JPWO2002043477A1 - 異種細胞の生着、分化および増殖に適したマウスの作出方法、該方法により作出されたマウスならびにそのマウスの用途 - Google Patents

Abstract

異種細胞の生着、分化および増殖に適した免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）および該マウスの作出方法を提供する。該マウスは、ＮＯＤ／ＳｈｉマウスにＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスを戻し交配することにより得られるマウスに、さらにインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配することにより得られ、ヒト抗体の作製、幹細胞アッセイ系、腫瘍モデルおよびウイルス感染モデルの作製に利用することができる。

Description

技術分野
本発明は、異種細胞の生着に優れたマウスの作出方法、その方法により作出されたマウスおよびそのマウスの用途に関する。
背景技術
ヒトを始めとする異種細胞を生着させた実験動物は、種々の病態発症機序の解析、その治療や予防のための薬剤開発に極めて重要であり、そのための受容体としての動物の開発は実験動物学の大きなテーマの１つである。特に近年では、幹細胞より分化させた組織や細胞の移植による治療（いわゆる再生治療）などが世界的に注目されるに至って、さらにこれらの動物の重要性が増している。
本発明者らは以前からこうした実験動物の開発・改良を続けてきた。特にヌードマウスやＳＣＩＤマウスの改良等を行い、これまでにこの目的の為に作製した免疫不全マウス等に関しては既に特許出願を行っている（特開平９−９４０４０号公報）。中でも、多機能免疫不全（機能的なＴ細胞およびＢ細胞の欠失、マクロファージ機能減退、補体活性の低下およびナチュラルキラー（ＮＫ）活性低下等）を示すＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスおよびＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄマウスは異種細胞の生着に適した実験動物として最も注目されており、幹細胞分化・増殖を初めとして多様な研究に用い得ることが明らかとなってからは更に適用範囲が拡がっているのが現状である。
しかしながら、上記ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスはヒト細胞の生着は高いものの、その生着性にかなりのバラつきが認められる。
ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスの生着性を高めるためには、抗ＩＬ−２Ｒβ鎖抗体（ＴＭβ１）や抗アシアロ−ＧＭ１抗体等を投与して前記マウスのＮＫ活性を減退させることが重要であることが既に明らかにされている（Ｋｏｙａｎａｇｉ，Ｙ．ら、１９９７．”Ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１　ｖｉｒｅｍｉａ　ａｎｄ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｈｕ−ＰＢＬ−ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｏｕｓｅ　ｓｔｒａｉｎ．”Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　７１：２４１７；Ｋｏｙａｎａｇｉ，Ｙ．ら、１９９７．“Ｈｉｇｈ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｖｉｒｅｍｉａ　ｉｎ　ｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ−ｓｃｉｄ　ｍｉｃｅ　ｗｉｔｈ　ＨＩＶ−１　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．”Ｌｅｕｋｅｍｉａ　１１　Ｓｕｐｐｌ．３：１０９；Ｙｏｓｈｉｎｏ　Ｈ，ら、２０００．“Ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｅｒ　ｃｅｌｌ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｎｔｉ−ａｓｉａｌｏ　ＧＭ１　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ　ｉｎ　ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ　ｍｉｃｅ．”Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　２６：１２１１−６。しかし、そうした抗体は極めて高価であり、またその効果も個体によってバラつきが認められる。さらに、抗アシアロ−ＧＭ１抗体を用いる場合、実験期間中は１１日に１度という頻度で投与を行わなくてはならず、煩雑さも付きまとう。
このために、米国Ｊａｃｋｓｏｎ研究所のＤｒ．Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．らは、ヒト細胞高生着性ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄマウスに、ＮＫ活性を消失しているβ２ｍ　ＫＯマウスと交配することによって、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌ（β２ｍ（ｎｕｌｌ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（Ｋｏｌｌｅｔ　Ｏ，Ｐｅｌｅｄ　Ａ，Ｂｙｋ　Ｔら、ｂｅｔａ２　ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ（β２ｍ（ｎｕｌｌ））ＮＯＤ／ＳＣＩＤ　ｍｉｃｅ　ａｒｅ　ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ　ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ　２０００；９５（１０）：３１０２−５）を作製している。
上記のＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスにおいては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が消失しており、またマクロファージ、補体の機能が減退している。しかし、移植異種細胞、組織の拒絶には、それら以外の細胞（例えば、樹状細胞）や因子（例えば、ＩＦＮγ）も関与している。
このため、上記のＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスよりもさらに異種細胞の生着性にバラつきが無く、抗体が不要で、かつ異種細胞の生着性に優れているマウスが望まれる。
発明の開示
そこで本発明は、上記問題点を解決し、異種細胞の生着性に優れているマウスの作出方法および該方法により作出されたマウスを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＮＯＤ／ＳｈｉマウスにＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスを戻し交配することにより得られるマウスに、インターロイキン２受容体γ鎖（ＩＬ−２Ｒγ）遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配することにより、異種細胞の生着性にバラつきが無く、かつ抗体が不要な（すなわち、異種細胞の生着に適した）マウスが得られるという知見を得た。本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）　以下のＡのマウスにＢのマウスを戻し交配することを特徴とする、異種細胞の生着に適したマウスの作出方法；
Ａ：ＮＯＤ／ＳｈｉマウスにＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスを戻し交配することにより得られるマウス、
Ｂ：インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウス。
（２）　ＡのマウスがＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスである、（１）のマウスの作出方法。
（３）　ＢのマウスがＩＬ−２ＲγＫＯマウスである、（１）または（２）のマウスの作出方法。
（４）　（１）〜（３）のいずれかのマウスの作出方法により作出されたマウス。
（５）　機能的なＴ細胞およびＢ細胞を共に欠失し、マクロファージ機能が減退し、ＮＫ細胞またはＮＫ活性を消失し、かつ樹状細胞機能が減退しており、優れた異種細胞生着性を有していることを特徴とする、ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγ　ＫＯ）マウス。
（６）　移植したヒト幹細胞が、排除されることなく、効率良く分化、増殖する（４）または（５）のＮＯＧマウス。
（７）　（４）〜（６）のいずれかのマウスにヒト幹細胞を移植し、分化・増殖する細胞を解析することを含む、幹細胞アッセイ方法。
（８）　Ｔ細胞およびＢ細胞の分化・増殖を解析する、（７）の幹細胞アッセイ方法。
（９）　（４）〜（６）のいずれかのマウスにヒト幹細胞を移植し増殖させた後に、該マウスの骨髄からヒト幹細胞を回収しさらに、（４）〜（６）のいずれかのマウスに移植することを繰り返し行うことを含むヒト幹細胞を増殖させる方法。
（１０）　繰り返しが少なくとも３回である（９）のヒト幹細胞を増殖させる方法。
（１１）　（９）または（１０）の方法で得られた純度が９９．７％以上のヒト幹細胞。
（１２）　ヒト幹細胞が外来遺伝子を導入したものである、（９）または（１０）の方法。
（１３）　ヒトＴ細胞およびＢ細胞を安定に保持し、ヒト抗体を産生することが可能な、（４）〜（６）のいずれかのマウス。
（１４）　ヒトＴ細胞およびＢ細胞を保持する、（４）〜（６）のいずれかのマウスを抗原で免疫することを含む、ヒト抗体の産生方法。
（１５）　ヒトＴ細胞およびＢ細胞を保持する、（４）〜（６）のいずれかのマウスを抗原で免疫した後に該マウスから該抗原に対する抗体産生細胞を回収し、株化することを含む、ヒト抗体を産生する抗体産生細胞株を製造する方法。
（１６）　ヒト腫瘍細胞を保持した（４）〜（６）のいずれかのマウスである、ヒト腫瘍モデルマウス。
（１７）　ヒト腫瘍細胞がＨＴＬＶ−１白血病由来細胞である、（１６）のヒト腫瘍モデルマウス。
（１８）　ヒト腫瘍細胞を耳介に保持した、（１６）または（１７）のヒト腫瘍モデルマウス。
（１９）　（１６）〜（１８）のいずれかのマウスを用いて抗癌剤をスクリーニングする方法。
（２０）　（４）〜（６）のいずれかのマウスにヒト腫瘍細胞を移植することを含む、ヒト腫瘍モデルマウスを作出する方法。
（２１）　ヒト腫瘍細胞がＨＴＬＶ−１白血病由来細胞である、（１６）の方法。
（２２）　ヒト腫瘍細胞をマウスの耳介に移植する、（２０）または（２１）の方法。
（２３）　マクロファージトロピックなウイルスばかりでなく、Ｔトロピック（Ｔ細胞親和性）なウイルスに感染したＴ細胞を保持した（４）〜（６）のいずれかのマウスである、ウイルス感染モデルマウス。
（２４）　ウイルスがＨＩＶである、（２３）のウイルス感染モデルマウス。
（２５）　ウイルスがＨＴＬＶ−１である、（２３）のウイルス感染モデルマウス。
（２６）　（２３）〜（２５）のマウスを用いて抗ウイルス剤をスクリーニングする方法。
（２７）　（３）〜（６）のマウスを用いて、ＮＯＧマウスよりも異種細胞の生着性が向上した免疫不全マウスを作出する方法。
（２８）　ＮＯＧマウスよりも異種細胞の生着性が向上した免疫不全マウスを作出するための、（３）〜（６）のマウス。
以下、本発明の一般的実施態様について説明する。
１．本発明のマウスの作出
本発明の異種細胞の生着に適したマウスの作出方法は、以下のＡのマウスにＢのマウスを戻し交配することを特徴とする；
Ａ：ＮＯＤ／ＳｈｉマウスにＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスを戻し交配することにより得られるマウス、
Ｂ：インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウス。
ここで異種細胞としては、ヒトを始めとしてマウス、ラット等の哺乳動物由来の細胞や組織、特にヒトの幹細胞、リンパ球や腫瘍細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。
ＡのマウスにおけるＮＯＤ／ＳｈｉマウスへのＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスの戻し交配は、当業者に公知の手法、例えば、Ｃｒｏｓｓ　Ｉｎｔｅｒｃｒｏｓｓ法による戻し交配（Ｉｎｂｒｅｄ　Ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍ．Ｆ．Ｗ．Ｆｅｓｔｉｎｇ，１９７９，ＩＳＢＮ　０−３３３−２３８０９−５，Ｔｈｅ　Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ　ａｎｄ　Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ）に従い、Ｃ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスとＮＯＤ／Ｓｈｉマウスとを交配し、そのＦ１マウス同士を更に交配して得たＦ２マウスの血清中の免疫グロブリン量を測定し、検出できないマウスを選別する。このマウスを再びＮＯＤ／Ｓｈｉマウスと交配する。この操作を９回以上繰り返し（Ｃｒｏｓｓ　Ｉｎｔｅｒｃｒｏｓｓ法）行うことによって実施できる。
尚、ＮＯＤ／ＳｈｉマウスおよびＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスは共に日本クレア株式会社から販売されている。また、これらのマウスの交配により得られるマウスとしては、例えば、本発明者らが以前に樹立したＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（または、ＮＯＤ−ｓｃｉｄとも呼ぶ）（特開平９−９４０４０号公報）があり、これを日本クレア株式会社から入手して直接Ａのマウスとして用いることもできる。尚、ＮＯＤ／ＳｈｉマウスおよびＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスについては、上記以外に本出願人も所持しており、必要に応じていつでも分譲することができる。
また、Ｂのマウスにおけるインターロイキン２受容体γ鎖（ＩＬ−２Ｒγ）遺伝子のノックアウトは、当業者に公知の手法、例えば、マウスＥＳ細胞を用いた相同組換えの手法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ａｌｔｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｂｙ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８９）２４４，１２８８−１２９２）に従い、マウス由来の特定の遺伝子と例えばネオマイシン等の薬剤耐性遺伝子を含む相同遺伝子とをＥＳ細胞の段階で置き換えた後、該ＥＳ細胞を受精卵に注入することにより実施できる。
