WO2022019403A1 - 고효능 줄기세포를 제조하기 위한 s-i-s 배양방법 - Google Patents

고효능 줄기세포를 제조하기 위한 s-i-s 배양방법 Download PDF

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WO2022019403A1
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cell
enhanced
cells
ability
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이명우
김대성
송주용
김채은
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to an S-I-S culture method for producing high-potency stem cells and to high-potency stem cells prepared by the method.
  • Stem cells are cells that have the ability to differentiate into all kinds of cells that make up the body, such as nerves, blood, and cartilage, if necessary, while remaining undifferentiated into specific cells. There are two main ways to obtain these stem cells. First, they are obtained from a fetus generated from a fertilized egg (embryonic stem cells), and secondly, stem cells (adult stem cells) stored in each part of our body as adults. is to recover Although there are differences in function, both embryonic and adult stem cells have the characteristic of being able to differentiate into various types of cells.
  • human mesenchymal stem cells can be derived from a variety of tissues and are strong candidates for cell-based transplantation or regenerative drug therapy. Characteristics of MSCs such as migration to damaged tissues, immunosuppressive function, self-renewal, and pluripotency open up the possibility of their therapeutic application.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • the present inventors have developed a stem cell culture method (ie, SIS culture method) with enhanced efficacy including stem cell selection, interaction and stimulation steps, and the SIS culture method
  • SIS culture method ie, SIS culture method
  • the present invention was completed.
  • an object of the present invention is a method for producing a stem cell with enhanced efficacy of any one or more of immunosuppressive ability, anticancer, immune cell recruitment, regeneration, and cell engraftment, and stem cells with enhanced efficacy produced by the method is to provide
  • Another object of the present invention PD-L1, CXCR7, PGES and two or more proteins selected from the group consisting of PGDS; Or to provide a stem cell with enhanced expression of the gene encoding it; immunosuppressive ability, anticancer, immune cell recruitment (recruitment), regenerative ability, and cell engraftment ability of any one or more efficacy.
  • the present invention provides (a) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; a selection step of selecting stem cells with enhanced expression; (b) an interaction step of culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; And (c) a stimulation step of treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant; any one of immunosuppressive ability, anticancer, immune cell recruitment, regeneration and cell engraftment ability, including; It provides a method for producing stem cells with one or more enhanced efficacy.
  • the present invention provides a stem cell with enhanced efficacy of any one or more of immunosuppressive ability, anticancer, immune cell recruitment, regenerative ability, and cell engraftment ability prepared by the above method.
  • the present invention provides two or more proteins selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PEGS and PGDS; Or the gene encoding it; the expression of which is enhanced, immunosuppressive ability, anticancer, immune cell recruitment (recruitment), regeneration ability and provides a stem cell with enhanced efficacy of any one or more of the cell engraftment ability.
  • the high-potency stem cells prepared through the S-I-S culture method according to the present invention have enhanced efficacy of any one or more of immunosuppressive ability, anticancer, immune cell recruitment, regeneration, and cell engraftment. Accordingly, the high-potency stem cells according to the present invention can be variously used in the treatment field of cancer, immune-related diseases, and skin diseases.
  • Figure 1b is a factor (CCL8, CCL13, TNFSF10, TNFSF13, TNFSF13B, HLA-DRA, CD74, GBP1, GBP2, GBP4) is a diagram showing the result of confirming.
  • 1c is a diagram showing the results of confirming the factors (GBP5, PGE2, IDO, CXCL9) with increased expression compared to the control group, naive MSC, in mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of the present invention through a microarray to be.
  • Figure 2 confirms the immunosuppressive effect of the mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared by the culturing method of the present invention, and shows the immune cell proliferation inhibitory effect of naive MSCs and MSCs prepared by the culturing method according to the present invention. will be.
  • FIG. 3 is confirming the anticancer effect of the mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of the present invention, and various cancer cell lines of naive MSCs and MSCs prepared by the culture method according to the present invention (human acute T lymphocytic).
  • Anticancer effects were assessed by measuring the cell viability in leukemia cell lines (Jurkat), human liver cancer cell lines (HepG2, Hep3b), human lung cancer cell lines (A549), human breast cancer cell lines (MBA-MB-231), and human colorectal cancer cell lines (HCT116). The confirmed results are shown.
  • Figure 4 confirms the immune cell recruitment effect of mesenchymal stem cells with enhanced efficacy produced by the culture method of the present invention, and the mobilization of immune cells of naive MSCs and MSCs prepared by the culture method according to the present invention ( Recruitment) effect.
  • Figure 5 confirms the regenerative effect of mesenchymal stem cells with enhanced efficacy produced by the culture method of the present invention
  • Figure 5a is a wound healing of naive MSC and MSC prepared by the culture method according to the present invention (wound healing) The results of comparing the effects are shown
  • FIG. 5B shows the results of observing the results of FIG. 5A with a microscope at 200 magnification.
  • FIG. 6 is a view showing the results of confirming the effect of enhancing the cell engraftment in the peripheral blood by the efficacy-enhanced mesenchymal stem cells prepared by the culture method of the present invention.
  • FIG. 7 is a view showing the results of confirming the effect of promoting cell engraftment in the bone marrow by mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of the present invention.
  • the present invention provides a method for producing stem cells in which the efficacy of any one or more of immunosuppressive ability, anticancer, immune cell recruitment, regeneration, and cell engraftment is enhanced, and the efficacy produced by the method is enhanced provided stem cells.
  • the method for producing stem cells with enhanced efficacy includes (a) PD-L1 (Programmed death-ligand 1) or CXCR7 protein; or a gene encoding it; a selection step of selecting stem cells with enhanced expression; (b) an interaction step of culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; and (c) a stimulation step of treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant.
  • PD-L1 Programmed death-ligand 1
  • CXCR7 protein or a gene encoding it
  • a stem cell refers to a cell having the ability to differentiate into two or more cells while having the ability to self-renew, and the stem cell is an adult stem cell, a pluripotent stem cell, an induced pluripotent stem cell or an embryonic stem cell. contains stem cells.
  • the stem cells are preferably embryonic stem cells or adult stem cells.
  • the adult stem cells are preferably derived from bone marrow, blood, skin, fat, brain, umbilical cord, umbilical cord blood, periodontal, amniotic membrane, chorion, decidua, placenta or Wharton's jelly, but not limited thereto. does not
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord.
  • mesenchymal stem cells are undifferentiated stem cells isolated from human or mammalian tissues.
  • Mesenchymal stem cells can be derived from various tissues, and in particular, from one or more selected from the group consisting of bone marrow, blood, skin, fat, brain, umbilical cord, umbilical cord blood, periodontal, amniotic membrane, chorion, decidua, placenta, or Wharton's jelly. can come from Techniques for isolating stem cells from each tissue are already known in the art.
  • the mesenchymal stem cells are autologous, allogeneic or allogeneic bone marrow, blood, skin, fat, brain, umbilical cord, umbilical cord blood, periodontal, amniotic membrane, chorion, decidua, placenta or Wharton's jelly.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from humans, fetuses, or mammals other than humans.
  • the mammals other than humans may be more preferably canines, felines, monkeys, cattle, sheep, pigs, horses, rats, mice or guinea pigs, and the origin is not limited thereto.
  • selection means selecting cells according to whether a certain protein or a gene encoding it is expressed or not and the amount of expression.
  • PD-L1 Programmed death-ligand 1 refers to a transmembrane protein encoded by the CD274 gene in humans, and suppresses the immune system in the treatment of pregnancy, tissue allograft, autoimmune disease and hepatitis. It plays an important role.
  • the PD-L1 transmits a signal that reduces the proliferation of antigen-specific T cells in the lymph node, and at the same time increases apoptosis.
  • CXCR7 C-X-C chemokine receptor type 7 refers to a chemokine receptor also known as ACKR3 (G-protein coupled receptor 159) and GPR159 (Atypical chemokine receptor 3).
  • PGES prostaglandin E2 synthase
  • PGE prostaglandin E2 synthase
  • PGDS Prostaglandin-D synthase refers to an enzyme belonging to the sigma class glutathione-S-transferase family.
  • the PGDS catalyzes the conversion of PGH2 to PGD2 (Prostaglandin-D), and is involved in prostanoid production in the immune system and mast cells.
