WO2016189799A1 - ヒトｉｌ－１５分泌免疫不全マウス - Google Patents

ヒトｉｌ－１５分泌免疫不全マウス Download PDF

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hil
mice
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伊藤　守
いくみ 片野
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Definitions

  • the present invention is capable of secreting human IL-15, and h (human: human) CD56 + cells are detected in vivo for a long time after transplantation of human NK cells derived from human peripheral blood.
  • the present invention relates to an immunodeficient mouse in which a DNA consisting of the base sequence shown in is inserted into genomic DNA.
  • Humanized immunodeficient mice that can analyze human cells and human tissues in vivo can be used not only as research tools for drug discovery, but also as a basis for in vivo human cell differentiation and functional analysis by transplanting human cells. As a useful tool for conducting research, it is considered to be an experimental animal that can be expected to contribute to medical care, and for many years, attempts have been made to create more useful humanized immunodeficient mice.
  • NOD mice As a female individual who was strongly positive for polyuria and urinary glucose was discovered in a cataract mouse, and its symptoms resemble those of human type 1 diabetes (insulin-dependent diabetes).
  • NOD mice named Diabetes were established by Makino (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • Makino see, for example, Non-Patent Document 2.
  • NOD / scid mice capable of engrafting human cells exceeding that of the SCID mouse was created.
  • NOD / scid mice there was a decrease in complement activity, macrophage function, natural killer (NK) cell activity, etc. derived from the NOD strain, and even when transplanted with human hematopoietic stem cells, it was not rejected. Problems such as not being high and short life of the mouse were pointed out.
  • NOG mice A mouse obtained by knocking out the interleukin 2 receptor ⁇ chain gene is backcrossed to a mouse obtained by backcrossing a B-17-scid mouse, thereby deleting both functional T cells and B cells, NOD / SCID / ⁇ c null mice (also simply referred to as “NOG mice”), which have reduced macrophage function, lost NK cells or NK activity, and reduced dendritic cell function, and have excellent heterologous cell engraftment (See, for example, Patent Document 1). NOG mice have much higher engraftment of human cells and tissues than conventional mice, and transplanted human stem cells can differentiate into mature cells, and more diverse humanized mouse models It is said that it is useful for preparation of (refer nonpatent literature 3).
  • NK cells are a kind of cytotoxic lymphocytes that act as a major factor of innate immunity, can damage tumor cells and virus-infected cells without antigen sensitization, and express surface antigens including CD56. It has the characteristic of being.
  • differentiation efficiency into human NK cells is low when umbilical cord blood-derived hematopoietic stem cells are transplanted, and human NK cells are also transplanted when peripheral blood-derived human mature NK cells are transplanted. It was supposed to be maintained for a short time.
  • An object of the present invention is to provide a mouse capable of examining the function of human NK cells.
  • the present inventors insert a gene region containing DNA encoding the signal peptide of human interleukin 2 (hIL-2) and hIL-2 protein into the genomic DNA of NOD-IL2r ⁇ null mouse and cross it with NOG mouse NOD-scid, IL-2r ⁇ null -hIL-2 Tg mice were prepared by transplanting human cord blood-derived hematopoietic stem cells, so that mature human NK cells positive for hCD56 were obtained in vivo. Although differentiated and proliferated (Katano et al., J. Immunol. February 23, 2015 1401323), when human peripheral blood was transplanted, human NK-like cells that were positive for hCD56 rarely proliferated. Have confirmed.
  • hIL-2 human interleukin 2
  • the hIL-2 signal peptide-hIL-15 fusion is carried out by transfecting a COS cell with DNA containing a sequence encoding the hIL-2 signal peptide upstream of the DNA sequence encoding the hIL-15 protein.
  • the sequence encoding the signal peptide of hIL-15 was compared with the case where hIL-15 protein was produced using DNA containing a sequence placed upstream of the DNA sequence encoding hIL-15.
  • the present inventors have a gene region comprising DNA in which a cDNA sequence encoding interleukin 15 (IL-15) is operably linked to a cDNA sequence encoding a signal peptide of human interleukin 2 (IL-2).
  • IL-15 interleukin 15
  • IL-2r ⁇ null -hIL-15 Tg mouse is prepared by inserting a DNA having a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 into the cDNA of a known immunodeficient mouse, and cord blood-derived human hematopoietic stem cells Was transplanted, it was confirmed that human CD56 + NK cells were differentiated and proliferated, similar to the above results for NOD-scid, IL-2r ⁇ null -hIL-2 Tg mice.
  • the present inventors continued further investigation and transplanted human peripheral blood-derived hCD56 + NK cells into NOD-scid, IL-2r ⁇ null -hIL-15 Tg mice.
  • cells positive for hCD56 were found. The number increased gradually and showed a peak value at a very high concentration of 8000 cells / ⁇ L in the blood of the mouse at 5 weeks after transplantation. Thereafter, although the number of cells positive for hCD56 decreased gradually, at least 6 months after transplantation, a sufficient concentration of hCD56 + cells to study human mature NK cells in vivo was present in the blood of the mice of the present invention. It was confirmed that it was detected.
  • the present invention is as follows.
  • SEQ ID NO: 1 which is capable of secreting human IL-15 and that hCD56 + cells are detected in vivo for a long time after transplantation of human NK cells derived from human peripheral blood
  • An immunodeficient mouse in which a DNA comprising a base sequence is inserted into genomic DNA.
  • hCD56 + [1] wherein the immunodeficient mouse, wherein the cell further HCD16 is hCD56 + hCD16 + cells show positive.
  • hCD56 + cells are used as cell surface molecules as hNKG2A, hNKG2C, hNKG2D, hCD94, hNKp30, hNKp46, hNKp44, hNKp80, hCD57, hCD158a / h (KIR), hCD158b (KIR), hCD158d (KIR), IR8
  • KIR hCD158a / h
  • KIR hCD158b
  • hCD158d KIR8
  • the immunodeficient mouse according to any one of the above [1] to [3], which is a cell positive for KIR) or hCD158f (KIR).
  • the vector prepared in the above step (1) and / or the vector fragment prepared in (1-1) above is injected into a fertilized egg of an interleukin 2 receptor ⁇ chain gene (IL-2R ⁇ ) knockout mouse Producing an injected fertilized egg by: (3) A step of producing a newborn mouse by culturing the injected fertilized egg produced in the step (2); (4) A step of determining whether or not a DNA containing the nucle
  • human peripheral blood-derived NK cells transplanted into the mouse of the present invention can be maintained for a very long time in the mouse, and the function of human NK cells can be analyzed in vivo over a long period of time. .
  • (A) shows the structure of a pCMV ⁇ vector
  • (b) shows the structure of a vector for preparing a fertilized egg injection DNA.
  • the structure of the DNA fragment for fertilized egg injection is shown.
  • the hIL-15 concentration in the plasma of NOG-hIL-15 Tg mice is shown.
  • (a) shows the shows hCD45 + cells mononuclear cells (MNC) in, hCD19 + cells, hCD56 + cells of cells (/ [mu] L), respectively,
  • (b) occupy the mononuclear cells hCD45
  • the cell number (%) of + cells, hCD19 + cells, and hCD56 + cells are shown.
  • the flow cytometry analysis result about the immune cell obtained from the bone marrow, spleen, and peripheral blood of each stem cell transplant mouse is shown. It is the result of having analyzed the expression of a human NK cell specific receptor by the flow cytometry analysis of the human NK cell in a stem cell transplant mouse.
  • the flow cytometry analysis result about the cytotoxic granule secretion ability of a human hematopoietic stem cell origin NK cell is shown, (a) shows the result about GranzymeA and Perforin expression, (b) shows the result about hIFN ⁇ expression.
  • the flow cytometry analysis result of peripheral blood of peripheral blood transplanted hIL-15 mice is shown.
  • mice For peripheral blood transplanted mice, (a) shows the number of hCD56 + cells (%) in mononuclear cells (MNC) and (b) shows the number of CD3 + T cells in mononuclear cells (MNC) ( %).
  • C) shows HCD56 + cell counts in peripheral blood transplantation hIL-15 mice in blood (/ [mu] L), and (d) are, HCD56 + cell count in peripheral blood transplantation non-Tg mice blood (/ [mu] L) Show. 2 is a graph showing the transition of two types of human mature NK cell subspecies in the peripheral blood of peripheral blood transplanted hIL-15 mice. The flow cytometry analysis result about the peripheral blood of frozen peripheral blood hIL-15 mouse
  • mouth is shown.
  • FIG. 2 is a graph showing the transition of two types of human mature NK cell subspecies in the peripheral blood of frozen peripheral blood hIL-15 mice.
  • mouth is shown.
  • mouth is shown.
  • the flow cytometry analysis result about the cytotoxic granule secretion ability of a human peripheral blood origin NK cell is shown, (a) shows the result about GranzymeA and Perforin expression, (b) shows the result about hIFN ⁇ expression.
  • 2 is a graph showing in vivo cytotoxic activity of peripheral blood transplanted hIL-15 mice against subcutaneously transplanted human tumors.
  • the immunodeficient mouse of the present invention is capable of secreting human IL-15, and is capable of maintaining transplanted human NK cells for a long period of time in vivo.
  • DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the human IL-15 is a kind of human cytokine protein produced by human peripheral blood mononuclear cells and is represented by SEQ ID NO: 1 above.
  • the nucleotide sequence is a cDNA encoding human interleukin 2 (hIL-2) signal peptide (hereinafter also referred to as “hIL-2SP cDNA”) and a cDNA encoding interleukin 15 protein (hIL-15) (hereinafter “hIL- HIL-2SP cDNA / hIL-1 operatively linked to each other. It is a nucleotide sequence of the cDNA coupling body.