具体的には、例えば、１２９／ＳＶマウスのゲノムライブラリーからヒトのＩＬ−２ＲγｃＤＮＡをプローブとしてマウスＩＬ−２Ｒγを含む遺伝子クローンを単離し、該クローンのうちＩＬ−２Ｒγ全長を含む８．６ｋｂの大きさの断片を使用してターゲッティングベクターを作製する。すなわち、前記断片のＩＬ−２Ｒのエクソン７と８との間にネオマイシン耐性遺伝子を発現するＰＭＣ１−ｎｅｏポリＡを挿入し、またエクソン８から１ｋｂ離れた３’側にジフテリア毒素−Ａ遺伝子を配置する。次いで、前記ベクターを直鎖状にし、Ｅ１４ＥＳ細胞１×１０^７個に電気穿孔法で導入する。その後、Ｇ４１８を含む培養液の中で相同的組換えを起こしたＥＳクローンを選択し（ＰＣＲまたはサザン法で確認）、該ＥＳクローンをＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に注入した後、仮親マウスの子宮に移植する。この仮親マウスから生まれたキメラマウスを更にＣ５７ＢＬ／６マウスと交配することによって、生殖細胞系に伝達したＩＬ−２ＲγＫＯヘテロマウスを得ることができる。
あるいは、既に確立されているインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子（ＩＬ−２Ｒγ）ノックアウトマウス系統を直接入手して用いてもよく、こうしたマウス系統として、例えば、ＩＬ−２ＲγＫＯマウス系統（菅村和男教授［東北大学医学部生体防御学講座・免疫分野］より作出されたインターロイキン２受容体γ鎖（ＩＬ−２Ｒγ）ノックアウトマウス（Ｏｈｂｏ　Ｋ，Ｓｕｄａ　Ｔ，Ｈａｓｈｉｙａｍａ　Ｍら、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ｗｉｔｈ　ａ　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｇａｍｍａ　ｃｈａｉｎ．Ｂｌｏｏｄ　１９９６；８７（３）：９５６−６７））がある。尚、ＩＬ−２ＲγＫＯマウスは、作出者である菅原教授の委嘱によって、現在は本出願人ら（（財）実験動物中央研究所）の胚保存バンクの中で保存されており、必要に応じていつでも凍結胚または融解復元マウスとして提供することができる。
さらに、ＡのマウスへのＢのマウスの戻し交配は、上記と同様に、当業者に公知の手法、例えば、上述の戻し交配に従い、すなわちＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスとＩＬ−２ＲγＫＯマウスとを交配し、そのＦ１マウスをＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスに戻し交配することにより実施できる。
また、本発明のマウスは、上記本発明の方法により作出されたマウスであることを特徴とする。本発明のマウスをＮＯＧマウス（ＮＯＧマウス；ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，γｃ　ｎｕｌｌマウス；ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγｃｈａｉｎ−／−マウス；ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒ（γｃ）^ｎｕｌｌマウスなど）と称する。
本発明のマウスは、機能的なＴ細胞およびＢ細胞を共に欠失し、マクロファージ機能が減退し、ＮＫ細胞またはＮＫ活性を消失している重度の免疫不全マウスである。このため、本発明のマウスに異種細胞（例えば、ヒト末梢血単核球）を移入した場合、抗ＮＫ抗体処理を施した従来の免疫不全マウスと比較してもさらに高率の生着・増殖が認められる（後述の実施例１を参照されたい）。また、本発明のマウスは樹状細胞の機能も不全であり、サイトカインの産生も著しく減退している。従って、本発明のマウスは従来の免疫不全マウスと比較して最も優れた異種細胞生着性を有しており、このマウスに生着する様々な移入異種細胞（幹細胞、分化細胞および癌細胞を含む）の解析に有効であると考えられる。さらに、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１や癌の病態モデルマウスの確立、ヒト型抗体の作製に利用することも可能である。
以下、本発明のマウスの用途について述べる。用いるマウスは、通常８〜１２週齢のものが好ましいが、限定はされない。
２．本発明のマウスを用いたヒト幹細胞アッセイ系の確立
本発明のマウスを用いて、ヒト幹細胞の分化、増殖に関与する因子、機構の検討を行うためのヒト幹細胞アッセイ系を確立することができる。また、ヒト幹細胞アッセイ系を用いることにより種々の治療薬の探索も可能になる。
ヒト幹細胞アッセイ系の確立は、本発明のマウスに、ヒト幹細胞を移入することにより行うことができる。ここで、幹細胞とは造血幹細胞の他、神経幹細胞等の造血系由来ではない幹細胞も含む。ヒト幹細胞は、抗体によって同定される特異的なエピトープ部位と関連する細胞表面マーカーの存在によって同定され、例えばヒト骨髄、臍帯血、末梢血等からＣＤ３４陽性細胞として単離することができる。
幹細胞を生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の細胞および生体に影響を与えない溶液に懸濁させて、１×１０^４〜１×１０^６細胞をマウスの静脈内に投与することにより移植することができる。
移植後、数週間後に細胞を移植したマウスの末梢血、脾臓、骨髄、胸腺等の各臓器から細胞を回収し、その表面抗原を例えばＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ）を用いて調べることにより移植した細胞の分化を調べることができる。この際指標となる細胞表面の抗原マーカーとしては、幹細胞に関連するものとしてＣＤ３４、Ｔ細胞に関連するものとしてＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８等、Ｂ細胞に関連するものとしてＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０等、Ｂ１ａ細胞に関連するものとしてＣＤ５等、骨髄系細胞に関連するものとしてＣＤ３３等、樹状細胞に関連するものとしてＣＤ１１ｃ等、リンパ球全体に関連するものとしてＣＤ４５等、マクロファージに関連するものとしてＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ等、ＮＫ細胞に関連するものとしてＣＤ５６等、形質細胞に関連するものとしてＣＤ３８等、血小板に関連するものとしてＣＤ４１等、赤血球に関連するものとしてグリコフォリンＡ等が挙げられ、必要に応じて各種の関連マーカーを選択することができる。
また、回収した細胞からのインターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦａ等のサイトカインの産生をＥＬＩＳＡ等により測定することによっても、幹細胞の分化を調べることができる。
さらに、本発明のマウスを用いれば、ヒト幹細胞の継代移植が可能であり、すなわち自己複製可能な真のヒト幹細胞を得ることができる。具体的には、本発明のマウスにヒト幹細胞を移植し、数週間後にマウス骨髄から未分化のヒト幹細胞を回収し、さらに回収した該幹細胞を本発明のマウスに移植する。この移植および回収を繰り返すことにより、他の細胞の混入のない純度の高いヒト幹細胞を大量に得ることができる。継代移植により、少なくとも純度９９％以上、好適には９９．７％以上のヒト幹細胞を得ることができる。従来のマウスにおいては、２次移植までしか可能でなかったが、本発明のマウスでは２回を超える継代移植も可能となった。
本発明のマウスを用いて得られたヒト幹細胞を、白血病等の治療のためにヒトに移植することが可能であるし、またヒト幹細胞に外来遺伝子を導入し、本発明のマウスに移植して、増殖させることによりヒト幹細胞を標的とした遺伝子治療に用いることもできる。幹細胞への遺伝子導入は、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて可能である。ここで用いる遺伝子として例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症患者に対してＡＤＡ遺伝子等が挙げられる。これらの遺伝子をヒト幹細胞に導入した後に、本発明のマウスに移植し、増殖・純化し患者に投与することにより遺伝子治療が可能になる。
３．本発明のマウスを用いたヒト抗体の産生
本発明のマウスを用いて、ヒト抗体を産生するヒト株化細胞およびヒト抗体を得ることができる。本発明のマウスに上述のヒト幹細胞を移植して、Ｔ細胞、Ｂ細胞等の免疫担当細胞を分化・増殖させるか、あるいはマウスにヒトＴ細胞、Ｂ細胞等の免疫担当細胞を移植してマウス体内に生着させることにより、ヒト抗体を産生し得るヒト免疫担当細胞を保持したマウスを得ることができる。ヒト幹細胞を移植した場合、６〜８週間でＴ細胞およびＢ細胞の分化・増殖が認められ、ヒト抗体の産生が可能になる。
ヒトのＴ細胞およびＢ細胞を生着・保持したマウスに抗原を投与することにより該抗原に対するヒト抗体および該抗体を産生する細胞を得ることができる。本発明のマウスへの抗原投与は、通常マウスに免疫を行うときと同様の方法で行えばよい。
ヒト抗体産生細胞は、マウスの各臓器、特に脾臓、リンパ節等から回収することができる。ヒト抗体産生細胞の割合が多い場合は回収細胞をそのまま株化に用いることができるが、割合が小さい場合は、適宜抗ヒトＢ細胞抗体を用いたアフィニティーカラム法等で精製すればよい。また、混入しているマウス細胞を抗マウス抗体および補体を用いた細胞溶解法等により除去しておくのが望ましい。
このようにして得られたヒト抗体産生細胞をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）による形質転換法、適当な増殖生細胞と融合することによる細胞融合法等により株化し、抗体を産生しつつ長期継代が可能なヒト抗体産生株化細胞を得ることができる。
４．腫瘍病態モデルマウスの作出
本発明のマウス中でヒト腫瘍を生着・増殖させることも可能であり、本発明のマウスに腫瘍細胞を移植することにより、ヒト腫瘍の動物モデルを得ることができる。例えば、ヒト腫瘍細胞を投与することによりマウス体内で増殖し、ヒト腫瘍を有するマウスを得ることができる。この際用いる細胞として、従来のヌードマウスでのヒト腫瘍継代株、ＥＤ−４０５１５（−）、ＭＴ−１、ＴＬ−０ｍｌ等のＨＴＬＶ−１白血病由来細胞株等が挙げられる。また、ヒトの腫瘍組織を数ｍｍの大きさに切り刻んでその癌組織片を直接、本発明のマウスに移植して生着させてもよい。この際、腫瘍細胞、組織を移植するマウスの部位は限られず、細胞の場合はマウスの腹腔内、静脈内または皮下に移植し、組織の場合はマウスの皮下に移植することができる。皮下は臀部皮下等マウスのどの部分の皮下でもよいが、切開することなく腫瘍を確認することができるという点で、耳介皮下や背部皮下へ移植することが望ましい。また、抗癌剤の臨床効果を反映した結果を得ようとする場は、同所移植（大腸癌細胞の場合は大腸に移植する）が望ましい。細胞を移植した場合、数週間から数ヶ月で腫瘍が形成され、特にＨＴＬＶ−１細胞を耳介後部皮下に移植した場合、２週間で腫瘍が形成され、実用的な腫瘍モデルマウスを迅速に作出することができる。
さらに、本発明のマウスに腫瘍を移植した場合、白血化等の腫瘍細胞の転移も認められ、腫瘍の転移のモデル動物として利用することもできる。
このようにして得られたヒト腫瘍モデルマウスを用いて、抗癌剤、癌転移抑制剤等のスクリーニングを行うことができる。この方法としては、腫瘍を形成したマウスに、経口、経皮等の適当な方法で候補薬剤を投与し、腫瘍の大きさ、転移巣の数・大きさ、マウスの生死等を観察することにより薬剤の効果を判定することができる。
５．ウイルス感染症病態モデルマウスの作出
本発明のマウスを用いてウイルス感染症病態モデルマウスを得ることができる。すなわち、本発明のマウスにヒトウイルスが感染しうる細胞を移植し該ウイルスを感染させることにより、あるいはウイルスの感染した細胞を移植することにより、ウイルス感染細胞を体内に生着・保持したウイルス感染症病態モデル動物を得ることができる。
従来のマウスでは、マクロファージに感染するＭトロピック（Ｍ−ｔｒｏｐｉｃ）ウイルスのみの増殖が可能であったが、本発明のマウスを用いてＴ細胞に感染するＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１等のＴトロピック（Ｔ−ｔｒｏｐｉｃ）ウイルスの増殖も可能になった。
例えば、１×１０^７〜１×１０^８のヒト末梢血単核細胞を本発明のマウス腹腔内に投与し、数日後に数百〜数千ＴＣＩＤ_５０のＨＩＶを接種することにより、ヒト細胞にＨＩＶが感染したＨＩＶ感染モデルマウスを得ることができる。ＨＩＶの感染は、ｐ２４陽性細胞等のＨＩＶ抗原の発現を指標に検出することができる。
ＨＩＶの代わりに、ＨＴＬＶ−１を接種させることにより、ＨＴＬＶ−１感染モデルマウスを得ることができる。
本発明により得られた病態モデル動物を用いて、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１等のｉｎ　ｖｉｖｏにおける増殖機構の研究を行うことができ、またウイルス感染治療法の開発、ウイルス感染治療剤のスクリーニング等を行うことができる。
６．ＮＯＧマウスを用いた異種細胞生着性の向上したマウスの作出
本発明のＮＯＧマウスを用いて、より異種細胞生着性の向上したマウスを作出することができる。例えば、本発明のＮＯＧマウスにマウスの免疫系に関与する遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配することにより得ることができる。免疫系に関与する遺伝子として、例えばサイトカイン受容体遺伝子、サイトカイン遺伝子等がある。
また、ヒト細胞の分化、増殖に関与するヒトサイトカイン遺伝子等（例えば、ｈＧＭ−ＣＳＦやｈＳＣＦ等）を導入することによってもより異種細胞生着性の向上したマウスを作出することができる。例えば、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：７３８０−７３８４，１９８０の方法等に従って、上記遺伝子をマウスの前核期受精卵に注入し、この導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによってヒトサイトカイン遺伝子等を発現するマウスを作出し、これと本発明のＮＯＧマウスを交配することによりする異種細胞生着性の向上したマウスを作出することができる。
発明を実施するための最良の形態
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１　ＮＫ活性を消失かつ、樹状細胞機能を減退させた免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）の作製、該マウスにおける異種細胞生着性の検討および該マウスを用いたヒト幹細胞のアッセイ系の確立
（１）　ＮＫ活性を消失かつ、樹状細胞機能を減退させた免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）の作製
ＮＫ活性を消失させた多機能免疫不全マウスを得るために、（財）実験動物中央研究所で維持しているＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（日本クレア　Ｋ．Ｋ．からも入手可）（８週齢）に、菅村和夫教授（東北大学医学部生体防御学講座・免疫分野）より譲渡されたインターロイキン２受容体γ鎖ノックアウトマウス（ＩＬ−２ＲγＫＯマウス）（８週齢）を戻し交配することによって、ＩＬ−２Ｒγ変異遺伝子を導入したＦ１マウスを作製した。Ｆ１マウスでの変異ＩＬ−２Ｒγ鎖遺伝子の導入は、該遺伝子をＰＣＲで増幅して検出することにより確認した。具体的には、まずＦ１マウスの眼底より採取した血液１００μＬからＤＮＡ自動抽出機（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ、ＴＯＹＯＢＯ社製）によりＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ１．５μＬに、２３．５μＬの１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．４ｍＭ　ｄＮＴＰおよび２５ｐｍｏｌの２セットのプライマー（野生型の判定には下記プライマーＰＩとＰＩＩＩのセット、変異型を判定するには同ＰＩとＰＩＩのセットを用いた）を含むＰＣＲ緩衝液を添加し、ＩＬ−２Ｒγ鎖遺伝子の野生型と変異型とを判定するＰＣＲを下記増幅条件下で行った。
（プライマー）