  • the presence of PGDS is also used to identify the differentiation stage of human megakaryocytes.
  • IDO indoleamine 2,3-dioxygenase
  • IDO refers to a heme-containing enzyme encoded by the IDO 1 gene in humans. IDO limits T cell function and is involved in immune regulation through its ability to control mechanisms of immune tolerance.
  • CXCL9 (Chemokine (C-X-C motif) ligand 9), also known as gamma-interferon-induced monochitin, is a small cytokine belonging to the CXC chemokine.
  • the CXCL9 is a T-cell chemoattractant induced by gamma-interferon.
  • CXCL10 (Chemokine (CXC motif) ligand 10) is known as IP-10 (Interferon gamma-induced protein 10) or small-inducible cytokine B10, a protein of 8.7 kDa encoded by the CXCL10 gene in humans. it means.
  • CXCL10 is a small cytokine belonging to the C-X-C chemokine family.
  • the selected stem cells of step (a) are BD2 (Beta-defensin 2) or LL-37 (Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37) protein; Or it is preferred that the expression of the gene encoding it is further enhanced.
  • BD2 Beta-defensin 2
  • LL-37 Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37
  • culturing to enable the cell-to-cell interaction of step (b) maintains a state of 90% or more confluent when expressed in terms of culture density, but maintains the shape of the cells, It is preferable to be cultured at a level that does not overlap, and more preferably, after seeding at a density of 3,000 to 20,000 cells/cm 2 , it may be cultured for 3 to 5 days.
  • the stimulatory agent is preferably at least one selected from the group consisting of IFN- ⁇ , TNF- ⁇ and poly IC.
  • the stem cells of step (b) include one or more proteins selected from the group consisting of CXCR7 (C-X-C chemokine receptor type 7), PGES (prostaglandin E2 synthase), and PGDS (Prostaglandin-D synthase); Or the gene encoding it; it is preferred that the expression of the enhanced.
  • CXCR7 C-X-C chemokine receptor type 7
  • PGES prostaglandin E2 synthase
  • PGDS Prostaglandin-D synthase
  • the stem cells with enhanced efficacy include (i) two or more proteins selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS; or a gene encoding it; (ii) IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9 (Chemokine (CXC motif) ligand 9), CXCL10 (Chemokine (CXC motif) ligand 10), HLA-G (human leukocyte antigen G), ICAM1 (Intercellular Adhesion Molecule 1), VCAM1 (vascular cell adhesion molecule 1), IL18BP (Interleukin-18-binding protein), RARRES3 (Retinoic acid receptor responder protein 3), CCL8 (CC motif ligand 8) ), CCL13 (CC motif ligand 13), TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), APRIL (A proliferation-inducing ligand), BAFF
  • the steps (a) to (c) refer to selection, interaction, and stimulation steps, respectively, and each step is preferably performed sequentially.
  • the immunosuppressive ability, anticancer, immune cell recruitment, regeneration and cell engraftment ability were enhanced in stem cells cultured by a culture method for selecting, interacting with and stimulating stem cells.
  • the effect of inhibiting immune cell proliferation was confirmed in MSC cultured by the method of the present invention and pretreated with IFN- ⁇ in the stimulator treatment step.
  • the MSC cultured by the method of the present invention and pretreated with IFN- ⁇ in the stimulant treatment step had excellent anticancer effect, cultured by the method of the present invention and treated with IFN- ⁇ alone in the stimulant treatment step; or IFN- ⁇ and TNF- ⁇ treatment in combination; the recruitment effect of immune cells was confirmed in one MSC, cultured by the method of the present invention and treated with IFN- ⁇ alone in the stimulant treatment step; Alternatively, the regenerative effect of MSCs treated with IFN- ⁇ and TNF- ⁇ in combination was specifically confirmed, and the hematopoietic stem cell engraftment enhancing effect of MSCs cultured by the method of the present invention and pretreated with IFN- ⁇ in the stimulator treatment step was confirmed. .
  • the culture method according to the present invention enhances the immunosuppressive ability of stem cells, anticancer, immune cell recruitment, regeneration and cell engraftment ability, which is widely used in cancer, immune diseases and skin diseases. suggest that it could be
  • the culture method according to the present invention selects, interacts with, and stimulates stem cells, thereby enhancing the immunosuppressive ability of the cells in vivo, anticancer, immune cell recruitment (recruitment) ability, regenerative ability and cell engraftment ability. It is possible to provide stem cells that can be widely used in fields, etc.
  • the present invention provides two or more proteins selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS; Or the gene encoding it; the expression of which is enhanced, immunosuppressive ability, anticancer, immune cell recruitment (recruitment), regeneration ability and provides a stem cell with enhanced efficacy of any one or more of the cell engraftment ability.
  • the stem cells with enhanced efficacy include BD-2 or LL-37 protein, which is an additional selection factor; Or the gene encoding it; expression may be further enhanced.
  • the stem cells with enhanced efficacy are IDO, CXCL9, CXCL10, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, GBP1 , at least one protein selected from the group consisting of GBP2, GBP4, GBP5, PGE2 and IFN-beta; Or it is preferred that the expression of the gene encoding it is further enhanced.
  • Stem cells with enhanced efficacy according to this aspect have significantly improved immunosuppressive ability, anticancer, immune cell recruitment, regeneration and cell engraftment compared to naive stem cells, and cancer, immune-related disease treatment and prevention field can be used in a variety of ways.
  • the umbilical cord tissue collected immediately after childbirth was washed before being transferred to the laboratory, and containing F-12 medium supplemented with transfer medium (50 IU/ml penicillin, 50 ⁇ g/ml streptomycin (purchased from Invitrogen))
  • transfer medium 50 IU/ml penicillin, 50 ⁇ g/ml streptomycin (purchased from Invitrogen)
  • the stem cells were extracted in a sterile flow hood.
  • the sample is transferred to a sterile stainless steel container, washed several times with PBS, cut into 2 cm lengths, transferred to a cell culture dish with a diameter of 10 cm, and additionally washed with 70% (v/v) ethanol. Infection treatment was carried out, and the solution was washed several times with PBS to which an antibiotic mixture (50 IU/ml penicillin, 50 ⁇ g/ml streptomycin (purchased from Invitrogen)) was added until the solution became clear.
  • an antibiotic mixture 50 IU/ml penicillin,
  • the umbilical cord tissue was incised to separate Wharton's jelly (the matrix of the umbilical cord) from the blood vessels and other internal elements of the umbilical cord, the blood vessels were removed to separate the Wharton's jelly.
  • the isolated Wharton's jelly was cut into small pieces (0.5 cm ⁇ 0.5 cm). The culture of the isolated tissue was performed according to cell culture conditions suitable for the extraction of mesenchymal stem cells.
  • the explanted tissue was impregnated with 5 ml of MEM- ⁇ (Minimum essential medium-alpha, Gibco) with 10% FBS, 10% FBS and 1% antibiotics-antimycotic. It was cultured at a temperature of 37° C. in a carbon dioxide cell incubator. At this time, the medium was replaced every 3 or 4 days, and the outgrowth of cells was monitored with an optical microscope. Elongating cells were trypsinized (0.125% trypsin/0.05% EDTA) for further expansion and cryopreservation (MEM- ⁇ , 10% FBS), and the medium was changed every 3 or 4 days. The outgrowth of cells from the explanted tissue was monitored by light microscopy.
  • MEM- ⁇ Minimum essential medium-alpha, Gibco
  • the cell pellet was resuspended in medium (MEM- ⁇ (Gibco), 10% FBS, 1% Antibiotics-antimycotic) and counted, and inoculated into T75 tissue culture flasks. The medium was changed every 3 or 4 days. Cell growth and clonogenesis were monitored by light microscopy. At about 90% confluence, cells were sub-cultured as described above.
  • Human acute T lymphocytic leukemia cell line Jurkat
  • human liver cancer cell line HepG2, Hep3b
  • human lung cancer cell line A549
  • human breast cancer cell line MAA-MB-231
  • human colorectal cancer cell line HCT116
  • Example 2 S-I-S (Selection-Interaction-Stimulation) culture method for producing mesenchymal stem cells with enhanced efficacy
  • mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord tissue of Example 1 cells with enhanced expression of PD-L1 and CXCR7 proteins were selected. Specifically, the mesenchymal stem cells of Example 1 were confluently cultured to enable cell-to-cell interaction. An experiment was performed to confirm the expression of PD-L1 and CXCR7 proteins in cultured mesenchymal stem cells. In addition, the expression of BD-2 and LL-37 proteins was confirmed as additional selection factors.
