CN102762592A - 人类造血细胞癌的非人类哺乳动物模型 - Google Patents

Abstract

本发明说明了使用这些化合物的光致易变化化合物的方法。这些光致易变化化合物具有一种可光致释放的配体，该配体可以具有生物活性，并且当暴露于光线时从该化合物中光致释放出该配体。在一些实施方案中，这些光致易变化的化合物包括一种光线天线，例如标记的分子或它的一种活性衍生物。在一个实施方案中，该光是可见光，它对于这些生物样品，例如细胞和组织的活力是无害的，其中这种释放的有机分子是生物活性的并且可以具有一种疗效。在另一个实施方案中，该可光致释放的配体可以是一种标记分子，例如一种荧光分子。

Description

人类造血细胞癌的非人类哺乳动物模型

相关申请

本申请要求于2009年6月29日提交的美国临时申请号61/221,438的权益。通过引用将以上一项或多项申请的全部传授内容结合在此。

政府支持

本发明是全部或部分地由国家卫生研究院的基金AI69208所支持的。在本发明中政府具有一定的权利。

发明背景

在美国癌是排在心脏病之后的第二位的死亡原因；在全部癌症死亡中约10％是由于造血系统癌所致(Heron，M.P.以及B.L.Smith.2007.National Vital StatisticsReports Vol.55，No.10；U.S.Cancer Statistics Working Group.2006.United StatesCancer Statistics 2003 incidence and mortality.U.S.Department of Health and HumanServices)。这些包括白血病(它是造血干细胞和早期祖细胞的弥散性癌)，以及淋巴瘤(它是以离散的质块形式形成的成熟淋巴细胞癌)。在人体中，进展性淋巴瘤和缓慢进展性淋巴瘤两者中绝大多数(80％-85％)是B细胞来源的(Aster，J.C.2005.Diseases of the White Blood Cells，Lymph Nodes，Spleen，and Thymus.In：Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease，7th edition(Kumar，V.，A.K.Abbas，and N.Fausto，eds.)Elsevier Inc.，Philadelphia，PA，pp.661-709)。

为了进一步研究和鉴别癌的治疗，需要人类造血系统瘤的改进的模型。

发明概述

一方面，本发明是针对制造非人类哺乳动物的一种方法，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型，该方法包括将基因工程化以表达与人类造血细胞癌相关的一种或多种人类癌基因的人类造血干细胞(HSC)引入免疫缺陷型非人类哺乳动物体内。在其中该非人类哺乳动物的血细胞谱系被人类HSC重建并且这些癌基因表达于该哺乳动物体内的条件下维持该哺乳动物，由此制造出一个非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型。

另一方面，本发明的方法可以进一步包括将该非人类哺乳动物的造血细胞癌(即，该人源化的非人类哺乳动物模型，该模型是用于人类造血细胞癌的一种模型；初级人源化非人类哺乳动物模型)连续地移植到其他非人类哺乳动物体内，由此制造出一种或多种另外的非人类哺乳动物，它们是用于人类造血细胞癌的模型(二级人源化非人类哺乳动物模型；随后人源化的非人类哺乳动物模式)。在这个方面中，该方法包括将表达来自作为人类造血细胞癌的一种模型的该人源化非人类哺乳动物的一种或多种人类癌基因的人类细胞(例如，从该人源化非人类哺乳动物体内得到的人类造血细胞癌细胞)引入到一种或多种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内。在其中该非人类哺乳动物的血细胞谱系被人类HSC重建并且这些癌基因表达于这些非人类哺乳动物体内(二级人源化非人类哺乳动物模型)的条件下维持该一种或多种非人类哺乳动物，由此制造出一种或多种另外的非人类哺乳动物，这些非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的模型。

在又另一个方面，本发明是针对制造非人类哺乳动物的一种方法，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌病人的一种模型。在这个方面中，该方法包括将该造血细胞癌病人的造血干细胞(HSC)引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内。在其中非人类哺乳动物的血细胞谱系被人类HSC重建并且该癌症病人的一种或多种癌基因表达于该非人类哺乳动物体内的条件下维持该非人类哺乳动物，由此制造出一种非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是针对该造血细胞癌病人的一种模型。

本发明还针对通过这些方法制造的非人类哺乳动物。

在其他方面中，在此提供的这些非人类哺乳动物可以用于鉴别可以用于治疗人类造血细胞癌的一种或多种试剂或治疗科学计划(方案)。在这个方面，本发明包括将该一种或多种试剂或治疗方案施用到在此说明的一种(一种或多种)非人类哺乳动物体内。然后确定该非人类哺乳动物体内的癌是否得以缓解，其中如果该非人类哺乳动物体内的癌在该非人类哺乳动物体内得以缓解，则可以使用该一种或多种试剂或治疗方案来治疗该人类造血细胞癌。在一个具体实施方案中，作为用于这种方法中一种模型的该非人类哺乳动物可以是一种哺乳动物，该哺乳动物是针对一个具体的人类造血细胞癌病人的一种模型。因此，该一种或多种试剂或治疗科学计划对于该癌症病人而言是特异性的。

在又另一个方面中，本发明是针对在需要它的个体体内治疗白血病的一种方法，该方法包括将一个有效量的抗CD52抗体和一种或多种化疗试剂同时施用到该个体体内。在一个具体方法中，该抗CD52抗体是阿来组单抗并且该一种或多种化疗试剂是环磷酰胺。在又另一个方面，在施用阿来组单抗和环磷酰胺之后该个体的骨髓中癌细胞载量降低10,000倍。

附图简要说明

本发明或申请文件包含彩色绘制的至少一个图。具有多个彩色图的该专利或专利申请公开物的拷贝将根据需要由专利局提供，并且要付必要的费用。

图1A-1C：(图1A)在Em-增强子和CD19启动子的控制下过量表达GFP、c-Myc以及bcl-2的慢病毒构建体。将人类脐带血衍生的HSC以MOI＞10感染并且注射到亚致命照射的NOD-SCID IL-2Rγ-/-小鼠体内。通过流式细胞术检测鼠类对人类CD45表达来检测移植物移入。GFP对照载体以5％人类细胞的形式存在，这些人类细胞指示从成功感染的HSC衍生的B细胞(图1B)。感染HSC的GFP/myc/bcl(在此也称为“GMB模型”或“ALL模型”)显示出＞95％人类细胞GFP阳性(图1C)。

图2A-2D：人源化GFP/myc/bcl-白血病：大量渗透以及脾增大(图2A，图2C)的组织形态学；肾(图2B)和脑(图2D)的渗透；渗透的淋巴细胞显示出blas样形态以及频繁的有丝分裂图像(图2C，通过箭头指示)。

图3：在用感染的HSC重建之后人源化小鼠的累计存活率。GFP对照显示对存活无损害(蓝线)。GFP/myc/bcl感染HSC将存活期局限于在该转移之后最大2个月(红线)。

图4A：假定的治疗靶CD38和CD52的表达。对应地针对人类CD45-PE和CD38-APC或CD52-APC将从全脾得到的淋巴细胞染色。人类淋巴细胞是由FSC/SSC淋巴细胞门并且hCD45-PE阳性表达来选通的。GFP+GFP/myc/bcl细胞显示肿瘤抗原独特的高表达。GFP阴性非恶性人类细胞部分地显示出CD38和CD52的表达。

图4B：二级GFP/myc/bcl-小鼠的阿来组单抗治疗：用从初级GFP/myc/bcl-供体小鼠体内得到的10⁶GFP/myc/bcl细胞来移植12NSG-小鼠。当显示白血病表型时在移植之后将这些小鼠治疗14天。对应地用5mg/kg阿来组单抗(n＝6)静脉注射或PBS(n＝6)来治疗这些小鼠。在7天之后对治疗的响应进行评估，通过流式细胞仪来测量白血病负荷并且计算出每个器官的绝对细胞数。在外周血、脾以及肝中阿来组单抗诱导显著应答，而在骨髓和脑中未见到显著的应答。

图4C：阿来组单抗治疗(n＝10)相比于对照(n＝10)的累计存活率。时序检验显示在阿来组单抗治疗的小鼠中显著地延长了存活期。

图5A：补体依赖型细胞毒性(CDC)：在体外用逐渐增加量值的阿来组单抗(从1μg/ml至100μg/ml)来孵化GFP/myc/bcl细胞。培养基添加人类、鼠类BL6-作为NSG-衍生的血清。无血清培养基和热灭活的血清用作对照。在48小时之后通过Annexin-V-PE/7-AAD流式细胞仪对细胞活力进行评估。在人类血清中检测出补体依赖性细胞毒性，但是在小鼠血清中则未没有。

