CN105838671A - I型干扰素及间充质干细胞在制备抗肿瘤药物中的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及I型干扰素及间充质干细胞在制备抗肿瘤药物中的新用途。首次揭示了I型干扰素可以通过抑制间充质干细胞(MSCs)表达iNOS而使其发挥抗肿瘤作用，抑制肿瘤生长。本发明为I型干扰素及MSCs在抗肿瘤中的应用提供了新的重要的机制，提出了新型临床治疗途径。

Description

I型干扰素及间充质干细胞在制备 抗肿瘤药物中的新用途

技术领域

本发明属于免疫学领域，更具体地，本发明涉及I型干扰素及间充质干细胞在制备抗肿瘤药物中的新用途。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)因其具有的免疫调节作用在免疫紊乱性疾病的治疗中占有重要地位。更重要的是，MSCs的免疫抑制作用是需要炎症因子的刺激。并且，介导MSCs免疫抑制作用的核心分子具有物种差异性，在小鼠MSCs中是诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)，在人MSCs中是吲哚胺-2，3-双加氧酶。在小鼠MSCs中，iNOS的产生主要依赖于IFNγ和TNFα或IL-1的共同刺激，其中IFNγ是必不可少的。

众所周知，同属干扰素家族的I型干扰素(IFNα和IFNβ)和II型干扰素(IFNγ)与TNFα协同均能很好地诱导小鼠巨噬细胞表达iNOS。然而，对于MSCs，I型干扰素IFNα或IFNβ则不能替代IFNγ与TNFα组合诱导iNOS的表达。

干扰素(Interferon，IFN)，是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的，是一种细胞因子，具有抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。其本质是蛋白质，类型可分为α、β、γ、ω等几种。

IFN能诱导细胞对病毒感染产生抗性，它通过干扰病毒基因转录或病毒蛋白组分的翻译，从而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制品。但是I型干扰素在临床应用中，涉及毒副作用大，半衰期短的问题，限制了其应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供I型干扰素及间充质干细胞在制备抗肿瘤药物中的新用途。

在本发明的第一方面，提供一种间充质干细胞，所述的间充质干细胞是I型干扰素预处理的间充质干细胞，或是过表达I型干扰素的间充质干细胞。

在一个优选例中，所述的预处理包括：

将I型干扰素与间充质干细胞相混合，使得I型干扰素的终浓度为200-10000U/ml；较佳地为300-8000U/ml；更佳地为500-5000U/ml；例如800U/ml，1000U/ml，15000U/ml，2500U/ml。

在另一优选例中，所述的过表达I型干扰素的间充质干细胞中转化有编码I型干扰素的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的I型干扰素选自：IFNα或IFNβ；或所述的间充质干细胞是骨髓来源的间充质干细胞，或是脐带、脂肪、胎盘、牙龈等来源的间充质干细胞。

在另一优选例中，所述的I型干扰素是IFNα，其氨基酸序列如GenBank登录号NP_034633.2所示。

在另一优选例中，所述的I型干扰素是IFNβ，其氨基酸序列如GenBank登录号AAA37891.1所示。

在本发明的另一方面，提供所述的间充质干细胞用途，用于制备抑制肿瘤的药物。

在一个优选例中，所述的肿瘤是黑色素瘤。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药物组合物，所述的药物组合物中包含任一所述的间充质干细胞。

在本发明的另一方面，提供I型干扰素的用途，用于制备提高间充质干细胞中MHC I表达的组合物；或用于制备降低间充质干细胞的免疫抑制能力(即：调动间充质干细胞发挥免疫促进作用)或提高机体抗肿瘤免疫反应的组合物。

在本发明的另一方面，提供Ⅰ型干扰素的用途，用于制备抑制间充质干细胞中STAT1的DNA结合能力的组合物；或用于制备减少间充质干细胞中诱导型一氧化氮合成酶的表达的组合物。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的用途，所述的I型干扰素选自：IFNα或IFNβ。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、IFNα单独或与TNFα联合作用，不能刺激MSCs的一氧化氮产生。