  • Example 1-2 Among the mesenchymal stem cells isolated and cultured in Example 1-2, cells with enhanced expression of PD-L1, CXCR7, BD-2 and LL-37 proteins were identified and selected, and these were used in the next experiment.
  • the selected PD-L1, CXCR7, BD-2 and LL-37 protein expression-enhanced mesenchymal stem cells were subcultured. Specifically, the mesenchymal stem cells were put into the mesenchymal stem cell culture medium and tissue culture flask of Example 1-2, and cultured at 37° C., 5% CO 2 in an incubator. At this time, bFGF was added to the culture medium. During subculture, mesenchymal stem cells of each generation were frozen. In addition, experiments were performed to confirm the morphology and cell proliferation rate of mesenchymal stem cells during subculture and freezing.
  • mesenchymal stem cells with enhanced expression of PD-L1, CXCR7, BD-2 and LL-37 proteins maintained the characteristics of mesenchymal stem cells even during subculture, and maintained or increased the cell proliferation rate.
  • mesenchymal stem cells with enhanced expression of PD-L1, CXCR7, BD-2 and LL-37 proteins maintained the characteristics of mesenchymal stem cells even when frozen and thawed, and maintained or increased the cell proliferation rate.
  • mesenchymal stem cells selected in the selection step of Example 2-1 cells with enhanced expression of CXCR7, PGES and PGDS proteins were selected in the additional selection step.
  • 'culture to enable interaction between cells' refers to maintaining a state of 90% or more confluent when expressed in terms of culture density, but maintaining the shape of the cells and culturing at a level where cells do not overlap. do.
  • the mesenchymal stem cells selected in the selection step of Example 2-1 were seeded at a density of 3,000 to 20,000 cells/cm 2 to enable cell-to-cell interaction, and then harvested after culturing for 3 to 5 days. An experiment was performed to confirm the expression of CXCR7, PGES and PGDS proteins in the harvested mesenchymal stem cells.
  • IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , or polyIC Polyinosinic:polycytidylic acid, Poly I:C
  • the gene expression of mesenchymal stem cells ie, mesenchymal stem cells cultured by S-I-S culture method
  • the results of analysis of genes with increased expression in mesenchymal stem cells treated with immune stimulants are shown in FIG. 1 .
  • the genes encoding the PD-L1, TRAIL, APRIL and BAFF proteins are denoted as CD274, TNFSF10, TNFSF13 and TNFSF13B, respectively.
  • Example 3 Evaluation of immunosuppressive function of stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2
  • Example 2 In order to confirm the immunosuppressive ability by the mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared in Example 2, stimulation with phytohemagglutinin (PHA) that activates healthy adult peripheral blood mononuclear cells (PBMC) And, it was co-cultured with the mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2, and the experiment was performed in the following manner. As a control, naive MSCs that were not subjected to the S-I-S culture method were used.
  • PHA phytohemagglutinin
  • MMC Mitomycin C
  • an MMC stock solution was added to the cell culture medium and mixed, and the mixture was put into hMSC 175T-flask and cultured in a carbon dioxide cell incubator for 1 hour. After centrifugation, the cells were suspended in RPMI culture medium and applied to a 96-well plate to 1.25 ⁇ 10 4 cells/well, and PBMCs activated with PHA were added to 0.5 for co-culture with mesenchymal stem cells with enhanced efficacy. Alternatively, 1 ⁇ 10 5 cells/well were dispensed into the wells with stem cells.
  • the 96-well plate was co-cultured for 3 days under 5% CO 2 , 37° C. temperature conditions. On the 3rd day, in order to evaluate the immunosuppressive ability, a BrdU labeling solution was added to each well, and incubated for 16 hours in a carbon dioxide cell incubator.
  • Example 4 Evaluation of anticancer function of stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2
  • Alamar Blue analysis was performed.
  • the Alamar Blue assay is a modified form of the MTT assay. After treating living cells with a compound that is degraded by a specific enzyme, the relative number of living cells after drug treatment is confirmed by measuring the fluorescence intensity of the product that is released as the compound is decomposed.
  • the cell growth inhibitory effect on the cancer cell line of the mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2 was confirmed.
  • the mesenchymal stem cells with enhanced efficacy are mesenchymal stem cells (MSC SIS CP (I) ) cultured by the culture method of Example 2 and pretreated with IFN- ⁇ in the stimulant treatment step.
  • the cancer cell lines used in this experiment were human acute T lymphocytic leukemia cell line (Jurkat), human liver cancer cell line (HepG2, Hep3b), human lung cancer cell line (A549), human breast cancer cell line (MBA-MB-231), and human colorectal cancer cell line (HCT116). )to be.
  • 4.0 ⁇ 10 4 cancer cells per well were dispensed in a 24-well plate, and mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared by the culturing method of Example 2, which inhibited growth with MMC 0.4 mm pores (Corning Inc.) were plated at a density of 1 ⁇ 10 4 cells in the inserted transwell, and cultured at 37° C. in a humid atmosphere containing 5% CO 2 for 72 hours.
  • a 24-well plate After adding Alamar Blue reagent corresponding to 1/10 of the amount of the culture solution to the cell culture solution filled in each well, the plate was incubated in an incubator for 2 hours. To evenly react the cells in each well, shake the plate slowly and measure the fluorescence intensity at 600 nm while irradiating light at a wavelength of 570 nm with a Fluorescence Microplate Reader (Molecular Devices Corp.) to determine the cell viability. Confirmed. As a control, naive MSCs that were not subjected to the S-I-S culture method were used. The results of confirming the cell viability are shown in FIG. 3 .
  • the effect of inhibiting the cell viability of cancer cells in the mesenchymal stem cell treatment group (MSC SIS CP (I) ) with improved efficacy prepared by the culture method according to Example 2 was higher than that of the naive MSC treatment group. Confirmed.
  • the above result means that the mesenchymal stem cells cultured by the culture method of Example 2 have a remarkable anticancer effect on various carcinomas such as acute T lymphocytic leukemia, liver cancer, lung cancer, breast cancer and colorectal cancer.
  • Example 5 Immune cell recruitment (recruitment) function evaluation of stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2
  • the recruitment function of the stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2 was evaluated through the method of mobilizing PBMCs.
  • IFN- ⁇ alone treatment in the stimulation step (MSC SIS CP (I) ); Or IFN- ⁇ and TNF- ⁇ combined treatment (MSC SIS CP (I + T) ); to prepare mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared.
  • a PET transwell insert having a 3 ⁇ m pore size was coated with 0.1% (wt/vol) bovine gelatin in PBS. Afterwards, 2 ⁇ 10 5 cells/insert of PBMC was added to the top of the insert.
  • the insert was washed twice with cold PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for 5 minutes, and the insert was washed twice with PBS and fixed with methanol for 15 minutes.
  • the insert was washed twice with PBS and stained with hematoxylin for 20 minutes, and the inside of the insert was carefully wiped with a cotton swab to remove the remaining cells without movement.
  • the membrane of the insert was cut out with a knife, attached to a slide glass, covered with a cover glass, and observed under a microscope at 200 magnification, and counted with ImageJ.
  • naive MSCs that were not subjected to the SIS culture method were used.
  • Example 6 Evaluation of regenerative function of stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2
  • the regenerative function of the stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2 was evaluated by a wound healing assay.
  • the fibroblasts used for the test were cultured as a monolayer at 100% density using the HS68 cell line.
  • cells were treated with 10 mg/ml MMC for 1 hour before scratching. After scratching with a sterile 200 ⁇ l pipette tip, it was washed twice with PBS to remove cell debris, and DMEM high glucose media containing 0.5% FBS was added and a 0.4 ⁇ m pore transwell insert (transwell insert). ), stem cells with enhanced efficacy suspended in MEM-alpha media containing 0.5% FBS were added.