图5B：阿来组单抗的体内分布。将标记阿来组单抗的AlexaFluor750静脉注入GFP/myc/bcl小鼠体内。在24小时之后将小鼠处死，并且通过IVIS荧光光度测定法对标记抗体的分布进行评估。脾、肝和骨显示强染色。在解剖的全脑中显示高信号。

图5C：通过5mg/kg Alexafluor750标记的阿来组单抗体内结合GFP/myc/bcl细胞。将这些器官均匀化并且通过流式细胞仪检测抗体与细胞的结合。GFP+白血病细胞显示在脾和骨髓中AlexaFLuor750信号增加，而在脑衍生的白血病细胞中不能检出任何检测。

图5D：阿来组单抗的Fc片段依赖性细胞毒性效应。在移植后第14天将阿来组单抗的F(ab)2片段注入二级GFP/myc/bcl小鼠体内。与阿来组单抗对照相比较，F(ab)2片段未显示出疗效。

图5E：使用在体外硫乙醇酸盐从NSG小鼠诱导的巨噬细胞来评估阿来组单抗的抗体依赖性细胞的细胞毒性。在阿来组单抗的存在下这些巨噬细胞在13个小时内杀死GMB细胞。在不添加抗体下对于F(ab)2片段和巨噬细胞而言未见到针对GFP/myc/bcl的杀死作用。

图6A-6B：在移植后第14天在二级GFP/myc/bcl体内进行阿来组单抗和环磷酰胺的联合治疗。将小鼠分组成未治疗组(n＝5)、在第1和2天腹腔注射150mg/kg环磷酰胺组(n＝5)、以及在第1、4以及8天静脉注射5mg/kg阿来组单抗组。此外，在第1和2天接收腹腔注射150mg/kg环磷酰胺以及第1、4和8天静脉注射5mg/kg阿来组单抗两者的一个组合组(n＝5)。通过FACS以及绝对数计算对每个器官的GFP+白血病细胞的绝对数量进行评估。在外周血、脾以及肝中联合治疗显示出白血病细胞的最大减少(图6A)。在阿来组单抗治疗耐受性器官中联合治疗显示出在骨髓中白血病细胞高度显著地减少(图6B)。

图7显示出人类原B细胞急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的发展。

发明详细说明

造血细胞的(例如，淋巴的；骨髓的)恶性肿瘤，在此也称为造血细胞癌，是在身体的造血组织(例如，淋巴组织；骨髓组织)中产生的癌症。在淋巴癌中经常发现称为t(14；18)的一种特定的基因突变。这种突变使细胞产生过多的称为Bcl-2的蛋白，该蛋白抑制了程序性细胞死亡的过程(凋亡)并且导致肿瘤形成、肿瘤生长、以及对治疗的耐受性。

滤泡性淋巴瘤(FL)是最常见的缓慢进展淋巴瘤，并且占非何杰金氏淋巴瘤的所有新诊断病例的20％至40％。该肿瘤是由安排在淋巴结滤泡中的众多的B细胞组成的；这些B细胞在形态上和表型上类似于正常生发中心的淋巴细胞。在大多数病例中(约85％)，FL细胞对于t(14；18)染色体易位是阳性的，该染色体易位将bcl-2癌基因与免疫球蛋白重链(IgH)基因座连接。因此这些细胞针对Bcl-2蛋白是强烈阳性的染色的，这与正常的增生性生发中心B细胞不同，它们是Bcl-2阴性的。这种淋巴瘤典型地以外围淋巴结的无痛肿胀形式存在于中老年个体体内，并且通常进展非常缓慢，平均存活期超过10年。然而，最终地，这些不断发展的淋巴结病以及淋巴细胞渗透干扰了正常器官的功能并且造成死亡，虽然在许多病人体内(高达70％)晚期疾病的特征为组织学地转化为侵袭性弥散性B细胞淋巴瘤，它是致死性的(Freedman，A.S.and N.L.Harris.2007.Clinical and pathologic features offollicular lymphoma.In：UpToDate(Rose，B.D.，ed.)，UpToDate，Waltham，MA；Lossos，I.S.and R.Levy.2003.Semin.Cancer Biol.13：191-202)。

然而，当通过在IgH增强子例如Eμ的控制下安置异位的bcl-2表达而将人类FL特有的B细胞特异性t(14；18)易位在小鼠体内建模时，这些转基因动物显示B细胞增生而不出现淋巴瘤。然而，在这些小鼠体内增生的B细胞是多克隆的并且仅表达IgM和IgD，而在人类FL中，它们属于一种单克隆，并且它们中40％表达IgG(Freedman，A.S.and N.L.Harris.2007.Clinical and pathologic features of follicularlymphoma.In：UpToDate(Rose，B.D.，ed.)，UpToDate，Waltham，MA；McDonnel，T.J.，et al.，1989.Cell 57：79-88；Strasser，A.，et al.1990.Curr.Top.Microbiol.Immunol.166：175-181)。最终这些转基因小鼠的确发展出淋巴瘤(平均潜伏期约15个月)，但是与FL不同，这些是高达侵袭性的，并且它们中约50％显示出myc基因与IgH基因座的二次重排(在FL转化中非常稀少)(McDonnell，T.J.and S.J.Korsmeyer.1991.Nature 349：254-256；Kuppers，R.，et al.1999.N.Engl.J.Med.341(20)：1520-1529)。

因此在鼠类B细胞中bcl-2过量表达不表现出是足以产生滤泡性淋巴瘤。然而，最近在转基因小鼠体内产生出与FL高度类似的一种疾病，其中异位的bcl-2表达是由全造血系的启动子VavP驱动的(Egle，A.，et al.2004.Blood 103：2278-2283)。在18周这些健康的年轻的VavP-bcl-2小鼠发展出充满增生的B细胞的增大的生发中心，其中30％至50％的B细胞经历了类别转换并且表达IgG。然而到18个月时，这些小鼠中约50％继续发展一种单克隆B细胞淋巴瘤，表示为包含中心细胞以及有丝分裂的中心母细胞的混合物的增大的淋巴结以及脾。因为在这些小鼠体内bcl-2表达不限于B细胞，还见到T细胞显著增加(3-5倍)，尤其是在生发中心中对于B细胞活化极其重要的CD4+T细胞。值得注意的是，当VavP-bcl-2小鼠与特异性地缺少CD4⁺T细胞的小鼠杂交时，得到的双转基因后代显示无生发中心疾病，强调CD4+T细胞的重要性有助于这种疾病(Egle，A.，et al.2004Blood 103：2278-2283)。

当在VavP-bcl-2小鼠体内产生的这种疾病的数种特征确实与人类滤泡性淋巴瘤中的情况不同时(例如，扩展的T细胞群)，这种FL模型的最重要的缺点是它的鼠类本性。换言之，还不清楚在这些小鼠体内的这种疾病是否是由与人体中相同机理产生的，以及因此地在这些小鼠体内鉴别的这些潜在的药物靶在FL病人体内是否是相关性的。此外，在淋巴瘤治疗方面最新进展涉及使用针对人类B细胞特异性CD20抗原的单克隆抗体。在鼠类疾病模型中不能对针对人类抗原的这种和其他的抗体以及免疫系统的其他的小分子类型的调节剂的安全性和有效性进行测试。产生这种和其他疾病的人源化小鼠模型精确地提供了这些可能性。

在此说明了制造一种人源化的非人类哺乳动物的方法，该人源化的非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型。如在此使用的，“人源化的非人类哺乳动物”(例如，“人源化小鼠”)是移入人类细胞(例如，造血细胞)或组织、和/或转基因表达人类基因的免疫缺陷型非人类哺乳动物(例如，小鼠)。这类人源化非人类哺乳动物用作例如人类免疫系统及其疾病的模型。

一方面，本发明是针对制造非人类哺乳动物的一种方法，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型，该方法包括将基因工程化以表达与人类造血细胞癌相关的一种或多种人类癌基因的人类造血干细胞(HSC)引入免疫缺陷型非人类哺乳动物体内。在其中该非人类哺乳动物的血细胞谱系用或被人类HSC(例如，人类HSC已经用人类血细胞谱系重建了该非人类哺乳动物的血细胞谱系)重建并且癌基因表达于该哺乳动物体内的条件下维持该哺乳动物，由此制造一种非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型。如本领域普通技术人员所应当理解的，通过人类HSC重建非人类哺乳动物的血细胞谱系可以是一个完全的、基本上完全的或部分的重建。