(A)骨髓来源的巨噬细胞或MSCs，用IFNγ(10ng/ml)，TNFα(10ng/ml)或IFNα(2500U/ml)的各种细胞因子组合刺激24小时后，通过Greiss试剂检测培养上清中一氧化氮的含量；Control为PBS。图中数值为means±SD。

(B)MSCs用IFNγ(10ng/ml)，IFNα(2500U/ml)或IFNβ(2500U/ml)刺激12小时，然后通过流式细胞仪检测MHC I类分子K^bD^b的表达。数据为3次独立重复实验中的1次代表性结果。

图2、IFNα可以减弱MSCs的免疫抑制作用。

(A)MSCs与CD3抗体激活的脾细胞共培养，并同时用L-NMMA(1mM)或IFNα(2500U/ml)处理48小时。培养上清中的一氧化氮通过Greiss法测定，细胞增殖水平通过³H-TdR掺入法检测。Control为PBS处理组。

(B)不同密度的MSCs与CD3抗体激活的脾细胞(Spl)共培养，并同时用IFNα(2500U/ml)或IFNβ(2500U/ml)处理48小时。细胞增殖水平通过³H-TdR掺入法检测。图中数值为means±SD。数据为2次独立重复实验中的1次代表性结果。Control为PBS处理组。

图3、IFNα可在MSCs中抑制IFNγ和TNFα介导的iNOS产生。

A-C、MSCs用IFNγ(10ng/ml)，TNFα(10ng/ml)或IFNα(2500U/ml)的各种细胞因子组合刺激24小时后，检测了iNOS的mRNA(A)和蛋白表达水平(B左)及上清中一氧化氮的含量(B右)；Control为PBS处理组。图中数值为means±SD。数据为至少3次独立重复实验中的1次代表性结果。

图4、IFNα不影响绝大多数本发明人所检测的细胞因子、趋化因子等的表达。MSCs用IFNγ(10ng/ml)和TNFα(10ng/ml)或IFNγ(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)和IFNα(2500U/ml)处理24小时，上清通过Bio-Plex检测；Control为PBS处理组。图中数值为means±SD。数据为至少2次独立重复实验中的1次代表性结果。每列图下方的横坐标适用于该列所有图作为横坐标。

图5、IFNα处理不影响MSCs的IFNγ受体表达。

(A)MSCs用IFNγ(10ng/ml)和TNFα(10ng/ml)或IFNγ(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)和IFNα(2500U/ml)处理24小时。收集的总RNA用Affymetrix公司的小鼠4302.0表达谱芯片检测；Control为PBS处理组。左图纵坐标适用于该行所有图作为纵坐标。

(B)MSCs用IFNγ(10ng/ml)和TNFα(10ng/ml)或IFNγ(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)和IFNα(2500U/ml)处理后，通过流式细胞仪检测IFNγ受体的表达水平。图中数值为means±SEM；Control为PBS处理组。

图6、IFNα抑制MSCs中STAT1的结合活性。

(A)MSCs用各种细胞因子(TNFα(10ng/ml)、IFNγ(10ng/ml)、IFNα(2500U/ml))处理24小时后收集总蛋白。STAT1和p65通过与连接了各自结合位点寡核苷酸序列的琼脂糖微珠孵育并富集，然后通过western blotting检测。

(B)MSCs先用STAT1转录活性的报告质粒-2×SIE荧光素酶质粒转染，然后用各种细胞因子及其组合处理，最后在不同的时间点用荧光素酶检测试剂盒检测STAT1的转录活性。左图纵坐标适用于该行所有图作为纵坐标。

(C)MSCs用各种细胞因子(TNFα(10ng/ml)、IFNγ(10ng/ml)、IFNα(2500U/ml))组合处理，在不同时间点分别检测IL-6和iNOS的mRNA水平。图中数值为means±SEM。数据为3次独立重复实验中的1次代表性结果。

