WO2023163559A1 - 무혈청배지를 이용한 줄기세포 배양 방법 - Google Patents

무혈청배지를 이용한 줄기세포 배양 방법 Download PDF

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WO2023163559A1
WO2023163559A1 PCT/KR2023/002742 KR2023002742W WO2023163559A1 WO 2023163559 A1 WO2023163559 A1 WO 2023163559A1 KR 2023002742 W KR2023002742 W KR 2023002742W WO 2023163559 A1 WO2023163559 A1 WO 2023163559A1
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stem cells
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free medium
kit
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PCT/KR2023/002742
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김미진
송성수
안종찬
이승희
허지훈
허현숙
김연정
이미혜
강경선
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주식회사 강스템바이오텍
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1369—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. MSC from umbilical blood

Definitions

  • the present invention relates to a stem cell culture method using a serum-free medium.
  • Stem cells are undifferentiated cells in a pre-differentiation stage that can be obtained from each tissue of an embryo, fetus, and adult, and have characteristics such as self-renewing, differentiation, and immortal. Stem cells can be divided into pluripotency, multipotency, and unipotency stem cells according to their differentiation potential. Because it is relatively free from the risk of cancer, immune rejection, and ethical aspects, many studies and treatment development are in progress.
  • cord blood-derived mesenchymal stem cells are mesenchymal stem cells derived from the blood of newborns that can be obtained from the placenta and umbilical cord after delivery while circulating in the fetal cardiovascular system during pregnancy. After these excellent research results were reported, it began to receive a lot of attention in the research and medical fields. In particular, as stem cells separated from discarded tissue, it is highly valuable in that the donor's burden is low and medical waste is recycled.
  • Patent Document 1 Korean Patent Publication No. KR 10-2023-0017786 A
  • One object of the present invention is to provide a method for enhancing stem cell efficacy, comprising culturing stem cells in a serum-free medium.
  • Another object of the present invention is culturing stem cells in a serum-free medium; and differentiating the cultured stem cells into chondrocytes in a differentiation medium.
  • Another object of the present invention is culturing stem cells in a serum-free medium; and collecting the chondrocytes by differentiating the cultured stem cells into chondrocytes in a differentiation medium.
  • the size of stem cells can be kept small, their differentiation potential can be increased, and aging can be delayed or inhibited.
  • 1 is a result of measuring the size of cord blood-derived mesenchymal stem cells while subculturing them in an existing serum medium (KSB-3 Complete Medium ® Kit) or serum-free medium (StemVie TM XF Medium Kit).
  • Figure 2 is a result of comparing stem cell aging while subculturing umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in an existing serum medium (KSB-3 Complete Medium ® Kit) or serum-free medium (StemVie TM XF Medium Kit).
  • KSB-3 Complete Medium ® Kit serum-free medium
  • StemVie TM XF Medium Kit serum-free medium
  • Figure 3 compares the chondrogenic differentiation capacity of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells cultured in an existing serum medium (KSB-3 Complete Medium ® Kit) or serum-free medium (StemVie TM XF Medium Kit).
  • One aspect of the present invention is a method for enhancing stem cell efficacy, comprising culturing stem cells in a serum-free medium.
  • a serum-free medium means a cell culture medium that does not contain or substantially does not contain serum derived from humans or serum derived from non-human animals.
  • the serum-free medium is StemVie TM XF Medium Kit.
  • StemVie TM XF Medium Kit is a commercially available medium that can be obtained by those skilled in the art.
  • the medium contains glycine, L-arginine, L-cysteine 2HCl, L-glutamic acid, L-histidine, L -Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine 2HCl, L-Methionine, L-Phenylalanine, L- Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine 2Na 2H2O, L-Valine Valine), Choline Chloride, D-Pantothenic Acid (hemiCa), Folic Acid, Myo-Inositol, Niacinamide, Pyridoxine HCl (Pyridoxine HCl), Riboflavin, Thiamine HCl (Thiamine HCl), Magnesium Sulfate (anhydrous) (Magnesium Sulfate (anhydrous)),
  • the enhancement of stem cell efficacy may mean any one or more selected from (i) reduction or maintenance of cell size, (ii) increase in differentiation potential, and (iii) delay in aging.