如上面讨论的，造血细胞的(例如，淋巴的；骨髓的)恶性肿瘤，在此也称为造血细胞癌，是在身体的造血组织中产生的癌症。如本领域普通技术人员所理解的，这些造血组织包括淋巴组织和骨髓组织。

淋巴癌的实例包括滤泡性淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)，具体地是T细胞ALL、原B ALL、前B ALL、以及幼稚B ALL。非何杰金氏淋巴瘤的组中的实例包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、以及套细胞淋巴瘤(MCL)。骨髓癌的实例包括急性髓细胞性白血病(AML)；骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性髓细胞性白血病(CML)或其他骨髓增生性疾病(例如，骨髓纤维瘤、真性红细胞增多症以及特发性血小板增多症)。

如在此使用的，HSC(例如，人类HSC)是自身更新的干细胞，当移入受体体内时，这些干细胞能够“再生”或“重建”移植受体(例如，一种非人类哺乳动物；一种免疫缺陷型非人类哺乳动物)的造血系统并且在受体体内维持(例如，长期地)造血细胞生成。该造血系统是指涉及产生血细胞谱系的器官和组织(例如，骨髓、脾、扁桃体、淋巴结)。HSC是产生(分化成)多种血细胞类型的多能性干细胞，这些细胞类型包括髓样细胞谱系(例如，单核细胞和巨噬细胞、嗜中性细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)以及淋巴样细胞谱系(例如，T-细胞、B-细胞、NK-细胞)。

HSC表达细胞标记物CD34，并且通常被称为“CD34+”。如本领域普通技术人员所理解的，HSC还可以表达其他细胞标记物，例如CD133和/或CD90(“CD133+”，“CD90+”)。在一些实例中，HSC特征在于不被表达的标记物，例如，CD38(“CD38-”)。因此，在本发明的一个实施方案中，在此所述的方法中使用的人类HSC是CD34+、CD90+、CD133+、CD34+CD38-、CD34+CD90+、CD34+CD133+CD38-、CD133+CD38-、CD133+CD90+CD38-、CD34+CD133+CD90+CD38-、或它们的任何组合。在一个具体实施方案中，这些HSC是CD34(“CD34+”)和CD133+(“CD133+”)两者，在此也称为“双阳性”或“DP”细胞或“DPC”。在另一个实施方案中，HSC是CD34+CD133+以及CD38-和/或CD90+。

HSC被发现于骨髓中，例如在供体(例如，脊椎动物，例如哺乳动物，包括人类、灵长类、猪、小鼠等)的股骨、髋骨、肋骨、胸骨、以及其他骨骼中。用于临床和科学用途的HSC的其他来源包括脐带血、胎盘、胎儿肝脏、动员的外周血、非动员的(或未动员的)外周血、胎儿肝脏、胎儿脾脏、胚胎干细胞、以及主动脉-性腺-中肾(AGM)、或它们的一种组合。

如本领域普通技术人员所应当理解的，动员的外周血是指富含HSC(例如，CD34+细胞)的外周血。施用多种试剂(例如化疗剂和/或G-CSF)将干细胞从骨髓动员到外周循环中。例如，施用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)持续至少或大致5天将CD34+细胞动员到外周血中。观察到循环的CD34+细胞富集30倍，峰值出现在开始施用G-CSF之后第5天。在不动员外周血的情况下，循环的CD34+细胞的数量非常低，估计在全部单核血细胞的0.01％至0.05％之间。

可以从单个或多个供体体内得到用于这些方法的人类HSC。此外，在此说明的方法中使用的HSC可以是新鲜分离的HSC、深冷保存的HSCS、或它们的一种组合。

如本领域已知的，可以使用本领域已知的多种方法从这些来源中得到HSC。例如，可以在用细胞因子(例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，该因子诱导细胞从骨髓小室中释放)预治疗供体之后通过使用针和注射器从骨髓中取出(例如髋骨、股骨等中)、或从血液中取出而直接地得到HSC。

在将HSC引入该非人类哺乳动物体内之前，能够以得到的(例如，未展开)或操作的(例如，展开)形式将用于本发明方法中的HSC直接引入该非人类哺乳动物体内。在一个实施方案中，在将HSC引入该非人类哺乳动物体内之前该HSC被扩展。如本领域普通技术人员所应当理解的，有多种方法可以用于扩展HSC(参见例如，Zhang，Y.，et al.，Tissue Engineering，12(8)：2161-2170(2006)；Zhang CC，et al.，Blood，111(7)：3415-3423(2008))。在一个具体实施方案中，可以通过在生长因子(例如血管生成素样5(Angplt5)生长因子、IGF结合蛋白2(IGFBP2)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板生成素(TPO)、或它们的一种组合)的存在下将HSC与间充质干细胞(MSC)共同培养以产生一种细胞培养物而扩展HSC的一个群体。在其中生产HSC的一个扩展的群体的条件下(参见，例如Maroun，K.，et al.，ISSCR，7^th Annual Meeting，Abstract No.1401(July 8-11，2009)Attorney Docket No.4471.1000-001，于2010年5月28日提交的作为WO__________公开的PCT申请PCT/US2010/036664，其全部内容通过引用结合在此)维持该细胞培养物。

如在此说明的，被引入该非人类哺乳动物体内的HSC是基因工程化的这样使得这些HSC和/或它们的子代(例如，被人类HSC重建的血细胞谱系，例如B细胞子代)表达(例如，过量表达)与人类造血细胞癌相关的一种或多种人类癌基因。

如本领域普通技术人员所应当理解的，“与人类造血细胞癌相关的”癌基因包括直接地或间接地涉及一种或多种人类造血细胞癌的病因和/或发展的癌基因。与人类造血细胞癌相关的多种癌基因是本领域普通技术人员已知的。这类癌基因的实例包括ABL、AKT、RAS、BRAC1、BRAC2、CBL、CDK4、CDK6、PML、突变体IDH1或IDH2。如本领域普通技术人员还应当理解的，与造血细胞癌相关的融合基因也可以用于这些方法中。这类融合基因的实例包括BCR-ABL、MLL-AF4、MLLAF10以及MLL-ENO。

在一个实施方案中，这些HSC表达两种癌基因，这些癌基因已知是与人类淋巴瘤相关的。在一个具体实施方案中，这两种癌基因是bcl-2和myc。在约3周内以B细胞特异性模式表达(例如，过量表达)两种癌基因的转基因动物发展出白细胞肿瘤并且在5-6周内死亡(Strasser，A.，et al.1990.Nature 348：331-333；Marin，M.C.，et al.1995.Exp.Cell Res.217：240-247)。与促进增殖的其他癌基因不同，发现bcl-2没有通过抑制凋亡调节物例如半胱天冬酶的活化来阻止程序性细胞死亡；bcl-2过量表达是滤泡性淋巴瘤的标志(Chao，D.T.and S.J.Korsmeyer.1998.Annu.Rev.Immunol.16：395-419；Cory，S.，et al.2003.Oncogene 22：8590-8607)。

另一方面，已知myc癌基因阻止末端细胞分化，但还具有促凋亡功能；它的过量表达是与高度侵袭性伯基特淋巴瘤强烈相关的(Marin，M.C.，et al.1995.Exp.Cell Res.217：240-247；Nilsson，J.A.and J.L.Cleveland.2003.Oncogene22：9007-9021；Adams，J.M.，et al.985.Nature 318：533-538)。令人感兴趣的是，bcl-2已经显示通过阻断myc相关的凋亡而不抑制myc诱导的细胞增殖增强了myc的发生肿瘤的潜力(Marin，M.C.，et al.1995.Exp.Cell Res.217：240-247；Meyer，N.，et al.2006.Semin.Cancer Biol.16：275-287)。

如在此显示的，当将基因工程化以表达bcl和myc的人类HSC引入小鼠体内，并且在其中这些HSC得以重建并且这些癌基因表达于这些小鼠体内的条件下维持这些小鼠时，在这些bcl-2/myc双-转基因人源化小鼠体内发展出这些人类淋巴样肿瘤。