（ＰＣＲ増幅条件）
９４℃で５分の加熱処理後、９４℃で１分，５５℃で１分，７２℃で１分を１サイクルとして３０〜３５サイクル実施し、その後７２℃で１０分加熱した。
上記ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中で電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後に検出される発色バンドのサイズで判定した。野生型では約６６０ｂｐ、変異型では約３５０ｂｐのサイズのバンドが認められた。
（戻し交配）
次に、この変異ＩＬ−２Ｒγ遺伝子を導入したＦ１マウスをＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスと交配することによりＦ２マウスを得た。さらにＦ２マウスでの変異ＩＬ−２Ｒγ鎖遺伝子の導入を上記同様に検出し、かつ血清中の免疫グロブリンを単純免疫拡散法により検出することにより、変異ＩＬ−２Ｒγ鎖遺伝子を有し、かつｓｃｉｄ遺伝子がホモであるマウス個体を選別した。その後、上記マウス個体をＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスに掛け合わせて、得られた産仔のうち変異ＩＬ−２Ｒγ鎖遺伝子を有するものをさらにＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスと交配した。
以上の戻し交配を少なくとも９回行うことにより、ＮＯＧ（ＮＯＧ）マウスを作出した（概略を図１に示す）。ここで、ＩＬ−２Ｒγ鎖遺伝子はＸ鎖染色体上にあるため、雄マウスにＩＬ−２ＲγＫＯマウスを使用することが有効である。
（２）　ＮＯＧマウスにおける異種細胞生着性の検討
次に、上記交配により得られたＮＯＧマウスと従来の免疫不全マウスであるＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスとを用いて、これらのマウスへの異種細胞生着性に抗ＮＫ抗体処理が与える影響の程度について試験した。
▲１▼（抗ＩＬ−２受容体β鎖モノクローナル抗体）
抗ＩＬ−２受容体β鎖モノクローナル抗体（クローンＴＭβ１）は、大阪大学医学部の宮坂昌之教授により作製され（Ｔａｎａｋａ　Ｔ，Ｔｓｕｄｏ　Ｍ，Ｋａｒａｓｕｙａｍａ　Ｈら、Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ｍｕｒｉｎｅ　ＩＬ−２Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｅｔａ−ｃｈａｉｎ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ　ｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｙｍｐｈｏｉｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ＥＬ−４　ｃｅｌｌｓ．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１９９１；１４７（７）：２２２２−８）、供与されたハイブリドーマから作製した。具体的には、該ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃＡ−ｎｕマウスに腹腔内投与し、その数週間後の腹水より採取した。
この抗体を、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス５匹（８〜１２週齢）、ＮＯＧマウス３匹（８〜１２週齢）に、マウス１匹当たり１ｍｇずつ腹腔内投与した。また、抗体非投与対照として、ＮＯＧマウス４匹（８〜１２週齢）に生理食塩水を投与した。
また、ヒト末梢血リンパ球は、ボランティアより採取した血液より、リンホプレップによる比重遠心法を用いて採取した。
得られたヒト末梢血単核球１×１０^７個を、ＴＭβ１投与後２日目の上記マウスの腹腔内に投与した。
ヒト末梢血単核球の投与から２週間後にマウスを処分し、全腹腔滲出細胞を含む腹水をＲＰＭＩ−１６４０培養液で十分洗浄することにより回収した。全腹腔細胞中の全腹腔滲出細胞をフローサイトメトリーを用いて計測し、その数により、ヒト細胞のマウスへの生着性・増殖性を判定した。抗体非投与対照についても同様の操作を行った。この結果を表１に示す。