  • stem cells are arbitrarily separated based on a certain size, the proliferation of small cell populations is relatively high, and the stem cell efficacy is increased, such as low expression of aging-related markers.
  • Other studies have confirmed that stem cells with a diameter of less than a certain size show a relatively excellent whitening effect, and another study has reported that stem cells with high mobility have high differentiation potential and that these cells are characterized by their relatively small size. It is becoming. Accordingly, maintaining a relatively small cell size during stem cell culture can lead to enhancement of stem cell efficacy.
  • any one or more of lysosomal proteins, ROS (reactive oxygen species), and ⁇ -galactosidase activity may be measured.
  • the level of aging of stem cells can be confirmed by measuring the activity of ⁇ -galactosidase.
  • the size of the stem cells can be maintained constant, and/or (ii) the purpose and/or (iii) senescence of stem cells can be inhibited or delayed.
  • the size of the stem cells is maintained constant, and (ii) the desired cell size is maintained. Differentiation potential is increased, and (iii) senescence of stem cells can be inhibited or delayed.
  • the method of the present invention is compared to the case of culturing stem cells in KSB-3 Complete Medium ® Kit medium, (i) the size of the stem cells can be maintained constant or reduced and/or (ii) the ability to differentiate into desired cells can be increased, and/or (iii) the senescence of stem cells can be inhibited or delayed.
  • differentiation refers to a phenomenon in which the structure or function of a cell is specialized. In other words, it refers to the process in which cells, tissues, etc. of living organisms change into suitable forms and functions to fulfill their roles. For example, not only the differentiation of stem cells into osteocytes, chondrocytes, or adipocytes, but also the process of changing embryonic stem cells into ectoderm, mesodermal, and endoderm cells may be included in differentiation, and when necessary, cells of a specific tissue may be included. It also includes improving the ability to differentiate into.
  • the differentiation of the present invention is the differentiation of stem cells into chondrocytes.
  • the “stem cells” of the present invention are cells having the ability to differentiate into various tissues, that is, undifferentiated cells.
  • the stem cells may be of human or animal origin, and may be from umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amnion or placenta.
  • the stem cells of the present invention are mesenchymal stem cells.
  • the stem cells of the present invention are cord blood-derived mesenchymal stem cells.
  • the cord blood-derived mesenchymal stem cells are cord blood-derived pluripotent stem cells having the following characteristics while exhibiting positive immunological characteristics for the transcriptional regulator ZNF281.
  • the cord blood-derived mesenchymal stem cells may exhibit any one or more of the following characteristics:
  • cord blood-derived mesenchymal stem cells may be cells obtained by isolation as described in Korean Patent Registration No. 10-0950195.
  • the contents disclosed in Korean Patent Registration Nos. 10-0950195 and 10-1627907 are included as references.
  • stem cell culture may be subculture.
  • the "subculture" of the present invention is one of the cell proliferation methods and is a method of transferring culture from a previous culture to a fresh medium periodically, for example, every 1 to 7 days.
  • Subculture is a culture method that preserves cell lines and continues cell generations, and this method is called subculturing or passaging. Through such subculture, it is possible to suppress cell death and promote growth and proliferation by removing accumulated toxic metabolites and supplying depleted nutrients.
  • the subculture is performed in two or more passages. In one embodiment, the subculture is performed for 3 passages, 4 passages or 5 passages, or more.
  • Another aspect of the present invention comprises culturing stem cells in a serum-free medium; and differentiating the cultured stem cells into chondrocytes in a differentiation medium.
  • Another aspect of the present invention comprises culturing stem cells in a serum-free medium; and collecting the chondrocytes by differentiating the cultured stem cells into chondrocytes in a differentiation medium.
  • the serum-free medium is StemVie TM XF Medium Kit.
  • cell therapy refers to cells and tissues prepared by isolation, culture, and special manipulation from a subject, and is a drug (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention, and is used to restore the function of cells or tissues. It refers to drugs used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as proliferation and selection of living autologous, allogeneic, or heterogeneous cells in vitro or changing the biological characteristics of cells in other ways.