  • hIL-2SP cDNA human interleukin 2
  • hIL-15 interleukin 15 protein
  • the base shown in SEQ ID NO: 1 is used for genomic DNA extracted from mouse tissue. Examples thereof include a method for confirming by PCR using an appropriate primer set for detecting DNA comprising a sequence, and a method for confirming by Southern blot analysis.
  • an immunological assay using an antibody that specifically recognizes hIL-15 is used as a method for determining whether the immunodeficient mouse of the present invention secretes human IL-15.
  • a method for determining whether human IL-15 is detected in lymph fluid, blood fluids such as serum and plasma, organ extracts and the like can be exemplified.
  • the immunological measurement method include an immunohistochemical staining method, an ELISA method, an EIA method, an RIA method, a method of confirming by Western blot analysis, and the like.
  • an anticoagulant is added to collected mouse peripheral blood, and whether or not human IL-15 is detected in the plasma fraction is determined using a commercially available ELISA kit equipped with anti-hIL-15 antibody A method can be illustrated.
  • Human NK cells derived from human peripheral blood in the present invention include human NK cells contained in human peripheral blood, human NK cells isolated from human peripheral blood, and artificial culture using human peripheral blood.
  • irradiation to destroy the intramedullary environment such as X-rays is performed in order to improve the engraftment ability of the transplanted heterologous cells.
  • a method of transplanting hCD56 + NK cells derived from human peripheral blood can be mentioned, and the intensity of emitted radiation is preferably 1.5 to 3.5 Gy.
  • the time for transplantation is preferably within 24 hours after irradiation.
  • the NK cell transplant number to be transplanted preferably 6 0.2 ⁇ 10 ⁇ 10, preferably 0.5 ⁇ 3 ⁇ 10 6, more preferably be mentioned 10 6 1 ⁇ 2 ⁇ it can.
  • a method for confirming whether or not hCD56 + cells are detected in vivo in the immunodeficient mouse of the present invention known methods can be used. For example, cells in the blood of the immunodeficient mouse of the present invention can be used. Another example is a method for confirming whether or not hCD56 is a positive hCD56 + cell in cells isolated from the blood of the immunodeficient mouse of the present invention by analysis by flow cytometry.
  • hCD56 + cells are present in mononuclear cells at 1% or more, preferably 3% or more, more preferably 5% or more, and even more preferably 10% or more. And hCD56 + cells are present in the blood at least 40 cells / ⁇ L.
  • human CD56 + CD16 + cells and human CD56 + CD16 ⁇ cells are blood and spleen, respectively.
  • human CD56 + CD16 + cells and human CD56 + CD16 ⁇ cells are not detected in the bone marrow.
  • spleen, liver, lung, blood, etc. The detection of hCD56 + cells in the organs / tissues of mice may be expressed as the engraftment of hCD56 + cells.
  • KIR Kitat Immunoglobulin-like Receptor
  • hCD158b KIR
  • hCD158K hIR158K
  • some of the antigens such as hCD158f (KIR) are positive (expressing) cells, and hNKG2A, hNKG2C, hNKG2D, hCD94, hNKp30, hNKp46, hNKp44, hNKp80, h CD57, hCD158a / h (KIR), hCD158b (KIR)
  • hNKp46 which is known as a member of the family, is a positive cell, or that Granzyme A is a positive cell.
  • hCD56 + NK cells isolated from the spleen are used as a method for confirming whether the immunodeficient mouse of the present invention can suppress the growth of a human tumor in vitro after transplantation of human NK cells derived from human peripheral blood.
  • hCD56 + NK cells isolated from the spleen are used. Is cultured in the presence of cytokines and then co-cultured with target human tumor cells, and the culture supernatant is evaluated by the coloration degree by the common enzyme reaction between dead cell-derived cytoplasmic enzyme LDH and the reaction substrate A method for measuring (cytotoxicity (%)) can be exemplified.
  • the cytokine include human IL-2, human IL-15, a mixed composition of human IL-2 and human IL-15, and human IL-15 is preferable.
  • human NK cells derived from human peripheral blood are used. After transplantation, when a NK-sensitive human tumor cell line is further transplanted and the tumor diameter is measured over time, a method for determining whether or not the tumor size is reduced can be mentioned.
  • the long period during which the hCD56 + cells are detected in vivo can include 8 weeks or more, preferably 12 weeks or more, more preferably 16 weeks or more, still more preferably 20 weeks or more, and particularly preferably 24 weeks or more. preferable.
  • NOD-scid, IL-2r ⁇ null -hIL-15 Tg mouse can be preferably exemplified, and the method for producing the immunodeficient mouse of the present invention is not particularly limited, For example, a method for producing the NOD-scid, IL-2r ⁇ null -hIL-15 Tg mouse including the following steps (1) to (7) can be exemplified.
  • the vector prepared in the above step (1) and / or the vector fragment prepared in (1-1) above is injected into a fertilized egg of an interleukin 2 receptor ⁇ chain gene (IL-2R ⁇ ) knockout mouse Producing an injected fertilized egg by: (3) A step of producing a newborn mouse by culturing the injected fertilized egg produced in the step (2); (4) A step of determining whether or not a DNA containing the nucle
  • step (1) the insertion region necessary for inserting DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 into mouse genomic DNA is operable in mouse cells such as cytomegalovirus promoter (pCMV-IE).
  • pCMV-IE cytomegalovirus promoter
  • a region containing a promoter, SV40SS / SA, and SV40 PolyA can be exemplified, and an expression vector containing such an insertion region can be exemplified by pCMV ⁇ .
  • Examples of a method for preparing a mouse fertilized egg-injected DNA preparation vector containing DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 include a method using a known gene recombination technique. Specifically, pCMV An example is a method in which -LacZ is excised with the restriction enzyme NotI and the DNA encoding ⁇ -galactosidase is replaced with DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the method for preparing a DNA fragment for injecting a fertilized egg in the step (1-1) include a method using a known gene recombination technique. Specifically, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used. A method for purifying a vector fragment having a DNA comprising a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a DNA containing an insertion region by cutting out a vector for preparing a mouse fertilized egg injection DNA having a DNA containing the DNA with the restriction enzyme PvuII Can do.
  • the method for producing an injected fertilized egg in step (2) is not particularly limited as long as it can inject the mouse fertilized egg injected DNA preparation vector or the fertilized egg injected DNA fragment into a fertilized egg of a mouse.
  • Examples thereof include a microinjection method, an electroporation method, and a virus vector method.
  • Preferred examples of the interleukin 2 receptor ⁇ chain gene (IL-2R ⁇ ) knockout mouse include NOD-IL-2r ⁇ null mice.
  • the method of culturing the injected fertilized egg in the step (3) is not particularly limited as long as it is a method capable of obtaining a newborn mouse, and the injected fertilized egg was cultured at 37 ° C. for 18 to 24 hours outside the body. Thereafter, a method can be exemplified in which a newborn mouse is obtained by transplanting and implantation into the uterus of a temporary parent and performing a cesarean section just before giving birth. Such a newborn mouse is preferably a newborn mouse by performing a foster child operation.
  • the method for determining whether or not the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is inserted into the genomic DNA in the above-mentioned newborn mouse or offspring mouse is that each mouse is 3-4 weeks of age or older. And a method of confirming whether or not the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 has been inserted into the genomic DNA extracted from the mouse tissue.
  • step (5) a mouse determined to have inserted DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in step (4) into the genomic DNA of NOD-IL-2r ⁇ null mouse secretes hIL-15. Examples of the method for determining whether or not there is the above-mentioned immunological assay using an antibody that specifically recognizes hIL-15.
  • a method for producing a NOD-scid, IL-2r ⁇ null- hIL-15 Tg mouse includes introducing a scid mutation into a mouse selected as the NOD-IL-2r ⁇ null mouse-hIL-15Tg mouse.
  • the method is not particularly limited as long as it can be performed, and specifically includes a method of mating NOD-IL-2r ⁇ null -hIL-15Tg mice with NOG (NOD-scid, IL-2r ⁇ null ) mice. Can do.
  • step (7) NOD-scid, IL-2r ⁇ null -hIL-15 Tg mouse and NOG mouse are crossed by crossing NOD-scid, IL-2r ⁇ null -hIL-15 Tg mouse with NOG mouse. 1: 1 can be obtained.
  • Example 1 [Production of NOD-scid, IL-2r ⁇ null -hIL-15 Tg Mice Producing IL-15] (Overview) The NOD-IL-2r ⁇ null mouse, NOD-scid, IL-2r ⁇ null mouse and the NOD-scid, IL-2r ⁇ null mouse were used in accordance with the guidance approved by the Animal Experiment Committee of the Institute for Experimental Animal Research (hereinafter referred to as “JICA”). (Hereinafter also referred to as “NOG mouse”) was used to produce NOD-scid, IL-2r ⁇ null -hIL-15 Tg mice, which are transgenic mice secreting human IL-15. These mice are specially managed in the SPF breeding room at Jissin laboratory, and can be distributed under certain conditions.
  • JICA Animal Experiment Committee of the Institute for Experimental Animal Research
  • the pCMV-LacZ is excised with the restriction enzyme NotI, and the gene coding for ⁇ -galactosidase is referred to Genbank (accession number: hIL-2 (NM_000586) and hIL-15 (NM_000585 or BC100962). And replaced with the DNA containing the base sequence of the hIL-2SP cDNA / hIL-15 cDNA conjugate determined.
  • pCMV ⁇ was treated with the restriction enzyme NotI, the ⁇ -galactosidase gene sequence portion was removed, and the hIL-2SP cDNA / hIL-15 cDNA conjugate cut out with NotI was inserted therein.