表１に示す結果から、ヒト末梢血単核球を移入したＮＯＧマウスでは、従来のＴＭβ１処置マウスと比較して、該抗体処置無しでも極めて高率のヒト細胞が分化、生着、増殖することが明らかとなった。
▲２▼（抗アシアロ−ＧＭ１抗体）
次に、ＮＯＧマウスおよびＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスを用いて、これらのマウスへのヒト臍帯血由来細胞の生着性に抗アシアロ−ＧＭ１抗体（ＡＧＭ１）（ウサギ）（和光純薬工業Ｋ．Ｋ．、０１４−０９８０１）が与える影響の程度について試験した。
先ず、表２に示すように番号付けしたＮＯＧマウス（８〜１２週齢）およびＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（８〜１２週齢）に２．４ＧｙのＸ線を照射した。次に、これらのマウスに、投与直前にマウス１匹当たり２０μＬの抗アシアロ−ＧＭ１抗体を４００μＬのＰＢＳで希釈したものを投与した。また、抗体非投与対照のマウス（表２中、５，６，１０，１１，１５，１６番のマウス）には生理食塩水を腹腔内投与した。
ヒト臍帯血ＣＤ３４陽性細胞は、予め承認を得たボランティアより採取した臍帯血からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ比重遠心により単核球を採取し、さらにＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ−４５０　ＣＤ３４およびＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤ　ＣＤ３４（Ｄｙｎａｌ　Ａｓ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）によって、ＣＤ３４陽性細胞を分離した（Ｕｅｄａ　Ｔ，Ｔｓｕｊｉ　Ｋ，Ｙｏｓｈｉｎｏ　Ｈら、Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ，Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３　ｌｉｇａｎｄ，ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＩＬ−６，ａｎｄ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ＩＬ−６　ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　２０００；１０５（７）：１０１３−２１）。
上記で得られたヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞１×１０^５個を、抗アシアロ−ＧＭ１抗体投与直後にマウスの尾静脈より移入した。
ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞の投与から４週間後にマウスを処分し、末梢血を採取し、単核球中のヒト細胞（ＣＤ４５＋）および全血中のヒト血小板（ＣＤ４１＋）をフローサイトメトリーを用いて計測し、その数により、ヒト細胞のマウスへの生着性・増殖性を判定した。抗体非投与対象についても同様の操作を行った。この結果を表２に示す。

