KR102669135B1 - 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물 - Google Patents
중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물에 관한 것으로, 디클로닌 하이드로클로라이드(Dyclonine hydrochloride) 및 화합물 14 내지 화합물 18 중 하나 이상을 포함하는 조성물은 중간엽 줄기세포의 증식 및/또는 이동을 촉진시켜 중간엽 줄기세포의 이식을 통한 치료 효율을 증대시킬 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물에 관한 것이다.
중간엽 줄기 세포는 다분화능을 가진 기질세포(가슴샘이나 골수 등의 기관에서 그 기능을 담당하는 세포나 조직(유조직)에 둘러싸고 지탱하는 세포)로 조골세포(뼈 세포), 연골세포, 근육세포, 지방세포(골수 지방 조직을 만드는 지방세포)를 포함한 다양한 세포로 분화할 수 있다 (Ankrum 등, 2014).
중간엽 줄기 세포는 골수, 혈액, 제대혈과 지방 등과 같은 다양한 조직들로부터 분리해낼 수 있으며, 시험관내 배양 조건에서 대량 증식이 가능하여 윤리적인 문제없이 세포 치료제의 원료 세포로 활용할 수 있다는 장점들을 갖고 있다. 또한, 이들은 손상된 조직 및 염증 부위로 이동할 수 있는 지향성(tropism)을 갖고 있어서 상처 치유에 도움을 주며, 여러 조건에서 면역억제 특성을 보인다.
한편, 중간엽 줄기세포는 백혈구와 같은 혈액세포들보다 손상 조직 및 염증 부위로 이동하는 능력이 미약한 편이다. 중간엽 줄기세포는 손상 조직 및 염증 부위로 이동하는 지향성을 가지고 있으나 이를 위한 핵심적인 부착인자(adhesion ligands)와 케모카인 (chemokine) 수용체들은 상대적으로 소량 발현하고 있으며, 이들마저도 대량 증식을 위한 시험관 내 배양을 하는 동안 점차로 잃어버린다고 보고되었다 (Rombouts 등, 2003). 이들의 고발현을 유도하는 연구들이 많이 수행되었으나 대부분의 연구들이 해당 유전자들을 효율적으로 전달하기 위한 벡터로 바이러스 시스템을 사용하여 인간을 대상으로 하는 임상에 적용하기 힘들다는 단점을 가지고 있다.
종래선행기술인 한국공개특허 제2013-0085863호에는 콜로니 자극인자를 포함하는 조성물로 중간엽 줄기세포를 자극, 증식시키고 CXCR4, SDF-1에 의해 조절되는 중간엽 줄기세포의 이동 유도용 조성물이 개시되어 있다. 한국등록특허 제1229819호에는 β-픽스(PIX) 유전자를 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 이동성 개선용 조성물, β-픽스(PIX) 유전자의 발현량을 측정함으로서 줄기세포 이동성을 예측하는 방법 및 줄기세포의 이동성을 개선시키는 신경질환 치료 보조제의 스크리닝 방법이 개시되어 있다. 한국등록특허 제2025474호에는 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는 줄기세포 이동성 향상용 배지 조성물, 및 이의 용도가 기재되어 있으며, 한국등록특허 제1466811호에는 손상된 조직 치료용 이식 조성물 및 손상된 조직 부위로 치료용 세포의 인 비보 이동 유도방법으로, 화학주성인자(예컨대, IL-8 또는 MIP-3α)와 반응시킨 생분해성 지지체를 손상된 위치(예컨대, 관절연골 또는 피부)에 이식하여 조직 재생을 위한 세포의 호밍을 유도/촉진함으로써 손상된 조직을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 한국공개특허 제2010-0063696호에는 환자의 혈소판들로 혈소판 용해물을 제조하고, 이를 이용하여 세포 성장 배지를 제조하고, 여기에 중간엽 줄기세포를 증식시키는 점이 기재되어 있다.그러나, 상기 기술들은 본 발명의 구성과 차이가 있으며, 비용과 효과면에서도 중간엽 줄기세포의 증식 및 이동을 촉진하는 본 발명과 차이가 있다.