  • the hIL-2SP cDNA / hIL-15 cDNA conjugate was prepared separately.
  • Primer A ATAGCGCCGCTCACAGTAACCTCCAACTCCTGCAA (SEQ ID NO: 2) and PrimerB: ATCACTTAGTTGCACTGTTTGATCGATGTA 4) and Primer D: CAACTAGTTCACTTGTCACCGTCGTCCCTTGTAGTCAAGAGTGTTGATGA (SEQ ID NO: 5) were used to amplify the human hIL-15MP part, and each amplified fragment was inserted into a PCR2.1 vector (registered trademark) (manufactured by Invitrogen).
  • PCR2.1 vector registered trademark
  • the human hIL-2SP part was excised with Not1 and inserted into pCMV ⁇ from which the ⁇ -galactosidase gene sequence part was removed. Thereafter, a region containing the human IL-15 cDNA portion was further excised with SpeI and inserted into the vector.
  • the structure of the constructed vector for preparing a fertilized egg injection DNA is shown in FIG.
  • the above DNA for DNA preparation for fertilized egg injection is excised with the restriction enzyme PvuII, and a vector fragment containing the region necessary for injection into the fertilized egg is purified to prepare a DNA fragment for fertilized egg injection (see FIG. 2) consisting of 1840 bp. did.
  • the sequence of the DNA fragment for fertilized egg injection is shown in SEQ ID NO: 6.
  • Genome analysis Regarding the genomic DNA extracted by the automatic DNA extraction device (manufactured by TOYOBO) from the tissue piece collected from the tip 1-2 mm of the tail of each litter when the litter mouse reaches 3-4 weeks of age, Using the primer set shown below, whether or not the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 was inserted into the genomic DNA of each offspring was confirmed by the PCR method under the following conditions.
  • IL2SPS1 5′-ATAGCGGCCGCTCACATAGAACCTAACTCCCTGCCA-3 ′ (forward primer) (SEQ ID NO: 7)
  • IL15mpAS3 5′-CAACTAGTTCACTTTGTCATCGTCGTCCTGTGTAGCAGAA-3 ′ (reverse primer) (SEQ ID NO: 8)
  • PCR reaction solution A liquid: 2.5 ⁇ L for Ex-taq ⁇ 10 buffer 2 ⁇ L dNTPmix 1.25 ⁇ L IL2SPS1 (5 ⁇ M) 1.25 ⁇ L IL15mpAS3 (5 ⁇ M) 0.125 ⁇ L Ex-taq 6.875 ⁇ L DW B liquid: 8.5 ⁇ L DW 1.5 ⁇ L genomic DNA A liquid and B liquid were mixed and the PCR reaction liquid was prepared.
  • PCR amplification conditions Using 24 ⁇ L of the above PCR reaction solution, heat treatment at 94 ° C. for 3 minutes; 35 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute, and then 72 ° C. The amplification treatment was performed under the conditions of 2 minutes heat treatment.
  • the PCR product obtained by the above PCR was subjected to electrophoresis in a 2% agarose gel, and the presence or absence of an amplification product band around 480 bp was confirmed. It was determined whether the contained DNA was inserted into the genomic DNA.
  • NOD-scid, IL-2r ⁇ null -hIL-15 Tg mouse production of NOD-scid, IL-2r ⁇ null -hIL-15 Tg mouse.
  • NOG mouse NOD-IL 2r ⁇ null -hIL-15 Tg mice
  • NOG-hIL-15 Tg mouse and the NOG mouse were obtained at a ratio of 1: 1 by mating the NOG-hIL-15 Tg mouse with the NOG mouse.
  • NOG mice hereinafter sometimes referred to as “non-Tg mice” are used as negative controls in which the gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is not inserted into the genomic DNA.
  • NOG-hIL-15 Tg mice were examined.
  • Example 2 [Study on NOG-hIL-15 Tg mice] (HIL-15 concentration in plasma) The concentration of hIL-15 in the plasma of NOG-hIL-15 Tg mice was measured. Peripheral blood was collected from an individual mouse 4-6 weeks old under anesthesia using heparin (Novo-heparin, manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.). The hIL-15 concentration in plasma was measured using the ELISA kit. The results are shown in FIG.
  • the plasma hIL-15 concentration in non-Tg mice was 1.3 ⁇ 1.5 pg / mL. Therefore, NOG-hIL-15Tg mice inserted into genomic DNA were significantly more produced than NOG mice, and were produced systemically by the gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 inserted into genomic DNA. It was confirmed that hIL-15 was secreted into the blood.
  • Example 3 [Study of human cell differentiation ability of human cord blood-derived CD34 + hematopoietic stem cell transplantation NOG-hIL-15 Tg mice] (Flow cytometry measurement procedure) The examination using the flow cytometry after Example 3 was performed in the following procedure. It was judged that hCD56 + cells were human NK cells, and analysis was carried out using antibodies suitable for the respective examination items. Specifically, after staining in the dark at 4 ° C. for 30 minutes, the cells were washed with FACS buffer (PBS containing 1% FBS and 0.1% NaN 3 ), and the cells were re-applied with FACS buffer containing propidium iodide. Suspended and then subjected to flow cytometry measurement.
  • FACS buffer PBS containing 1% FBS and 0.1% NaN 3
  • Flow cytometry measurement was performed using a BD FACSCanto TM flow cytometer (manufactured by BD), and the data was analyzed by FACSDiva software (ver. 6.1.3) (manufactured by BD). The absolute value of the cell number was calculated according to the instruction manual using Flow-Count (Beckman Coulter).
  • Anti-hCD3 antibody anti-human CD3-FITC (manufactured by BioLegend) anti-human CD3-PE (manufactured by BioLegend)
  • Anti-hCD16 antibody anti-human CD16-FITC (manufactured by BioLegend)
  • Anti-hCD19 antibody anti-CD19 (manufactured by BioLegend)
  • Anti-hCD33 antibody anti-human CD33-FITC (BD Biosciences)
  • Anti-hCD45 antibody anti-human CD45-allophycocyanin-Cy7 (manufactured by BioLegend)
  • Anti-hCD56 antibody anti-human CD56-PE (manufactured by BioLegend)
  • Anti-hCD57 antibody anti-CD57 (manufactured by BioLegend)
  • Anti-NKG2A antibody anti-human CD159a (NKG2A) -PE (manufactured by Beckman Coulter), Anti-NKG2C
  • Example 4 (Preparation of human umbilical cord blood-derived hCD34 + hematopoietic stem cell transplanted NOG-hIL-15 Tg mice) Human umbilical cord blood-derived hCD34 + hematopoietic stem cells were transplanted into the above 8-12 week old adult NOG-hIL-15 Tg mice.
  • the 2 ⁇ 10 4 cells hCD34 + hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood were transplanted through the tail vein within 24 hours after irradiation, were implanted with human cord blood-derived hCD34 + hematopoietic stem cells
  • NOG- hIL-15 Tg mice (hereinafter also referred to as “stem cell transplanted hIL-15 mice”) were prepared.
  • NOG mice transplanted with human umbilical cord blood-derived hCD34 + hematopoietic stem cells hereinafter also referred to as “stem cell transplanted non-Tg mice” were prepared and used as negative controls.
  • NOG-hIL-2 Tg mice in which interleukin 2 (hIL-2) signal peptide and cDNA have been inserted into genomic DNA, which have been confirmed to selectively differentiate and proliferate in human NK cells, have been introduced.
  • Mice transplanted with human umbilical cord blood-derived hCD34 + hematopoietic stem cells (hereinafter also referred to as “stem cell transplanted hIL-2 mice”) were used as positive controls.
  • Example 5 (Examination of human cell differentiation ability in peripheral blood of umbilical cord blood-derived hIL-15 mice)
  • blood was collected from peripheral blood at 4 weeks after transplantation, hCD56 antigen serving as an index for NK cells, hCD45 antigen serving as an index for leukocytes, and hCD19 antigen serving as an index for B cells.
  • the human leukocyte chimera ratio in mouse blood was analyzed by staining with each specific antibody against hCD3 antigen, which is an indicator of T cells, and then measuring by flow cytometry.
  • FIG. 4 (a) shows the amount of human immune cells (/ ⁇ L) in mononuclear cells (MNC), and FIG. 4 (b) shows the number of cells (%) in mononuclear cells.
  • Example 6 (Examination of human cell differentiation ability in each tissue of stem cell transplanted hIL-15 mice) For the above three test mice transplanted with hCD34 + hematopoietic stem cells, bone marrow, spleen, and peripheral blood were collected 6 weeks after transplantation, human CD56 + NK cells were isolated and stained with each specific antibody, followed by flow cytometry. The human cell differentiation ability in each mouse tissue was analyzed. The results are shown in FIG.
  • NK cells As is clear from FIG. 5, the localization of human NK cells is expressed in hCD56 in the bone marrow (BM), spleen (SPL), and peripheral blood (PB) of stem cell transplanted hIL-15 mice and stem cell transplanted hIL-2 mice. Although it was confirmed in the red frame indicated by the fractions of + and hCD45 + , the localization of human NK cells was hardly confirmed in the stem-cell transplanted non-Tg mice.
  • BM bone marrow
  • SPL spleen
  • PB peripheral blood
  • Human NK cells isolated from the spleens of the stem cell transplanted hIL-15 mice and stem cell transplanted hIL-2 mice are considered to be specific cell surface molecules in the sub-fraction of mature NK cells differentiated in vivo.