  • the cell therapy agent of the present invention may contain 1.0 ⁇ 10 to 1.0 ⁇ 10 9 cells per 1 ml, but is not limited thereto.
  • the cell therapy product of the present invention may be used unfrozen or frozen for future use. If frozen, standard cryopreservatives (eg DMSO, glycerol, Epilife cell freezing medium (Cascade Biologics)) can be added to the cell population prior to freezing.
  • standard cryopreservatives eg DMSO, glycerol, Epilife cell freezing medium (Cascade Biologics)
  • the cell therapy agent can be formulated and administered in a unit dosage form suitable for administration into the body of a patient according to a conventional method in the pharmaceutical field, and the agent can be administered in an effective dosage by one or several administrations.
  • Formulations suitable for this purpose include injections such as injection ampoules, injections such as infusion bags, and sprays such as aerosol formulations for parenteral administration.
  • the ampoule for injection may be mixed with an injection solution immediately before use, and physiological saline, glucose, mannitol, Ringer's solution, or the like may be used as the injection solution.
  • the infusion bag may be made of polyvinyl chloride or polyethylene, and may be manufactured by Baxter, Becton Dickinson, Medcep, National Hospital Products, or Terumo. An infusion bag of yarn can be exemplified.
  • the cell therapy agent may include one or more conventional pharmaceutically acceptable inert carriers, such as a preservative, pain reliever, solubilizer or stabilizer in the case of an injection, and a base in the case of a preparation for topical administration. , excipients, lubricants or preservatives may be further included.
  • a preservative such as a preservative, pain reliever, solubilizer or stabilizer in the case of an injection
  • a base in the case of a preparation for topical administration.
  • excipients, lubricants or preservatives may be further included.
  • the cell therapy product of the present invention thus prepared can be administered together with other stem cells used for transplantation and other purposes, or in the form of a mixture with such stem cells, using an administration method commonly used in the art. It is possible to engraft or transplant directly to the diseased area of a patient in need or to directly transplant or inject into the abdominal cavity, but is not limited thereto. In addition, the administration can be carried out by both non-surgical administration using a catheter and surgical administration methods such as injection or transplantation after incision in the diseased area. In addition to parenteral, for example, direct administration to a lesion according to a conventional method, transplantation by intravascular injection, which is a general method of hematopoietic stem cell transplantation, is also possible.
  • the cell therapy agent may be administered once or divided into several times.
  • the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of various related factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the weight, age and sex of the patient, and therefore, the dosage is It does not limit the scope of the present invention in any way.
  • Example 1 Comparative analysis of the size of cord blood-derived mesenchymal stem cells according to culture medium conditions
  • Cord blood-derived mesenchymal stem cells were isolated and used as stem cells showing positive immunological characteristics for ZNF281, a transcriptional regulator, as described in Korean Registered Patent No. 10-0950195. At each passage point, cells in each culture condition were treated in triplicate to obtain single cells.
  • the obtained single cells were analyzed for comparative cell size using NC200.
  • the diameters of cells under each culture condition at P4 were similar at 13.7 ⁇ m and 13.8 ⁇ m, respectively, in serum-free medium (StemVie TM XF Medium Kit) and conventional serum medium (KSB-3 Complete Medium ® Kit), respectively, but in P5, respectively, It was confirmed that there was a difference of about 0.5 ⁇ m at 14 ⁇ m and 13.5 ⁇ m, and a difference of about 1.7 ⁇ m at 15.4 ⁇ m and 13.7 ⁇ m at P6, respectively.
  • cord blood-derived mesenchymal stem cells cultured in the existing serum medium (KSB-3 Complete Medium ® Kit) increased in cell size as passage progressed under the same conditions
  • cord blood cultured in serum-free medium (StemVie TM XF Medium Kit) It was confirmed that the derived mesenchymal stem cells did not increase in size even when passaged under the same conditions (FIG. 1).