此外或可替代地，可以将这些HSC进行基因工程化以在HSC和/或这些HSC的子代中(例如，在该非人类哺乳动物体内由人类HSC重建的血细胞谱系)抑制一种或多种肿瘤抑制基因的表达。因此，在一个实施方案中，本发明是针对制造一种非人类哺乳动物的方法，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型，该方法包括将包括(包含)在HSC和/或这些HSC的子代中抑制一种或多种肿瘤抑制基因的表达的核酸的人类造血干细胞(HSC)引入一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内。在其中该非人类哺乳动物的血细胞谱系被人类HSC重建并且在该哺乳动物体内该一种或多种肿瘤抑制基因的表达被抑制的条件下维持该哺乳动物，由此制造出一种非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型。

在另一个实施方案中，本发明是针对制造一种非人类哺乳动物的方法，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型，该方法包括将包括(包含)在HSC中和/或在HSC的子代中编码(例如，基因工程化以表达)与人类造血细胞癌相关的一种或多种癌基因的核酸、以及抑制一种或多种肿瘤抑制基因表达的核酸的人类造血干细胞(HSC)引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内。在其中在该哺乳动物体内该非人类哺乳动物的血细胞谱系被人类HSC重建并且该一种或多种癌细胞被表达，并且该一种或多种肿瘤抑制基因的表达被抑制的条件下维持该哺乳动物，由此制造出一种非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型。

这些肿瘤抑制基因表达多种蛋白，这些蛋白有助于防止或“抑制”异常细胞发展成为成熟的肿瘤。当这类基因功能失效时，如在癌细胞中它们通常所处的状态，细胞可以不受控制地生长，形成多种肿瘤，这些肿瘤是癌的标志。肿瘤抑制基因的实例包括p53、Rb、APC、PTEN、CD95、ATM、以及DAPKI。

如本领域普通技术人员所应当理解的，抑制和/或降低一种或多种肿瘤抑制基因表达的任何适当的核酸可以用于本发明的方法中。例如敲出、敲入和/或敲除肿瘤抑制基因表达的核酸可以用于本发明的方法中。这样核酸的一个实例包括一种核酸，该核酸被靶向用于插入一个肿瘤抑制基因中由此删除或中断(敲除)该肿瘤抑制基因的表达。另一个实例是一种核酸，该核酸被靶向以替换该肿瘤抑制基因(例如，编码除了肿瘤抑制基因之外的一种基因的核酸)，由此敲入该肿瘤抑制基因。另外的实例包括与该肿瘤抑制基因具有序列互补性的核酸或该肿瘤抑制基因的一种mRNA转录本，该mRNA转录本通过阻断转录(在基因结合的情况下)、降解mRNA转录本(例如通过小干扰RNA(siRNA)或RNase-H依赖型反义)、或阻断mRNA翻译位点、前mRNA剪接位点亦或用于其他功能性RNA(例如miRNA)成熟的核酸酶切割位点而导致表达量降低(Summerton，J(2007)，Med Chem.，7(7)：651-660)(例如，通过吗啉代寡核苷酸(Morpholino oligos)或其他RNase-H非依赖型反义(Summerton，J.，(1999)Biochimica et Biophysica Acta 1489(1)：141-58))。

如本领域普通技术人员所应当理解的，可以将HSC基因工程化从而使用本领域已知的多种技术来表达(例如，过量表达)一种或多种癌基因、融合的基因或肿瘤抑制基因。例如可以通过用包含该核酸的一种或多种适当的载体转导人类HSC来得到编码一种或多种癌基因的核酸和/或通过HSC抑制一种或多种肿瘤抑制基因的表达的核酸的表达。在一个实施方案中，这些载体是病毒载体。用于在此说明的方法中的适当的病毒载体的实例包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等。

如本领域普通技术人员还应当理解的，可以将编码该一种或多种癌基因的核酸和/或抑制一种或多种肿瘤抑制基因表达的核酸连同一种报告基因/选择标志物一起置于一个单个的载体或多个载体中。适当的报告基因/选择标志物的实例包括GFP、RFP，以及其他荧光蛋白(例如，mCherry、Tomato、cyan、荧光素酶)以及多种细胞表面标志物(例如，Thy-1、抗生素耐受性基因)。此外，该一种或多种癌基因和/或抑制一种或多种肿瘤抑制基因表达的核酸能够以化学计算量从单个的启动子表达。在具体实施方案中，当使用多于一种癌基因和/或抑制一种或多种肿瘤抑制基因表达的核酸时，可以通过编码核糖体跳跃诱导肽例如2A肽的一个区域来分离这些癌基因和/或抑制一种或多种肿瘤抑制基因表达的核酸(Szymczak，A.L.，et al.2004.Nat.Biotechnol.22：589-594；Fang，J.，et al.2005.Nat.Biotechnol.23：584-590)。

包括该一种或多种癌基因和/或抑制一种或多种肿瘤抑制基因表达的核酸的载体可以进一步包括可操作地连接到该一种或多种癌基因上的多种启动子。例如，可以将该一种或癌基因和/或抑制一种或多种肿瘤抑制基因表达的核酸可操作地连接到一种Eμ增强子加上CD19启动子或一种EF1α启动子上；前者将主要在B细胞中指导该一种或多种癌基因和/或抑制一种或多种肿瘤抑制基因的表达的核酸表达，而后者将指导在多种血细胞谱系中该一种或多种癌基因和/或抑制一种或多种肿瘤抑制基因的表达的核酸表达。

这些载体可以包括本领域普通技术人员已知的另外的元件。例如，该载体可以进一步包括一种IRES驱动的报告基因。此外，如在此说明的，可以使用病毒假型来进一步优化感染。例如，可以使用被膜蛋白RD114、表面糖蛋白VSV-G(Brenner，S.and H.L.Malech.2003.Biochim.Biophys.Acta.1640：1-24；Sandrin，V.，et al.2002.Blood 100：823-832；Di Nunzio，et al.2007.Hum.Gene Ther.18：811-20)、或长臂猿白血病病毒(GAVL)外壳蛋白假型化的病毒(例如慢病毒)。

在本发明的方法中，将被工程化以表达一种或多种癌基因的HSC引入一种非人类哺乳动物体内。如在此使用的，术语“哺乳动物”以及“哺乳动物的”是指包括单孔类动物、有袋类动物以及胎盘类动物的任何脊椎动物，这类动物哺乳它们的幼体并且或者产下活的幼体(真哺乳亚纲或有胎盘哺乳动物)亦或产蛋(后兽亚纲的动物或无胎盘哺乳动物)。可以用于在此说明的方法中的哺乳动物物种的实例包括非人类灵长类(例如，猴类、猩猩)、啮齿类(例如，大鼠、小鼠、豚鼠)、犬类、猫类、以及反刍动物(例如，牛、猪、马)。在一个实施方案中，该非人类哺乳动物是一个小鼠。在此所述的方法中使用的非人类哺乳动物可以是成年的、新生的(例如＜48小时龄；幼小动物)、或在子宫中。

在具体实施方案中，该非人类哺乳动物是一种免疫缺陷型非人类哺乳动物，即在其免疫系统中具有一种或多种缺陷的一种非人类哺乳动物(例如，NSG或NODscidγ(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠)，并且其结果是，当引入时允许通过人类HSC重建人类血细胞谱系。例如，这种非人类哺乳动物缺少其自身的T细胞、B细胞、NK细胞或它们的一种组合。在具体实施方案中，该非人类哺乳动物是一种免疫缺陷型小鼠，例如一种携带重度联合免疫缺陷突变的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid小鼠)、一种携带重度联合免疫缺陷突变并且缺少针对细胞因子受体γ链的一种基因的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid IL2R γ-/-小鼠)以及一种Balb/c rag-/-γc-/-小鼠。

免疫缺陷型小鼠的其他具体实例包括但不限于重度联合免疫缺陷症(scid)小鼠、非肥胖糖尿病(NOD)-scid小鼠、IL2rg^-/-小鼠(例如，NOD/LySz-scid IL2rg^-/-小鼠、NOD/Shi- scid IL2rg^-/-小鼠(NOG小鼠)、BALB/c- Rag^-/-IL2rg^-/-小鼠、H2^d-Rag^-/-IL2rg^-/-小鼠)、NOD/Rag^-/-IL2rg^-/-小鼠。