  • HCD16 antigen hCD57 antigen expressed in a subset of cells with NK activity in human peripheral blood
  • hNKG2A antigen expressed as an inhibitory receptor expressed on the surface of NK cells
  • active receptor expressed on the surface of NK cells Analysis of human NK cell-specific receptor expression by staining with specific antibodies against hNKG2C antigen, an active receptor expressed on the surface of NK cells, and specific antibodies against hNKG2D antigen expressed on the surface of NK cells did.
  • Japan PB-NK cells human NK cells isolated from the peripheral blood of a Japanese donor who received informed consent
  • the results are shown in FIG.
  • NK cell-specific antigen similar to hCD56 + CD16 ⁇ activated NK cells increased in the blood of patients who received 2-dose therapy, stem cell transplanted hIL-15 mice and stem cell transplanted hIL -2 It was estimated that human hematopoietic stem cell-derived NK cells differentiated in mice had many NK cells activated by hIL-15 or hIL-2 in the mice.
  • Example 8 (Verification of cytotoxic granule secretion ability of human hematopoietic cell-derived NK cells) It was verified whether human NK cells isolated from the spleens of the stem cell transplanted hIL-15 Tg mice and stem cell transplanted hIL-2 Tg mice have the ability to secrete cytotoxic granules / produce cytokines.
  • Example 9 Preparation of human peripheral blood-derived hCD56 + NK cell transplanted NOG-hIL-15 Tg mice
  • Human peripheral blood-derived CD56 + NK cells were transplanted into the above 8-12 week old adult NOG-hIL-15 Tg mice. Irradiated with 2.5 Gy of X-ray, within 1 to 24 hours after irradiation, 1 to 2 ⁇ 10 6 hCD56 + NK cells derived from human peripheral blood were transplanted from the tail vein, and human peripheral blood-derived CD56 + NK cell transplanted NOG ⁇ hIL-15 Tg mice (hereinafter also referred to as “peripheral blood transplanted hIL-15 mice”) were prepared.
  • peripheral blood-derived hCD56 + NK cell transplanted NOG-hIL-2 Tg mice (hereinafter also referred to as “peripheral blood transplanted hIL-2 mice”) were prepared.
  • NOG mice transplanted with human peripheral blood-derived hCD56 + NK cells (hereinafter also referred to as “peripheral blood transplanted non-Tg mice”) were prepared and used as negative controls.
  • Example 10 (Study of peripheral blood cells of peripheral blood transplanted hIL-15 mice) Blood was collected at 3 weeks after transplantation and stained with each specific antibody against mCD45 antigen, hCD3 antigen, hCD16 antigen, hCD45 antigen, and hCD56 antigen, and then measured by flow cytometry to determine the human leukocyte chimera rate in each mouse blood. Analyzed. Patterns for hCD45 antigen-positive fraction that serves as an indicator of human leukocytes (mCD45 is a negative fraction that serves as an indicator for mouse leukocytes), and patterns for hCD56 antigen that serves as an indicator of human NK cells and hCD3 antigen that serves as an indicator of T cells Deployed.
  • the cells were gated on hCD45 + CD56 + NK cells, further developed in a pattern for hCD56 antigen and hCD16 antigen, and the ratio of hCD56 + hCD16 + NK cells was analyzed. In order to confirm the contamination of human T cells, the proportion of hCD45 + hCD3 + T cells was also confirmed. The results are shown in FIG.
  • PBMC represents a mononuclear cell in human peripheral blood derived from a healthy person.
  • CD56 + sorted (pre-transfer) represents hCD56 + NK cells isolated from PBMC before transplantation.
  • After transfer (3w) represents peripheral blood of peripheral blood transplanted hIL-15 mice at 3 weeks after transplantation. In hIL-15 mice transplanted with peripheral blood 3 weeks after transplantation, the CD56 + CD16 + NK cell fraction accounted for the majority (99.7%) in hCD45 + human leukocytes.
  • NK cells in human peripheral blood account for 90% or more in hCD56 + hCD16 + fraction in hCD45 + human leukocytes.
  • the transplanted hCD56 + NK cells survived and proliferated while maintaining the same properties as hCD56 + hCD16 + NK cells similar to those of mononuclear cells in human peripheral blood derived from healthy individuals even after 3 weeks from the transplantation. I was able to judge that.
  • Example 11 Blood was collected over time after transplantation, and the proportion of mononuclear cells occupied by NK cells and T cells was measured.
  • blood is collected from peripheral blood at the time after the transplantation, and each specific antibody against hCD56 antigen serving as an index of NK cells, hCD45 antigen serving as an index of leukocytes, and hCD3 antigen serving as an index of T cells
  • the human leukocyte chimera ratio in mouse blood was analyzed by measuring with flow cytometry after staining with.
  • FIG. 9A shows the number of NK cells (%) in mononuclear cells (MNC)
  • FIG. 9B shows the number of T cells (%) in MNC.
  • FIG. 9 (c) shows the number of NK cells (/ ⁇ L) in the blood of peripheral blood transplanted hIL-15 mice
  • FIG. 9 (d) shows the number of NK cells in the blood of peripheral blood transplanted non-Tg mice (/ ⁇ L). ).
  • NK cells accounted for about 30 to about 46% of mononuclear cells at 2 weeks after transplantation in peripheral blood transplanted hIL-15 mice, and about 10 at 4 weeks. Accounted for about 20% and about 8 to about 15% after 6 weeks.
  • FIG. 9 (b) in the peripheral blood transplanted hIL-2 mice, the increase was only less than 10% at 4 weeks after transplantation. T cells were hardly detected in peripheral blood transplanted hIL-15 mice, whereas peripheral blood transplanted hIL-2 mice accounted for about 18 to about 23% at 3 to 4 weeks after transplantation. In peripheral blood transplanted non-Tg mice, neither NK cells nor T cells were confirmed.
  • NK cells do not proliferate in the blood, and very few T cells mixed in the transplanted cells proliferate.
  • human peripheral blood hIL-15Tg mice the number of human NK cells in the blood gradually increased and increased to 8000 cells / ⁇ L after 4-5 weeks after transplantation. After that, although it gradually decreased, about 40 cells / ⁇ L was confirmed even after 24 weeks from the transplantation (see FIG. 9C).
  • human peripheral blood non-Tg mice the maximum value was confirmed at about 40 cells / uL at 2 weeks after transplantation, and almost no proliferation was observed (see FIG. 9 (d)).
  • Example 12 (Examination of transition of human mature NK cell subspecies) Human NK cells are known to have a subpopulation specialized for cytotoxicity occupying the hCD56 + hCD16 + fraction and a subpopulation specialized for the ability to produce cytokines occupying the hCD56 + hCD16 ⁇ fraction. It has been. To confirm in which fraction human mature NK cells transplanted into peripheral blood transplanted hIL-15 mice proliferated, the sub-population variation over time was analyzed. The results are shown in FIG.
  • the hCD56 + hCD16 + fraction maintained approximately 90% or more from the first week to the eighth week after transplantation.
  • the hCD56 + hCD16 ⁇ fraction accounted for about 11% at 1 week after transplantation, but gradually decreased thereafter. Therefore, it was confirmed that in the peripheral blood of peripheral blood transplanted hIL-15 mice, a subpopulation specialized for cytotoxicity showing an hCD56 + hCD16 + fraction grew.
  • Example 13 [Preparation of frozen peripheral blood hIL-15 mice]
  • the human peripheral blood-derived hCD56 + frozen NK cells were thawed and transplanted into the 8-12 week old adult NOG-hIL-15 Tg mice.
  • 1 to 2 ⁇ 10 6 human peripheral blood-derived CD56 + NK cells that had been irradiated with 2.5 Gy X-rays and thawed 24 hours after irradiation were transplanted from the tail vein, and human peripheral blood-derived CD56 + frozen NK cells Transplanted NOG-hIL-15 Tg mice (hereinafter also referred to as “frozen peripheral blood hIL-15 mice”) were prepared.
  • Example 14 (Examination of human cell differentiation ability in the peripheral blood of frozen peripheral blood hIL-15 mice) The frozen peripheral blood hIL-15 mice were collected over time after transplantation, stained with each specific antibody, and then measured by flow cytometry to analyze the human leukocyte chimera rate in the mouse blood.
  • Patterns for hCD45 antigen-positive fraction that serves as an indicator of human leukocytes mCD45 is a negative fraction that serves as an indicator for mouse leukocytes
  • patterns for hCD56 antigen that serves as an indicator of human NK cells and hCD3 antigen that serves as an indicator of T cells And a pattern for human hCD56 antigen and hCD16 antigen, and the ratio of human CD56 + NK cells and human CD56 + CD16 + NK cells was analyzed.
  • the proportion of hCD45 + hCD3 + T cells was also confirmed. The results are shown in FIG. 11 and FIG.
  • Example 15 Investigation of human cells in each tissue of peripheral blood transplanted hIL-15 mice.
  • Peripheral blood transplanted hIL-15 mice were subjected to euthanasia treatment by whole blood collection under anesthesia 6 weeks after transplantation, and then bone marrow, spleen, liver and lung were collected to prepare cells.
  • Humanized cells in each mouse tissue were analyzed by staining with each specific antibody followed by flow cytometry. The results are shown in FIG.
  • hNKp46 + which is a member of the natural cytotoxicity receptor (NCR) family that induces cytotoxic activity of NK cells, which is one of NK cell markers.
  • Example 16 (Expression analysis of specific cell surface molecules of human NK cells) For peripheral blood transplanted hIL-15 mice, human NK cells isolated from the spleen at 8 weeks after transplantation were analyzed for the expression of the same specific cell surface molecules as mature NK cells in human tissues. .