James A Ankrum, Joon Faii Ong 2, Jeffrey M Karp, Mesenchymal stem cells: immune evasive, not immune privileged, Nat Biotechnol. 2014, Mar;32(3):252-60.
Mark F. Pittenger et al., Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells, 1999, Science 284, 143
R. J. Deans, A. B. Moseley, Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses, 2000, Exp Hematol. Aug;28(8):875-84.
W. J. C. Rombouts, R E Ploemacher, Primary murine MSC show highly efficient homing to the bone marrow but lose homing ability following culture, Leukemia. 2003 Jan;17(1):160-70.
본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 “줄기세포 (stem cells)”란 적합한 환경 및 자극을 통해 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며, 자가증식 (self-renewal) 능력을 갖추고 있는 세포를 말한다.
본 발명에서 “중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSC)”란 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포를 말한다. 중간엽 줄기세포는 다분화능 (multipotency)을 가고, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반 등 기타 조직 등에도 존재하는 것으로 알려져 있다.
상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반 조직 유래인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 그 유래 조직에 관계없이 중간엽 줄기세포의 일반적인 특징인 중간엽 계열 (mesodermal lineage)의 세포 예컨대, 골, 지방 및 연골 등으로 분화할 수 있는 세포라면 본 발명의 범위에 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 동물 유래의 중간엽 줄기세포를 모두 포함하며, 상기 동물은 손상 조직이 발생하여 본 발명의 중간엽 줄기세포를 통해 치료가 가능한 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 4]로 표현되는 카페시타빈(Capecitabine), 노메제스트롤 아세테이트(Nomegestrol acetate), 트리메타지딘(Trimetazidine), 디클로닌 하이드로클로라이드(Dyclonine hydrochloride) 및 화합물 1 내지 화합물 18 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 증식 또는 이동 촉진용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
상기 카페시타빈(Capecitabine)은 유방암, 위암 및 대장암의 치료제로, 노메제스트롤 아세테이트(Nomegestrol acetate)은 피임약, 폐경 호르몬 요법에 사용되는 프로게스틴계 약물로, 트리메타지딘(Trimetazidine)은 세포 보호 항 허혈 치료제로, 디클로닌 하이드로클로라이드(Dyclonine hydrochloride)는 구강 등의 국소 마취제로 각각 FDA 승인된 화합물이다.
이때 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명은 상기 [화학식 1] 내지 [화학식 4]로 표현되는 카페시타빈(Capecitabine), 노메제스트롤 아세테이트(Nomegestrol acetate), 트리메타지딘(Trimetazidine), 디클로닌 하이드로클로라이드(Dyclonine hydrochloride) 및 화합물 1 내지 화합물 18 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 증식 및 이동 촉진용 조성물을 제공한다.
이때 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물은 약학 조성물로 제조될 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포 증식 및 이동 촉진용 조성물을 포함하는 약학 조성물은 사람 및 동물의 손상 조직에서 골, 지방 및 연골 등으로 분화함으로써 손상 조직의 치료에 직접적으로 기여할 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물은 전체 약학 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~40중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 손상조직 내에 직접 주사 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 102~1010 세포이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.상기 약학적 조성물은, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 및 피부 도포에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물은 중간엽 줄기세포의 전처리(preconditioning)에 사용될 수 있다. 본 발명의 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물을 중간엽 줄기세포의 전처리(preconditioning)에 사용하는 경우, 중간엽 줄기세포의 생존률을 증가시키고, 중간엽 줄기세포의 이동 및/또는 증식에 도움이 될 수 있으며, 중간엽 줄기세포의 조직 내 주입 시, 중간엽 줄기세포의 생존률, 이동 및/또는 증식을 촉진시켜 치료효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 배양 전, 배양 중, 또는 배양 후에 중간엽 줄기세포를 상기 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물로 처리한 중간엽 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포의 배양 전, 배양 중, 또는 배양 후에 중간엽 줄기세포를 상기 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물로 처리한 중간엽 줄기세포를 배양한 조절 배양액(conditioned medium)을 제공한다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 배양 전 중간엽 줄기세포를 상기 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물로 전처리한 조절 배양액(conditioned medium)으로부터 분리, 정제된 세포외입자(extracellular vehicles), 유전자 및 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 조성물을 제공한다.