  • Example 2 Comparative analysis of senescence of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells according to culture medium conditions
  • P4 and P6 cells obtained in each culture condition obtained in Example 1 were equally inoculated into 1x10 5 cells/mL in a 12-well plate and cultured in a 37°C 5% CO2 incubator for one day. After that, the cells were washed once with PBS and then fixed with 4% Paraformaldehyde for 10 minutes. After fixation, the cells were washed twice with PBS, treated with 0.5 mL of ⁇ -galactosidase staining reagent per well, stained for 48 hours at 37 ° C, and examined under a microscope.
  • the SA- ⁇ Gal Positive (%) value at P4 was 2.91%, respectively, in serum-free medium (StemVie TM XF Medium Kit) and conventional serum medium (KSB-3 Complete Medium ® Kit) culture conditions at P4, respectively.
  • serum-free medium StemVie TM XF Medium Kit
  • KSB-3 Complete Medium ® Kit serum medium
  • the result was about 1% lower in the culture condition of the serum-free medium (StemVie TM XF Medium Kit), and in P6, it was 12.38% and 2.97%, respectively, about 10% in the culture condition of the serum-free medium (StemVie TM XF Medium Kit). Low results were confirmed.
  • Example 3 Comparative analysis of differentiation potential of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells according to culture medium conditions
  • the P6 cells in each culture medium obtained in Example 1 were dispensed at 3x10 5 / 1mL per 15mL tube, centrifuged, and cultured in a 37°C, 5% CO 2 incubator for one day. After that, the generated pellet was transferred to a 96 well round plate, replaced with cartilage differentiation medium (StemPro TM Chondrogenesis Differentiation Kit), and then replaced with cartilage differentiation medium three times a week, and differentiation was induced for 3 weeks. After completion of differentiation, the pellet was washed with PBS and fixed with 4% PFA, and then Safranin-O staining was performed by requesting an analysis company. As a result, when cultured in serum-free medium (StemVie TM XF Medium Kit), it was confirmed that cartilage differentiation ability was significantly increased compared to the conventional serum medium (KSB-3 Complete Medium ® Kit) (Fig. 3).

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Abstract

본 발명은 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 효능 증진 방법에 관한 것이다.

Description

무혈청배지를 이용한 줄기세포 배양 방법
본 발명은 무혈청배지를 이용한 줄기세포 배양 방법에 관한 것이다.
줄기세포(Stem cell) 는 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포로서 자기 재생(self-renewing), 분화, 영구성(immortal) 등의 특징을 가지고 있다. 줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있으며, 다분화능이 특징인 성체 줄기세포는 만능 분화능을 지닌 배아줄기세포 및 IPS에 비해 암 발생의 위험, 면역거부반응 및 윤리적인 측면에서 비교적 자유롭기 때문에 많은 연구 및 치료제 개발이 진행 중이다. 특히, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 (UCB-MSCs)의 경우 임신 중 태아의 심혈관계를 순환하다가 분만 후 태반과 탯줄로부터 얻을 수 있는 신생아의 혈액 유래 중간엽 줄기세포로서 타 조직 유래의 줄기세포보다 증식능이 뛰어나다는 연구결과들이 보고 된 후로 연구 및 의학 분야에서 많은 주목을 받기 시작했다. 특히 버려지는 조직으로부터 분리하는 줄기세포로서 공여자의 부담이 적고 의료 폐기물은 재활용한다는 점에서 높은 가치가 있다.
[선행기술문헌]
(특허문헌 1) 한국공개특허 KR 10-2023-0017786 A
이에 따라, 줄기세포를 효율적으로 배양하기 위한 방법이 요구되는 실정이다.
본 발명의 하나의 목적은 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 효능 증진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 배양된 줄기세포를 분화 배지에서 연골세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 연골세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 배양된 줄기세포를 분화 배지에서 연골세포로 분화시켜 연골세포를 수집하는 단계를 포함하는, 세포치료제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법을 통해 줄기세포를 배양함으로써 줄기세포의 크기를 작게 유지시킬 수 있고, 분화능을 증가시키고 노화를 지연 또는 억제시킬 수 있다.