目前携带重度联合免疫缺陷(scid)突变的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是最广泛使用的异种移植受体。然而，将人类细胞移入这些NOD/scid小鼠体内还没有超过几个百分比，可能是由于在这些小鼠体内残存的先天免疫性以及低的但存在的NK细胞活性(Shultz，L.D.，et al.2007.Nat.Rev.Immunol.7：118-130；Chicha L.，R.etal.2005.Ann.N.Y.Acad.Sci.1044：236-243)。它们对胸腺淋巴瘤的高易感性以及因此的较短的寿命(约37周)进一步限制了它们的有用性(Shultz，L.D.，et al.2005.J.Immonol.174：6477-6489)。

近来，Shultz等人生产出缺少针对共用细胞因子受体γ链(对于淋巴发育具有关键性的不同细胞因子受体的一种极其重要的亚基)的基因的NOD/scid小鼠(Shultz，L.D.，et al.2005.J.Immonol.174：6477-6489；Cao，X.，et al.1995.Immunity 2：223-238)。与NOD/scid小鼠相比较，得到的NOD/scid，γc^null小鼠无胸腺淋巴瘤，具有长得多的寿命(约90周)，并且在它们的先天免疫性方面具有更显著的缺陷；因此在它们的骨髓中它们允许人类细胞移入增大＞10倍(在它们的骨髓中约70％的细胞是人类的，相对地在NOD/scid小鼠体内为约6％)(Shultz，L.D.，et al.2005.J.Immonol.174：6477-6489；Ishikawa，F.，et al.2005.Blood 106(5)：1565-1573)。

在这些小鼠体内人类HSC在骨髓中产生B细胞前体以及成熟IgM⁺B细胞，以及NK细胞、髓样细胞、树突状细胞、以及干细胞。胸腺包含的T细胞前体、以及外周血白细胞主要地是CD4⁺和CD8⁺T细胞。大多数脾细胞是安排在滤泡结构中的人类B细胞；在外周血中检测出可溶性人类IgM和IgG，表明发生种类转换。最后，在脾以及肠系膜淋巴结中观察到一些T细胞周围包含大部分B细胞的滤泡样结构，并且在用卵白蛋白免疫之后这些B细胞显示能够生产抗原特异性抗体(IgM和IgG两者)(Shultz，L.D.，et al.2005.J.Immonol.174：6477-6489；Ishikawa，F.，et al.2005.Blood 106(5)：1565-1573)。

在一些实施方案中，在引入工程化以表达一种或多种癌基因(例如，用于进一步增强人类HSC的重建)的HSC之前，对该非人类哺乳动物进行治疗或处理。例如，可以对该非人类哺乳动物进行处理以进一步增强人类HSC的移入和/或重建。在一个实施方案中，在引入这些HSC以及编码该一种或多种细胞因子的该(一种或多种)核酸之前，对该非人类哺乳动物进行照射。在另一个实施方案中，在引入这些HSC之前，将一种或多种化疗剂施用到该非人类哺乳动物体内。

如本领域普通技术人员还应当理解的，有多种方法来将工程化以编码该一种或多种癌基因的HSC引入到一种非人类哺乳动物体内。这类方法的实例包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、眼内、股内、心室内、颅内、鞘内、静脉内、心内、肝内、骨髓内、皮下、局部、口腔以及鼻内途径给药。其他适当的引入方法还可以包括子宫内注射、流体动力学基因送递、基因治疗、可再充电的或生物可降解的设备、颗粒加速设备(“基因枪”)以及缓释聚合物设备。可以使用任何一种这类给药途径或类似途径将HSC引入非人类动物体内。

在本发明的方法中，在将工程化以表达该一种或多种癌基因的人类HSC引入该非人类哺乳动物体内之后，在其中该非人类哺乳动物用人类HSC进行重建并且这些癌基因表达于该哺乳动物体内的条件下维持该非人类哺乳动物。在其下维持本发明的非人类动物的这类条件包括满足如本领域普通技术人员已知的该哺乳动物的基本需要(例如，食物、水、光)。在具体实施方案中，在这类适当条件下维持该动物导致在该非人类哺乳动物体内发展出淋巴样肿瘤。

本发明的方法可以进一步包括确定编码该一种或多种细胞因子的核酸是否被表达和/或该非人类动物是否被HSC重建。在此提供了用于确定该核酸是否被表达和/或该非人类哺乳动物的血细胞谱系是否被HSC重建的方法，并且这对于本领域普通技术人员而言是熟知的。例如，使用对人类HSC的表面细胞标志物具有特异性的抗体的流式细胞术分析可以用于检测在该非人类哺乳动物体内人类HSC或人类HSC子代的存在(例如，在该非人类哺乳动物体内该人类HSC分化成的血细胞谱系)。此外，在重建之后，可以仔细监测受体小鼠的总体健康情况。这类监控可以包括得到外周白细胞计数以及细胞标志物表型。在具体实施方案中，可以使用流式细胞仪以及免疫组织化学来表征该非人类哺乳动物的初级和二级淋巴器官的细胞构成。此外，可以通过检测在该非人类哺乳动物体内表达该一种或多种人类癌基因的人类白细胞对该非人类哺乳动物体内通过人类HSC重建人类血细胞谱系进行评估。

在另一方面，本发明的方法可以进一步包括将该非人类哺乳动物的淋巴癌(即，该人源化的非人类哺乳动物模型，该模型是用于人类淋巴癌的一种模型；一级人源化非人类哺乳动物模型)连续地移植到其他非人类哺乳动物体内，由此制造出一种或多种另外的非人类哺乳动物，它们是用于人类淋巴癌的模型(二级人源化非人类哺乳动物模型)。在这个方面中，该方法包括将表达来自作为人类淋巴癌的一种模型的该人源化非人类哺乳动物的一种或多种人类癌基因的人类细胞(例如，从该人源化非人类哺乳动物体内得到的人类白细胞)引入到一种或多种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内。在其中该人类HSC被重建并且这些癌基因表达于该第二非人类哺乳动物体内的条件下维持该一种或多种非人类哺乳动物，由此制造出一种或多种另外的非人类哺乳动物，这些非人类哺乳动物是用于人类淋巴癌的模型。在具体实施方案中，这些另外的一种或多种非人类哺乳动物是与最初人源化的非人类哺乳动物模型相同的或类似的物种(即，最初的非人类哺乳动物模式是一种人源化的小鼠模型并且这些另外的非人类哺乳动物模型是小鼠)。在其他实施方案中，这些另外的一种或多种非人类哺乳动物是与最初的人源化非人类哺乳动物模型不同的物种。

如本领域普通技术人员所应当理解的，表达该一种或多种从该人源化非人类哺乳动物体内得到的人类癌基因的数种类型的细胞可以用于这种方法中。例如，可以使用表达该一种或多种从该人源化的非人类哺乳动物体内骨髓或脾得到的人类癌基因的人类细胞。在一个具体实施方案中，这些细胞是该人源化非人类哺乳动物(初级人源化非人类哺乳动物)的脾细胞。

用于得到(分离、纯化、实质性纯化)这类细胞的方法是本领域普通技术员已知的。如在此使用的，“分离的”(例如，“表达一种或多种人类癌基因的分离的细胞”)是指相对于它天然存在于其中的复杂的(例如，细胞的)环境或器官、身体、或培养基而言，基本上分离的。在一些实例中，该分离的物质将形成组合物(例如，包含其他物质的粗提取物)、缓冲液系统或试剂混合物的一部分。在其他情况下，可以将该物质纯化到基本上均质性的。一个分离的细胞群可以构成存在的全部细胞的至少约50％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％(以总细胞数量计)。

在一些方面，可以将表达从该人源化的非人类哺乳动物体内得到的一种或多种人类癌基因的细胞直接注射到一种或多种非人类哺乳动物体内。在其他实施方案中，在引入到该一种或多种非人类哺乳动物体内之前可以如在此说明的将该细胞扩展。

因此，可以使用表达从初始(第一，初级)非人类哺乳动物体(该初始非人类哺乳动物是通过引入工程化以表达与人类造血细胞癌相关的一种或多种人类癌基因的人类HSC而制造的)内得到的人类癌基因的人类细胞制造作为人类淋巴癌的模型的非人类哺乳动物的同龄组(例如，约2只、约3只、约4只、约5只、约6只、约7只、约8只、约9只、约10只、约20只、约30只、约40只、约50只、约60只、约70只、约80只、约90只、约100只等)。如本领域普通技术人员所应当理解的，这些小鼠还用于连续移植一只或多只同龄动物。

