 붙은 세포를 트립신을 이용하여 바닥에서 분리를 시킨 후 원심분리를 하여 모은 후, 로우 글루코즈(low glucose) DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 4ng/ml bFGF로 구성된 기본 배지에 재부유시켜 100mm 세포 배양 접시에 세포를 시딩하였다. 12~24시간 후 새 배지로 바꿔 주었다. 양수 내 태아 유래 세포주는 다양한 형태의 모양을 (heterogenous population) (도 1A: a-d) 가지며 2~3번의 계대 배양 후에는 한 가지의 섬유아세포 모양만을 가지게 됨을 확인할 수 있었다 (도 1A:e). 도 1과 같은 형태에서배지는 2~3일에 한 번씩 바꿔주었으며 세포 밀도가 80~90%정도 일 때 계대 배양을 하였다.
실시예 2: 핵형 분석을 통해 양수 내 태아 유래 세포라는 것을 확인
양수 내 태아 유래 세포인지 알아보기 위해 핵형 검사를 하였다.
핵형분석은 염색체의 수, 크기, 모양 등을 핵형이라고 하며 태아의 염색체를 검사하여 염색체 돌연변이, 성별을 알 수 있다. 핵형분석을 하기 위해서 1~2시간 동안 콜세미드(Colcemid)로 세포 분열을 중기에 중지시키고 지 밴딩 염색법(G-banding staining)으로 관찰하여 염색체를 분석하였다. 이렇게 핵형분석을 통해 알아본 결과, 양수 내 태아 유래 세포는 정상염색체를 가지고 있고 성염색체가 XY로 나타나는 것으로 보아 산모가 아닌 태아에게서 유래된 세포임을 확인할 수 있었다 (도 2).
실시예 3: 양수 내 태아 유래 세포가 중간엽줄기세포와의 유사성 확인
양수 내 태아 유래 세포가 다분화성의 중간엽줄기세포의 특성을 가지고 있는지를 확인하였다.
먼저, 유세포 분석기를 통해서 면역학적 표현형을 분석한 후 양수 내 태아 유래 세포가 사람 골수유래 중간엽줄기세포와 같이 비교하였을 때 CD13, CD29, CD44가 발현 되는 것을 확인하였다 (도 3). 그리고 이런 표면의 발현은 중간엽줄기세포에 특이적인 마커이긴 하지만 세포들마다 다른 특성들이 존재할 수도 있기 때문에 중간엽줄기세포의 성격을 나타내는 대표적인 특성인 뼈, 지방, 연골세포로의 분화능을 살펴보았다.
양수 내 태아 유래 세포는 인간 골수유래 중간엽줄기세포와 마찬가지로 분화를 시킨 후, 뼈는 골이 형성이 되면서 특이적으로 발현되는 유전자인 오스테오폰틴(osteopontin)과 오스테오칼신(osteocalcin)으로 확인하고, 지방은 지방 형성에 관련된 유전자인 리포프로테인 리파아제(lipoprotein lipase ; LPL), 패틱 액시드 바인딩 프로테인 2(fatty acid binding protein ; aP2)와 페록시좀 프로리퍼레이터 엑티베이티드 리셉터 감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ; PPARγ)로 확인하였으며, 연골은 연골이 형성되면서 대표적인 유전자 타입 2 콜라겐(Type II collagen), 타입 1 콜라겐(Type I collagen)과 어그리칸(aggrecan)으로 분화가 되었다는 것을 역전사 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 확인하였다. 뼈로 분화를 시키면 칼슘염의 생성되는 것을 확인하기 위해서 알리자린 레드 에스 염색법(Alizarin red S staining)으로, 지방으로 분화를 시키면 지방액포(Lipid droplet)가 생기고 이것을 염색을 하기 위해서 오일 레드 오 염색법(Oil red O staining)과 연골로 분화를 시키면 연골 특이적으로 분비하는 기질을 염색하기 위해서 알시안 블루 염색법(Alcian blue staining)을 이용하여 각 분화별 특이적인 염색법으로 확인하였다 (도 4). 따라서 본 발명에서는 양수 내 태아 유래 세포는 골수유래 중간엽줄기세포와 유사한 특성을 가지는 세포라는 것이 확인되었다.
실시예 4: 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에서 조건별 컨디션드 배지 제조
확립된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포로부터 세포 수별 컨디션드 배지의 생산 조건을 확립하였다.