도 1은 기존 혈청 배지(KSB-3 Complete Medium® Kit) 또는 무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 에서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 계대 배양하면서 크기를 측정한 결과이다.
도 2는 기존 혈청 배지(KSB-3 Complete Medium® Kit) 또는 무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 에서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 계대 배양하면서 줄기세포 노화를 비교한 결과이다.
도 3은 기존 혈청 배지(KSB-3 Complete Medium® Kit) 또는 무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 에서 배양된 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 연골 분화능을 비교한 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 하나의 양태는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 효능 증진 방법이다.
본 발명에서, 무혈청 배지란 인간으부터 유래된 혈청이나 또는 비인간 동물로부터 유래된 혈청을 전혀 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 세포 배양 배지를 의미한다.
하나의 구체예에서, 상기 무혈청 배지는 StemVieTM XF Medium Kit 이다.
StemVieTM XF Medium Kit은 상용화된 배지로 당업자가 입수 가능한 배지이다. 상기 배지는 글리신 (Glycine), L-아르기닌 (L-Arginine), L-시스테인·2HCl (L-Cystine·2HCl), L-글루탐산 (L-Glutamic Acid), L-히스티딘 (L-Histidine), L-이소류신 (L-Isoleucine), L-류신 (L-Leucine), L-라이신· 2HCl (L-Lysine·HCl), L-메티오닌 (L-Methionine), L-페닐알라닌 (L-Phenylalanine), L-세린 (L-Serine), L-쓰레오닌 (L-Threonine), L-트립토판 (L-Tryptophan), L-타이로신·2Na·2H2O (L-Tyrosine·2Na·2H2O), L-발린 (L-Valine), 염화콜린 (Choline Chloride), D-판토텐산 (D-Pantothenic Acid (hemiCa)), 엽산 (Folic Acid), 마이오이노시톨 (myo-Inositol), 나이아신아마이드 (Niacinamide), 피리독신(Pyridoxine)·HCl (Pyridoxine · HCl), 리보플라빈 (Riboflavin), 티아민(Thiamine)·HCl (Thiamine·HCl), 황산 마그네슘 무수물 (Magnesium Sulfate (anhydrous)) (Magnesium Sulfate (anhydrous)), 염화칼륨 (Potassium Chloride), 염화나트륨 (Sodium Chloride), 및 D-글루코스(덱스트로스) (D-Glucose (Dextrose))를 포함할 수 있다. 상기 배지는 추가로, 무기염류, 비타민, 완충제, 등장화제 등이 선택적으로 더 포함될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 줄기세포 효능 증진이란 (i) 세포 크기 감소 또는 유지, (ii) 분화능 증가, 및 (iii) 노화 지연 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 의미할 수 있다.
줄기세포를 임의적으로 일정한 크기를 기준으로 분리하였을 때 작은 세포 집단의 증식능이 상대적으로 높고 노화 관련 표지가 낮게 발현 되는 등 줄기세포 효능이 증가한다는 보고가 있다. 타 연구에서는 특정 크기 이하의 직경을 갖는 줄기세포가 상대적으로 뛰어난 미백효과를 나타내는 결과를 확인한 바 있으며, 또 다른 연구에서는 이동성이 높은 줄기세포의 분화능이 높고 이 세포들은 상대적으로 크기가 작은 특징임이 보고 되고 있다. 이에 따라 줄기세포 배양 시 세포 크기를 상대적으로 작게 유지하는 것은 줄기세포 효능 증진으로 이어질 수 있다.
줄기세포 배양을 통해 노화된 세포에서는, 라이소좀 단백질, ROS (활성산소), β-galactosidase 활성 등이 증가되는 것이 보고되어 있다. 따라서 노화 수준을 측정하기 위해 라이소좀 단백질, ROS (활성산소), β-galactosidase 활성 중 어느 하나 이상을 측정할 수 있다. 그 예로, β-galactosidase 활성을 측정하여 줄기세포의 노화 수준을 확인할 수 있다.