상기 치료 조성물은 치료목적에 따라, 연골세포 (chondrocyte), 골아세포(osteoblast), 지방세포(adipocyte), 근육세포(myocyte), 신경세포(neuron) 및 심근세포로 분화 유도할 수 있으며, 연골, 골조직종양 제거 수술, 화상 등에 의해 생긴 연부조직결손을 치료할 생체 재료 생산에 이용될 수 있다.
본 발명은 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물에 관한 것으로, 중간엽 줄기세포의 이식을 통한 치료 효율을 증대시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 중간엽 줄기세포(MSC)의 이동(igration)에 대한 capecitabine, Trimetazidine 및 Nomegestrol acetate의 효과를 나타내는 사진이다.
도 2는 Dyclonine hydrochloride의 농도에 따른 중간엽 줄기세포(MSC) hBM MSC 2 (A) 및 hBM MSC 3 (B)의 증식(proliferation)에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 중간엽 줄기세포(MSC)의 이동(igration)에 대한 화합물 7, 화합물 13 및 화합물 17의 효과를 나타내는 사진이다.
도 2는 Dyclonine hydrochloride의 농도에 따른 중간엽 줄기세포(MSC) hBM MSC 2 (A) 및 hBM MSC 3 (B)의 증식(proliferation)에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 중간엽 줄기세포(MSC)의 이동(igration)에 대한 화합물 7, 화합물 13 및 화합물 17의 효과를 나타내는 사진이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<
실시예
1.
중간엽
줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진 화합물 확인>
본 발명자들은 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동을 촉진하는 화합물을 다음과 같이 스크리닝하였다.
실시예
1.1
카페시타빈
,
노메제스트롤
아세테이트,
트리메타지딘
,
디클로닌
하이드로클로라이드
본 발명의 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물은 하기 [화학식 1]로 표현되는 카페시타빈(Capecitabine), 노메제스트롤 아세테이트(Nomegestrol acetate), 트리메타지딘(Trimetazidine) 및 디클로닌 하이드로클로라이드(Dyclonine hydrochloride) 으로 구성된 군으로부터 선택되는 1을 포함한다.
[화학식 1]
실시예
1.2 화합물 1 내지 화합물 11
본 발명의 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물은 하기 [화학식 2]로 표현되는 화합물 1 내지 11로 구성된 군으로부터 선택되는 1을 포함한다.
[화학식 2]
상기 화합물 1 내지 11의 화학명 및 smiles 는 표 1에 나타내었다.
| 화합물 | 화학명 | Smiles |
| Compound 1 | (17R)-2'-ethoxy-2',10,13-trimethyl-6,7,8,9,10,12,13,14,15,16-decahydrospiro[cyclopenta[a]phenanthrene-17,4'-[1,3]dioxane]-3,5',11-trione | CCOC1(C)OCC(=O)[C@]2(CCC3C4CCC5=CC(=O)C=CC5(C)C4C(=O)CC23C)O1 |
| Compound 2 | 2-((8S,10R,13S)-17-hydroxy-10,13-dimethyl-3,11-dioxo-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)-2-oxoethyl acetate | [H]C12CCC(O)(C(=O)COC(C)=O)[C@@]1(C)CC(=O)C1([H])[C@@]2([H])CCC2=CC(=O)CC[C@]12C |
| Compound 3 | 5-(4-(2-((10R,13S,17R)-17-acetoxy-10,13-dimethyl-3-oxo-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)-2-oxoethoxy)-4-oxobutanamido)pentanoic acid | CC(=O)O[C@@]1(CCC2C3CCC4=CC(=O)CC[C@]4(C)C3CC[C@]12C)C(=O)COC(=O)CCC(=O)NCCCCC(O)=O |
| Compound 4 | 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 6-(4-(2-((8R,10R,13S,17R)-17-hydroxy-10,13-dimethyl-3-oxo-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)-2-oxoethoxy)-4-oxobutanamido)hexanoate | [H][C@@]12CCC3=CC(=O)CC[C@]3(C)C1CC[C@@]1(C)C2CC[C@]1(O)C(=O)COC(=O)CCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O |
| Compound 5 | (8R,10R,13S,17S)-17-hydroxy-10,13,17-trimethyl-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-3H-cyclopenta[a]phenanthren-3-one | [H]C12CC[C@](C)(O)[C@@]1(C)CCC1([H])[C@@]2([H])CCC2=CC(=O)C=C[C@]12C |