图7、IFNα预处理的MSCs在体内显著地抑制了小鼠黑色素瘤的生长。

(A)B16-F0黑色素瘤细胞(1×10⁶/25μl)与IFNα(0.25μg/g小鼠体重)处理的MSCs、MSC-GFP或MSC-IFNα(1×10⁶/25μl)共同注射到C57BL/6小鼠的腿部肌肉。12天后，从处死的小鼠腿部剥离肿瘤并称重。

(B)MSCs先用IFNα(2500U/ml)预处理(IFNαprimed MSC)24小时，然后用A中的方法与B16-F0黑色素瘤细胞共同注射到C57BL/6小鼠的腿部肌肉。每隔3天往肿瘤部位注射用IFNα预处理24小时的MSCs(2×10⁶)。14天后，从处死的小鼠腿部剥离肿瘤并称重。图中数值为means±SEM。数据为2次独立重复实验中的1次代表性结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示了I型干扰素可以通过抑制间充质干细胞(MSCs)表达iNOS而使其发挥抗肿瘤作用，抑制肿瘤生长。本发明为I型干扰素及MSCs在抗肿瘤中的应用提供了新的重要的机制，并提出了新型临床治疗途径。

为了明确I型干扰素在MSCs中是否有信号转导，本发明人首先检测I型干扰素所调控的基因在MSCs上的表达。结果表明I型干扰素能上调MSCs上MHC I的表达，其效果与二型干扰素无明显差别。然而I型干扰素可以消除MSCs的免疫抑制作用。鉴于IFNα和IFNβ对MSCs的调控作用相同，在后续实验中均采用IFNα。对于信号通路的分析发现，IFNα并未影响IFNγ受体表达、STAT1和NF-κB的磷酸化及其入核。萤光素酶实验和特异性寡核苷酸结合实验表明，IFNα抑制STAT1的结合能力，而非NF-κB。因此，IFNα通过抑制STAT1的结合能力减少iNOS的表达，从而降低MSCs的免疫抑制能力。MSCs免疫抑制的发挥还依赖于其表达的高水平趋化因子。借助趋化因子，MSCs可以把T细胞等免疫细胞募集至其周围，从而发挥其强大的免疫抑制作用。然而，microbead-based多通道细胞因子实验结果显示IFNα并未影响MSCs趋化因子的表达，因此，IFNα对MSCs免疫抑制作用的调节主要体现在调控iNOS的表达上，但是对趋化因子的表达没有显著影响。更为重要的是，本发明人通过体内肿瘤生长实验证明，IFNα预处理的MSCs可通过下调其一氧化氮表达，从而抑制B16-F0黑色素瘤的发展。

基于本发明人的新发现，本发明提供了一种MSCs，其是I型干扰素预处理的MSCs，或是过表达I型干扰素的MSCs。优选的是I型干扰素预处理的MSCs，其制备方法简单，无需转基因操作，不涉及外源基因的插入，给药时不会存在安全性问题。

一个方面，所述的MSCs是经I型干扰素预处理的MSCs；较佳地，所述的预处理包括：将I型干扰素与间充质干细胞相混合，使得I型干扰素的终浓度可以为200-10000U/ml。

所述的I型干扰素作为一种已知的蛋白质(多肽)，其可以是重组多肽、合成多肽。

作为本发明的优选方式，所述的I型干扰素是IFNα，其可以具有GenBank登录号NP_996753.1所示的氨基酸序列。编码IFNα的多核苷酸的核苷酸序列可以是GenBank登录号NC_000070.6。

作为本发明的优选方式，所述的I型干扰素是IFNβ，其可以具有GenBank登录号AAA37891.1所示的氨基酸序列。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、但保留了本发明实施例中所用I型干扰素相同功能的I型干扰素变体或生物活性片段也包括在本发明中。I型干扰素变体或生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种I型干扰素的生物活性片段都可以被应用到本发明中。在这里，I型干扰素的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的I型干扰素的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长I型干扰素的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长的I型干扰素的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的I型干扰素，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的I型干扰素。也就是说，任何不影响I型干扰素的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