먼저, 확립된 중간엽줄기세포를 100mm 세포 배양 접시에서 트립신 처리를 하여 바닥에서 분리하였다. 떨어진 세포를 모아서 15ml 튜브에 담고 원심분리를 하였다. 모아진 세포를 5~10ml 배지에 풀어준 다음 잘 섞어 주었다. 튜브 안에 세포부유물 중 20㎕를 혈구계산기(hematocytometer)를 이용하여 세포 수를 측정한 후, 로우 글루코즈 DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 4ng/ml bFGF로 구성된 기본 배지에 5x104, 1x105, 2.5x105, 5x105 개의 세포를 100mm 세포 배양 접시에 시딩하였다. 12시간 후, 컨디션드 배지인 DMEM/F12 serum-free 배지로 바꿔주고 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후, 각각의 수별 배양액을 튜브에 옮겨 담은 후 원심분리를 하고 0.20시린지 필터(syringe filter)를 하여 컨디션드 배지를 생산하였다. DMEM/F12 serum-free 배지에서 3일 동안 배양한 후에 CM을 얻을 때의 세포의 모습을 도 5A에 나타내었는데, cm2당 세포의 count를 4가지로 나눠서 seeding을 하였을 때의 CFU-assay 결과를 확인할 결과(도 5B), 100/cm2에서 가장 높은 수치를 나타내는 것을 알 수 있었으며, 세포의 cm2당 개수에 따라 다른 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 인비트로(in vitro) 상에서 컨디션드 배지 효과 확인
양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용하여 세포 수를 세어 5x104, 1x105, 2.5x105, 5x105 개로 각각의 DMEM/F12 serum-free 배지로 바꿔 주어 3일 동안 배양하여 컨디션드 배지를 만들어 섬유아세포의 성장에 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험을 하였다. 3일 동안 CM에서 배양하였을 때의 세포의 모습과 이 때의 세포의 성장 정도를 비교하였더니 CM(2.5x105)에서 세포의 성장이 가장 높게 나타남을 확인할 수 있었다 (도 6). 이를 다시 증명하기 위해 CM을 피부 유래 섬유아세포에 처리하여 배양하였을 때의 세포의 성장주기를 PI stain을 통해 확인하였고, 그 결과 이전의 실험결과와 마찬가지로 CM(2.5x105)에서 S phase (증식 기간)에 가장 높은 13.83%로 확인이 되었다 (도 7). 세포의 성장주기 중에 S phase와 관련된 유전자들의 발현을 Real-time PCR로 확인한 결과 CM을 처리한 그룹의 세포들의 유전자 발현이 증가하는 양상을 보임을 확인할 수 있었고, 특별히 CM(2.5x105)에서 발현이 높게 나타나는 것으로 보아, 25만개의 양수세포에서 유래한 CM이 세포의 성장을 높게 증가시키는 것으로 확인할 수 있었다 (도 8). 이러한 실험 결과를 바탕으로 세포의 증식에 관련된 단백질들의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써 최적의 배양조건을 확립할 수 있었다.
실시예 6: 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에서 조건별 컨디션드 배지 성분 확인
양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용하여 얻은 컨디션드 배지의 성분을 분석하기 위하여 antibody arrary을 이용하여 어떠한 단백질들이 발현되는지를 보고 그 양의 변화를 측정하였다. 컨드션드 배지가 아닌 DMEM/F12 serum-free 배지에서는 성장인자 및 단백질의 발현이 되지 않았으며 (도 9A), DMEM/F12 serum-free의 컨디션드 배지의 성분을 분석한 결과 세포 성장인자 및 증식에 관여하는 단백질중 총 36개에서 TGFβ, VEGF, EGF, TNFα, IL8, IL6, MMP3 등 27개로 많은 성장요소 인자들이 함유되어 있는 것을 분석 되었다 (도 9B).

Claims (10)

  1. 양수 내 태아 유래 세포를 FBS(fetal bovaine serum) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor) 함유 배지에서 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, 다음과 같은 특성을 나타내는 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 제조방법:
    (a) CD13, CD29 및 CD44 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타냄;
    (b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및
    (c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지의 FBS 의 함량은 10% 이고, bFGF 의 함량은 1~20 ng/ml 인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배지는 로우 글루코즈 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 중배엽 유래 세포는 지방세포, 골세포 또는 연골세포인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되고, 다음과 같은 특성을 나타내는 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포 :
    (a) CD13, CD29 및 CD44 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타냄;
    (b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및
    (c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
  6. (a) 산모로부터 얻은 양수 내에서 태아 유래 세포를 분리하는 단계;
    (b) FBS 및 bFGF 함유 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 수득하는 단계;
    (c) 상기 수득된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 무혈청 배지에 2일 내지 7일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계를 포함하는, 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포로부터 인간 성장인자를 대량으로 생산하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 인간 성장인자는 Apo-1/Fas, 표피세포 성장인자(EGF), IP-10, 렙틴(Leptin), MIP4, MMP3, 란테스(Rantes), 인터페론-감마(IFNγ), 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNFα), 종양괴사인자 수용체 Ⅰ(TNFRⅠ), 종양괴사인자 수용체Ⅱ(TNFRⅡ), 세포부착인자-1(ICAM-1), 혈관세포부착인자-1(VCAM-1), 맥관내피세포 성장인자(VEGF), 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-1 수용체 알파(IL-1Rα), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 방법.
  8. 제 6항의 방법에 의하여 수득한 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지 조성물.
  9. ApoI/Fas, EGF, IP-10, Leptin, MIP4, MMP3, Rantes, IFNγ, TGFβ, TNFα, TNFRⅠ, TNFRⅡ, ICAM-1, VCAM-1, VEGF, IL-1β, IL-1Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 및 IL-15 를 포함하는 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 조성물은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지 조성물임을 특징으로 하는 조성물.
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