  • hNKG2A, hNKG2C, hNKG2D, hCD94, hNKp30, hNKp46, hNKp44, hNKp80, hCD57, hCD158a / h (Killer Immunoglobulin) are known as specific cell surface molecules of mature NK cells in human tissues.
  • -like Receptor: KIR), hCD158b (KIR), hCD158d (KIR), hCD158e (KIR), hCD158f (KIR) expression of each antigen was confirmed.
  • human NK cells proliferated in peripheral blood transplanted hIL-15 mice have almost the same NK cell surface molecule expression pattern as the results of mature NK cells differentiated in human body (data not shown). It was.
  • Example 17 (Verification of cytotoxic granule secretion ability of human peripheral blood-derived NK cells) It was verified whether human NK cells isolated from the spleen of peripheral blood transplanted hIL-15 mice have the ability to secrete cytotoxic granules / produce cytokines as mature NK cells differentiated in vivo.
  • spleens were collected from peripheral blood transplanted hIL-15 mice to prepare cells, human CD56 + NK cells were isolated, and in the presence of brefeldin A and in the presence of human IL-2 or IL-15 cytokines After culturing for 20 hours, intracellular staining was performed with a fluorescently labeled antibody FITC-anti-hGranzyme A antibody and FITC-anti-Perforin antibody (manufactured by Biolegend) and measured by flow cytometry. The results are shown in FIG.
  • human CD56 + NK cells isolated above were cultured in the presence of PMA / ionomycin, followed by intracellular staining using fluorescence-labeled antibody PE-anti-hIFNg antibody (manufactured by Biolegend) and measured by flow cytometry. did. The results are shown in FIG.
  • NK cells isolated from peripheral blood transplanted hIL-15 mice show cytotoxicity against the target cells.
  • spleens were collected from peripheral blood transplanted hIL-15 mice to prepare cells, hCD56 + cells were isolated, human IL-2, human IL-15, human IL-2 and human IL
  • the cells were co-cultured with the target tumor cells (human NK high-sensitivity tumor cell line K562) for 4 hours, and cytotoxic activity (cytotoxicity (%)) was measured.
  • the measurement was performed using the obtained culture supernatant and CytoTox96 Non-radioactive Cytotoxicity Assay (manufactured by Promega), and by a common enzyme reaction between the dead cell-derived cytoplasmic enzyme LDH released in the culture supernatant and the reaction substrate. Evaluation was based on chromaticity. The results are shown in FIG.
  • human NK cells differentiated in NOG-hIL-15 Tg mice showed the strongest cytotoxic activity when cultured in the presence of hIL-15. From these results, it was confirmed that human NK cells differentiated in peripheral blood transplanted hIL-15 mice can suppress the growth of human tumors in vitro in the same manner as mature NK cells differentiated in the human body.
  • mice Tumor growth in vivo suppression experiment
  • NK cells derived from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were transplanted (hu-PB-NK hIL-15 Tg.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK cells were not used.
  • Transplanted (hIL-15-Tg) mice were used.
  • the size of tumors in human NK cells-transplanted mice is about 500 ⁇ 950 mm 3
  • the size of tumors in NK cells Not transplantation (hIL-15-Tg) mice is about 495 ⁇ 1730mm 3
  • the size of tumors in human NK cells transplanted mice were approximately two-thirds the size of tumors in NK cells Not transplantation (hIL-15-Tg) mice.
  • Tumor suppressive effects were observed in the human NK cell transplant group (d7-21; p ⁇ 0.05). From these results, it was confirmed that peripheral blood transplanted hIL-15 mice inhibit human tumor growth in vivo.
  • the mouse of the present invention is very useful in the medical field as a humanized immunodeficient mouse that can study the function of human NK cells for a long time after transplantation of human NK cells derived from human peripheral blood.

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Abstract

ヒトＮＫ細胞の機能を検討することができるマウスを提供することを課題とする。　ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）のシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ配列にインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をコードするｃＤＮＡ配列が作動可能に連結されたＤＮＡを含む遺伝子領域である配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを免疫不全マウスのｃＤＮＡに挿入することにより、作製されたＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスによると移植後少なくとも６カ月は、ヒト成熟ＮＫ細胞の研究をインビボで行うために十分な濃度のｈＣＤ５６＋細胞が検出される。

Description

ヒトＩＬ－１５分泌免疫不全マウス
　本発明は、ヒトＩＬ－１５を分泌することができ、かつ、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、ｈ（human:ヒト）ＣＤ５６＋細胞がインビボで長期に検出される、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されている免疫不全マウスに関する。
　ヒト細胞、ヒト組織をインビボで解析できるヒト化免疫不全マウスは、創薬のためのリサーチツールとしての利用のみならず、ヒト細胞を移植することによりインビボでヒト細胞の分化、機能解析等の基礎研究を行うことができる有用なツールとして、医療への貢献が期待できる実験動物であるとされ、長年にわたり、より有用なヒト化免疫不全マウスの作出が試みられてきた。
　１９６２年、胸腺がないため、胸腺に由来するＴ細胞を欠損したヌードマウスが免疫不全マウスとして発見されたが、このマウスには他の免疫細胞は存在し、一部のヒトがん細胞は生着したが、通常のヒト細胞は生着しなかった。１９８０年に、Ｍｅｌｖｉｎ ＢｏｓｍａらによってＣ．Ｂ－１７系統マウスで発見された自然発症の突然変異体で、重度のＳＣＩＤ（Severe Combined ImmunoDeficiency）変異を呈するＳＣＩＤ免疫不全マウスが発見された（例えば、非特許文献１参照）。上記ｓｃｉｄ変異とは、定染色体劣性の遺伝様式をとり、Ｔ細胞及びＢ細胞がないことから、ＳＣＩＤマウスの腎被膜下にヒト胎児の胸腺を移植することができた等の一定の成果があったが、期待されたほどヒト細胞の生着率は向上しなかった。
　同じく１９８０年ごろ、白内障マウスの中に、多尿・尿糖強陽性を呈するメス個体が発見され、その症状がヒトの１型糖尿病(インスリン依存型糖尿病)に類似することから、ＮＯＤ（Non Obese Diabetes）と命名されたＮＯＤマウスが牧野により確立された（例えば、非特許文献２参照）。かかるＮＯＤマウスと上記ＳＣＩＤマウスとを交配させることにより、ＳＣＩＤマウスを上回るヒト細胞の生着が可能となるＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスが作出された。ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスでは、ＮＯＤ系統に由来する補体活性、マクロファージ機能やナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性等の減退がみられ、ヒト造血幹細胞を移植しても拒絶されなかったが、生着効率が高くないことや、マウスの寿命が短いことなどの問題が指摘されていた。
　さらに本発明者らは、ＮＯＤマウスにＣ．Ｂ－１７－ｓｃｉｄマウスを戻し交配することにより得られるマウスに、インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配することにより、機能的なＴ細胞及びＢ細胞を共に欠失し、マクロファージ機能が減退し、ＮＫ細胞又はＮＫ活性を消失し、かつ樹状細胞機能が減退しており、優れた異種細胞生着性を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γcｎｕｌｌマウス（単に「ＮＯＧマウス」ともいう。）を作出した（例えば、特許文献１等参照）。ＮＯＧマウスは、従来のマウスと比較して格段にヒトの細胞や組織の生着性が高く、かつ移植したヒト幹細胞が成熟細胞へも分化することが可能であり、さらに多様なヒト化マウスモデルの作製に有用であるとされている（例えば、非特許文献３参照）。
　一方、ＮＫ細胞とは、先天免疫の主要因子として働く細胞傷害性リンパ球の一種とされ、抗原感作なしに、腫瘍細胞やウィルス感染細胞を障害することができ、ＣＤ５６を含む表面抗原が発現しているという特性を有する。しかしながら、上記ＮＯＧマウスにおいては、臍帯血由来の造血幹細胞を移植した場合においては、ヒトＮＫ細胞への分化効率は低く、末梢血由来のヒト成熟ＮＫ細胞を移植した場合においても、ヒトＮＫ細胞は短期間維持されるにとどまるとされた。
特許第３７５３３２１号
Nature. 301, 527-530, 1983. Jikken Dobutsu. 29:1-13, 1980 Blood, 100, no.9, 3175-3182, 2002