본 발명의 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양함으로써, 혈청을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 경우와 비교하여, (i) 줄기세포의 크기가 일정하게 유지될 수 있고/있거나, (ii) 목적하는 세포로의 분화능이 증가될 수 있고/있거나, (iii) 줄기세포의 노화가 억제되거나 지연될 수 있다.
본 발명의 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양함으로써, 혈청을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 경우와 비교하여, (i) 줄기세포의 크기가 일정하게 유지되고, (ii) 목적하는 세포로의 분화능이 증가되고, (iii) 줄기세포의 노화가 억제되거나 지연될 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 KSB-3 Complete Medium® Kit　배지에서 줄기세포를 배양하는 경우와 비교하여, (i) 줄기세포의 크기가 일정하게 유지되거나 감소될 수 있고/있거나, (ii) 목적하는 세포로의 분화능이 증가될 수 있고/있거나, (iii) 줄기세포의 노화가 억제되거나 지연될 수 있다.
본 발명에서 "분화" 란 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말한다. 예를 들어, 줄기세포가 골세포, 연골세포 또는 지방세포 등으로 분화하는 것 뿐만 아니라, 배아줄기세포가 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포로 변하는 과정도 분화에 포함될 수 있으며, 필요한 때에 특정한 조직의 세포로 분화시킬 수 있는 능력을 개선하는 것 또한 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 분화는 줄기세포의 연골세포로의 분화이다.
본 발명의 "줄기세포"는 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 미분화 세포이다. 상기 줄기세포는. 인간 또는 동물 유래 일 수 있고, 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것일 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예에서, 본 발명의 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포이다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예에서, 상기 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 전사조절인자인 ZNF281에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내면서 하기 특성을 갖는 제대혈 유래 만능 줄기세포이다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예에서, 상기 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 다음 중 어느 하나 이상의 특성을 나타낼 수 있다:
(a) 전사조절인자인 c-myc에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
(b) 세포외기질이 코팅된 바닥에 부착되어 부착 후 5 내지 30일 사이에 선 형태 또는 구 형태의 세포 집락을 이루면서 증식함;
(c) 30 내지 45의 CPDL(cumulative population doubling level)을 보임;
(d) CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타냄;
(e) 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포로 분화 가능함; 및
(f) TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인을 분비함.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예에서, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 한국등록특허 10-0950195호에 기재된 바와 같이 분리하여 수득한 세포일 수 있다. 본 발명의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 관련하여, 한국등록특허 10-0950195호 및 10-1627907 호에 개시된 내용이 참조로서 포함된다.
하나의 구체예에서, 줄기세포 배양은 계대배양일 수 있다.
본 발명의 "계대배양(subculture)"은 세포증식 방법의 하나로 주기적으로, 예컨대 1 내지 7일마다, 이전 배양으로부터 새로운(fresh) 배지에 옮겨 배양하는 방법이다. 계대배양은 세포주를 보존하고 세포의 대를 이어나가는 배양방식으로, 이러한 방법은 subculturing 또는 passaging이라고 한다. 이러한 계대배양을 통해 축적되는 독성 대사물질을 제거하고 고갈된 영양분을 공급하여 세포 사멸을 억제하고 성장 및 증식을 촉진할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예에서, 상기 계대배양은 2 계대 이상 수행된다. 일 구체예에서 상기 계대배양은 3 계대, 4 계대 또는 5 계대, 또는 그 이상 수행된다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 배양된 줄기세포를 분화 배지에서 연골세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 연골세포의 제조방법이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 배양된 줄기세포를 분화 배지에서 연골세포로 분화시켜 연골세포를 수집하는 단계를 포함하는 세포치료제의 제조방법을 제공한다.
하나의 구체예에서, 상기 무혈청 배지는 StemVieTM XF Medium Kit 이다.
본 발명에서 "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 세포치료제는 1ml 당 1.0Х10개 내지 1.0Х109개의 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 세포치료제는 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다. 또한, 상기 세포치료제는 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 이용될 수 있다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨 (Becton ickinson), 메드셉(Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모 (Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.
상기 세포치료제에는 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 세포치료제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.