本发明中，可将编码过表达I型干扰素的多核苷酸序列插入到重组表达载体中，转化MSCs。只要能在MSCs内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含I型干扰素的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

基于本发明的新发现，还提供了一种I型干扰素预处理的MSCs或过表达I型干扰素的MSCs的用途，用于制备抑制肿瘤的药物。

所述的肿瘤可以为各种良性或恶性肿瘤，如黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、脑肿瘤、卵巢癌、骨肿瘤、结肠、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、小肠肿瘤、肾肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤等。

MSCs具有趋化性，其能够聚集于肿瘤区域，因此，所述的干扰素预处理的MSCs或过表达I型干扰素的MSCs能够在肿瘤部位实现抗肿瘤的功能。

基于本发明的新发现，还提供了I型干扰素的用途，用于制备提高间充质干细胞中MHCI表达的组合物；或用于制备降低间充质干细胞的免疫抑制能力(即：调动间充质干细胞发挥免疫作用，提高机体抗肿瘤免疫反应)的组合物；或用于制备抑制间充质干细胞中STAT1的DNA结合能力的组合物；或用于制备减少间充质干细胞中诱导型一氧化氮合成酶的表达的组合物

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的干扰素预处理的MSCs或过表达I型干扰素的MSCs，以及药学上可接受的载体。

通常，可将所述细胞配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1.试剂

流式细胞分析所用的荧光标记流式抗体和同型对照抗体均购自eBioscience公司；免疫印迹所用抗体：分别抗iNOS、STAT1、p-STAT1、p65、p-p65、GAPDH的抗体购自Cell Signaling Technology公司。RNA抽提试剂盒和反转录试剂盒购自Tiangen biotech公司；RIPA裂解液购自Millipore公司；Nucleofector kit V购自Amaxa公司；培养MSCs所用培养液组分全部购自Gibco公司。

MSCs的获得：从小鼠骨髓分离纯化而来。分离获得的MSCs培养于低糖的DMEM培养液中。

本实施例中，处理细胞用的IFNα蛋白(获自PBL assay science)，其氨基酸序列如GenBank登录号NP_996753.1中第1位所示。MSCs中过表达的IFNα，其多核苷酸的序列如GenBank登录号NC_000070.6所示或其简并序列。所述的IFNβ，其氨基酸序列如GenBank登录号AAA37891.1所示。

2.实验动物

实验小鼠购自中国科学院斯莱克上海实验动物中心，饲养于上海交通大学医学院实验动物科学部SPF屏障环境中。在所有实验中，使用性别和年龄对应的小鼠进行实验，所有动物操作均通过动物伦理审查。

3.免疫印迹分析

(1)蛋白样品的制备

a)准备：冰，预冷的PBS，预冷的EP管，预冷离心机。

b)把经过实验处理的细胞及时放置冰上，中断刺激信号，弃掉上清，用预冷的PBS洗一遍；加入1ml预冷PBS用细胞刮将细胞刮下，并转入预冷的EP管中。

c)离心：3000rpm，5min；去上清。

d)再次离心3000rpm，2min，彻底去除PBS。

e)用适量裂解液(用时加入PI及PMSF)重悬细胞(尽量避免产生气泡)，冰上放置30min；每10min，用混匀一次。

d)离心，1.32X10⁵rpm，15min。取上清，-80℃保存备用。

(2)免疫印迹分析

a)实验准备：配置合适浓度的电泳胶(PAGE)；准备电泳缓冲液以及转膜缓冲液。

b)蛋白样品处理：把样品从-80℃取出，冰上融化，BCA法测定总蛋白浓度，并将各样品的总蛋白稀释至相同浓度备用；加入3X SDS上样缓冲液，100℃，孵育10min，结束后冰上冷却2min，离心，混匀。

c)将准备好的电泳胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液，将处理好的蛋白样品点样(50μg/孔)。

d)常规方法进行电泳。

4.流式细胞分析

取1X10⁶细胞用100μl FACS缓冲液重悬，加入荧光标记的抗体混匀后，置于4℃避光孵育30min。离心，弃上清，用FACS缓冲液洗三次。最后用300μl FACS缓冲液重悬细胞，用FACS Calibur flow cytometer进行检测。用FCS Express software进行数据分析。