  • Stem cells with enhanced efficacy are treated with IFN- ⁇ alone (MSC SIS CP (I) ) in the stimulation step of the SIS culture method of Example 2; Or IFN- ⁇ and TNF- ⁇ in combination treatment (MSC SIS CP (I + T) ); mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared by. Wound healing was induced under 5% CO 2 , 37°C temperature conditions, and after 24 hours, the insert was removed and the movement distance of HS68 was measured by microscopic observation. As a control group, naive MSCs without SIS culture were used.
  • Example 7 Evaluation of cell engraftment enhancement effect of stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2
  • mice per cage were irradiated with sublethal irradiation level of 300 cGy to induce autologous hematopoietic stem cells of NOD/SCID mice. did damage After 4 hours of irradiation, the test animals were treated with hematopoietic stem cells (negative control group, HSC), hematopoietic stem cells and normally cultured mesenchymal stem cells (positive control group, HSC+naive MSC), hematopoietic stem cells and intermediate with enhanced efficacy.
  • HSC hypothal irradiation level of 300 cGy
  • mesenchymal stem cells positive control group, HSC+naive MSC
  • the mesenchymal stem cells were divided into a group (test group, HSC+MSC SIS CP(I) ), and the test substance was administered through the tail vein.
  • the group administered with the hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells with enhanced efficacy was cultured by the culture method of Example 2, and treated with IFN- ⁇ as an immune stimulant.
  • the results of transplantation of hematopoietic stem cells were observed up to 10 weeks after administration of the test substance. During the observation period, general symptoms such as changes in general status, motility, appearance, and autonomic nerves were observed more than 5 times a week, and the presence or absence of dead animals was determined. did In order to judge the performance of hematopoietic stem cell transplantation, the engraftment rate (%) was confirmed by analyzing human-derived blood cell antigens expressed in the entire cell group through FACS analysis. ) analysis was performed.
  • FACS analysis was performed as follows. Bone marrow from the tibia and femur and peripheral blood from the inferior vena cava were collected from mice maintained aseptically in a specific pathogen free (SPF) facility for 10 weeks.
  • SPF pathogen free
  • the collected bone marrow was washed once with PBS (2% FBS-PBS) containing 2% fetal bovine serum, and then red blood cells were destroyed for 15 minutes at room temperature by adding red blood cell lysis buffer and washed once with 2% FBS-PBS. .
  • PBS 2% FBS-PBS
  • red blood cells were destroyed for 15 minutes at room temperature by adding red blood cell lysis buffer and washed once with 2% FBS-PBS.
  • FACS fluorescence phosphate
  • Cells were isolated from the peripheral blood of each mouse, and i) the ratio of hCD45 + cells and mCD45 + cells, and ii) the ratio of hCD45 + intracellular CD13 + cells (Myeloid cells) and CD19 + cells (B cells) were measured using FACS. analyzed. The results of analyzing the engraftment rate of hematopoietic stem cells in mouse peripheral blood are shown in FIG. 6 .
  • the engraftment rate of hematopoietic stem cells in mouse peripheral blood was higher than in the hematopoietic stem cell transplantation group (HSC). It was increased about 60 times, and it was confirmed that it increased about 3 times compared to the hematopoietic stem cell and mesenchymal stem cell transplant group (HSC + naive MSC).
  • Cells were isolated from the bone marrow of each mouse, and i) the ratio of hCD45+ cells and mCD45+ cells, and ii) the ratio of CD13+ cells (Myeloid cells) and CD19+ cells (B cells) in hCD45+ cells were analyzed using FACS. The results of analyzing the engraftment rate of hematopoietic stem cells in the mouse bone marrow are shown in FIG. 7 .
  • the engraftment rate of hematopoietic stem cells in the mouse bone marrow was approximately lower than in the hematopoietic stem cell transplantation group (HSC). It was increased by 14 times, and it was confirmed that it increased about 2 times compared to the hematopoietic stem cell and mesenchymal stem cell transplantation group (HSC+naive MSC).
  • the present inventors prepared mesenchymal stem cells with enhanced efficacy through the culturing method of the present invention, and confirmed that their immunosuppressive ability, anticancer, immune cell recruitment, regenerative ability and cell engraftment ability were enhanced. Accordingly, the mesenchymal stem cells with enhanced efficacy according to the present invention can be used in various ways in the treatment field of cancer, immune diseases, and skin diseases.

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Abstract

본 발명은 고효능 줄기세포를 제조하기 위한 S-I-S 배양방법 및 상기 방법으로 제조된 고효능 줄기세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 S-I-S 배양방법을 통해 제조된 고효능 줄기세포는 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 고효능 줄기세포는 암, 면역질환 및 피부질환의 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

고효능 줄기세포를 제조하기 위한 S-I-S 배양방법
본 발명은 고효능 줄기세포를 제조하기 위한 S-I-S 배양방법 및 상기 방법으로 제조된 고효능 줄기세포에 관한 것이다.
줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. 이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두가지가 있는데, 첫째는 수정란으로부터 발생한 태아로부터 얻는 것(배아줄기세포)이고 둘째는 성인이 된 우리 몸의 각 부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 모두 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다.
특히, 인간 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 다양한 조직에서 유래될 수 있으며, 세포 기반 이식 또는 재생 의약 치료에 있어서 강력한 후보자이다. 손상된 조직으로의 이동, 면역 억제기능, 자가-재생, 및 다분화능과 같은 MSCs의 특징은 이의 치료적 적용의 가능성을 연다. 현재, MSCs의 주입, 또는 이식을 포함하는 500 여개의 임상이 clinicaltrials.gov에 등록되어 있다. 그러나 대부분의 임상 1 상은 생물학적 안정성 문제를 나타내지 않음에도 불구하고, 그 이상의 임상단계에서는 미비한 결과가 도출되고 있다.
더욱이, MSCs의 표준화를 위한 배양 방법 또는 프로토콜이 부재하여, 동일한 수여자의 동일한 조직에서 분리한 MSCs의 경우에도 표현형적, 및 기능적 다양성이 관찰되고 있다. 따라서 특정 조건을 부여하여 MSC의 기능을 촉진 또는 억제하는 방법이 필요하다.
이에 본 발명자들은 줄기세포를 선별(selection), 상호작용(interaction) 및 자극(stimulation) 단계를 포함하는 효능이 증진된 줄기세포의 배양방법(즉, S-I-S 배양방법)을 개발하고, 상기 S-I-S 배양방법을 통해 제조된 줄기세포의 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능이 우수하다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 효능이 증진된 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 선별(selection) 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 상호작용(interaction) 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 자극(stimulation) 단계;를 포함하는, 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포를 제공한다.
또한 본 발명은 PD-L1, CXCR7, PEGS 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포를 제공한다.
본 발명에 따른 S-I-S 배양방법을 통해 제조된 고효능 줄기세포는 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 고효능 줄기세포는 암, 면역관련 질환 및 피부 질환의 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1a는 마이크로 어레이를 통해 본 발명의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포에서 대조군인 naive MSC에 비해 발현이 증가된 인자(CD274, CXCR7, PGES, PGDS, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL188P RARRES3, CXCR10)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 마이크로 어레이를 통해 본 발명의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포에서 대조군인 naive MSC에 비해 발현이 증가된 인자(CCL8, CCL13, TNFSF10, TNFSF13, TNFSF13B, HLA-DRA, CD74, GBP1, GBP2, GBP4)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 마이크로 어레이를 통해 본 발명의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포에서 대조군인 naive MSC에 비해 발현이 증가된 인자(GBP5, PGE2, IDO, CXCL9)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포에 의한 면역억제 효과를 확인한 것으로, naive MSC와 본 발명에 따른 배양방법에 의해 제조된 MSC의 면역세포 증식 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포의 항암 효과를 확인한 것으로, naive MSC와 본 발명에 따른 배양방법에 의해 제조된 MSC의 다양한 암 세포주(인간 급성 T 림프성 백혈병 세포주(Jurkat), 인간 간암 세포주(HepG2, Hep3b), 인간 폐암 세포주(A549), 인간 유방암 세포주(MBA-MB-231) 및 인간 대장암 세포주(HCT116)에서 세포의 생존율을 측정하여 항암 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포의 면역세포 동원(recruitment) 효과를 확인한 것으로, naive MSC와 본 발명에 따른 배양방법에 의해 제조된 MSC의 면역세포 동원(recruitment) 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포의 재생 효과를 확인한 것으로, 도 5a는 naive MSC와 본 발명에 따른 배양방법에 의해 제조된 MSC의 상처 치료(wound healing) 효과를 비교한 결과를 나타낸 것이고, 도 5b는 상기 도 5a의 결과를 200배율의 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포에 의한 말초 혈액 내 세포 생착 증진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포에 의한 골수 내 세포 생착 증진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 효능이 증진된 줄기세포를 제공한다.