| Compound 6 | 2-((10R,13S,17R)-17-hydroxy-10,13-dimethyl-3-oxo-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)-2-oxoethyl 4-((3,4-dihydroxyphenethyl)amino)-4-oxobutanoate | C[C@]12CCC3C(CCC4=CC(=O)CC[C@]34C)C1CC[C@]2(O)C(=O)COC(=O)CCC(=O)NCCc1ccc(O)c(O)c1 |
| Compound 7 | (8R,9S,10R,13S,14S,17R)-17-acetyl-6,10,13-trimethyl-3-oxo-2,3,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl acetate | [H][C@@]12CC[C@](OC(C)=O)(C(C)=O)[C@@]1(C)CC[C@@]1([H])[C@@]2([H])C=C(C)C2=CC(=O)CC[C@]12C |
| Compound 8 | 2-((10R,13S,17R)-17-hydroxy-10,13-dimethyl-3,11-dioxo-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)-2-oxoethyl 4-((1-ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl)amino)-4-oxobutanoate | CCOC(=O)C(Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)CCC(=O)OCC(=O)[C@@]1(O)CCC2C3CCC4=CC(=O)CC[C@]4(C)C3C(=O)C[C@]12C |
| Compound 9 | S-((7R,8R,9S,10R,13S,14S,17R)-10,13-dimethyl-3,5'-dioxo-1,2,3,4',5',6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-hexadecahydro-3'H-spiro[cyclopenta[a]phenanthrene-17,2'-furan]-7-yl) ethanethioate | [H][C@@]12CC[C@@]3(CCC(=O)O3)[C@@]1(C)CC[C@@]1([H])[C@@]2([H])[C@@H](CC2=CC(=O)CC[C@]12C)SC(C)=O |
| Compound 10 | (4-((10,13-dimethyl-3-oxo-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)oxy)-4-oxobutanoyl)phenylalanine compound with 1,4-dioxane (1:1) | C1COCCO1.CC12CCC3C(CCC4=CC(=O)CCC34C)C1CCC2OC(=O)CCC(=O)NC(Cc1ccccc1)C(O)=O |
| Compound 11 | (8R,9S,10R,13S,14S,17S)-17-hydroxy-10,13-dimethyl-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-3H-cyclopenta[a]phenanthren-3-one | [H][C@@]12CC[C@H](O)[C@@]1(C)CC[C@@]1([H])[C@@]2([H])CCC2=CC(=O)C=C[C@]12C |
실시예
1.3 화합물 12 및 화합물 13
본 발명의 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물은 또한 하기 [화학식 3]으로 표현되는 화합물 12 및 화합물 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 1을 포함한다.
[화학식 3]
상기 화합물 12 또는 13의 화학명 및 smiles 는 표 2에 나타내었다.
| 화합물 | 화학명 | Smiles |
| Compound 12 | ((3S,6S,6aS,8S,9R,10S,11aR,12S,12aS,13S)-1-ethyl-11a,12-dihydroxy-6,8,10,13-tetramethoxydodecahydro-2H-3,6a,12-(epiethane[1,1,2]triyl)-7,9-methanonaphtho[2,3-b]azocin-3(4H)-yl)methyl 2-aminobenzoate | CCN1C[C@]2(COC(=O)c3ccccc3N)CC[C@H](OC)[C@@]34C5C[C@H]6[C@H](OC)C5[C@](O)(C[C@@H]6OC)[C@@](O)([C@@H](OC)C23)[C@@H]14 |
| Compound 13 | ((3S,6S,6aR,7R,7aR,8S,9R,10S,11aR,12R,12aR,13S)-1-ethyl-11a,12-dihydroxy-6,8,10,13-tetramethoxydodecahydro-2H-3,6a,12-(epiethane[1,1,2]triyl)-7,9-methanonaphtho[2,3-b]azocin-3(4H)-yl)methyl 2-((S)-3-methyl-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)benzoate 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate | OC(=O)CC(O)(CC(O)=O)C(O)=O.[H][C@@]12C[C@H]3[C@H](OC)[C@]1([H])[C@](O)(C[C@@H]3OC)[C@]1(O)[C@@H](OC)C3[C@@]22[C@H]1N(CC)C[C@]3(COC(=O)c1ccccc1N1C(=O)C[C@H](C)C1=O)CC[C@@H]2OC |
실시예
1.4 화합물 14 내지 화합물 18
본 발명의 중간엽 줄기세포 증식 및/또는 이동 촉진용 조성물은 하기 [화학식 4]로 표현되는 화합물 14 내지 화합물 18으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 을 포함한다.