5.荧光素酶报告基因实验

将含STAT1特异性结合位点的2X SIE质粒(参见Wu,T.R.等(2002).SHP-2is a dual-specificity phosphatase involved in Stat1dephosphorylation atboth tyrosine and serine residues in nuclei.J Biol Chem 277,47572-47580)通过Amaxa Nuleofector device转染到MSCs中，接种到24孔板中过夜培养。在不同的细胞因子处理后，分别在不同时间点收集细胞(6hr，12hr和24hr)，使用荧光素酶检测试剂盒(Promega)测量荧光素酶活性。

6.MSCs免疫抑制实验

³H-methyl-thymidine法：首先，将一定数目的MSCs接种于96孔板过夜培养。吸去上清，每孔接种2X10⁶小鼠脾脏细胞(分别加1μg/ml anti-CD3和1μg/ml anti-CD28激活)。与MSCs混合培养2-3天后，于最后6小时在每100μl细胞培液中加入1μCi ³H-methyl-thymidine。6小时后将培养板放入-80℃冰箱保存，测量之前室温反复冻融2次，通过真空吸附转至专用滤膜，加入闪烁液，使用Wallac Microbeta闪烁计数器测量T细胞增殖情况。

7.荧光定量PCR检测基因的表达

a)RNA抽提：用RNAprep pure Cell/Bacteria Kit(TianGen)抽提细胞中的总RNA。

b)逆转录合成cDNA：用TaqMan Reverse Transcription Reagents将上一步抽提得到的RNA逆转录合成cDNA。

TaqMan Reverse Transcription Reagents所有试剂均在冰上融化，按照下面的反应体系配制放入RNase-free管中。

热循环参数：25℃ 10min→48℃ 30min→95℃ 5min。

c)将上述得到的cDNA-20℃保存或用无菌ddH₂O稀释至100μl备用。

d)Takara SYBR Green反应体系：

SYBR Green PCR Master Mix 5μl

Primers(5μM) 各0.5μl

cDNA 4μl

将加好样品的384孔板，放置在7900HT进行PCR反应。

8.转化MSCs

过表达IFNα的MSCs(MSC-IFNα)的制备

通过PCR的方法将小鼠I型干扰素IFNα编码序列从骨髓来源的DC细胞cDNA中扩增出来，引物序列分别为：5’ACGCTCGAGGCCACCATGGCTAGACTCTGTGC 3’(SEQ ID NO:1)和5’ACGTCTAGATCACTCCTTCTCTTCACTCAG 3’(SEQ ID NO:2)。所得片段使用XhoⅠ和XbaⅠ酶切，酶切产物插入到慢病毒穿梭质粒pLVX-IRES-zsGreen1中(带GFP，购自Clontech Laboratories)，得到质粒pLVX-IRES-zsGreen1-mIFNα。

使用三质粒系统进行病毒包装，包括pMD2G、pSPAX2和穿梭质粒(pLVX-IRES-zsGreen1或pLVX-IRES-zsGreen1-mIFNα)。使用Lipofectamine2000将3个质粒一起转染到293FT细胞中，48h后收集细胞培养上清，800g离心10min去除细胞碎片。再使用装有Ultracel-100膜的Ultra-15超滤管进行浓缩病毒并测定病毒滴度。使用MOI＝30左右的病毒分别感染MSCs，GFP和GFP连同IFNα感染的MSCs分别命名为MSC-GFP和MSC-IFNα。