表２に示す結果から、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を移入したＮＯＧマウスでは、従来の抗アシアロ−ＧＭ１抗体処置マウスと比較して、該抗体処置無しでも極めて高率のヒト細胞が分化、生着、増殖することが明らかとなった。
（３）　ＮＯＧマウスを用いたヒト幹細胞のアッセイ系の確立
マウスは、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスおよび本発明のＮＯＧマウスを用いた。ヒト臍帯血（ＣＢ）から採取したＣＤ３４陽性細胞の１×１０^５細胞を２．４Ｇｙの放射線照射した上述のマウスに移植した。
末梢血、骨髄、脾臓および胸腺中のヒト細胞をＦＡＣＳで解析した。移植８週間後の末梢血中のＣＤ４５陽性細胞の比率は、ＮＯＧマウスでは３７％で、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスでは７％であった。骨髄ではそれぞれ６５％および２０％であった。高率なキメリズムに加えて、ＮＯＧマウスでは、移植３ヶ月後の末梢血、骨髄、脾臓、胸腺において、ＢおよびＴリンパ球を含む多様な細胞系列への分化が認められた。骨髄では、ヒトＣＤ３３＋骨髄細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ４１ａ＋巨大核細胞およびグリコフォリンＡ＋赤血球が認められた。さらに、興味深いことに、胸腺で認められたヒトＴ細胞は少なかったが、脾臓ではＣＤ４＋／ＣＤ８−Ｔ細胞、ＣＤ４−／ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞が認められた。このことは、ヒト造血幹細胞は胸腺以外の場所で成熟Ｔ細胞へ分化増殖することを示している。
予め同意を得た正常妊娠の母の健康な新生児の出生時に臍帯血を得た。臍帯血はヘパリン化して保存し、採取より２４時間以内に以下の操作により処理し、移植実験に使用した。
ＣＤ３４陽性細胞純化は以下のようにして行った。ヘパリン化した臍帯血はリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）に５％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）を混ぜた緩衝液にて２倍希釈した後、Ｆｉｃｏｌｌを用いて単核球を分離した。分離した単核球はＤｙｎａｌ社のＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ−４５０　ＣＤ３４を用いてＣＤ３４陽性細胞に純化した。方法はＤｙｎａｌ社の指示通りであるが、概説すると２％ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ）とクエン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を用いて単核球を４×１０^７／ｍＬの濃度に調整した。よく懸濁したＤｙｎａｂｅａｄｓ　ＣＤ３４を単核球浮遊液１ｍＬあたり１００μＬ加え、氷上で３０分間、混和しながら反応させた。細胞とロゼットを形成したＢｅａｄｓは磁石を用いて回収した。続いてロゼットを形成しているＢｅａｄｓにＤｅｔａｃｈａｂｅａｄ（商標）ＣＤ３４を必要量加え３７℃で混和しながら１５分反応させた。ＣＤ３４陽性細胞はＢｅａｄｓから遊離するため、磁石を用いてＢｅａｄｓのみを除去し、ＣＤ３４陽性細胞を得た。
移植にはＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｆｒｅｅ）の環境下で飼育された８〜１２週齢のＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス、ＮＯＧマウスおよびＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスを用いた。これらのマウスは京都大学医学部動物実験施設にて施設の規約に則って飼育された。
前２者の比較の実験ではそれぞれ１．２Ｇｙのガンマ線（ガンマセル^１３７Ｃｓ）を２回照射し、マウス１匹につき１０万個のＣＤ３４陽性細胞を尾静脈より移植した。ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスについては移植直前と移植後１１日おきに腹腔内に抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬）を２００μｇ投与した。
ＮＯＧマウスとＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスの比較実験では、上記と同様に両者に１．２Ｇｙのガンマ線を２回照射したのちＣＤ３４陽性細胞４万個もしくは１万個を尾静脈から移植した。
移植後のマウスには飲料水に硫酸ネオマシン７３２ｍｇ／Ｌを加えて、感染を防御した。
マウスは示された時期にエーテル麻酔の上、眼窩静脈叢より末梢血を採血してヒト血球陽性率をフローサイトメトリーを用いて測定した。フローサイトメトリーは広く行われている一般的方法によるが、概説すると、採血した血液は直ちにＥＤＴＡ−２Ｎａに十分混和し、解析まで室温に放置した。全血の５０〜１００μＬに至適量の抗体を加え、４℃で３０分間反応させた後、ＦＡＣＳ溶解液（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて溶血、固定し、ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて測定した。骨髄、脾臓の場合は頸椎脱臼にてマウスを処分したのち大腿骨、脾臓を取り出し、５％ウシ胎児血清を含む培養液中にそれぞれ、骨髄、脾細胞を遊離させ、細胞浮遊液として、後は末梢血とほぼ同様に処理し、フローサイトメトリー法によって解析した。
解析に用いた抗体は、抗ヒトＣＤ４５ＦＩＴＣ抗体、抗ヒトＣＤ１０ＰＥ抗体、抗ヒトＣＤ３３ＰＥ抗体、抗ヒトＣＤ３ＰＥ抗体、抗ヒトＣＤ３４ＰＥ抗体、抗ヒトＣＤ４１ＰＥ抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、抗ヒトＣＤ３８ＰＣ５抗体、抗ヒトＣＤ５６ＰＣ５抗体、抗ヒトＣＤ１９ＰＣ５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、抗マウスＣＤ４５ＡＰＣ、抗マウスＣＤ４１ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）であった。
マウス末梢血中におけるヒトＣＤ４５陽性細胞とヒトＣＤ４１陽性細胞の比率（％）と絶対数（／μＬ）の推移を４週おきに１２週まで調べた（図２Ａおよび図２Ｂ）。図２Ａおよび図２Ｂに示すとおり、ＮＯＧマウスにおいて、有意な高い比率と絶対数が認められた。移植１２週以降でマウスを処分し、骨髄、脾臓で同様にヒトＣＤ４５陽性細胞の比率を調べたところＮＯＧマウスで非常に高い陽性率を示した（図３）。
ＮＯＧマウスとＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスの比較実験ではマウス末梢血中におけるヒトＣＤ４５陽性細胞の陽性率を調べた（図４）。図４に示すように、ＮＯＧマウスにおいてＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスより高いヒト細胞陽性率を示し、ヒト細胞の生着性に優れていた。
実施例２　ＮＯＧマウスのＮＫ活性およびサイトカイン産生における樹状細胞の機能不全の検討
本発明のＮＯＧマウス（１０〜１２週齢）の雌３匹、ＮＯＤ／ＳｈｉマウスにＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスを戻し交配して得られたＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（１０〜１２週齢）の雌４匹および雄４匹、ならびにＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウス（または、ｎｕｌｌβ２ｍ（ｎｕｌｌ）ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ＳＣＩＤ、β２ｍミクログロブリン欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスとも称する；Ｊａｃｋｓｏｎ研究所のＤｒ．Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．らにより作製「Ｋｏｌｌｅｔ　Ｏ，Ｐｅｌｅｄ　Ａ，Ｂｙｋ　Ｔら、ｂｅｔａ２　ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ（β２ｍ（ｎｕｌｌ））ＮＯＤ／ＳＨＩ−ＳＣＩＤ　ｍｉｃｅ　ａｒｅ　ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ　ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ　２０００；９５（１０）：３１０２−５」）（１０〜１２週齢）の雌２匹および雄２匹を用いて以下の検討を行った。
ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスに抗アシアロＧＭ１抗体（αＡＧＭ）で処置後、脾細胞を採取した。得られた細胞を２つに分け、１つをマグネティックセルソーター（Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ、ＭＡＣＳ）を用い、ＣＤ１１ｃ抗原陽性細胞（樹状細胞として考える）を除去した。同様に無処置ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスおよびＮＯＧマウスより、脾細胞を回収した。これら細胞の少量をとって、ＦＡＣＳ解析に供した。さらに、この４種の細胞を第Ｉ群：ＮＯＧマウス（３匹）；第ＩＩ群：αＡＧＭ無処置ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（雄２匹）、αＡＧＭ処置ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（３匹）およびαＡＧＭ処置後、さらにＣＤ１１ｃを除去したＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（３匹）；第ＩＩＩ群．ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウス（４匹）の３群に分け、細胞を１×１０^７／ｍｌ　ｉｎ　ＲＰＭＩ−１６４０に調整しその１００μｌをウェルに入れ、等量のリステリアモノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ＬＭ）抗原で刺激して培養した（Ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで実施した）。ＬＭは１０^１１Ｕｎｉｔｓ／ｍＬであるので、使用時にＲＰＭＩ−１６４０で２×１０^７Ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるように希釈して用いた。この際、ＬＭ不添加のものを対照として用いた。２４時間後に上清採取、ＥＬＩＳＡでＩＦＮ−γなどのサイトカイン量を測定した。
脾細胞におけるサブクラス（特にＣＤ１１ｃ，ＣＤ１１ｂ）をＦＡＣＳで解析した。
Ｔ細胞マーカーとしてＦＩＴＣ標識ＣＤ３、ＮＫ細胞マーカーとしてビオチン標識Ｐａｎ　ＮＫ（ＤＸ５）、マクロファージおよび樹状細胞マーカーとして、ＦＩＴＣ標識ＣＤ１１ｃ、ＰＥ標識ＣＤ１１ｂを用いた。
また、ＮＯＧ、Ｃ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄ、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄおよびＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウス（１０〜１２週齢）でのＮＫ活性を、^５１Ｃｒ標識ＮＫ感受性ＹＡＣ−１細胞を標的とした細胞障害性試験で検討した。すなわち、マウスより脾細胞を単離し、^５１Ｃｒ標識ＹＡＣ−１細胞と種々の比率で混合培養した。３７℃、５％ＣＯ_２下で４時間培養後、上清中の放射能活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。ＮＫ活性は下記の算定法で示される。
％特異的細胞障害性＝（特異的放射能活性−自然放射能活性）／（最大放射能活性−自然放射能活性）×１００。
図５Ａおよび図５Ｂに各種系統マウスより得られた脾細胞のＦＡＣＳパターンを示す。
ＮＫ細胞は、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄおよびＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスで検出された。しかし、抗アシアロＧＭ１抗体無処置ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスおよびＮＯＧマウスでは全く検出できなかった。また、樹状細胞マーカーであるＣＤ１１ｃ陽性細胞は極めて高率にこれら全てのマウスから検出された。抗アシアロＧＭ１抗体無処置ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス脾細胞からの磁気ビーズによるＣＤ１１ｃ陽性細胞の除去はほぼ完全であることが確認された。
図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃに上記脾細胞のＬＭ刺激下でのサイトカインの産生量をＥＬＩＳＡで検出した結果を示している。抗アシアロＧＭ１抗体無処置ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄおよびＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスではＩＦＮγの産生が認められるに係わらず、ＮＯＧマウスでは全く検出できないこと、抗アシアロＧＭ１抗体無処置ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスからＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去することによって、ＮＯＧマウスと同様にＩＦＮγの産生が認められなくなることが分かった。
図７に各種系統マウスより得られた脾細胞のＮＫ活性を示す。
Ｃ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスと比較して、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスではＮＫ活性の減退が認められたが、ＮＯＧマウスとＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスではＮＫ活性は全く認められなかった。
以上のことから、ＮＯＧマウスおよびＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスでは、ＮＫ活性が全く消失していることが明らかとなった。しかし、ＦＡＣＳ解析の結果から、ＮＯＧマウスでは　ＮＫ細胞が消失しているが、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスではＮＫ細胞は存在するが、ＮＫ活性が消失していることが明らかとなった。
また、ＮＯＧマウスで認められる脾細胞サイトカイン産生の減退には樹状細胞の機能不全が原因であることが明らかとなった。一方で、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスでは、そのＦＡＣＳおよびサイトカイン産生パターンは抗アシアロＧＭ１抗体無処置ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスとほぼ同等であることが示唆され、このマウスではＮＫ細胞が消失しており、樹状細胞は正常であることが明らかであった。
実施例３　ＮＯＧマウスを用いたヒト幹細胞の継代移植
遺伝子導入ヒト幹細胞の自己複製能を検討するためにＮＯＧマウスに臍帯血幹細胞を移植し、２次、３次移植の不可を検討した。
妊婦の同意と承諾の上で臍帯血を得て実験に使用した。臍帯血からＣＤ３４陽性細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，１．０７７±０．００１ｇ／ｍｌ；Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて単核細胞を分離後ＣＤ３４陽性細胞分離カラム（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｌｏｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて純化した。ＣＤ３４陽性細胞の純度は９６±３％であった。
レンチウィルスベクターｐＣＳ−ＣＧはＣＭＰプロモーターによりＧＦＰ遺伝子が発現するベクターであり、三好博士（筑波大学医学部免疫学）より供与された。ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）をそれぞれ５０ｎｇ／ｍＬ含む無血清培地ＳｔｅｍＰｒｏ　ＴＭ−３４ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）にて臍帯血ＣＤ３４陽性細胞を２４時間培養後、組み換えレンチウィルスＣＳ−ＣＧをＭＯＩ３０で５時間感染させた（Ｋａｗａｄａ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７：９０４−９１５，１９９９）。その後細胞を洗浄し、マウス骨髄ストローマ細胞ＨＥＳＳ−５存在下に同様の無血清培地中で５日間体外増幅培養を行った（Ｏｋｉ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｉｎｐｒｅｓｓ．２００１）。
７週齢のＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスに３Ｇｙ照射後、３×１０^５個の培養により増幅させた遺伝子導入細胞を尾静脈より移入した。６週後にマウス骨髄細胞の表面抗原を解析し、１×１０^７細胞を照射ＮＯＧマウスに移植した（２次移植）。６週後に同様の解析をおこない１×１０^７細胞を照射ＮＯＧマウスに移植した（３次移植）。さらに、６週後に同様の解析を行った。
表面抗原の解析はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて行った。使用した抗体はＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４５（Ｔ−２００）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ２（３９Ｃ１．５）、ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４（ＳＫ３）、ＣＤ１４（ＬｅｕＭ３）、ＣＤ１９（４Ｇ７）、ＣＤ２０（２Ｈ７）、ＣＤ３３（ＷＭ５３）、ＣＤ４１（Ｐ２）、ＣＤ５６（Ｎ９０１）およびグリコフォリン（ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ　Ａ）（ＫＣ１６）であり、いずれもＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎより購入した。
ＣＤ３４陽性細胞への遺伝子導入効率は４０±５％（ｎ＝５）であった。１次、２次、３次移植マウス骨髄細胞をヒトＣＤ４５で染色したＦＡＣＳの結果を図８に示す。いずれのマウスにも遺伝子導入ヒト細胞の存在が認められる。
本発明のＮＯＧマウスを宿主として利用することにより世界で初めて３次宿主まで移植可能な造血幹細胞に発現可能な遺伝子導入に成功した。従来のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスを利用した場合には２次移植までしか可能ではなかった点（Ｇｕｅｎｅｃｈｅａ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２，７５−８２，２００１）より、本マウスは造血幹細胞のアッセイ系としてより感度が高く有用であることが示された。
実施例４　ＮＯＧマウスによる完全ヒト型抗体の産生
ＮＯＧマウス（８週齢）は２．５Ｇｙ、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（８週齢）は３．５Ｇｙの照射をした後、ヒト臍帯血（妊婦の同意と承諾の上で、東海大学細胞移植研究センターより供与）よりマグネットビーズで精製したＣＤ３４＋細胞〜１×１０^６を静脈内に移植した。具体的には、臍帯血よりＭＮＣをＦｉｃｏｌｌを用いて分離した後、ＣＤ３４＋細胞をＭＡＣＳ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｌｏｄａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により単離した。ＣＤ３４＋細胞はＦＡＣＳにより９７％以上の純度であることを確認した後、移植に用いた。
経時的に眼窩採血し、ＭＮＣ分画をＦｉｃｏｌｌにより得た後、蛍光標識したＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ３抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で染色し、ヒトリンパ球の再構成をＣＤ４５により、Ｂ細胞、Ｔ細胞の割合をそれぞれ蛍光標識したＣＤ１９、ＣＤ３により、ＦＡＣＳで確認した。
また、これらのマウスより胸腺、脾臓を摘出し、細胞を調製した後、細胞数を計測し、各種蛍光抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で染色して、上記の再構成確認と同様、ＦＡＣＳにより解析した。
これらのマウスに、移植後６週ないし８週から抗原を投与した。抗原としてはＤＮＰ−ＫＬＨを用いた。１００μｇ／匹のＤＮＰ−ＫＬＨを水酸化アルミニュウム（ＡＬＵＭ）をアジュバントとして腹腔内に免疫した。２週間ごとに同様の免疫を行い、血清を採取してＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。
この際の、ＥＬＩＳＡは以下のようにして行った。
９６ｗｅｌｌプレートを、抗ヒトＩＧｓ（ＩＣＮ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｈｉｏ）またはＤＮＰ−ＫＬＨでコーティングした後、３％ＢＳＡでブロッキングし、洗浄した後、希釈した抗血清を添加した。２時間室温で反応させた後、洗浄し、ビオチン化抗ヒトＩｇＭまたは抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（Ｐｈｅｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を添加した。３７℃２時間反応させた後、洗浄し、アビジン化パーオキシダーゼを添加し、室温１時間反応させた。プレートを洗浄した後、ＴＭＢペルオキシダーゼＥＩＡ基質キット溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）を添加し、室温３０分反応させた後、１０％ＨＣｌで反応停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。Ｉｇ濃度は標準曲線より算出した。
（１）臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の移植と再構成の効率
ＮＯＧマウスの臍帯血幹細胞移植後のヒトＣＤ４５＋細胞の割合については、４週以降、漸次末梢血ではヒトＣＤ４５の割合が減少しつつあるが、１２週以降に突然Ｔ細胞の増加の割合が高くなり、これに伴ってヒトＣＤ４５の割合も増加したものが観察された（表３）。いままでＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ末梢血においては、このようなＴ細胞の増加によるＣＤ４５＋の割合の増加は一度も観察されなかった。このＮＯＧマウスは、１４週まで一度もＧＶＨＤを発症しなかった。