[화학식 4]
상기 화합물 14 내지 18의 화학명 및 smiles 는 표 3에 나타내었다.
| 화합물 | 화학명 | Smiles |
| Compound 14 | (E)-1-(5-bromo-2-hydroxyphenyl)-3-(2-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one | COc1ccccc1\C=C\C(=O)c1cc(Br)ccc1O |
| Compound 15 | (E)-4-(3-(2,4-dimethoxyphenyl)acryloyl)phenyl 4-chlorobenzoate | COc1ccc(\C=C\C(=O)c2ccc(OC(=O)c3ccc(Cl)cc3)cc2)c(OC)c1 |
| Compound 16 | (E)-3-(2,4-dimethoxyphenyl)-1-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one | COc1ccc(C=CC(=O)c2ccc(O)cc2)c(OC)c1 |
| Compound 17 | (E)-3-(4-hydroxy-2-methoxy-5-(2-methylbut-3-en-2-yl)phenyl)-1-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one | COc1cc(O)c(cc1\C=C\C(=O)c1ccc(O)cc1)C(C)(C)C=C |
| Compound 18 | (E)-4-(3-(2,3,4-trimethoxyphenyl)acryloyl)phenyl thiophene-2-carboxylate | COc1ccc(\C=C\C(=O)c2ccc(OC(=O)c3cccs3)cc2)c(OC)c1OC |
<
실시예
2. 인간 유래
중간엽줄기세포의
배양>
인간 유래 중간엽줄기세포 (human mesenchymal stem cell, 이하 hMSC 이라 명명함)는 인간의 경골 (tibiae) 및 대퇴골 (femurs)의 골수 (Bone marrow) 세포에서 수득하여, 각각의 세포를 hBM-MSC-2와 hBM-MSC-3으로 명기하여 사용하였다. hMSC는 CSBM-A06 배지 (코아스템(주), Korea)에 10% 소태아혈청 (FBS, fetal bovine serum; HyClone, Logan, UT, USA, #SH30919.03) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신 (Penicillin streptomycin; HyClone, Logan, UT, USA, #SV30010)과 2.5mM GlutaMAX™ supplement (Thermo Scientific, IL, USA, #35050061) 이 포함된 배지에서 37℃, 7% CO2 조건에서 배양하였다.
<
실시예
3.
카페시타빈
,
노메제스트롤
아세테이트 및
트리메타지딘
의
중간엽
줄기세포
생존률에
미치는 효과 확인>
상기 [화학식 1]의 카페시타빈, 노메제스트롤 아세테이트 및 트리메타지딘 의 세포 생존능을 확인하였다. 인간 유래 중간엽줄기세포의 세포 생존능력은 CCK-8 (Cell Counting Kit-8) 시약 (LPS solution, Seoul, Korea, #CYT3000)을 이용해 측정하였다. 스크리닝은 hBM-MSC-3 세포를 사용하였다. 세포는 96웰 플레이트 (Corning, NY, USA, #353072)에 웰 당 2 × 103 개의 세포를 분주하여, 37℃ 및 7% CO2 조건에서 24시간 배양 후 물질을 처리하였다. 카페시타빈, 노메제스트롤 아세테이트 및 트리메타지딘 10 μM 을 72시간 동안 처리 한 후 각각의 well에 10 μl CCK-8을 첨가하여 충분히 색이 변할 정도로 배양하였다. 색이 변한 배지는 Hidex sense microplate reader (Hidex, Turku, Finland, #425-301)를 이용해 450 nm 파장의 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 실험값은 대조군을 100%로 뒀을 때 상대적인 %값을 사용하였으며, 세 번의 독립적인 실험을 통해 확인하고 결과를 표 4에 나타내었다. 하기 표 4에서 보는 바와 같이, 카페시타빈, 노메제스트롤 아세테이트 및 트리메타지딘은 세포 독성을 나타내지 않았다.
| 화합물 | 세포 생존능 (% of control) |
| Capecitabine | 110 |
| Trimetazidine | 107 |
| Nomegestrol acetate | 107 |
<
실시예
4.