实施例1、IFNα不能诱导MSCs产生iNOS但可使其上调MHC I类分子

为了研究IFNα是对MSCs的免疫调节作用的影响，本发明人首先检测了IFNα能否与TNFα协同作用，诱导MSCs产生一氧化氮(Nitric Oxide，NO)。与文献报道一致，IFNα和IFNγ均能与TNFα协同诱导骨髓来源的巨噬细胞大量产生NO。但本发明人发现，与IFNγ在MSCs中的作用不同，IFNα和TNFα组合却不能诱导MSCs产生NO(图1A)。几乎所有类型的细胞都会表达I型干扰素受体，本发明人的基因芯片数据也表明，MSCs表达IFNα受体：IFNAR1和IFNAR2。

为了检测IFNα的信号能否在MSCs中正常传导，本发明人检测了MSCs在IFNs作用下MHC class I(K^bD^b)的表达。结果显示IFNα和IFNβ均能像IFNγ一样，上调K^bD^b在MSCs上的表达(图1B)。这证明经典的I型干扰素信号在小鼠MSCs中是存在的。

实施例2、IFNα削弱MSCs的免疫抑制作用

既然I型干扰素不能诱导MSCs产生其免疫调节作用的核心分子一氧化氮，那么IFNα是否影响MSCs的免疫调节作用呢？为解决这一问题，本发明人把IFNα加入到MSCs与激活的小鼠脾脏细胞(splenocytes，spl)共培养的免疫抑制系统里，以研究其作用。本发明人发现，与iNOS抑制剂L-NMMA类似，IFNα的加入不但解除了MSCs对激活脾脏细胞增殖的抑制作用，与对照组相比，反而增加了脾细胞的增殖(图2A左图)。

同时，本发明人检测了共培养体系里NO的量，发现IFNα也与L-NMMA类似，都抑制了MSCs的NO产生(图2A右图)。

I型干扰素家族的另一种分子IFNβ，也能很好地解除MSCs的免疫抑制作用(图2B)，也意味着可提高机体抗肿瘤免疫反应。后续实施例中均采用IFNα。

实施例3、IFNα抑制IFNγ和TNFα刺激的MSCs产生iNOS

IFNα能够削弱MSCs的免疫抑制作用，而且减少了共培养体系里NO的量。因此本发明人假设，IFNα可能抑制了iNOS的表达或阻断了iNOS的功能，从而减少了NO的产生。首先，本发明人将IFNα或IFNγ和TNFα一起刺激MSCs，24hr后收取RNA和蛋白，分别用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹检测iNOS在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示，IFNα能在mRNA水平部分抑制iNOS的表达(图3A)，而对其蛋白水平的抑制作用则更显著(图3B)。

本发明人之前的研究表明，MSCs发挥免疫抑制作用还需要产生大量的趋化因子，招募免疫细胞迁移至MSCs附近，使NO得以在短距离内发挥抑制细胞增殖的作用。那么，IFNα是否对MSCs产生趋化因子也有作用呢？本发明人将MSCs用IFNγ和TNFα或者IFNα、IFNγ和TNFα共同刺激24hr，并收集上清，用Bio-Plex悬浮芯片系统检测趋化因子的表达。结果发现，IFNα除了相对特异地抑制MSCs表达NO，促进IL-6的表达，它对其他趋化因子的表达没有显著影响(图4)。

实施例4、IFNα不影响MSCs上IFNγ受体的表达及STAT1和p65的表达、磷酸化水平和入核能力

接下来，本发明人集中研究了IFNα通过什么机制抑制MSCs的iNOS表达。有文献报道，IFNα/β通过下调巨噬细胞表面IFNγ受体IFNGRs的表达，抑制巨噬细胞激活，使宿主易感Listeria monocytogenes。本发明人的芯片数据分析表明，IFNγ受体IFNGR1/2表达均未受IFNα影响，作为阳性对照干扰素可以上调H2-D1、H2-K1的表达(图5A)。