（２）　ＮＯＧマウスにおけるＴ細胞分化について
Ａ．　胸腺内Ｔ細胞分化について
図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａおよび図１０Ｂに胸腺内のＴ細胞分化パターンを示した。図に示すように、このマウスにおいて胸腺内でＣＤ３陽性細胞が分化し、これらの細胞は通常の胸腺あるいはｈｕ／ｍ−ＲＴＯＣによって検出されたものと同様に、ＣＤ４／ＣＤ８　ＤＮ（Ｄｏｕｂｌｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ）、ＤＰ（Ｄｏｕｂｌｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、ＳＰ（Ｓｉｎｇｌｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を含み、移植後１１ないし１３週ですでにその一部がＣＤ１ａ−ｌｏｗＴ細胞にまで成熟していることが示された。胸腺細胞数は１〜２×１０^６と、通常のマウス胸腺細胞数の約１／１００であった。この現象は、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄにおいても観察されたが、その頻度は著しく低く、８／２８（２８．６％）であったのに対し、ＮＯＧマウスでは、７／７（１００％）であった。
Ｂ．　末梢のＴ細胞について
図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２Ａ、図１２Ｂ、図１３Ａおよび図１３Ｂに、さらに脾臓細胞あるいは末梢血中のＴ細胞について解析したものを示す。胸腺内でＴ細胞分化が観察されたマウスにおいて、末梢でもＣＤ３陽性細胞が観察された。これらはＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞群であり、胸腺内で分化したものを含む可能性が示唆された。
（３）　ＮＯＧマウスにおけるＢ細胞分化について
Ａ．　Ｂ細胞サブセット分化について
また、図１４Ａおよび図１４Ｂに、骨髄細胞中のＢ細胞が、ＣＤ５を発現する割合について示した。骨髄中では、ＣＤ５陽性のいわゆるＢ１ａ細胞の分化は亢進しておらず、ＣＤ１９陽性、ＩｇＭ陽性の細胞群が優勢であった。また、これらのＩｇＭ　ｈｉｇｈの細胞群は、ＣＤ２０を発現していた。このマウス骨髄でのヒトＢ細胞の分化については、特に異常は検出されなかった。この現象はＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスにおけるＢ細胞分化においても観察されることであり、共通の性質と考えられる。
Ｂ．　末梢のＢ細胞について
図１３Ａおよび図１３Ｂに、末梢でのＢ細胞のＦＡＣＳパターンを示した。Ｂ細胞の割合はＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄと殆ど変わらなかった。しかしながら、脾臓においてはＣＤ５陽性のいわゆるＢ細胞の亜群であるＢ１ａ細胞が優勢であり、骨髄の分化パターンと大きな差が検出された。しかし、ＩｇＭ陽性ＣＤ５陰性の細胞群も２０％程度検出されており、Ｂ１ａ細胞のみが検出されているわけではないことが確認された。
（４）　ＮＯＧマウスにおける抗体産生能について
このマウスに、抗原としてＤＮＰ−ＫＬＨを投与し、経時的にＩｇＭおよびＩｇＧ抗体産生量を測定した。その結果、抗原非特異的ＩｇＭおよびＩｇＧ抗原特異的ＩｇＭが３回の繰返し投与により検出された。Ｔ細胞が胸線及び末梢で検出されたにもかかわらず、抗原特異的ＩｇＧ産生は検出されなかった（図１５Ａ、図１５Ｂおよび図１５Ｃ）。図１５Ａ、図１５Ｂおよび図１５Ｃには、骨髄（ＢＭ）（図１５Ｂ）、末梢血（ＰＢＳＣ）（図１５Ｃ）由来ＣＤ３４＋細胞移植マウスの結果も同時に示した。これらでは、特異的ＩｇＭおよび特異性と無関係なＩｇＧ産生が臍帯血と比較して低い傾向が見られた。
以上の結果より、このマウスは、ヒトＴ細胞及びＢ細胞を分化させ、ヒト型抗体産生系に用いるのに有用であることが示された。
実施例５　新生物増殖系
ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスおよびＮＯＧマウスおよびＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕマウス（クレアより入手）およびＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄマウス（クレアより入手）を用いた。総てのマウスは５週齢以上のものを用いた。
マウスに移植する細胞として、移植ヒト腫瘍細胞株、ＬＭ−２−ＪＣＫを用いた。ＬＭ−２−ＪＣＫは、１３歳の女性患者のリンパ芽球リンパ腫から確立し、ヌードマウスへの継代異種移植で維持されている細胞株である。ＬＭ−２ＪＣＫは、Ｔ細胞抗原ＣＤ４およびＣＤ５を発現するが、抗体も含め他の細胞抗原を発現しないことが報告されている。
異種移植アッセイのための固形腫瘍はヌードマウスの皮下で１２代継代したものを用いた。腫瘍をＦ−１０栄養補足培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）中にハサミを用いて細切後、ピペットで十分分散させた後、ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液を得た。懸濁液中の生細胞の濃度はトリパンブルー（ＧＩＢＯ　ＢＲＬ）染色により算定した。遠心後、腫瘍細胞を１×１０^７および１×１０^６生細胞／ｍｌの濃度で生理食塩水に分散させた。腫瘍細胞分散液をマウスの両脇腹皮下に２５ゲージの針を付けた１ｍＬシリンジを用いて０．１ｍＬ注入した。腫瘍細胞の注入後、１週間毎に腫瘍の大きさと体重を測定した。１×１０^６を移植し、腫瘍が大きくなった移植後２１日目に、マウスを処分して腫瘍の重量およびサイズを測定した。
異なるバックグラウンドのマウスのＬＭ−２−ＪＣＫの移植性の違いを表４に記した。

１×１０^６の移植では、ＮＯＧマウスとＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスにおいてすべての腫瘍が生着した、一方Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄでの生着率は８０％であった。
これらの系統での腫瘍の生着率は１×１０^５移植のとき減少し、とくにＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄではすべてのマウスで腫瘍増殖が観察されなかった。
１×１０^６移植時の腫瘍の増殖曲線を図１６に示した。
ＮＯＧマウスの腫瘍増殖は他の２系統に比べ勝っていた。
ＮＯＧマウスにおける２１日めの平均腫瘍体積は、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスとＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄの同日の平均腫瘍体積のそれぞれ２．８９倍と３．９７倍であり、Ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定において有意な差がみられた（ｐ＜０．００１）。
ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスに生着した腫瘍の２１日めの平均体積とＣ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄに生着した腫瘍の同日の平均体積との間には有意差は認められなかった。
実施例６　ＮＯＧマウスを用いたＨＩＶ感染モデル系の確立
ＮＯＧマウスを用いたＨＩＶ感染モデル系の確立を種々のＨＩＶ株を用いて検討した。代表例を以下に示す。
マウスとしては、ＮＯＧマウスを用いた。比較のためＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスとＮＯＤ／Ｓｈｉマウスの両ミュータントマウスの戻し交配により以前作製されたＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスも用いた。
使用したＨＩＶ−１はエイズ脳症の前頭葉組織より分離されＤＮＡクローン化されたマクロファージとＴ細胞に感染性を有するＪＲＦＬウイルスである。さらに、ｅｎｖ　Ｖ３領域をこのＪＲＦＬウイルス、ｇｐ４１の下流にＧＦＰ遺伝子を挿入したＧＦＰ−ＨＩＶ−１を用いた。
（１）ヒト単核球細胞を移植したマウスの（ｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＧマウス）の作製
ＮＯＧマウスに直接マウス当たり１×１０^７個の実験使用の同意と承諾を得た正常人の末梢血ヒト単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ（ＰＢＬ））を腹腔内接種した。比較にＩＬ−２Ｒγ鎖が正常なＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスに同じドナーからのＰＢＬを腹腔内接種した。
（２）マウスへのＨＩＶ−１の感染
ＰＢＬ接種後６日目にマウスに１，０００ＴＣＩＤ_５０のウイルスを腹腔内に接種した。ウイルス感染後２週目にマウスを処分し、腹腔滲出細胞を含む腹水を回収し、その中のヒト細胞数をＦＡＣＳにて算出した。また、脾臓を摘出し、パラフォルムアルデヒドで固定後パラフィン包埋切片を作製した。
（３）病理学的解析
脾臓組織切片をＨＥ染色し、さらに、ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原に対する抗体を用いて免疫染色を行った。免疫組織染色は、従来報告されているＡＢＣ法に加え、ＥＰＯＳ法、Ｅｎｖｉｓｉｏｎｔ法を用いた。
ｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＧマウスにおけるヒト細胞の定着を評価した。
表５に一連の検討の結果を示す。