카페시타빈
,
노메제스트롤
아세테이트 및
트리메타지딘
의
중간엽
줄기세포 이동 능력에 미치는 효과 확인>
세포 이동능력은 hBM-MSC-3세포를 활용하여, boyden 챔버 (chamber)와 transwell 챔버를 이용해 평가하였다.
Boyden 챔버 방법은 8μm pores polycarbonate membrane (neuro probe, MD, USA, #PFB8)을 0.2% 젤라틴 (merck, MO, USA, #G2625)으로 코팅한 후 건조 시켜 사용하였다. Bottom chamber에 각 웰에 10% 소태아혈청이 포함된 배지를 33 ㎕씩 넣어준 후 멤브레인을 올리고 tap 챔버를 올려 나사로 고정시킨다. Top 챔버의 각 웰에 50 ㎕의 0.1% 소태아혈청이 포함된 배지에 5 × 103개의 세포가 포함되게 넣어준 후 24시간 동안 7% CO2, 37℃ 조건에서 배양한다. 배양이 완료되면 멤브레인을 분리하여 Diff Quik (sysmex, kobe, Japan, #38721) 시약을 이용해 염색한 후 현미경으로 각 군의 세포 수를 세었다. 그리고, 대조군 세포 수를 100%로 두었을 때 상대적인 값을 %로 표기하여 사용하였으며, student t-test 방법으로 통계 처리를 하여, p<0.05 이하일 때 통계적인 유의성을 가짐을 표기하였다.
Transwell chamber 방법은 Nunc™ Carrier Plate for Cell Culture Insert (Thermo Scientific, IL, USA, #141006)를 사용하였다. Bottom 챔버에 각 웰에 10% 소태아혈청이 포함된 배지를 1.5 ㎖씩 넣어준 후 Top 챔버의 각 웰에 200 ㎕의 0.1% 소태아혈청이 포함된 배지에 4 × 104개의 세포가 포함되게 넣어준 후 24시간 동안 7% CO2, 37℃ 조건에서 배양한다. 배양이 완료되면 top chamber를 Diff Quik 시약을 이용해 염색하여 현미경으로 세포를 관찰하고, 이를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, 카페시타빈, 노메제스트롤 아세테이트 및 트리메타지딘을 처리한 군이 대조군에 비해 더 많은 세포가 이동하여 이동촉진 능력을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
5.
디클로닌
하이드로클로라이드의
중간엽
줄기세포 증식에 미치는 효과 확인>
hBM-MSC-2 및 hBM-MSC-3을 96웰 플레이트 (Corning, NY, USA, #353072)에 웰 당 2 × 103 개의 세포를 분주하여, 37℃ 및 7% CO2 조건에서 24시간 배양 후 디클로닌 하이드로클로라이드를 1, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 μM이 되도록 각각 처리하였다. 72시간 동안 처리 한 후 각각의 well에 10 μl CCK-8을 첨가하여 충분히 색이 변할 정도로 배양하였다. 색이 변한 배지는 Hidex sense microplate reader (Hidex, Turku, Finland, #425-301)를 이용해 450 nm 파장의 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 실험값은 대조군을 100%로 뒀을 때 상대적인 %값을 사용하였으며, 세 번의 독립적인 실험을 통해 확인하고 이를 표 5 및 도 2에 나타내었다.
| Dyclonine hydrochloride (μM) | 30 | 10 | 3 | 1 | 0.3 | 0.1 | 0.03 | 0.01 | 0.003 | 0 |
| hBM-MSC-2 증식률 (% of control) |
204 | 180 | 154 | 145 | 136 | 130 | 116 | 106 | 98 | 100 |
| hBM-MSC-3 증식률 (% of control) |
128 | 124 | 110 | 106 | 110 | 102 | 102 | 104 | 102 | 100 |
표 5 및 도 2에서 보는 바와 같이 디클로닌 하이드로클로라이드는 농도 의존적으로 중간엽 줄기세포의 증식을 촉진하였다.