　本発明の課題は、ヒトＮＫ細胞の機能を検討することができるマウスを提供することにある。
　本発明者らは、ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ－２）のシグナルペプチドとｈＩＬ－２タンパク質とをコードするＤＮＡを含む遺伝子領域をＮＯＤ－ＩＬ２ｒγｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入し、ＮＯＧマウスと交配することによりＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－２ Ｔｇマウスを作製し、かかるマウスにおいては、ヒト臍帯血由来造血幹細胞を移植することにより、ｈＣＤ５６が陽性を示す成熟型ヒトＮＫ細胞がインビボで分化、増殖したが(Katano et al., J. Immunol. February 23, 2015 1401323）、ヒト末梢血を移植した場合には、ｈＣＤ５６が陽性を示すヒトＮＫ様細胞が増殖することはほとんどなかったことを確認している。
　上記ｈＩＬ－２のシグナルペプチドをコードする配列を、ｈＩＬ－１５タンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に設置した配列を含むＤＮＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクトして、ｈＩＬ－２シグナルペプチド－ｈＩＬ－１５融合タンパク質を発現させたところ、ｈＩＬ－１５のシグナルペプチドをコードする配列をｈＩＬ－１５をコードするＤＮＡ配列の上流に設置した配列を含むＤＮＡを用いてｈＩＬ－１５タンパク質を産生させた場合と比較して、細胞外に分泌されたｈＩＬ－１５タンパク質量が、１５倍から２０倍に達するという報告（J. Immunol. 1998;160;4418-4426）がある。
　本発明者らは、ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）のシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ配列にインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をコードするｃＤＮＡ配列が作動可能に連結されたＤＮＡを含む遺伝子領域である配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを公知の免疫不全マウスのｃＤＮＡに挿入することにより、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスを作製し、臍帯血由来ヒト造血幹細胞を移植したところ、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－２ Ｔｇマウスについての上記結果と同様、ヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞が分化、増殖していることが確認された。
　本発明者らはさらに検討を続け、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスにヒト末梢血由来のｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞を移植したところ、驚くべきことに、ｈＣＤ５６が陽性を示す細胞数は徐々に増加し、移植後５週間経過時には、マウス血液中において８０００細胞／μＬという非常に高濃度のピークの値を示した。その後はｈＣＤ５６が陽性を示す細胞数は漸減したものの、移植後少なくとも６カ月は、ヒト成熟ＮＫ細胞の研究をインビボで行うために十分な濃度のｈＣＤ５６＋細胞が、本発明のマウスの血液中に検出されることが確認された。さらに、ヒト末梢血由来のｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞を移植後の、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスにおいては、ヒト腫瘍の生育がインビトロのみならず、インビボでも抑制されることを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ヒトＩＬ－１５を分泌することができ、かつ、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、ｈＣＤ５６＋細胞がインビボで長期に検出されることを特徴とする、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されている免疫不全マウス。
［２］ｈＣＤ５６＋細胞がさらにｈＣＤ１６が陽性を示すｈＣＤ５６＋ｈＣＤ１６＋細胞であることを特徴とする前記［１］記載の免疫不全マウス。
［３］ｈＣＤ５６＋細胞が、脾臓、肝臓及び／又は肺において検出されるが、骨髄において検出されない細胞であることを特徴とする前記［１］又は［２］記載の免疫不全マウス。
［４］ｈＣＤ５６＋細胞が、細胞表面分子として、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、又はｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）について陽性を示す細胞であることを特徴とする前記［１］～［３］のいずれか記載の免疫不全マウス。
［５］ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、サイトカイン存在下で、ヒト腫瘍の生育をインビトロで抑制することができることを特徴とする前記［１］～［４］のいずれか記載の免疫不全マウス。
［６］サイトカインが、ｈＩＬ－１５であることを特徴とする前記［５］記載の免疫不全マウス。
［７］ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、ヒト腫瘍の生育をインビボで抑制することができることを特徴とする前記［１］～［６］のいずれか記載の免疫不全マウス。
［８］以下の（１）～（７）の工程を順次含むＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスの作製方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡをマウスゲノムＤＮＡに挿入するために必要な領域を含むベクターに、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを導入することにより、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを有するマウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを作製する工程；
（１－１）必要に応じて、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがマウスゲノムＤＮＡに挿入されるために必要な領域とを含む受精卵注入用ＤＮＡ断片を調製する工程；
（２）上記工程（１）において作製されたベクター及び／又は上記（１－１）で調製されたベクター断片をインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子（ＩＬ－２Ｒγ）ノックアウトマウスの受精卵に注入することにより注入受精卵を作製する工程；
（３）上記工程（２）において作製された注入受精卵を培養することにより、新生子マウスを作製する工程；
（４）上記工程（３）において作製されたマウスにおいて、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたか否かを判定する工程；
（５）上記工程（４）において配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたと判定されたマウスが、ｈＩＬ－１５を分泌しているか否かを判定し、ｈＩＬ－１５を分泌しているマウスをＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５Ｔｇマウスとして選抜する工程；
（６）上記ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配して、ｓｃｉｄ変異が導入されたＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスを作製する工程；
（７）ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配してＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ ＴｇマウスとＮＯＧマウスとを１：１で作製する工程；
　本発明によると、本発明のマウスに移植されたヒト末梢血由来ＮＫ細胞は、マウスにおいて非常に長期に維持されることができ、ヒトＮＫ細胞の機能について長期間にわたりインビボで解析することができる。
（ａ）は、ｐＣＭＶβベクターの構成を示し、（ｂ）は、受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターの構成を示す。 受精卵注入用ＤＮＡ断片の構成を示す。 ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスの血漿中のｈＩＬ－１５濃度を示す。 幹細胞移植マウスについて、（ａ）は単核細胞（ＭＮＣ）中のｈＣＤ４５＋細胞、ｈＣＤ１９＋細胞、ｈＣＤ５６＋細胞の細胞量（／μＬ）をそれぞれ示し、（ｂ）は単核細胞中に占めるｈＣＤ４５＋細胞、ｈＣＤ１９＋細胞、ｈＣＤ５６＋細胞の細胞数（％）を示す。 幹細胞移植マウスの骨髄、脾臓、末梢血それぞれから得られた免疫細胞についてのフローサイトメトリー解析結果を示す。 幹細胞移植マウスにおけるヒトＮＫ細胞のフローサイトメトリー解析により、ヒトＮＫ細胞特異的な受容体の発現を解析した結果である。 ヒト造血幹細胞由来ＮＫ細胞の細胞傷害顆粒分泌能についてのフローサイトメトリー解析結果を示し、（ａ）は、ＧｒａｎｚｙｍｅＡとＰｅｒｆｏｒｉｎの発現についての結果を示し、（ｂ）はｈＩＦＮγ発現についての結果を示す。 末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスの末梢血のフローサイトメトリー解析結果を示す。 末梢血移植マウスについて、（ａ）は、単核細胞（ＭＮＣ）中に占めるｈＣＤ５６＋細胞数（％）を示し、（ｂ）は、単核細胞（ＭＮＣ）中に占めるＣＤ３＋Ｔ細胞数（％）を示す。（ｃ）は、末梢血移植ｈＩＬ－１５マウス血液中のｈＣＤ５６＋細胞数（／μＬ）を示し、（ｄ）は、末梢血移植ｎｏｎ－Ｔｇマウス血液中のｈＣＤ５６＋細胞数（／μＬ）を示す。 末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスの末梢血中の２種類のヒト成熟ＮＫ細胞亜種の推移を示すグラフである。 凍結末梢血ｈＩＬ－１５マウスの末梢血についてのフローサイトメトリー解析結果を示す。 凍結末梢血ｈＩＬ－１５マウスの末梢血中の２種類のヒト成熟ＮＫ細胞亜種の推移を示すグラフである。 末梢血移植ｈＩＬ－１５マウス各組織中のヒトＮＫ細胞の分布についてのフローサイトメトリー解析結果を示す。 末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスの脾臓から単離されたヒトＮＫ細胞の細胞表面分子についてのフローサイトメトリー解析結果を示す。 ヒト末梢血由来ＮＫ細胞の細胞傷害顆粒分泌能についてのフローサイトメトリー解析結果を示し、（ａ）は、ＧｒａｎｚｙｍｅＡとＰｅｒｆｏｒｉｎの発現についての結果を示し、（ｂ）はｈＩＦＮγ発現についての結果を示す。 末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスから単離されたｈＣＤ５６＋細胞の、腫瘍生育インビトロ抑制能を示すグラフである。 末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスの、皮下移植ヒト腫瘍に対するインビボ細胞傷害活性を示すグラフである。
　本発明の免疫不全マウスは、ヒトＩＬ－１５を分泌することができ、かつ、移植されたヒトＮＫ細胞をインビボで長期に維持できることを特徴とする、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されている免疫不全マウスであれば特に制限されず、ヒトＩＬ－１５とは、ヒト末梢血単核細胞が産生するヒトサイトカインタンパク質の一種であり、上記配列番号１に示される塩基配列とは、ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ－２）シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ（以下「ｈＩＬ－２ＳＰｃＤＮＡ」ともいう。）にインターロイキン１５タンパク質（ｈＩＬ－１５）をコードするｃＤＮＡ（以下「ｈＩＬ－１５ｃＤＮＡ」ともいう。）が作動可能なように連結されているｈＩＬ－２ＳＰｃＤＮＡ／ｈＩＬ－１５ｃＤＮＡ連結体の塩基配列である。
　上記配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡが、マウスのゲノムＤＮＡに挿入されているか否かを判定する方法としては、マウスの組織から抽出されたゲノムＤＮＡについて、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを検出するために適切なプライマーセットを用いてＰＣＲ法により確認する方法や、サザンブロット分析により確認する方法を例示することができる。
　本発明の免疫不全マウスが、ヒトＩＬ－１５を分泌しているか否かを判定する方法としては、ｈＩＬ－１５を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、本発明のマウスのリンパ液、血清・血漿等の血液の体液や臓器抽出物などにおいて、ヒトＩＬ－１５を検出されるか否かを決定する方法を例示することができる。上記免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット分析により確認する方法等を挙げることができる。具体的には、採取したマウス末梢血に抗凝固剤を添加し、抗ｈＩＬ－１５抗体を備える市販のＥＬＩＳＡキットを用いてヒトＩＬ－１５が血漿分画に検出されるか否かを決定する方法を例示することができる。