ヒト末梢血を移植したマウスの脾臓にヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞ならびにＣＤ８陽性Ｔ細胞がそれぞれ脾臓中心動脈周辺に定着されることを見出した。ヒトＣＤ３陽性細胞数は明らかにＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスよりＮＯＧマウスにおけるヒト細胞数は明らかに多かった。ＦＡＣＳによる測定では腹水中のヒトＣＤ４陽性細胞は平均１×１０^７個以上であった。
一方、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスではＣＤ４陽性細胞はほとんど検出されず、ＣＤ８陽性細胞がほとんどであった。前述の実施例においてはＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスにＮＫ細胞の分化を抑制するマウスＩＬ−２レセプターβ鎖に対する抗体（ＴＭβ−１）（マウス当り０．５ｍｇ）をヒトＰＢＬの接種３日前に腹腔に注射したが、本実施例においては行なわなかった。抗体の処理を行なったマウスは多くのＣＤ４ならびにＣＤ８陽性のヒト細胞が定着することを別の実験にて確認している。しかし、この抗体処理を行なったＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスからのヒト細胞数よりもＮＯＧマウスからのヒト細胞数が３から４倍は明らかに多かった。
ＨＩＶ感染マウスにおいてはＨＩＶ抗原であるｐ２４陽性細胞が脾動脈周囲に検出された。さらにＧＦＰを発現するＨＩＶ感染マウスにおいては明らかにＧＦＰ発現細胞が脾臓ならびに腹水中に検出された。ウイルス感染細胞数は明らかにＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスにおけるそれより多かった。
実施例７　ＮＯＧマウスを用いたＨＴＬＶ−１感染モデル系の確立
ＮＯＧマウスに、ＨＴＬＶ−１白血病由来細胞株であるＭＴ−２細胞をマウスあたり２×１０^７細胞移植した。
移植後４週目に、リンパ腫瘍形成マウスの数を数え（表６）、リンパ腫瘍マウスにＨＴＬＶ遺伝子が感染しているか否かをサザンブロット法とＰＣＲ法にて確認した。プロウイルス数は病理学的検索の結果、明らかに皮膚内リンパ腫と後腹腔内両側性のリンパ腫瘍さらに、腫瘍の大きなマウスは胃周辺リンパ節に転移と胸膜内に癌細胞が浸潤していた。また、末梢血にＨＴＬＶ陽性細胞が増えていた。このことは、典型的白血病となっていることを示す。さらに、肺間質内にも浸潤しているのが認められた。これらの細胞はすべてＴａｘタンパク質を発現していた。但し、脳内には浸潤していなかった。

実施例８　新生物細胞の移入による白血病化およびＮＯＧマウスを用いたＨＴＬＶ−１陽性細胞などの可移植性の検討
ＮＯＧマウスに各種のＨＴＬＶ−１細胞株の移植、腫瘍形成実験を行い、その有用性について検討した。
３例のＨＴＬＶ−１白血病由来細胞株［Ｌ＝Ｌｅｕｋｅｍｉｃ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ：ＥＤ−４０５１５（−），ＭＴ−１　ａｎｄ　ＴＬ−０ｍｌ］、６例のＨＴＬＶ−１感染細胞株［ＩＴ＝Ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ：ＳＬＢ−１，Ｍ８１１６，ＨＵＴ−１０２，ＭＴ−２，ＭＴ−４　ａｎｄ　ＴＹ９−３１ＭＴ］１０^７−８個／０．５ｍＬをＮＯＧマウスおよびＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスの左耳介後部皮下に、一部では臀部皮下に移植し、マウス内の腫瘍の大きさ、組織像、白血化の有無を経時的に比較検討し、ＮＦｋＢなどの転写因子、Ｔａｘタンパクの増減との関係についても解析した。
ＨＴＬＶ−１白血病由来細胞株［Ｌ］の全例及び例外的にＨＴＬＶ−１感染細胞株［ＩＴ］のＳＬＢ−１は２週間以内に２４×１７×１１ｍｍ大の腫瘍を形成したのに対し、ＩＴの６例中５例はせいぜい１０×１０×７ｍｍにとどまり、Ｍ８１１６やＴＹ９−３１ＭＴではほとんど腫瘤を形成しなかった（表７）。

この腫瘍形成性細胞株の例では末梢血中の白血病細胞の出現及び臓器浸潤の度合いは比較的高いが、非腫瘍形成性細胞の例のなかにはそれ以上のものもあり（例えばＨＵＴ−１０２、ＭＴ−２など）、腫瘍形成性と末梢血中の白血病細胞の出現及び臓器浸潤の程度とは必ずしも相関しなかった（表８）。

腫瘍形成性のＥＤ−４０５１５（−）１０^７をＮＯＧマウスおよびＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスの左耳介後部皮下に移植して２週間目の腫瘍形成性を比較したところ、ＮＯＧマウスでは２２×１７×１０ｍｍ大の腫瘤を形成したのに反し、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄではほとんど腫瘤を形成せず、ＮＯＧマウスでの易腫瘍形成性が明らかになった（表９）。

ＮＯＧマウスでの易腫瘍形成性がＴ細胞系のみならず、Ｂ細胞系でも同様であるかどうかを調べる目的で、ＥＢＥＲ（ＥＢＶ−Ｅｎｃｏｄｅｄ　Ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ）およびベクターだけを形質転換したＢＪＡＢ細胞７×１０^７個をＮＯＧマウスの左耳介後部皮下に移植して３週間目の腫瘍形成性を比較した。ＢＪＡＢ−ＥＢＥＲでは対照であるＢＪＡＢ−ＶＥＣＴＯＲに比較し、有意に大きな腫瘤を形成した（２６×１８×７／１３×１８×３ｍｍ）。その大きさは前例のＥＤ−４０５１５（−）の場合の腫瘤に匹敵した（表１０）。

ＮＯＧマウスにおけるＥＤ−４０５１５（−）１０^７による効率的な腫瘤形成性は腫瘍細胞のＣＸＣＲ４を介する、腫瘍血管の活発な新生によるものであれば、内皮細胞にあるそのリガンドであるＳＤＦ−１の競合剤（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ）であるＫＲＨ−１６３６を持続投与しておけば、腫瘤形成が抑制されることが期待された。しかしＥＤ−４０５１５（−）及び出血を伴う（組織学的にはアンジオトロピック（ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｃ）な）ＳＬＢ−１の場合、ＫＲＨ−１６３６を毎日腹腔内投与したに関わらず、非投与群と変わらない２５×１８×１２ｍｍ及び２０×１０×１８ｍｍの大きさの腫瘤を形成した（表１１）。

ＥＤ−４０５１５（−）及びＳＬＢ−１のｉｎ　ｖｉｔｒｏの培養細胞のサイトスピン標本と、ｉｎ　ｖｉｖｏの腫瘤形成細胞の凍結切片標本を用いて、酵素抗体法によるＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＳＤＦ−１免疫染色の態度を比較検討した。ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ−１ではいずれもほぼ同様に陽性で、ＣＣＲ５はいずれも陰性だった。ＣＤ８はｉｎ　ｖｉｔｒｏでは陰性であったが、ｉｎ　ｖｉｖｏでは陽性であった（表１２）。

ＥＤ−４０５１５（−）のｉｎ　ｖｉｔｒｏの培養細胞とｉｎ　ｖｉｖｏの腫瘤形成細胞を用いて、Ｔａｘ、ＣＸＣＲ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌのウエスタンブロット分析をおこなった。Ｔａｘはいずれも陰性であったが、ＣＸＣＲ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌはいずれも陽性であり、その強さに有意の差はみとめられなかった（表１３）。

ＥＤ−４０５１５（−）のｉｎ　ｖｉｔｒｏの培養細胞とｉｎ　ｖｉｖｏの腫瘤形成細胞を用いてＮＦｋＢの転写因子活性を電気泳動移動度シフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｓｈｉｆｔ　ａｓｓａｙ（ＥＭＳＡ））で検討したが、両者に差をみとめなかった（表１４）。