<
실시예
6. 화합물 1 내지 18의
중간엽
줄기세포 증식에 미치는 효과 확인>
상기 실시예 5와 동일한 방법으로 화합물 1 내지 18의 세포가 중간엽 줄기세포 증식에 미치는 효과를 확인하고 그 결과를 표 6에 나타내었다. 단 각 화합물은 최종농도 10 μM이 되도록 하여 72시간 동안 처리하고, 각각의 well에 10 μl CCK-8을 첨가하여 충분히 색이 변할 정도로 배양하였다. 색이 변한 배지는 Hidex sense microplate reader (Hidex, Turku, Finland, #425-301)를 이용해 450 nm 파장의 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 실험값은 대조군을 100%로 뒀을 때 상대적인 %값을 사용하였으며, 세 번의 독립적인 실험을 통해 확인하고 이를 표 6에 나타내었다.
| 화합물 | hBM-MSC-2 증식률 (% of control) |
hBM-MSC-3 증식률 (% of control) |
| Compound 1 | 115 | 127 |
| Compound 2 | 142 | 118 |
| Compound 3 | 110 | 114 |
| Compound 4 | 127 | 115 |
| Compound 5 | 142 | 142 |
| Compound 6 | 124 | 147 |
| Compound 7 | 102 | 122 |
| Compound 8 | 111 | 118 |
| Compound 9 | 120 | 144 |
| Compound 10 | 115 | 138 |
| Compound 11 | 112 | 149 |
| Compound 12 | 111 | 134 |
| Compound 13 | 124 | 113 |
| Compound 14 | 122 | 125 |
| Compound 15 | 126 | 132 |
| Compound 16 | 124 | 141 |
| Compound 17 | 114 | 132 |
| Compound 18 | 107 | 143 |
상기 표 6에서 보는 바와 같이, 화합물 1 내지 18은 모두 각 처리 농도에서 세포독성을 나타내지 않았으며, 일정한 중간엽 줄기세포의 증식 촉진 효과를 나타내었다. 특히, 화합물 2, 4, 5, 6, 9, 13~16은 hBM-MSC-2 줄기세포에서, 화합물 1, 5~7, 9~12, 14~18은 hBM-MSC-3 줄기세포에서 대조군보다 20% 이상의 증식 촉진 효과를 나타내었다.
<
실시예
7.
중간엽
줄기세포 (
MSC
)의 이동(migration)과 증식(proliferation)을 동시에 촉진하는 화합물 확인 >
상기 카페시타빈, 노메제스트롤 아세테이트, 트리메타지딘, 디클로닌 하이드로클로라이드 및 화합물 1 내지 18 중 중간엽 줄기세포 (MSC)의 이동(migration)과 증식(proliferation)을 동시에 촉진하는 화합물을 확인하였다.
상기 실시예 4와 동일한 방법으로, 세포 이동능력은 hBM-MSC-3세포를 활용하여, boyden 챔버 (chamber)와 transwell 챔버를 이용해 평가하였으며, 상기 화합물 중, 화합물 1~3 의 줄기세포 (MSC)의 이동(migration)에 대한 효과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, 화합물 7, 화합물 13 및 화합물 17 은 줄기세포 (MSC)의 이동(migration)을 촉진시켰으며, 상기 표 6에서 보는 바와 같이, 줄기세포의 증식 또한 촉진시키는 것을 확인하였다.
Claims (7)
- 디클로닌 하이드로클로라이드(Dyclonine hydrochloride) 및 하기 [화학식 4]로 표현되는 화합물 14 내지 화합물 18 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 증식 또는 이동 촉진용 조성물.
[화학식 4]
- 제1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 증식 또는 이동 촉진용 조성물. - 디클로닌 하이드로클로라이드(Dyclonine hydrochloride) 및 하기 [화학식 4]로 표현되는 화합물 14 내지 화합물 18 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 증식 및 이동 촉진용 조성물.
[화학식 4]
- 제3항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 증식 및 이동 촉진용 조성물. - 삭제
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