可以通过引入工程化以表达与造血细胞癌相关的一种或多种癌基因的人类HSC来制造用作人类造血细胞癌的一种模型的人源化非人类哺乳动物的发现提供了多种用途。

例如，在另一个方面，本发明提供了制造一种非人类哺乳动物的方法，该非人类哺乳动物是针对人类造血细胞癌病人的一种模型。在这个方面中，该方法包括将该淋巴癌病人的造血干细胞(HSC)引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内。在其中非人类哺乳动物的血细胞谱系被人类HSC重建并且该癌症病人的癌基因表达于该非人类哺乳动物体内的条件下维持该非人类哺乳动物，由此制造出一种非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是针对该造血细胞癌病人的一种模型。

另一方面，本发明提供了包括通过在此说明的方法制造的该非人类哺乳动物的构成。

在又另一个方面，可以使用在此提供的非人类哺乳动物来鉴别可以用于治疗一种人类造血细胞癌的一种或多种试剂或治疗方案(科学计划)。在这个方面，本发明包括将该一种或多种试剂或治疗方案施用到在此说明的一种(一种或多种)非人类哺乳动物体内。然后确定该非人类哺乳动物体内的癌是否得以缓解，其中如果该非人类哺乳动物体内的癌在该非人类哺乳动物体内得以缓解，则可以使用该一种或多种试剂或治疗方案来治疗该人类淋巴癌。在一个具体实施方案中，作为用于这种方法中一种模型的该非人类哺乳动物可以是一种哺乳动物，该哺乳动物是针对一个具体的人类淋巴癌病人的一种模型。即，该非人类哺乳动物是通过引入该特定的淋巴癌病人的HSC而制造的一种动物。因此，该一种或多种试剂或一种或多种治疗科学计划对于该癌症病人而言是特异性的。

如本领域普通技术人员应当理解的，人类淋巴癌的缓解包括切除癌、减轻癌、延长该癌症病人的寿命、或改善癌症病人的生活质量或它们的组合。

如本领域普通技术人员还应当理解的，该方法可以进一步包括与多种适当的对照比较该非人类哺乳动物体内的癌是否得以缓解。这样的对照的一个实例是未接受该试剂或治疗方案的一种非人类哺乳动物。

如在此所示，使用淋巴癌的人源化非人类哺乳动物模型来鉴别在淋巴癌的治疗中产生协同效应的一种治疗科学计划。具体地，如实例3中所述，因为表面标志物CD52表达于在此说明的ALL模型中，使用这些同龄动物来测试单克隆抗体阿来组单抗(坎帕斯-1(Campath-1))的有效性，该单克隆抗体靶向人类CD52并且已经获得FDA批准用于对抗复发性慢性淋巴细胞性白血病。而且，对在阿来组单抗治疗开始时用广泛使用的化疗剂环磷酰胺治疗小鼠是否可以提高其疗效进行测试。发现在血液、肝以及脾中环磷酰胺和阿来组单抗的组合比单独的阿来组单抗稍微更加有效(约5-10倍)，并且在脑中比单独的环磷酰胺也稍稍更加有效(约5-10倍)。然而，值得注意的是，在骨髓中用环磷酰胺和阿来组单抗的组合治疗的小鼠将它们的癌细胞载量降低了约10,000倍或更多，这样使得在治疗之后在股骨骨髓样品中可检出很少量(如果有的话)的细胞。

因此，在另一个方面中，本发明是针对在需要它的个体体内治疗白血病的一种方法，该方法包括将一个有效量的抗CD52抗体和一种或多种化疗试剂同时施用到该个体体内。在一个具体方法中，该抗CD52抗体是阿来组单抗并且该一种或多种化疗试剂是环磷酰胺。在又其他方面中，在施用阿来组单抗和环磷酰胺之后该个体的骨髓中癌细胞载量减少约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约150倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍、约600倍、约700倍、约800倍、约900倍、约1000倍、约2000倍、约3000倍、约4000倍、约5000倍、约6000倍、约7000倍、约8000倍、约9000倍、约10,000倍、约20,000倍。在又一个具体方面中，在施用阿来组单抗和环磷酰胺之后该个体的骨髓中癌细胞载量降低10,000倍。

例证

实例1 免疫系统癌的人源化小鼠模型。

在此说明了创建淋巴癌(例如，白血病和淋巴瘤)的一种人源化小鼠模型。

制备慢病毒主链，其中一种B细胞特异性启动子(与Eμ增强子结合的人类CD19启动子)控制绿色荧光蛋白(GFP)和癌基因Myc和/或Bcl-2的表达。如前面说明的，使用这种主链来制备VSVG假型慢病毒，并且使用超速离心进行浓缩。对病毒滴度进行确定。

使用磁性拣选来纯化从胎儿组织或脐带中得到的人类CD34⁺或CD133⁺细胞并且再悬浮于包含4ug/ml聚凝胺的培养基中。然后添加前面制备的携带人类癌基因的慢病毒(见上述)，这样使得感染复数(MOI)为10或更多。然后将这些细胞和病毒的混合物等分到一个96孔U底板中，这样使得每个孔包含20,000-50,000个细胞。然后在室温下(25℃)将这些细胞在1000xG下离心90-120分钟。随后在37℃下将这些细胞孵化过夜。第二天用新鲜的(无病毒的)细胞培养基来替换包含病毒的培养基，并且将这些细胞再悬浮。

还可以将上述感染实验计划应用到已经在体外使用前面说明的培养实验计划扩展的人类CD34+或CD133⁺细胞上(Zhang et al，2008，Blood 111(7)3415-23)。在扩展之后，如上所述将这些CD133+细胞再次纯化并且感染。

感染后约60小时，将这些细胞收集、重悬于StemSpan

培养基中，并且注射到亚致命照射的免疫缺陷型NOD/scid/γc^null宿主小鼠体内。然后大约每10天一次通过目测以及通过针对人类细胞的出现筛查外周血(例如，对于人类CD45抗原具有阳性)两者对这些小鼠进行监测。

用表达GFP以及Myc和Bcl-2癌基因两者的细胞重建的小鼠在重建的2个月内开始经历体重减轻。在随后3-5周的期间，这些小鼠逐渐变得虚弱，最终不能自己进食；同时呈GFP+(并且因此还有Myc+和Bcl-2+)的人类白细胞数量增加直至它们占外周血中白细胞的95％以上。在这时将这些小鼠处死并且进行检查。参见图1A-1C。

用表达GFP、Myc、以及Bcl-2的细胞重建的所有小鼠显示脾肿大以及骨髓浸润，其中有几个还显示出淋巴结增大、肺部发炎、以及肿瘤侵入它们的肝、肾、脑以及脊骨周围肌肉中的迹象。参见图2A-2D，以及图3。

实例2 该免疫系统的癌是可以连续移植的

该疾病显示可以连续地移植到其他NOD/scid/γc^null小鼠体内。二级移植的小鼠显示出表型类似于初级供体的白血病。白血病细胞的迁移模式以及临床症状是类似的。这些二次受体的寿命显示是取决于它们最初被注射的GFP+细胞的数量。基于GFP标志物表达通过流式细胞术在MoFlow细胞分选仪上将细胞纯化。作为一种替代方法，针对CD19+细胞的磁性阳性选择显示＞99％的类似纯度。在分离并且纯化之后无需进一步扩展直接注射这些细胞以避免在体外选择潜在的亚群。当用从初级宿主小鼠的骨髓亦或脾中取得的约一百万GFP+细胞(重悬于约100uL StemSpan

培养基中)注射时，在初次注射之后约3周二级受体发展出相同的白血病，并且在此后约1-2周因之死亡。使用来自初级白血病小鼠的GFP+脾细胞，产生出大量同龄组(例如，每组50-100只动物)的二级小鼠。给予从脾中分离的大量的恶性细胞(例如，高达10⁹细胞)，未出现二级移植同龄动物的尺寸相关限制。

实例3 使用人源化模型来研究人类特异性治疗方法

人源化的急性成淋巴细胞性白血病(ALL)模型提供了研究新的人类特异性治疗剂尤其是靶向肿瘤相关抗原的单克隆抗体的可能性。在这种模型中这些白血病细胞表达多种细胞表面标志物，其中一些是针对正在市售或处于临床前开发的单克隆抗体或生物制剂的靶，例如CD52、CD22、CD19、CD38、CD44、CD47、CD74、DR4、DR5、CD123以及NRP1。