本发明人用流式细胞术分析得到了类似的结果(图5B)。

实施例5、IFNα通过抑制STAT1的结合能力，降低MSCs中iNOS表达

上述结果表明，IFNα并不影响MSCs上IFNγ受体的表达及STAT1和p65的表达、磷酸化水平和入核能力。一般，激活的STAT1可以进入细胞核，与特定基因(如iNOS)启动子中的特异识别位点结合，行使其基因转录活性的调控能力。接下来本发明人用能与转录因子特异性结合的寡核苷酸序列(STAT1：5’GATCCTTCTGGGAATTCCTAGATC 3’(SEQ ID NO:3)；p65：5’AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG 3’(SEQ ID NO:4))联接的琼脂糖珠子，沉淀STAT1或NF-κB以分别检测其DNA结合能力。结果发现，经IFNα处理的MSCs中，其STAT1的结合能力显著下降，而NF-κB的结合能力则没有受明显影响(图6A)。

荧光素酶报告基因实验的结果也进一步证实，IFNα可以抑制STAT1的转录活性(图6B)。

在不同时间点收取了IFNγ/TNFα和IFNγ/TNFα/IFNα刺激下的MSCs，抽提总RNA，用荧光定量PCR检测了iNOS以及IL-6在24hr内的表达模式。结果与前面bio-plex结果一致，IFNα抑制iNOS表达而促进IL-6表达(图6C)。

同时，还发现IFNα在6hr内对iNOS的表达抑制非常微弱，而随着时间的推迟，IFNα对iNOS表达的抑制效果更加显著(图6C)。

实施例6、IFNα预处理的MSCs抑制肿瘤生长

肿瘤微环境中的基质细胞对肿瘤的发生发展具有重要作用。此前的报道表明，从肿瘤中可分离出MSCs，其产生一氧化氮的调控机制与骨髓来源的MSCs十分类似。体外实验表明，肿瘤基质细胞可通过产生一氧化氮抑制免疫反应。体内实验也在证明，抑制肿瘤基质细胞的一氧化氮产生可以显著缓解肿瘤的发展。

因此本研究首先采用了过表达IFNα的MSCs(MSC-IFNα)，将其与B16-F0黑色素瘤细胞共同注射于小鼠腿部肌肉；以注射PBS+B16-F0、注射IFNα+B16-F0、注射MSC-GFP+B16-F0的小鼠作为对照。结果表明，MSC-IFNα可显著抑制黑色素瘤的生长(图7A)。

为了排除IFNα对肿瘤生长的直接抑制作用，本发明人又采用了IFNα预处理24小时的MSCs与B16-F0共同注射的方式。结果显示，IFNα预处理的MSCs仍可抑制肿瘤生长(图7B)。因此本发明人的研究证明，I型干扰素可通过减少MSCs的一氧化氮产生，影响其在肿瘤微环境中的免疫抑制作用，从而在体内抑制肿瘤生长。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞，其特征在于，所述的间充质干细胞是I型干扰素预处理的间充质干细胞，或是过表达I型干扰素的间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于，所述的预处理包括：

将I型干扰素与间充质干细胞相混合，使得I型干扰素的终浓度为200-10000U/ml。

3.如权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于，所述的过表达I型干扰素的间充质干细胞中转化有编码I型干扰素的多核苷酸。

4.如权利要求1-3任一所述的间充质干细胞，其特征在于，所述的I型干扰素选自：IFNα或IFNβ。

5.权利要求1-4任一所述的间充质干细胞用途，用于制备抑制肿瘤的药物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤是黑色素瘤。

7.一种用于抑制肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中包含权利要求1-4任一所述的间充质干细胞。

8.I型干扰素的用途，用于制备提高间充质干细胞中MHC I表达的组合物；或用于制备降低间充质干细胞的免疫抑制能力或提高机体抗肿瘤免疫反应的组合物。

9.I型干扰素的用途，用于制备抑制间充质干细胞中STAT1的DNA结合能力的组合物；或用于制备减少间充质干细胞中诱导型一氧化氮合成酶的表达的组合物。

10.如权利要求8或9任一所述的用途，其特征在于，所述的I型干扰素选自：IFNα或IFNβ。