상기 효능이 증진된 줄기세포 제조방법은 (a) PD-L1(Programmed death-ligand 1) 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 선별(selection) 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 상호작용(interaction) 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 자극(stimulation) 단계;를 포함한다.
본 발명에 있어서, 줄기세포(stem cell)는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 상기 줄기세포는 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 성체줄기세포는 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 줄기세포는 인간 제대 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 있어서, 중간엽 줄기세포는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포는 다양한 조직에서 유래할 수 있으며, 특히 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로부터 유래할 수 있다. 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.
상기 중간엽 줄기세포는 자가, 타가 또는 동종이형의 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로 구성된 군에서 선택되는 것으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 인간, 태아, 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 보다 바람직하게는 개과 동물, 고양이과 동물, 원숭이과 동물, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으며, 그 유래를 제한하지 않는다.
본 발명에 있어서, 선별은 어떤 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 여부 및 발현량에 따라 세포를 골라내는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, PD-L1(Programmed death-ligand 1)은 인간에서 CD274 유전자에 의해 암호화되는 막 관통 단백질을 의미하며, 임신, 조직 동종 이식, 자가 면역 질환 및 간염의 치료에 있어서 면역계를 억제하는데 중요한 역할을 한다. 상기 PD-L1은 림프절에서 항원 특이적 T 세포의 증식을 감소시키는 신호를 전달하는 동시에, 세포자살(apoptosis)를 증가시킨다.
본 발명에 있어서, CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7)은 ACKR3(G-protein coupled receptor 159) 및 GPR159(Atypical chemokine receptor 3)로도 알려진 케모카인 수용체를 의미한다.
본 발명에 있어서, PGES(prostaglandin E2 synthase)는 MAPEG(Membrane-Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism) 계통인 에이코사노이드(eicosanoid) 및 글루타치온(glutathione)의 대사에 관여하는 효소를 의미한다. 보다 상세하게는 상기 PGES는 PGH2(Prostaglandin H2)로부터 PGE(prostaglandin E)를 생성한다.
본 발명에 있어서, PGDS(Prostaglandin-D synthase)는 시그마 클래스 글루타치온-S-트랜스퍼레이즈 패밀리에 속하는 효소를 의미한다. 상기 PGDS는 PGH2가 PGD2(Prostaglandin-D)로 전환되는 것을 촉매하고, 면역계와 비만 세포에서 프로스타노이드 생성에 관여한다. 또한 PGDS의 존재는 인간 거핵세포(megakaryocyte)의 분화 단계를 확인하는 데에 이용된다.
본 발명에 있어서, IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)는 인간에서 IDO 1 유전자에 의해 암호화되는 헴-함유 효소(heme-containing enzyme)를 의미한다. IDO는 T 세포의 기능을 제한하고, 면역 내성의 메커니즘은 제어하는 능력을 통해 면역 조절에 관여한다.
본 발명에 있어서, CXCL9(Chemokine(C-X-C motif) ligand 9)는 감마-인터페론에 의해 유도된 모노키틴으로도 알려져 잇으며, CXC 케모카인에 속하는 작은 사이토카인이다. 상기 CXCL9는 감마-인터페론에 의해 유도되는 T 세포 화학유인물질(T-cell chemoattractant)이다.
본 발명에 있어서, CXCL10(Chemokine(C-X-C motif) ligand 10)은 IP-10(Interferon gamma-induced protein 10) 또는 small-inducible cytokine B10으로 알려져 있는, 인간에서 CXCL10 유전자에 의해 코딩되는 8.7 kDa의 단백질을 의미한다. CXCL10은 C-X-C 케모카인 계통에 속하는 작은 사이토카인이다
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (a)의 선별된 줄기세포는 BD2(Beta-defensin 2) 또는 LL-37(Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37) 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (b)의 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 것은 배양 밀도로 표현 시 90% 이상의 컨플루언트(confluent) 상태를 유지하되, 세포의 형태가 유지되며, 세포가 겹치지 않는 수준으로 배양되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 3,000 내지 20,000 cells/cm 2의 밀도로 시딩한 후 3 내지 5일 동안 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 자극제는 IFN-γ, TNF-α 및 폴리IC(Poly IC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (b)의 줄기세포는 CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7), PGES(prostaglandin E2 synthase) 및 PGDS(Prostaglandin-D synthase)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 효능이 증진된 줄기세포는 (i) PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진되고, (ii) IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9(Chemokine(C-X-C motif) ligand 9), CXCL10(Chemokine(C-X-C motif) ligand 10), HLA-G(human leukocyte antigen G), ICAM1(Intercellular Adhesion Molecule 1), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1), IL18BP(Interleukin-18-binding protein), RARRES3(Retinoic acid receptor responder protein 3), CCL8(C-C motif ligand 8), CCL13(C-C motif ligand 13), TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand), APRIL(A proliferation-inducing ligand), BAFF(B-cell activating factor), HLA-DRA(HLA class II histocompatibility antigen-DR alpha chain), CD74(Cluster of Differentiation 74), GBP1(Guanylate-binding protein 1), GBP2(Guanylate-binding protein 2), GBP4(Guanylate-binding protein 4), GBP5(Guanylate-binding protein 5), PGE2(Prostaglandin E2) 및 IFN-beta(Interferon-beta)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것이 바람직하다..
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a) 내지 (c)는 각각 선별(selection), 상호작용(interaction) 및 자극(stimulation) 단계를 의미하며, 각 단계는 순차적으로 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 전술한 바와 같이, 줄기세포를 선별, 상호작용 및 자극하는 배양방법으로 배양된 줄기세포에서 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능이 증진된 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 일 실시예에서 줄기세포의 효능증진을 구체적으로 확인한 결과, 본 발명의 방법으로 배양하고 자극체 처리 단계에서 IFN-γ를 전처리한 MSC에서 면역세포 증식 억제 효과를 확인하였을 뿐만 아니라, 본 발명의 방법으로 배양하고 자극제 처리 단계에서 IFN-γ를 전처리한 MSC에서 항암 효과가 우수함을 확인하였고, 본 발명의 방법으로 배양하고 자극제 처리 단계에서 IFN-γ 단독 처리; 또는 IFN-γ 및 TNF-α를 병용 처리;한 MSC에서 면역세포의 동원(recruitment) 효과를 확인하였으며, 본 발명의 방법으로 배양하고 자극제 처리 단계에서 IFN-γ 단독 처리; 또는 IFN-γ 및 TNF-α를 병용 처리;한 MSC의 재생 효과를 구체적으로 확인하였고, 본 발명의 방법으로 배양하고 자극제 처리 단계에서 IFN-γ를 전처리한 MSC의 조혈모세포 생착 증진 효과를 확인하였다.
상기 결과로부터 본 발명에 따른 배양방법이 줄기세포의 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능을 증진시키는바, 이는 암, 면역질환 및 피부질환에 있어 다양하게 활용될 수 있음을 시사한다.
본 발명에 따른 배양방법은 줄기세포를 선별, 상호작용 및 자극함으로써, 생체 내에서 상기 세포의 면역억제능, 항암, 면역세포의 동원(recruitment)능, 재생능 및 세포 생착능을 증진시키는바, 제약 분야 등에 널리 활용 가능한 줄기세포를 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 효능이 증진된 줄기세포는 추가 선별 인자인 BD-2 또는 LL-37 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 효능이 증진된 줄기세포는 IDO, CXCL9, CXCL10, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, GBP1, GBP2, GBP4, GBP5, PGE2 및 IFN-beta로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것이 바람직하다.