상기 세포치료제는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 배양 배지 조건에 따른 제대혈유래 중간엽 줄기세포의 크기 비교 분석
무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 및 기존 혈청 배지(KSB-3 Complete Medium® Kit) 배양시 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 세포 크기 비교분석을 위해 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 150mm Plate에 3,000개/cm2로 접종하여 P3부터 P6까지 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 한국 등록특허 10-0950195 에 기재된 바와 같이 전사조절인자인 ZNF281에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내는 줄기세포를 분리하여 사용하였다. 각 계대시점에서 각 배양 조건의 세포는 트리플을 처리하여 단일 세포를 수득하였다.
수득한 단일세포를 NC200을 이용하여 세포 크기를 비교 분석하였다. 그 결과 P4에서 각 배양조건 세포의 diameter는 무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 및 기존 혈청 배지(KSB-3 Complete Medium® Kit) 배양 조건 에서 각각 13.7 μm, 13.8 μm로 비슷하나, P5에서는 각각 14 μm, 13.5 μm로 약 0.5 μm차이가 나고 P6 에서는 각각 15.4 μm, 13.7 μm로 약 1.7 μm 차이가 나는 결과를 확인 하였다.
따라서 기존 혈청 배지(KSB-3 Complete Medium® Kit) 배양 조건의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 동일 조건에서 계대가 진행될수록 세포의 크기가 증가하는 반면 무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 배양의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 동일 조건에서 계대가 진행되어도 크기가 증가하지 않는 결과를 확인하였다(도 1).
실시예 2: 배양 배지 조건에 따른 제대혈유래 중간엽 줄기세포의 노화 비교 분석
무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 또는 기존 혈청 배지(KSB-3 Complete Medium® Kit) 배양시 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 노화 정도를 비교분석 하기 위해 β-galactosidase 염색을 통해 각 배양 조건의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 노화 정도를 비교분석 하였다.
상기 실시예 1에서 수득한 각 배양 조건의 P4 그리고 P6 세포는 12well Plate에 1x105개/mL 으로 동일하게 접종하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 그 후 세포를 PBS를 이용하여 1회 세척한 뒤 4% Paraformaldehyde 로 10분간 고정을 진행 했다. 고정 종료 후 PBS 2회 세척하고 β-galactosidase 염색 시약을 각 well당 0.5 mL씩 처리한 뒤 37℃ 조건으로 48시간 염색 후 현미경으로 검경하였다.
β-galactosidase 염색 결과, P4에서 SA-β Gal Positive(%)값은 P4에서 무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 및 기존 혈청 배지(KSB-3 Complete Medium® Kit) 배양 조건에서 각각 2.91%, 1.81%로 무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 배양 조건에서 약 1% 낮은 결과를 확인 하였고, P6 에서는 각각 12.38%, 2.97%으로 무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 배양 조건에서 약 10% 낮은 결과를 확인 하였다.
따라서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 노화는 무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 에서 반복 계대 배양 시 기존의 혈청 배지(KSB-3 Complete Medium® Kit) 배양 조건보다 노화를 늦추는 결과를 확인 하였다(도 2).
실시예 3: 배양 배지 조건에 따른 제대혈유래 중간엽 줄기세포의 분화능 비교 분석
무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 또는 기존 혈청 배지(KSB-3 Complete Medium® Kit) 배양시 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 비교하기 위해, 각 배지 조건에서 배양한 세포에서 연골분화 (Chondrogenic differentiation)를 분석 하였다.