　本発明におけるヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞としては、ヒト末梢血に含まれているヒトＮＫ細胞や、ヒト末梢血から単離されたヒトＮＫ細胞や、ヒト末梢血を用いて人工的に培養されたヒトＮＫ細胞や、冷凍保存後解凍されたヒト末梢血に含まれているヒトＮＫ細胞や、ヒト末梢血から単離されたヒトＮＫ細胞を冷凍保存後解凍したヒトＮＫ細胞や、ヒト末梢血を用いて人工的に培養されたＮＫ細胞を冷凍保存後解凍したヒトＮＫ細胞等を挙げることができる。
　上記ヒトＮＫ細胞を本発明の免疫不全マウスに移植する方法としては、移植された異種細胞の生着能を向上させるためにＸ線等の骨髄内環境を破壊する放射線を照射し、放射線照射後にヒト末梢血由来のｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞を移植する方法を挙げることができ、放射される放射線の強度としては、好ましくは１．５～３．５Ｇｙを挙げることができる。移植の時期としては、放射線照射後２４時間以内が好ましい。また、移植されるＮＫ細胞移植数としては、好ましくは０．２～１０×１０６個、好ましくは０．５～３×１０６個、より好ましくは１～２×１０６個を挙げることができる。
　本発明の免疫不全マウスが、ｈＣＤ５６＋細胞がインビボで検出されるか否かを確認する方法としては、公知の方法を用いることができるが、例えば、本発明の免疫不全マウスの血液中の細胞や、本発明の免疫不全マウスの血液中から単離された細胞について、ｈＣＤ５６が陽性を示すｈＣＤ５６＋細胞であるか否かをフローサイトメトリーによる解析により確認する方法を挙げることができる。
　具体的には、上記フローサイトメトリーによる解析において、ｈＣＤ５６＋細胞が、単核細胞中に１％以上、好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上存在する場合や、ｈＣＤ５６＋細胞が、血液中に少なくとも４０細胞／μＬ存在する場合を挙げることができる。
　本発明におけるｈＣＤ５６＋細胞の、ヒト生体内で成熟したＮＫ細胞との表現型における同一性を増強するための条件としては、ヒトＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞やヒトＣＤ５６＋ＣＤ１６－細胞がそれぞれ血液、脾臓、肝臓及び／又は肺において検出されるが、ヒトＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞やヒトＣＤ５６＋ＣＤ１６－細胞がそれぞれ骨髄において検出されない場合を挙げることができ、本発明において、脾臓、肝臓、肺、血液等のマウスの臓器・組織においてｈＣＤ５６＋細胞が検出されることを、ｈＣＤ５６＋細胞が生着したと表現することがある。
　本発明におけるｈＣＤ５６＋細胞の、ヒト生体内で成熟したＮＫ細胞との表現型における同一性を補完するための追加的な条件としては、ヒト組織における成熟ＮＫ細胞の特異的な細胞表面分子として知られている、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（Killer Immunoglobulin-like Receptor:ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）等の各抗原のいくつかが陽性を示す（発現している）細胞であることを挙げることができ、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）のすべてが移植前のＮＫ細胞（ドナー）と同様の発現を示す細胞であることを好ましく挙げることができる。
　本発明におけるｈＣＤ５６＋細胞の、ヒト生体内で成熟したＮＫ細胞との表現型における同一性を増強するためのさらに追加的な条件としては、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を誘導するnatural cytotoxicity receptor（ＮＣＲ）ファミリーの一員として知られているｈＮＫｐ４６が陽性を示す細胞であることや、ＧｒａｎｚｙｍｅＡが陽性を示す細胞であることを挙げることができる。
　本発明の免疫不全マウスが、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後にヒト腫瘍の生育をインビトロで抑制することができるか否かを確認する方法としては、脾臓から単離したｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞をサイトカイン存在下で培養後に標的ヒト腫瘍細胞と共培養し、その培養上清について、死細胞由来細胞質性酵素ＬＤＨと反応基質との共益酵素反応による呈色度によって評価することにより、細胞傷害活性（cytotoxicity(%)）を測定する方法を例示することができる。上記サイトカインとしては、ヒトＩＬ－２、ヒトＩＬ－１５、ヒトＩＬ－２とヒトＩＬ－１５との混合組成物等を挙げることができるが、ヒトＩＬ－１５が好ましい。
　本発明の免疫不全マウスが、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後にヒト腫瘍の生育をインビボで抑制することができるか否かを確認する方法としては、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、さらにＮＫ感受性ヒト腫瘍細胞株を移植して経時的に腫瘍径を測定した場合に、腫瘍のサイズが縮小するか否かにより判定する方法を挙げることができる。
　上記ｈＣＤ５６＋細胞がインビボで検出される長期の期間としては、８週間以上を挙げることができ、１２週間以上が好ましく、１６週間以上がより好ましく、２０週間以上がさらに好ましく、２４週間以上が特に好ましい。
　本発明の免疫不全マウスとしては、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスを好適に例示することができ、本発明免疫不全マウスの作製方法は特に制限されるものではないが、例えば、以下の（１）～（７）の工程を順次含む上記ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスの作製方法を例示することができる。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡをマウスゲノムＤＮＡに挿入するために必要な領域を含むベクターに、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを導入することにより、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを有するマウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを作製する工程；
（１－１）必要に応じて、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがマウスゲノムＤＮＡに挿入されるために必要な領域とを含む受精卵注入用ＤＮＡ断片を調製する工程；
（２）上記工程（１）において作製されたベクター及び／又は上記（１－１）で調製されたベクター断片をインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子（ＩＬ－２Ｒγ）ノックアウトマウスの受精卵に注入することにより注入受精卵を作製する工程；
（３）上記工程（２）において作製された注入受精卵を培養することにより、新生子マウスを作製する工程；
（４）上記工程（３）において作製されたマウスにおいて、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたか否かを判定する工程；
（５）上記工程（４）において配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたと判定されたマウスが、ｈＩＬ－１５を分泌しているか否かを判定し、ｈＩＬ－１５を分泌しているマウスをＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５Ｔｇマウスとして選抜する工程；
（６）上記ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５Ｔｇマウスと、ＮＯＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ）マウスとを交配して、ｓｃｉｄ変異が導入されたＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスを作製する工程；
（７）ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配してＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ ＴｇマウスとＮＯＧマウスとを１：１で作製する工程；
　工程（１）において、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡをマウスゲノムＤＮＡに挿入するために必要な挿入領域としては、サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ－ＩＥ）等のマウス細胞において作動可能なプロモーター、ＳＶ４０ＳＳ／ＳＡ、及びＳＶ４０ＰｏｌｙＡを含む領域を例示することができ、かかる挿入領域を含む発現ベクターとしては、ｐＣＭＶβを例示することができる。
　上記配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを含むマウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを作製する方法としては、公知の遺伝子組換え技術を用いる方法を挙げることができ、具体的には、ｐＣＭＶ－ＬａｃＺを制限酵素ＮｏｔＩで切り出し、β－ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡを、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに置換する方法を例示することができる。
　工程（１－１）における、受精卵注入用ＤＮＡ断片を作製する方法としては、公知の遺伝子組換え技術を用いる方法を挙げることができ、具体的には、上記配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを有するマウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを制限酵素ＰｖｕIIで切り出し、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと挿入領域とを含むＤＮＡとを有するベクター断片を精製する方法を挙げることができる。
　工程（２）における、注入受精卵を作製する方法としては、上記マウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターや受精卵注入用ＤＮＡ断片を、マウスの受精卵に注入することができる方法であれば特に制限されず、マイクロインジェクションによる方法、電気穿孔法、ウィルスベクター法等を挙げることができる。インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子（ＩＬ－２Ｒγ）ノックアウトマウスとしては、ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウスを好適に挙げることができる。
　工程（３）における、注入受精卵を培養する方法としては、新生子マウスを取得することができる方法であれば特に制限されず、注入受精卵を体外で１８～２４時間３７℃にて培養した後、仮親の子宮へ移植・着床させ、出産直前に帝王切開を行い、新生子マウスを取得する方法を例示することができる。かかる新生子マウスは、さらに里子操作を行うことにより産子マウスとすることが好ましい。
　工程（４）における、上記新生子マウスや産子マウスにおいて、配列番号１に示される塩基配列がゲノムＤＮＡに挿入されているか否かを判定する方法としては、各マウスが３－４週齢以上に達した時点で、マウスの組織から抽出されたゲノムＤＮＡについて、配列番号１に示される塩基配列が挿入されたか否かをＰＣＲ法により確認する方法を挙げることができる。
　工程（５）における、工程（４）において配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたと判定されたマウスが、ｈＩＬ－１５を分泌しているか否かを判定する方法としては、ｈＩＬ－１５を特異的に認識する抗体を用いた前記免疫学的測定法を挙げることができる。
　工程（６）における、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスを作製する方法としては、上記ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウス－ｈＩＬ－１５Ｔｇマウスとして選抜されたマウスにｓｃｉｄ変異を導入することができる方法であれば特に制限されず、具体的には、ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ＴｇマウスとＮＯＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ）マウスとを交配する方法を挙げることができる。
　工程（７）においては、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配することによりＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ ＴｇマウスとＮＯＧマウスとを１：１で取得することができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例１］
［ＩＬ-１５を産生するＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスの作製］