본 양태에 따른 효능이 증진된 줄기세포는 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능이 naive 줄기세포에 비해 현저히 증진된 것으로, 암, 면역관련 질환의 치료 및 예방 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 실험 재료 준비
1-1. 인간 제대 채취
출산 직후에 바로 수집된 제대 조직을 실험실로 옮기기 전 세척하고, 이송용 배지(50 IU/㎖의 페니실린, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(Invitrogen으로부터 구매))가 첨가된 F-12 배지를 포함하는 500㎖의 멸균 유리병으로 옮긴 후, 멸균상태의 플로우 후드에서 줄기세포의 추출을 진행하였다. 먼저, 시료는 멸균 스테인리스 스틸의 용기로 옮겨진 후, PBS로 수차례 세정한 후 2 cm 길이로 잘라 10 cm 지름의 세포배양 접시로 옮겨지며, 추가적인 세정 및 70%(v/v) 에탄올에 의해 항감염 처리를 진행하고, 항생제 혼합물(50 IU/㎖의 페니실린, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 (Invitrogen으로부터 구매))이 첨가된 PBS로 상기 용액이 깨끗해질 때까지 수차례 세정하여 사용하였다.
1-2. 인간 제대 조직으로부터 줄기세포 분리 및 배양
제대의 혈관 및 기타 내부요소들로부터 와튼젤리(제대의 기질)를 분리하기 위해 제대조직을 절개한 후, 혈관을 제거하여 와튼젤리를 분리하였다. 세포 추출을 위해 상기 분리된 와튼젤리를 작은 조각(0.5 cm×0.5 cm)으로 잘랐다. 분리된 조직의 배양은 중간엽 줄기세포의 추출에 적합한 세포 배양 조건에 맞추어 수행하였다.
중간엽 줄기세포의 분리 및 배양을 위해 상기 외식된 조직을 10% FBS가 첨가된 5 ml의 MEM-α(Minimum essential medium-alpha, Gibco), 10% FBS 및 1% antibiotics-antimycotic에 함침시킨 후 이산화탄소 세포배양기에서 37℃ 온도로 배양하였다. 이때, 배지는 매 3일 또는 4일 마다 교체하였으며 세포의 성장(outgrowth)은 광학현미경으로 모니터링하였다. 신장하는 세포들은 추가적인 확장 및 냉동보관(MEM-α, 10% FBS)을 위해 트립신처리(0.125% 트립신/0.05% EDTA)하였으며, 상기 배지는 매 3일 또는 4일마다 교체되었다. 외식된 조직으로부터의 세포의 신장(outgrowth)은 광학현미경으로 모니터링하였다.
중간엽 줄기세포의 추출을 위해, 세포의 펠렛은 배지(MEM-α(Gibco), 10% FBS, 1% Antibiotics-antimycotic)에 재현탁 및 카운트되었으며, T75 조직배양 플라스크에 접종되었다. 상기 배지는 매 3일 또는 4일마다 교환되었다. 세포의 성장(growth) 및 클론형성은 광학현미경으로 모니터링되었다. 약 90%의 세포수(confluence)에서, 세포들은 상기에 설명된 바와 같이 서브-배양(sub-culture)되었다.
이러한 세포들은 in vitro에서 지방세포, 연골세포, 골세포 등으로의 분화능 및 중간엽 줄기세포를 특정하는 표면 항원(CD44/CD105, >95% positive; CD31/CD45, >95% negative) 존재 유무를 확인하였다.
1-3. 암세포주의 확보 및 배양
인간 급성 T 림프성 백혈병 세포주(Jurkat), 인간 간암 세포주(HepG2, Hep3b), 인간 폐암 세포주(A549), 인간 유방암 세포주(MBA-MB-231) 및 인간 대장암 세포주(HCT116)를 American Type Culture Collection으로부터 얻어 배양하였다. 모든 세포들은 항생제 및 10% FBS로 보충하고, 5% CO 2를 함유하는 습한 대기에서 37℃ 온도조건 하에 배양하였다.
실시예 2. 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 제조를 위한 S-I-S(Selection-Interaction-Stimulation) 배양방법
2-1. PD-L1 및 CXCR7 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포 선별 단계(Selection stage)
2-1-1. 중간엽 줄기세포에서 PD-L1 및 CXCR7 단백질 발현 분석
실시예 1의 인간 제대 조직으로부터 분리된 중간엽 줄기세포 중 PD-L1 및 CXCR7 단백질의 발현이 증진된 세포를 선별하였다. 구체적으로, 실시예 1의 중간엽 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 컨플루언트하게 배양하였다. 배양된 중간엽 줄기세포에서 PD-L1 및 CXCR7 단백질의 발현을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 또한 추가 선별 인자로서 BD-2 및 LL-37 단백질의 발현을 확인하였다.
실시예 1-2에 의해 분리 및 배양된 중간엽 줄기세포 중 PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질의 발현이 증진된 세포를 확인 및 선별하였으며, 이를 다음 실험에 사용하였다.
2-1-2. PD-L1 및 CXCR7 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포의 계대 배양 및 동결
선별된 PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포를 계대 배양하였다. 구체적으로 상기 중간엽 줄기세포를 실시예 1-2의 중간엽 줄기세포 배양배지와 조직배양 플라스크에 넣어 37℃, 5% CO 2 배양기에서 배양하였다. 이 때, 배양배지에 bFGF를 첨가하였다. 계대 배양 중 각 세대의 중간엽 줄기세포를 동결시켰다. 또한 계대 배양 및 동결 시 중간엽 줄기세포의 형태 및 세포증식율을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포는 계대 배양 중에도 중간엽 줄기세포의 특성이 유지되며, 세포 증식율이 유지 또는 증가하는 것을 확인하였다.
PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포는 동결 및 해동 시에도 중간엽 줄기세포의 특성이 유지되며, 세포 증식율이 유지 또는 증가하는 것을 확인하였다.
2-2. 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포에서 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포의 상호작용 단계(Interaction stage)
실시예 2-1의 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포 중 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질의 발현이 증진된 세포를 추가 선별 단계에서 선별하였다. 구체적으로, ‘세포 간 상호작용이 가능하도록 배양’은 배양 밀도로 표현 시 90% 이상의 컨플루언트(confluent) 상태를 유지하되, 세포의 형태가 유지되며, 세포가 겹치지 않는 수준으로 배양되는 것을 의미한다. 상기 실시예 2-1의 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 3,000 내지 20,000 cells/cm 2의 밀도로 시딩한 후 3 내지 5일 동안 배양한 후 수확하였다. 수확된 중간엽 줄기세포에서 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질의 발현을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
실시예 2-1의 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포를 상호작용이 가능하도록 배양한 후 이들 중 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질의 발현이 증진된 세포를 확인 및 선별하였으며, 선별된 세포를 다음 실험에 사용하였다.
2-3. 선별된 중간엽 줄기세포에 면역 자극제를 처리하는 프라이밍 단계 (Stimulation stage)
실시예 2-2의 추가 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포에 면역 자극제인 IFN-γ, TNF-α 또는 폴리IC(Polyinosinic:polycytidylic acid, Poly I:C)를 처리하거나 상기 자극제를 혼합하여 자극하였다. 마이크로 어레이를 통해 면역 자극제를 처리한 중간엽 줄기세포(즉, S-I-S 배양방법으로 배양된 중간엽 줄기세포)의 유전자 발현을 분석하였다. 면역 자극제를 처리한 중간엽 줄기세포에서 발현이 증가된 유전자의 분석 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 면역 자극제를 처리한 중간엽 줄기세포는 IDO, PD-L1, CXCL9, CXCL10, CXCR7, PGES, PGDS, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, GBP1, GBP2, GBP4, GBP5 및 IFN-beta 단백질을 코딩하는 유전자; 및 PGE2 단백질;의 발현이 증가된 것을 확인하였다. 상기 PD-L1, TRAIL, APRIL 및 BAFF 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 CD274, TNFSF10, TNFSF13 및 TNFSF13B로 표시된다.
이하, 실험에서는 면역 자극제 처리로 부스팅된 줄기세포를 이용하였다.
실시예 3. 실시예 2의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 줄기세포의 면역억제 기능 평가
상기 실시예 2에 의해 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포에 의한 면역 억제 능력을 확인하기 위해, 건강한 성인 말초 혈액단핵세포(PBMC)를 활성화시키는 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin, PHA)으로 자극하고, 이를 실시예 2의 배양 방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포와 공조배양하여, 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 대조군으로는 S-I-S 배양방법을 수행하지 않은 naive MSC를 이용하였다.