ＮＯＧマウスの耳介後部皮下に移植する系において、以下の事項が認められた。
１）ＮＯＧマウスでは、接種後１５日という、今まで考えられなかった極めて短期間内に大きな腫瘤形成を確実に確認できた。それに反しＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（ＩＬ−２Ｒγｃｈａｉｎ^＋／＋）では全く腫瘤を形成しなかった。
２）ＮＯＧマウスでは、遺伝的にＮＫ細胞が欠損することが明らかにされており、したがって、Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄやＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウス（ＩＬ−２Ｒγｃｈａｉｎ^＋／＋）の場合に必須とされる抗ＮＫ細胞に対するモノクローナル抗体などの前処置を必要としなかった。
３）耳介後部皮下に移植することにより、すなわち腹腔内よりも解剖学的にもＮＫ細胞がさらに少ないとされる部位を選択したことになり、腫瘤の形成を容易にするとともに、その結果、切開するまでもなく外観より腫瘍の大きさを容易に確認できた。
４）内山ら（Ｉｍａｄａ　Ｋ，Ｔａｋａｏｒｉ−Ｋｏｎｄｏ　Ａ，Ａｋａｇｉ　Ｔ，Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ　Ｋ，Ｓｕｇａｍｕｒａ　Ｋ，Ｈａｔｔｏｒｉ　Ｔ，Ｙａｍａｂｅ　Ｈ，Ｏｋｕｍａ　Ｍ，Ｕｃｈｉｙａｍａ　Ｔ：Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　Ｉ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｉｎ　ｓｅｖｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｉｎ　ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ　８６：２３５０−７．，１９９５，Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｔ：Ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　Ｉ（ＨＴＬＶ−Ｉ）ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５：１５−３７，１９９７）が腫瘤形成しないとしたＭＴ−１、Ｔ−２、ＴＬ−０ｍｌでもそれほど大きくはないものの腫瘤を形成した。
従ってＮＯＧマウスの耳介後部皮下に移植する系は画期的な腫瘍移植系であり、さらにＴ細胞系腫瘍のみならずＢ細胞腫瘍でも同様であることが明らかになった。すなわち、この系ががん細胞やヒト正常リンパ組織の移植にとっても有用な移植系であることを示している。
さらに実験動物モデルのない、あるいはあっても実用に供するのに困難な場合、このＮＯＧマウスにヒトの細胞、組織を移植してヒト疾患モデルを構築することにより、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験にのみ頼らざるを得なかった疾患の研究を、よりヒトのｉｎ　ｖｉｖｏに限りなく肉迫した実験系で実験できることになり、疾患の成立機序の解明、治療法の開発等にこのマウスは多大な貢献をすると考えられる。例えばＨＩＶ−１感染では強力なＨＡＡＲＴ療法に関わらず、ウイルス血症（ｖｉｒｅｍｉａ）のリバウンド（ｒｅｂｏｕｎｄ）や変異ウイルス出現が最重要課題であり、その感染性ウイルスのリザーバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）はリンパ濾胞のＦＤＣ（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ、濾胞樹状細胞）とされており、この研究のためには、ヒトリンパ濾胞を含むリンパ組織の移植をしたヒト型モデルマウスを構築することが不可欠であり、それにはこのＮＯＧマウスが有用である。
さらに、この系の易腫瘍形成性の要因について、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける培養細胞と比して、移植された細胞ではどんな因子が増加、あるいは活性化されているかを検討した。今回使用した細胞株はすべてＩＬ−２非依存性であり、ＩＬ−２産生性、さらにＴａｘ、ＣＸＣＲ４−ＳＤＦ−１系は直接関係していないことがあきらかになった。しかしそのほかの因子については検索した限りｉｎ　ｖｉｔｒｏの培養細胞とｉｎ　ｖｉｖｏの腫瘤構成細胞との比較で有意の差を認めるものはなかった。
産業上の利用可能性
本発明により、従来免疫不全マウスとして知られていたＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスやＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスに比較して、異種細胞、特にヒトの細胞の生着に適したＮＯＧマウスの作出方法、および該方法により作出されるマウスが提供される。このようにして得られたマウスにヒト幹細胞を移植することによりヒト幹細胞アッセイ系を確立することができる。また、ヒトの免疫担当細胞を移植することにより、本発明のマウスを用いてヒト抗体を作成することができる。さらに、ヒト腫瘍を移植・生着させることによりヒト腫瘍モデルマウスを作出することができ、腫瘍の治療方法、治療剤のスクリーニング等に利用することができる。さらにまた、ＨＩＶまたはＨＴＬＶ１に感染したヒトリンパ球が生着したＨＩＶまたはＨＴＬＶ−１感染モデルマウスを作出することができＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−１等のｉｎ　ｖｉｖｏにおける増殖機構の研究を行うことができ、またウイルス感染治療法の開発、ウイルス感染治療剤のスクリーニング等を行うことができる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、ＮＯＧマウスを作出するための戻し交配の概略を示す。
図２は、ＣＤ３４陽性細胞を移植したＮＯＧマウスでのマウス末梢血におけるヒトＣＤ４５陽性細胞とヒトＣＤ４１陽性細胞の移入後の経時的な推移を示す。
図３は、ＣＤ３４陽性細胞を移植したＮＯＧマウスでの骨髄、脾臓でのＣＤ４５陽性細胞の比率を示す。
図４は、ＮＯＧマウスとβ２　ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウス）の比較実験においてのマウス末梢血中のＣＤ４５陽性細胞の比率を示す。
図５は、各種系統マウスより得られた脾細胞でのＮＫ細胞および樹状細胞のＦＡＣＳパターンを示す。
図６は、各種系統マウスより得られた脾細胞のリステリア・モノサイトジェネス抗原刺激下でのサイトカインの産生量をＥＬＩＳＡで検出した結果を示す。
図７は、ＮＯＧおよびＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ，β２ｍ　ｎｕｌｌマウスにおけるＮＫ活性の消失を示す。
図８は、ヒトＣＤ３４陽性細胞の１次、２次および３次移植マウスの骨髄細胞をヒトＣＤ４５で染色したＦＡＣＳの結果を示す。
図９は、ヒトＣＤ３４陽性細胞を移入したＮＯＧマウス胸腺でのヒト細胞の生着と分化を示す。
図１０は、ヒトＣＤ３４陽性細胞を移入したＮＯＧマウス胸腺でのヒト細胞の生着と分化を示す。
図１１は、ヒトＣＤ３４陽性細胞を移入したＮＯＧマウス脾臓でのヒト細胞の生着と分化を示す。
図１２は、ヒトＣＤ３４陽性細胞を移入したＮＯＧマウス脾臓でのヒト細胞の生着と分化を示す。
図１３は、ヒトＣＤ３４陽性細胞を移入したＮＯＧマウス末梢血でのヒト細胞の生着と分化を示す。
図１４は、ヒトＣＤ３４陽性細胞を移入したＮＯＧマウス骨髄でのヒト細胞の生着と分化を示す。
図１５は、ＮＯＧマウスにおけるヒト抗体産生能を示す。
図１６は、各系統マウスにＬＭ−２−ＪＣＫ移植した後の腫瘍形成を示す。

Claims (28)

1. 以下のＡのマウスにＢのマウスを戻し交配することを特徴とする、異種細胞の生着に適したマウスの作出方法；
   Ａ：ＮＯＤ／ＳｈｉマウスにＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスを戻し交配することにより得られるマウス、
   Ｂ：インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウス。
2. ＡのマウスがＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄマウスである、請求項１記載のマウスの作出方法。
3. ＢのマウスがＩＬ−２ＲγＫＯマウスである、請求項１または２記載のマウスの作出方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のマウスの作出方法により作出されたマウス。
5. 機能的なＴ細胞およびＢ細胞を共に欠失し、マクロファージ機能が減退し、ＮＫ細胞またはＮＫ活性を消失し、かつ樹状細胞機能が減退しており、優れた異種細胞生着性を有していることを特徴とする、ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ＲγＫＯ）マウス。
6. 移植したヒト幹細胞が、排除されることなく効率よく分化、増殖する請求項４または５記載のＮＯＧマウス。
7. 請求項４〜６のいずれか１項記載のマウスにヒト幹細胞を移植し、分化・増殖する細胞を解析することを含む、幹細胞アッセイ方法。
8. Ｔ細胞およびＢ細胞の分化・増殖を解析する、請求項７記載の幹細胞アッセイ方法。
9. 請求項４〜６のいずれか１項記載のマウスにヒト幹細胞を移植し増殖させた後に、該マウスの骨髄からヒト幹細胞を回収しさらに、請求項４〜６のいずれか１項記載のマウスに移植することを繰り返し行うことを含むヒト幹細胞を増殖させる方法。
10. 繰り返しが少なくとも３回である請求項９記載のヒト幹細胞を増殖させる方法。
11. 請求項９または１０記載の方法で得られた純度が９９．７％以上のヒト幹細胞。
12. ヒト幹細胞が外来遺伝子を導入したものである、請求項９または１０記載の方法。
13. ヒトＴ細胞およびＢ細胞を安定に保持し、ヒト抗体を産生することが可能な、請求項４〜６のいずれか１項記載のマウス。
14. ヒトＴ細胞およびＢ細胞を保持する、請求項４〜６のいずれか１項記載のマウスを抗原で免疫することを含む、ヒト抗体の産生方法。
15. ヒトＴ細胞およびＢ細胞を保持する、請求項４〜６のいずれか１項記載のマウスを抗原で免疫した後に該マウスから該抗原に対する抗体産生細胞を回収し、株化することを含む、ヒト抗体を産生する抗体産生細胞株を製造する方法。
16. ヒト腫瘍細胞を保持した請求項４〜６のいずれか１項記載のマウスである、ヒト腫瘍モデルマウス。
17. ヒト腫瘍細胞がＨＴＬＶ−１白血病由来細胞である、請求項１６記載のヒト腫瘍モデルマウス。
18. ヒト腫瘍細胞を耳介に保持した、請求項１６または１７記載のヒト腫瘍モデルマウス。
19. 請求項１６〜１８のいずれか１項記載のマウスを用いて抗癌剤をスクリーニングする方法。
20. 請求項４〜６のいずれか１項記載のマウスにヒト腫瘍細胞を移植することを含む、ヒト腫瘍モデルマウスを作出する方法。
21. ヒト腫瘍細胞がＨＴＬＶ−１白血病由来細胞である、請求項１６記載の方法。
22. ヒト腫瘍細胞をマウスの耳介に移植する、請求項２０または２１記載の方法。
23. マクロファージトロピックなウイルスばかりでなく、Ｔトロピック（Ｔ細胞親和性）なウイルスに感染したＴ細胞を保持した請求項４〜６のいずれか１項記載のマウスである、ウイルス感染モデルマウス。
24. ウイルスがＨＩＶである、請求項２３記載のウイルス感染モデルマウス。
25. ウイルスがＨＴＬＶ−１である、請求項２３記載のウイルス感染モデルマウス。
26. 請求項２３〜２５記載のマウスを用いて抗ウイルス剤をスクリーニングする方法。
27. 請求項３〜６記載のマウスを用いて、ＮＯＧマウスよりも異種細胞の生着性が向上した免疫不全マウスを作出する方法。
28. ＮＯＧマウスよりも異種細胞の生着性が向上した免疫不全マウスを作出するための、請求項３〜６記載のマウス。

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