구체적으로 상기 실시예 1에서 수득한 각 배양액 배양 조건의 P6 세포는 15mL tube당 3x105개/ 1mL로 분주하여 원심분리 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 그 후 생성된 Pellet을 96 well Round plate로 옮겨주어 연골분화 배지(StemProTM Chondrogenesis Differentiation Kit)로 교체 후 주 3회 연골분화배지로 교체하며 3주간 분화를 유도하였다. 분화 종료 후 pellet은 PBS세척 및 4% PFA 고정 후 분석 업체 의뢰를 통해 Safranin-O 염색을 진행하였다. 그 결과 무혈청배지(StemVieTM XF Medium Kit) 배양 시 기존 혈청 배지(KSB-3 Complete Medium® Kit) 에 비해 연골분화능이 현저히 증가되는 결과를 확인하였다 (도3).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 효능 증진 방법으로,
    상기 무혈청 배지는 StemVieTM XF Medium Kit이고,
    상기 줄기세포 효능 증진은
    (i) 세포 크기 감소 또는 유지, (ii) 분화능 증가, 및 (iii) 노화 지연 중 선택되는 1 이상인, 줄기세포 효능 증진 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 무혈청 배지는 StemVieTM XF Medium Kit이고, 상기 방법은 혈청을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 경우와 비교하여, 줄기세포 크기를 감소 또는 유지시키고, 분화능을 증가시키고 노화를 지연시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 효능 증진 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 무혈청 배지는 StemVieTM XF Medium Kit이고, 상기 방법은 KSB-3 Complete Medium® Kit 배지에서 줄기세포를 배양하는 경우와 비교하여, 줄기세포 크기를 감소 또는 유지시키고, 분화능을 증가시키고 노화를 지연시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 효능 증진 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분화능은 연골세포로의 분화능인, 줄기세포 효능 증진 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 무혈청배지는 글리신 (Glycine), L-아르기닌 (L-Arginine), L-시스테인· 2HCl (L-Cystine · 2HCl), L-글루탐산 (L-Glutamic Acid), L-히스티딘 (L-Histidine), L-이소류신 (L-Isoleucine), L-류신 (L-Leucine), L-라이신· 2HCl (L-Lysine · HCl), L-메티오닌 (L-Methionine), L-페닐알라닌 (L-Phenylalanine), L-세린 (L-Serine), L-쓰레오닌 (L-Threonine), L-트립토판 (L-Tryptophan), L-타이로신 · 2Na · 2H2O (L-Tyrosine · 2Na · 2H2O), L-발린 (L-Valine), 염화콜린 (Choline Chloride), D-판토텐산 (D-Pantothenic Acid (hemiCa)), 엽산 (Folic Acid), 마이오이노시톨 (myo-Inositol), 나이아신아마이드 (Niacinamide), 피리독신(Pyridoxine) · HCl (Pyridoxine · HCl), 리보플라빈 (Riboflavin), 티아민(Thiamine) · HCl (Thiamine · HCl), 황산 마그네슘 무수물 (Magnesium Sulfate (anhydrous)) (Magnesium Sulfate (anhydrous)), 염화칼륨 (Potassium Chloride), 염화나트륨 (Sodium Chloride), 및 D-글루코스(덱스트로스) (D-Glucose (Dextrose))를 포함하는 것인, 줄기세포 효능 증진 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인, 줄기세포 효능 증진 방법.
  7. 제1항에 있어서 상기 배양은 계대배양인, 줄기세포 효능 증진 방법.
  8. 제7항에 있어서 상기 계대배양은 2 계대 이상 수행되는 것인 줄기세포 효능 증진 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 전사조절인자인 ZNF281에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내면서 하기 특성을 갖는 제대혈 유래 만능 줄기 세포인, 줄기세포 효능 증진 방법:
    (a) 전사조절인자인 c-myc에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
    (b) 세포외기질이 코팅된 바닥에 부착되어 부착 후 5 내지 30일 사이에 선 형태 또는 구 형태의 세포 집락을 이루면서 증식함;
    (c) 30 내지 45의 CPDL(cumulative population doubling level)을 보임;
    (d) CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타냄;
    (e) 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포로 분화 가능함; 및
    (f) TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인을 분비함.
  10. 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 배양된 줄기세포를 분화 배지에서 연골세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 연골세포의 제조방법으로,
    상기 무혈청 배지는 StemVieTM XF Medium Kit인, 연골세포 제조 방법.
  11. 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 배양된 줄기세포를 분화 배지에서 연골세포로 분화시켜 연골세포를 수집하는 단계를 포함하는, 세포치료제의 제조방법으로,
    상기 무혈청 배지는 StemVieTM XF Medium Kit인, 세포치료제의 제조방법.
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