구체적으로, hMSC의 MMC(Mitomycin C) 처리를 위하여, 세포배양액에 MMC 스톡(stock) 용액을 넣어 혼합하고, 혼합액을 hMSC 175T-flask에 넣어주어 1 시간동안 이산화탄소 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, 세포를 원심분리 후, RPMI 배양액에 부유하여 1.25×10 4 cells/well이 되도록 96 웰 플레이트에 도포하고, 효능이 증진된 중간엽 줄기세포와의 공동 배양을 위하여 PHA로 활성화 된 PBMC를 0.5 또는 1×10 5 cells/well이 되도록 줄기세포가 있는 웰에 분주하였다.
면역 억제 효능을 평가하기 위해 상기 96 웰 플레이트를 5% CO 2, 37℃ 온도 조건 하에 3일간 공동배양하였다. 3일차에 면역억제능을 평가하기 위하여 각 웰에 BrdU 라벨링(labeling) 용액을 넣어주고, 이산화탄소 세포배양기에서 16시간 동안 배양하였다.
결과 값 확보를 위하여 96 웰 플레이트를 원심분리 후, 상층액을 제거하여 완전 건조를 실시하였다. 세포의 고정을 위하여 각 웰에 FixDenat를 넣고 정치 후, Anti-BrdU-POD 워킹(working) 용액을 넣고 2시간 동안 정치시켰다. 이후, Anti-BrdU-POD를 제거 및 세척 후에, 기질(Substrate) 용액을 넣고 ELISA reader 370nm 및 492nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, naive MSC에 비해 본 발명의 배양방법으로 배양하고 자극제 처리 단계에서 IFN-γ를 전처리한 중간엽 줄기세포(MSC S-I-S CP (I))에서 면역세포 증식 억제 효과가 유의적으로 높은 것을 확인하였다.
실시예 4. 실시예 2의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 줄기세포의 항암 기능 평가
상기 실시예 2에 의한 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포의 항암 능력을 확인하기 위해 다양한 암세포와 공동배양 후, Alamar Blue 분석을 시행하였다. Alamar Blue 분석은 MTT 분석의 변형된 형태로서, 특정 효소에 의해서 분해되는 화합물을 살아있는 세포에 처리한 후 화합물이 분해되면서 나오는 생성물의 형광 세기를 측정함으로써 약물을 처리한 후 살아있는 세포의 상대적인 숫자를 확인할 수 있다.
상기 실시예 2의 배양 방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포의 암세포주에 대한 세포 성장 억제효과를 확인하였다. 상기 효능이 증진된 중간엽 줄기세포는 실시예 2의 배양방법으로 배양하고 자극제 처리 단계에서 IFN-γ를 전처리한 중간엽 줄기세포(MSC S-I-S CP (I))이다. 본 실험에서 사용한 암세포주는 인간 급성 T 림프성 백혈병 세포주(Jurkat), 인간 간암 세포주(HepG2, Hep3b), 인간 폐암 세포주(A549), 인간 유방암 세포주(MBA-MB-231) 및 인간 대장암 세포주(HCT116)이다. 구체적으로, 공동배양을 위해 24 웰 플레이트에 각 웰 당 4.0×10 4 개의 암 세포를 분주하고, MMC로 성장을 억제시킨 실시예 2의 배양 방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포를 0.4mm 포어(Corning Inc.)가 삽입된 트랜스웰에 1×10 4 세포 밀도로 플레이팅하고, 72시간 동안 5% CO 2를 함유하는 습한 대기에서 37℃ 온도조건 하에 배양하였다.
24-웰 플레이트에서 각 웰에 채워진 세포 배양액에 배양액양의 1/10에 해당하는 Alamar Blue 시약을 첨가한 후 플레이트를 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 각 웰의 세포를 고르게 반응시키기 위하여 플레이트를 천천히 흔들고, 570 ㎚의 파장에서 조사광을 조사하면서 600 ㎚에서 형광 세기를 형광광도계(Fluorescence Microplate Reader; Molecular Devices Corp.)로 측정하여, 세포의 생존율을 확인하였다. 대조군으로는 S-I-S 배양방법을 수행하지 않은 naive MSC를 이용하였다. 세포의 생존율을 확인한 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, naive MSC 처리군보다 실시예 2에 의한 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 처리군(MSC S-I-S CP (I))에서 암세포의 세포 생존율 억제 효과가 높은 것을 확인하였다. 상기 결과는 실시예 2의 배양방법으로 배양된 중간엽 줄기세포가 급성 T 림프성 백혈병, 간암, 폐암, 유방암 및 대장암 등과 같은 다양한 암종에 대하여 현저한 항암 효과가 있음을 의미한다.
실시예 5. 실시예 2의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 줄기세포의 면역세포 동원(recruitment) 기능 평가
상기 실시예 2의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 줄기세포의 동원(recruitment) 기능은 PBMC를 동원하는 방법을 통해 평가하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2의 S-I-S 배양방법 중 Stimulation 단계의 면역 자극제 IFN-γ 단독 처리(MSC S-I-S CP (I)); 또는 IFN-γ 및 TNF-α를 병용 처리(MSC S-I-S CP (I+T));하여 제조한 효능이 증진된 중간엽 줄기세포를 준비하였다. 24 웰 플레이트에 상기 효능이 증진된 줄기세포를 준비한 다음, 3 ㎛ 포어 크기를 가진 PET transwell insert를 0.1%(wt/vol) PBS 내 소 젤라틴(bovine gelatin in PBS)으로 코팅하였다. 이후 insert의 상부에 PBMC를 2×10 5 cells/insert 더해주었다. 5% CO 2, 37℃ 온도 조건하에 세포 배양 2시간 내지 4시간 이후, insert를 cold PBS로 2회 세척하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 5분간 고정하였고, 상기 insert를 PBS로 2회 세척하고 메탄올로 15분간 고정하였다. 상기 insert를 PBS로 2회 세척 하고 헤마톡실린(haematoxylin)으로 20분간 염색하고, 이동하지 않고 남아있는 세포를 제거하기 위하여 insert 내부를 조심스럽게 면봉으로 닦아주었다. insert의 막(membrane)은 칼로 도려내 슬라이드 글라스에 부착시키고 커버 글라스로 덮어 200배율로 현미경 관찰하였고, ImageJ로 카운트 하였다. 대조군으로는 S-I-S 배양방법을 수행하지 않은 naive MSC를 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 naive MSC보다 본 발명의 배양방법으로 배양하고, 자극제 처리 단계에서 IFN-γ 단독 처리(MSC S-I-S CP (I)); 또는 IFN-γ 및 TNF-α를 병용 처리(MSC S-I-S CP (I+T));한 중간엽 줄기세포에서 면역세포 동원(recruitment) 능력이 높게 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 6. 실시예 2의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 줄기세포의 재생 기능 평가
상기 실시예 2의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 줄기세포의 재생 기능은 상처 치료 분석(wound healing assay)으로 평가하였다.
시험을 위해 사용되는 섬유아세포(fibroblast)는 HS68 cell line을 이용하여 100% 밀도의 단일층으로 배양하였다. 증식(proliferation)에 대한 영향은 억제하기 위해, 세포에 스크래치를 내기 전 10 ㎎/㎖ MMC를 1시간 동안 처리하였다. 멸균된 200 ㎕ 파이펫 팁으로 스크래치 후 세포 잔여물(cell debris)을 제거하기 위해 PBS로 2회 세척하였고 0.5% FBS가 포함된 DMEM high glucose media를 첨가하고 0.4 ㎛ 포어의 트랜스 웰 인서트(transwell insert)에는 0.5% FBS가 포함된 MEM-alpha media에 현탁된 효능이 증진된 줄기세포를 첨가하였다. 상기 효능이 증진된 줄기세포는 상기 실시예 2의 S-I-S 배양방법 중 Stimulation 단계의 면역 자극제 IFN-γ 단독 처리(MSC S-I-S CP (I)); 또는 IFN-γ 및 TNF-α를 병용 처리(MSC S-I-S CP (I+T));하여 제조한 효능이 증진된 중간엽 줄기세포이다. 5% CO 2, 37℃ 온도조건 하에 상처 치료(wound healing)를 유도하고 24시간 이후, insert는 제거하고 현미경 관찰하여 HS68의 이동 거리를 측정하였다. 대조군으로는 S-I-S 배양방법을 수행하지 않은 naive MSC를 이용하였다.