对应地针对人类CD45-PE和CD38-APC或CD52-APC将从全脾得到的淋巴细胞染色。人类淋巴细胞是由FSC/SSC淋巴细胞门并且hCD45-PE阳性表达来选通的。GFP+GMB细胞显示肿瘤抗原独特的高表达。GFP阴性非恶性人类细胞部分地显示出CD38和CD52的表达。参见图4A。

因为表面标志物CD52表达于在此说明的ALL模型中，使用这些同龄动物来测试单克隆抗体阿来组单抗(坎帕斯-1)的有效性，该单克隆抗体靶向人类CD52并且已经获得FDA批准用于对抗复发性慢性淋巴细胞性白血病。用来自同一只初级供体小鼠的约10⁶GFP+个细胞注射二级小鼠的同龄组中每只小鼠。18-20天后将这些小鼠分成2组，并且针对在它们的外周血中发现的GFP+细胞的密度进行划分(例如，具有相同的(或类似)数量的GFP+细胞/uL血液)。然后从这些小鼠被分成组的那一天开始在治疗的第1、4、以及7天一组小鼠接受3次尾静脉注射5mg/kg体重阿来组单抗(在无菌PBS中稀释成1mg/ml)；另一种小鼠仅接受注射无菌PBS。在接受注射之前，立即对每只小鼠进行称重，并且因此对每个注射量进行调节，这样使得每只小鼠接受5uL阿来组单抗(或PBS)/克体重。

完成治疗过程之后两天，将数只小鼠安乐死并且对各器官中GFP+细胞的数量进行确定。发现与仅用PBS注射的小鼠相比较，阿来组单抗治疗的小鼠在它们的外周血(减少约30倍)、肝(减少约400倍)、以及脾(减少约3300倍)中具有显著更少的GFP+细胞。然而，这些阿来组单抗治疗的小鼠以及对照小鼠的骨髓或脑中GFP+细胞的数量是大致相同的，表明在这些器官中缺少阿来组单抗的作用。然而，与PBS治疗的动物相比较，阿来组单抗治疗的小鼠存活显著地更长时间。参见图4B以及4C。

为了测试阿来组单抗介导的白血病细胞杀伤机理，使用胃蛋白酶消化的阿来组单抗的F(ab)2片段，显示无疗效，表明Fc-受体介导的靶-效应细胞相互作用是阿来组单抗药物作用中的关键性机理。还可以通过补体介导的溶解来杀死抗体结合的白血病细胞。因为，NSG小鼠是补体C5缺陷的，来自NSG小鼠的血清在体外不介导阿来组单抗介导的肿瘤细胞杀伤(图5A)。类似地，在体外在ALL细胞上不能观察到直接的细胞毒性作用(图5C)。然而，诱导的腹膜巨噬细胞能够在添加阿来组单抗时在体外将ALL细胞溶解。且，当应用缺少Fc部分的阿来组单抗的F(ab)2片段时未见到有作用(图5D)。

为了分析巨噬细胞在体内阿来组单抗的抗白血病活性中所起的作用，在治疗之前通过静脉内或腹腔内注射包含脂质体的氯屈膦酸盐将携带肿瘤的小鼠体内的巨噬细胞耗尽。当在注射氯屈膦酸盐脂质体之后用阿来组单抗处理巨噬细胞耗尽的小鼠持续2天时，在脾中未见到白血病细胞减少。

人源化的ALL模型显示补体特异性治疗反应，具体地是脑和脊髓中阿来组单抗耐受性。为了说明耐受性的机理，通过用AlexaFluor 750标记阿来组单抗，对阿来组单抗的体内组织分布以及表位结合进行评估。以5mg/kg治疗剂量注射标记的阿来组单抗。24小时之后将小鼠处死并且在IVIS荧光计下成像。荧光信号集中于脾和骨上。将这些器官均匀化并且通过流速细胞术针对阿来组单抗-AlexaFluor750结合直接地对来自这些器官的细胞进行评估。在脾和骨髓中观察到强抗体结合，而在脑衍生的白血病细胞中未见到特异性结合。骨髓中这样的阿来组单抗耐受性机理是独立于药物代谢动力学的多个方面，而细胞侵入脑则大部分被血脑屏障所屏蔽。参见图5B以及5C。

而且，对在阿来组单抗治疗开始时用广泛使用的化疗剂环磷酰胺治疗小鼠是否可以提高其疗效进行测试。产生二级受体的同龄组并且如上所述将其分成多个治疗组。这些组包括对照小鼠(仅用PBS注射治疗)；仅用阿来组单抗(如上所述在第1、4、以及7天注射)治疗的小鼠；仅用环磷酰胺(将环磷酰胺以15mg/ml溶于无菌PBS中并且在第1和2天通过腹腔内注射进行递送；注射量根据体重调节，使每只小鼠接受10uL环磷酰胺溶液/克体重)治疗的小鼠；以及阿来组单抗和环磷酰胺联合治疗的小鼠。在完成阿来组单抗治疗之后2天(在开始所有治疗之后9天)，将小鼠安乐死并且对多种器官中GFP+细胞的数量进行确定(如上所述)。

发现，虽然在外周血中仅用环磷酰胺治疗与仅用阿来组单抗治疗同样有效地降低了GFP+细胞数量，在肝和脾中阿来组单抗比环磷酰胺有效性高约15倍。然而，虽然在脑中单独的阿来组单抗不起作用，在脑中发现环磷酰胺治疗将GFP+细胞的数量减少约300倍。然而，两种单独治疗对骨髓中白血病都没有大的影响。在血液、肝以及脾中环磷酰胺和阿来组单抗的组合比单独的阿来组单抗的有效性稍微(约5-10倍)高一些，并且在脑中也比单独的环磷酰胺的有效性稍微(约5-10倍)高一些。然而，值得注意的是，在骨髓中用环磷酰胺和阿来组单抗的组合治疗的小鼠将它们的癌细胞载量降低了约10,000倍或更多，这样使得在治疗之后在股骨骨髓样品中可检出很少量(如果有的话)的GFP+细胞。参见图6A以及6B。

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在此引用的所有专利、公开申请以及参考文献的传授的内容都通过引用以其全部内容结合在此。

虽然通过参考其实例性的实施方案本发明已经进行了具体的展示和说明，本领域普通技术人员应当理解的是在不偏离由所附权利要求所包括的本发明的范围下其中可以在形式和细节方面进行多种改变。

Claims (57)

1.一种制造一种非人类哺乳动物的方法，该非人类哺乳动物是用于一种人类造血细胞癌的一种模型，该方法包括

a)将遗传工程化以表达与人类造血细胞癌相关的一种或多种人类癌基因的人类造血干细胞(HSC)引入一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内；并且

b)在其中该非人类哺乳动物的血细胞谱系被人类HSC重建并且这些癌基因表达于该哺乳动物体内的条件下维持该哺乳动物，

由此制造出一种非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是用于一种人类造血细胞癌的一种模型。

2.如权利要求1所述的方法，其中该免疫缺陷型非人类哺乳动物是一个小鼠。

3.如权利要求2所述的方法，其中该小鼠是选自下组，该组由以下各项组成：一种携带重度联合免疫缺陷突变的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid小鼠)、一种携带重度联合免疫缺陷突变并且缺少针对细胞因子受体γ链的一种基因的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid IL2R γ^-/-小鼠)、以及一种Balb/c rag^-/- γc^-/-小鼠。

4.如权利要求3所述的方法，其中在将HSC引入该小鼠体内之前将该小鼠进行亚致命照射。

5.如权利要求1所述的方法，其中这些人类HSC是CD34+细胞、CD133+细胞、CD34+CD133+细胞或它们的一种组合。

6.如权利要求3所述的方法，其中该小鼠是人类淋巴瘤或人类白血病的一种模型。

7.如权利要求6所述的方法，其中该淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、以及套细胞淋巴瘤；并且该白血病是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T细胞ALL、原B细胞ALL、前B ALL以及幼稚B ALL、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、以及慢性髓细胞性白血病。

8.如权利要求6所述的方法，其中该一种或多种癌基因是myc、bcl-2、ABL、AKT、RAS、BRAC1、BRAC2、CBL、CDK4、CDK6、PML、突变体IDH1、突变体IDH2或它们的一种组合。