그 결과, 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이 naive MSC보다 본 발명의 배양방법으로 배양하고 자극제 처리 단계에서 IFN-γ 단독 처리(MSC S-I-S CP (I)); 또는 IFN-γ 및 TNF-α를 병용 처리(MSC S-I-S CP (I+T));하여 제조한 MSC에서 재생능이 현저하게 높게 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 7. 실시예 2의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 줄기세포의 세포 생착 증진 효과 평가
7-1. 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 및 조혈모세포 이식
조혈모세포를 NOD/SCID 마우스에 이식하기 4~6 시간 전 우리당 마우스를 3마리씩 넣고, 준치사 방사선조사(sublethal irradiation) 수준인 300 cGy로 방사선 조사를 수행하여, NOD/SCID 마우스의 자가 조혈모세포에 손상을 주었다. 방사선 조사 4 시간 후 시험동물들을 조혈모세포를 투여한 군(음성 대조군, HSC), 조혈모세포 및 일반적으로 배양된 중간엽 줄기세포(양성 대조군, HSC+naive MSC), 조혈모세포 및 효능이 증진된 중간엽 줄기세포를 함께 투여한 군(시험군, HSC+MSC S-I-S CP(I))으로 나누었고, 꼬리정맥을 통해 시험물질을 투여하였다. 상기 조혈모세포 및 효능이 증진된 중간엽 줄기세포를 함께 투여한 군(시험군, HSC+MSC S-I-S CP(I))는 실시예 2의 배양방법으로 배양하였고, 면역 자극제로 IFN-γ를 처리한 중간엽 줄기세포를 의미한다.
7-2. 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 및 조혈모세포의 이식 결과 관찰
시험물질 투여 후 10 주까지 조혈모세포의 이식 결과를 관찰하였다. 관찰기간 중 주 5회 이상 일반상태의 변화, 운동성, 외관, 자율신경 등의 일반증상을 관찰하고 사망동물의 유무를 파악하였으며, 시험동물의 체중은 각각 군 분리 시 및 관찰기간 중 주 2회 측정하였다. 조혈모세포 이식의 성과를 판단하기 위해, FACS 분석을 통해 전체 세포군에서 발현되는 사람유래 혈액세포항원을 분석하여 생착률(%)을 확인하였으며, 각 군별로 세포이식 후 골수를 채취하여 CFU(colony forming unit) 분석을 수행하였다.
FACS 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 10 주간 SPF(specific pathogen free) 시설에서 무균상태로 유지된 마우스로부터 경골 및 대퇴골에서 골수를, 하대정맥에서 말초혈액을 채취하였다.
채취된 골수는 2% 우태아혈청이 함유된 PBS(2% FBS-PBS)로 1회 세척 후, 적혈구 용해 완충액을 첨가하여 상온에서 15분간 적혈구를 파괴하고 2% FBS-PBS로 1회 세척하였다. FACS를 이용한 면역염색을 위해 튜브 당 5×10 5 세포를 100 ㎕에 현탁한 후, 분석하고자 하는 항체를 지시된 양만큼 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다.
채취된 말초혈액의 분석을 위해서는 혈액 75 ㎕에 골수 샘플에 첨가된 동일한 양의 항체를 반응시킨 후, 2 ㎖의 적혈구 용해 완충액으로 상온에서 15 분간 적혈구를 파괴하였고, 이후의 과정은 골수샘플 취급과정과 동일하였다. 2% FBS-PBS 2 ㎖을 넣고 세척한 후, 원심분리(1500 rpm, 5분)하여 상층액을 제거하였다. 4% PFA(paraformaldehyde) 250 ㎕를 넣고 가볍게 섞어준 후, FACS를 이용하여 분석하였다.
마우스 말초 혈액 내에서 조혈모세포의 생착률
각 마우스의 말초 혈액으로부터 세포를 분리하여 i) hCD45 + 세포 및 mCD45 + 세포의 비율과, ii) hCD45 + 세포 내 CD13 + 세포(Myeloid cell), CD19 + 세포(B cell) 비율을 FACS를 이용하여 분석하였다. 마우스 말초 혈액 내에서 조혈모세포의 생착률을 분석한 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 및 조혈모세포 이식군(HSC+MSC S-I-S CP(I))은, 마우스 말초 혈액에서 조혈모세포의 생착률이 조혈모세포 이식군(HSC)에 비해 약 60배 증가하였고, 조혈모세포 및 중간엽 줄기세포 이식군(HSC+naive MSC)에 비해 약 3배 증가한 것을 확인하였다.
마우스 골수에서 조혈모세포의 생착률
각 마우스의 골수로부터 세포를 분리하여 i) hCD45+ 세포 및 mCD45+ 세포의 비율과, ii) hCD45+ 세포 내 CD13+ 세포(Myeloid cell), CD19+ 세포(B cell) 비율을 FACS를 이용하여 분석하였다. 마우스 골수에서 조혈모세포의 생착률을 분석한 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 및 조혈모세포 이식군(HSC+MSC S-I-S CP(I))은, 마우스 골수에서 조혈모세포의 생착률이 조혈모세포 이식군(HSC)에 비해 약 14배 증가하였고, 조혈모세포 및 중간엽 줄기세포 이식군(HSC+naive MSC)에 비해 약 2배 증가한 것을 확인하였다.
종합적으로 본 발명자들은 본 발명의 배양방법을 통해 효능이 증진된 중간엽 줄기세포를 제조하고, 이의 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능이 증진된 것을 확인하였다. 이에 따라 본 발명에 따른 효능이 증진된 중간엽 줄기세포는 암, 면역질환 및 피부질환의 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. (a) PD-L1(Programmed death-ligand 1) 또는 CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7) 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 선별(selection) 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 상호작용(interaction) 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 자극(stimulation) 단계;
    를 포함하는, 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것인, 효능이 증진된 줄기세포 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로부터 유래된 것인, 효능이 증진된 줄기세포 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 선별된 줄기세포는 BD2(Beta-defensin 2) 또는 LL-37(Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37) 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것인, 효능이 증진된 줄기세포 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 것은 배양 밀도로 표현 시 90% 이상의 컨플루언트(confluent) 상태를 유지하되, 세포의 형태가 유지되며, 세포가 겹치지 않는 수준으로 배양되는 것인, 효능이 증진된 줄기세포 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 것은 3,000 내지 20,000 cells/cm 2의 밀도로 시딩한 후 3 내지 5일 동안 배양하는 것인, 효능이 증진된 줄기세포 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 자극제는 IFN-γ, TNF-α 및 폴리IC(Poly IC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 효능이 증진된 줄기세포 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 줄기세포는 CXCR7, PGES(prostaglandin E2 synthase) 및 PGDS(Prostaglandin-D synthase)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 효능이 증진된 줄기세포 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 효능이 증진된 줄기세포는,
    (i) PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진되고,
    (ii) IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9(Chemokine(C-X-C motif) ligand 9), CXCL10(Chemokine(C-X-C motif) ligand 10), HLA-G(human leukocyte antigen G), ICAM1(Intercellular Adhesion Molecule 1), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1), IL18BP(Interleukin-18-binding protein), RARRES3(Retinoic acid receptor responder protein 3), CCL8(C-C motif ligand 8), CCL13(C-C motif ligand 13), TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand), APRIL(A proliferation-inducing ligand), BAFF(B-cell activating factor), HLA-DRA(HLA class II histocompatibility antigen-DR alpha chain), CD74(Cluster of Differentiation 74), GBP1(Guanylate-binding protein 1), GBP2(Guanylate-binding protein 2), GBP4(Guanylate-binding protein 4), GBP5(Guanylate-binding protein 5), PGE2(Prostaglandin E2) 및 IFN-beta(Interferon-beta)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 효능이 증진된 줄기세포 제조방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된, 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포.
  11. PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 효능이 증진된 줄기세포는 BD-2 또는 LL-37 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것인, 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 효능이 증진된 줄기세포는 IDO, CXCL9, CXCL10, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, GBP1, GBP2, GBP4, GBP5, PGE2 및 IFN-beta로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것인, 면역억제능, 항암, 면역세포 동원능(recruitment), 재생능 및 세포 생착능 중 어느 하나 이상의 효능이 증진된 줄기세포.
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