9.如权利要求8所述的方法，其中用表达该myc癌基因、该bcl-2癌基因或它们的组合的一种病毒转染这些HSC。

10.如权利要求9所述的方法，其中该病毒是一种慢病毒。

11.如权利要求10所述的方法，其中该慢病毒进一步表达编码一种报告蛋白的基因。

12.如权利要求11所述的方法，其中该报告蛋白是一种绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、一种抗生素耐受性蛋白、荧光素酶、一种细胞表面蛋白或它们的一种组合。

13.如权利要求12所述的方法，其中这些癌基因以及该报告基因被可操作地连接到一种细胞特异性启动子上。

14.如权利要求13所述的方法，其中该细胞特异性启动子是一种人类B细胞特异性启动子。

15.如权利要求14所述的方法，其中该人类B细胞特异性启动子是一种人类CD19启动子。

16.如权利要求10所述的方法，其中该慢病毒是一种水泡性口炎病毒G(VSVG)-假型慢病毒。

17.如权利要求1所述的方法，其中在体外通过在补充有生长因子的无血清培养基中培养这些HSC来扩展这些HSC。

18.如权利要求17所述的方法，进一步包括引入间充质干细胞(MSC)的一种滋养层。

19.如权利要求18所述的方法，其中这些生长因子是干细胞因子、血小板生成素、成纤维细胞生长因子1、胰岛素成长因子结合蛋白2(IGFBP2)、血管生成素样蛋白5(Angptl5)、或它们的一种组合。

20.如权利要求17所述的方法，其中在体外扩展这些HSC期间用慢病毒转染这些HSC。

21.如权利要求1所述的方法，其中这些HSC是从一名癌症病人体内得到的。

22.如权利要求21所述的方法，其中该癌症病人患有一种淋巴癌或一种白血病。

23.如权利要求22所述的方法，其中该淋巴癌是滤泡性淋巴瘤，并且该白血病是急性成淋巴细胞性白血病。

24.如权利要求1所述的方法，进一步包括对于在该非人类哺乳动物体内该非人类哺乳动物的血细胞谱系通过人类HSC的重建进行评估。

25.如权利要求24所述的方法，其中通过检测在该非人类哺乳动物体内表达该一种或多种人类癌基因的人类白细胞对重建进行评估。

26.如权利要求1所述的方法，进一步包括制造一种或多种非人类哺乳动物，这些非人类哺乳动物是用于一种人类造血细胞癌的模型，该方法包括

c)将表达从步骤b)的非人类哺乳动物体内得到的该一种或多种人类癌基因的人类细胞引入到该一种或多种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内；并且

d)在其中该一种或多种非人类哺乳动物的血细胞谱系被人类HSC重建并且这些癌基因表达于该一种或多种非人类哺乳动物体内的条件下维持c)的一种或多种非人类哺乳动物，

由此制造出一种或多种非人类哺乳动物，这些非人类哺乳动物是用于一种人类造血细胞癌的模型。

27.如权利要求26所述的方法，其中表达从步骤c)的非人类哺乳动物体内得到的一种或多种人类癌基因的人类细胞是从该非人类哺乳动物的脾、骨髓、或它们的一种组合中得到的。

28.如权利要求27所述的方法，其中这些细胞是脾细胞。

29.如权利要求26所述的方法，其中该免疫缺陷型非人类哺乳动物是一种小鼠。

30.如权利要求29所述的方法，其中该小鼠是选自下组，该组由以下各项组成：一种携带重度联合免疫缺陷突变的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid小鼠)；一种携带重度联合免疫缺陷突变并且缺少针对细胞因子受体γ链的一种基因的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid IL2Rγ^-/-小鼠)、以及一种Balb/c rag^-/- γc^-/-小鼠。

31.如权利要求30所述的方法，其中在将HSC引入该小鼠体内之前将该小鼠进行亚致命照射。

32.如权利要求27所述的方法，其中该小鼠是人类淋巴瘤或人类白血病的一种模型。

33.如权利要求32所述的方法，其中该淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、以及套细胞淋巴瘤；并且该白血病是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T细胞ALL、原B细胞ALL、前B ALL以及幼稚B ALL、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、以及慢性髓细胞性白血病。

34.如权利要求1所述的方法，进一步包括将基因工程化以在这些HSC中、这些HSC的子代中或它们的一种组合中包括抑制一种或多种肿瘤抑制基因的核酸的HSC引入。

35.一种生产一种非人类哺乳动物的方法，该非人类哺乳动物是用于一种人类造血细胞癌的一种模型，该方法包括

a)将基因工程化以在这些HSC中、这些HSC的子代中或它们的一种组合中包括抑制一种或多种肿瘤抑制基因的核酸的人类造血干细胞(HSC)引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内；并且

b)在其中该非人类哺乳动物的血细胞谱系被人HSC重建并且在该哺乳动物体内该一种或多种肿瘤抑制基因的表达被抑制的条件下维持该哺乳动物，

由此制造出一种非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是用于一种人类造血细胞癌的一种模型。

36.一种通过权利要求1所述的方法制造的非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型。

37.一种通过权利要求3所述的方法制造的非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型。

38.一种通过权利要求13所述的方法制造的非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型。

39.一种通过权利要求15所述的方法制造的非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的一种模型。

40.一种通过权利要求23所述的方法制造的非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是用于人类癌的一种模型。

41.一种通过权利要求26所述的方法制造的一种或多种非人类哺乳动物，这些非人类哺乳动物是用于人类造血细胞癌的模型。

42.一种制造一种非人类哺乳动物的方法，该非人类哺乳动物是针对人类造血细胞癌病人的一种模型，该方法包括将该造血细胞癌病人的造血干细胞(HSC)引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内并且在其中该非人类哺乳动物的血细胞谱系被HSC重建并且该癌症病人的一种或多种癌基因表达于该哺乳动物体内的条件下维持该非人类哺乳动物，由此制造出一种非人类哺乳动物，该非人类哺乳动物是针对该造血细胞癌病人的一种模型。

43.如权利要求42所述的方法，其中该免疫缺陷型非人类哺乳动物是一个小鼠。

44.如权利要求43所述的方法，其中该小鼠是选自下组，该组由以下各项组成：一种携带重度联合免疫缺陷突变的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid小鼠)；一种携带重度联合免疫缺陷突变并且缺少针对细胞因子受体γ链的一种基因的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid IL2R γ^-/-小鼠)以及一种Balb/c rag^-/- γc^-/-小鼠。

45.如权利要求44所述的方法，其中在将HSC引入该小鼠体内之前将该小鼠进行亚致命照射。

46.如权利要求43所述的方法，其中该小鼠是人类淋巴瘤或人类白血病的一种模型。

47.如权利要求46所述的方法，其中该淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤，并且该白血病是急性成淋巴细胞性白血病。

48.如权利要求42所述的方法，进一步包括将一种试剂或一种治疗施用到该非人类哺乳动物体内并且确定该试剂或该治疗是否可以用于治疗该癌症病人，该非人类哺乳动物是针对该造血细胞癌病人的一种模型。

49.一种由权利要求42所述的方法制造的非人类哺乳动物。

50.一种鉴别可以用于治疗人类造血细胞癌的一种或多种试剂或治疗方案的方法，包括

a)将该一种或多种试剂施用到如权利要求36所述的一种非人类哺乳动物体内；并且

b)确定该非人类哺乳动物体内的癌是否得以缓解，

其中如果该非人类哺乳动物体内的癌在该非人类哺乳动物体内得以缓解，则该一种或多种试剂或治疗方案可以用于治疗该人类造血细胞癌。

51.根据权利要求50所述的方法，进一步包括与对照比较该非人类哺乳动物体内癌是否得以缓解。

52.如权利要求51所述的方法，其中该对照是未接受该试剂或治疗科学计划的一种非人类哺乳动物。

53.如权利要求50所述的方法，其中将两种或更多种试剂施用到该非人类哺乳动物体内。

54.如权利要求53所述的方法，其中施用这两种试剂导致对于治疗人类B细胞癌的协同效应。

55.一种在需要它的个体体内治疗白血病的方法，包括将一个有效量的一种抗CD52抗体以及一种或多种化疗剂同时施用到该个体体内。

56.如权利要求55所述的方法，其中该抗CD52抗体是阿来组单抗并且该一种或多种化疗剂是环磷酰胺。

57.如权利要求56所述的方法，其中在施用阿来组单抗和环磷酰胺之后该个体骨髓中的癌细胞载量降低了10,000倍。

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