（概要）
　公益財団法人実験動物中央研究所(以下、「実中研」ともいう。）の動物実験委員会の承認を得たガイダンスに従い、ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウスと、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウス（以下、「ＮＯＧマウス」ともいう。)とを用いて、ヒトＩＬ－１５を分泌するトランスジェニックマウスである、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスを作製した。これらのマウスは、実中研のＳＰＦ飼育室において特別に管理されており、一定条件下で分譲可能である。
（受精卵注入用ＤＮＡの調製）
　哺乳類用レポーターベクターであるｐＣＭＶβ（インビトロジェン社製）（図１（ａ）参照）を用いて、サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ－ＩＥ）ＤＮＡの下流に、ＳＶ４０ＳＤ／ＳＶ ＤＮＡ、ｈＩＬ－２ＳＰｃＤＮＡ／ｈＩＬ－１５ｃＤＮＡ連結体である配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、及びポリＡ配列ＤＮＡが順次組み込まれた、受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを構築した。具体的には、上記ｐＣＭＶ－ＬａｃＺを制限酵素ＮｏｔＩで切り出し、β－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を、Ｇｅｎｂａｎｋ（アクセッション番号：ｈＩＬ－２（ＮＭ＿０００５８６）と、ｈＩＬ－１５（ＮＭ＿０００５８５又はＢＣ１００９６２）とを参照することにより決定されたｈＩＬ－２ＳＰｃＤＮＡ／ｈＩＬ－１５ｃＤＮＡ連結体の塩基配列を含むＤＮＡと置き換えた。
　具体的には、ｐＣＭＶβを制限酵素ＮｏｔＩで処理し、β－ガラクトシダーゼ遺伝子配列部分を除去し、その中にＮｏｔＩで切り出したｈＩＬ－２ＳＰｃＤＮＡ／ｈＩＬ－１５ｃＤＮＡ連結体を挿入した。ｈＩＬ－２ＳＰｃＤＮＡ／ｈＩＬ－１５ｃＤＮＡ連結体は、別途調製された。すなわち、健常人末梢血単核球より作製したｃＤＮＡより、ＰｒｉｍｅｒＡ：ＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＡＡ（配列番号２）及びＰｒｉｍｅｒＢ：ＡＴＣＡＣＴＡＧＴＴＧＣＡＣＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＡＧＴＧＣ（配列番号３）を用いてヒトｈＩＬ－２ＳＰ部分を増幅し、ＰｒｉｍｅｒＣ：ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡＡＧＴＧ（配列番号４）及びＰｒｉｍｅｒＤ：ＣＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡ（配列番号５）でヒトｈＩＬ－１５ＭＰ部分を増幅し、それぞれの増幅断片をＰＣＲ２．１ベクター（登録商標）（インビトロジェン社製）にそれぞれ挿入した。その後、ヒトｈＩＬ－２ＳＰ部分をＮｏｔ１で切り出し、β－ガラクトシダーゼ遺伝子配列部分を除去したｐＣＭＶβに挿入した。その後、さらにそのベクターにヒトＩＬ－１５ｃＤＮＡ部分を含む領域をＳｐｅＩで切り出し、挿入した。構築された受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターの構成を図１（ｂ）に示す。
　上記受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを制限酵素ＰｖｕIIで切り出し、受精卵に注入するために必要な領域を含むベクター断片を精製して、１８４０ｂｐからなる受精卵注入用ＤＮＡ断片（図２参照）を調製した。受精卵注入用ＤＮＡ断片の配列を配列番号６に示す。
（ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスの作製）
　ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウスの前核期受精卵１２３個に、上記受精卵注入用ＤＮＡを１．５ｎｇ／ｍＬ濃度に調製し、マイクロマニピュレータ付き倒立顕微鏡（ライカ社製）を用いてマイクロインジェクションした。
　上記受精卵注入用ＤＮＡがマイクロインジェクションされた前核期受精卵のうち、培養後正常に２細胞期になった受精卵と判断された２細胞期胚６３個を仮親マウスの卵管へ移植し、出産直前に帝王切開を行い、新生子マウスを得、さらに里子操作を行うことにより２４匹の産子マウスを得た。
（遺伝子解析）
　上記産子マウスが３－４週齢に達した時点で、各産子マウスの尾の先端１－２ｍｍから採取した組織片から自動ＤＮＡ抽出装置（ＴＯＹＯＢＯ社製）によって抽出されたゲノムＤＮＡについて、以下に示されるプライマーセットを用いて、配列番号１に示される塩基配列が各産子のゲノムＤＮＡに挿入されたか否かを以下の条件によりＰＣＲ法により確認した。
(プライマー)
ＩＬ２ＳＰＳ１：５’－ＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡ－３’(フォワードプライマー)（配列番号７）
ＩＬ１５ｍｐＡＳ３：５’－ＣＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＡＡ－３’（リバースプライマー）（配列番号８）
(ＰＣＲ反応液)
Ａ液：
　　　　　２．５μＬ Ｅｘ－ｔａｑ用×１０　ｂｕｆｆｅｒ
　　　　　２μＬ　　　　　　ｄＮＴＰｍｉｘ
　　　　　１．２５μＬ　　　ＩＬ２ＳＰＳ１　（５μＭ）
　　　　　１．２５μＬ　　　ＩＬ１５ｍｐＡＳ３　（５μＭ）
　　　　　０．１２５μＬ　　Ｅｘ－ｔａｑ　
　　　　　６．８７５μＬ　　ＤＷ
Ｂ液：
　　　　　８．５μＬ　　　　ＤＷ
　　　　　１．５μＬ　　　　ゲノムＤＮＡ
　Ａ液とＢ液とを混合して、ＰＣＲ反応液を調製した。
（ＰＣＲ増幅条件）
　２４μＬの上記ＰＣＲ反応液を用い、９４℃にて３分の加熱処理；９４℃にて３０秒、６０℃にて３０秒、７２℃にて１分を１サイクルとして３５サイクル；その後７２℃にて２分加熱処理；の条件で増幅処理が行われた。上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中で電気泳動に供し、４８０ｂｐ付近の増幅産物バンドの有無を確認することにより、上記各産子マウスにおいて、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されたか否かを判定した。
　上記遺伝子解析にて、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されたと判定された産子マウスから採血を行い、血清／血漿分画へのｈＩＬ－１５の分泌の有無を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１５キット（cat no.435108）を用いてＥＬＩＳＡ法で確認した。ｈＩＬ－１５が分泌されていることが確認されたマウスを、ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスと呼ぶことにした。
（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスの作製）
　上記ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウス（雌）と、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウス（以下「ＮＯＧマウス」ともいう。）（雄）とを交配することにより、ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスに、免疫系の主要な担当細胞であるＴ細胞及びＢ細胞が欠損しているｓｃｉｄ変異をさらに導入して、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウス（以下「ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウス」ともいう。）を作製した。
　上記ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ ＴｇマウスとＮＯＧマウスとを交配することによりＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを１：１の割合で取得した。実施例２以降においては、ＮＯＧマウス（以下「ｎｏｎ-Ｔｇマウス」と表記される場合もある。)を、配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子がゲノムＤＮＡに挿入されていないネガティブコントロールとして、ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスについて検討を行った。
［実施例２］
［ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスについての検討］
（血漿中のｈＩＬ－１５濃度）
　ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスの血漿中のｈＩＬ－１５濃度を測定した。４～６週齢のマウス個体からヘパリン(Novo-heparin、持田製薬株式会社製)を用いて麻酔下にて末梢血を収集した。血漿中のｈＩＬ－１５濃度は、前記ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。結果を図３に示す。
（結果）
　図３から明らかなとおり、ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウス（図中では「ｈＩＬ－１５Ｔｇ」）（Ｎ＝１２６）における血漿中のｈＩＬ－１５濃度は、４７．７±２７．５ｐｇ／ｍＬであり、ｎｏｎ－Ｔｇマウスにおける血漿中のｈＩＬ－１５濃度は、１．３±１．５ｐｇ／ｍＬであった。したがって、ゲノムＤＮＡに挿入されたＮＯＧ－ｈＩＬ－１５Ｔｇマウスにおいては、ＮＯＧマウスに比べて顕著に多く、ゲノムＤＮＡに挿入された配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子により全身的に産生されたｈＩＬ－１５が血液中に分泌されていることが確認された。
［実施例３］
［ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞移植ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスのヒト細胞分化能の検討］
（フローサイトメトリー測定手順）
　実施例３以降のフローサイトメトリーを用いる検討は、以下の手順で行われた。ｈＣＤ５６＋細胞がヒトＮＫ細胞であると判断し、それぞれの検討項目に適した抗体により解析を行った。具体的には、４℃にて暗所で３０分間染色後、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳと０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）で洗浄し、細胞はヨウ化プロピジウム含有ＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁され、その後フローサイトメトリー測定に供された。フローサイトメトリー測定は、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ フローサイトメーター（ＢＤ社製）を用いて行われ、データは、ＦＡＣＳＤｉｖａ ソフトウェア（ver.6.1.3）（ＢＤ社製）によって解析された。細胞数の絶対値は、Ｆｌｏｗ－Ｃｏｕｎｔ(Beckman Coulter社製）を用いて取扱説明書にしたがって算出された。
（抗体）
　使用された抗体は、具体的には以下のとおりである。
抗ｈＣＤ３抗体：anti-human CD3-FITC(BioLegend社製）anti-human CD3-PE (BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１６抗体：anti-human CD16-FITC（BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１９抗体：anti-CD19 （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ３３抗体：anti-human CD33-FITC （BD Biosciences社製）、
抗ｈＣＤ４５抗体：anti-human CD45-allophycocyanin-Cy7 （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ５６抗体：anti-human CD56-PE(BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ５７抗体：anti-CD57（BioLegend社製）、
抗ＮＫＧ２Ａ抗体：anti-human CD159a (NKG2A)-PE (Beckman Coulter社製）、
抗ＮＫＧ２Ｃ抗体： Alexa Fluor 488-conjugated anti-human NK group 2 membrane C(R&D Systems社製）、
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体：anti-NKG2D（BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ９４抗体：anti-CD94（BioLegend社製）、
抗ｈＮＫｐ３０抗体：anti-NKp30（BioLegend社製）、
抗ｈＮＫｐ４６抗体：anti-NKp46（BioLegend社製）、
抗ｈＮＫｐ４４抗体：anti-NKp44（BioLegend社製）、
抗ｈＮＫｐ８０抗体：anti-human NKp80-PE(Beckman Coulter社製）、
抗ｈＣＤ１５８ａ／ｈ抗体（Killer Immunoglobulin-like Receptor:ＫＩＲ）（ＫＩＲ２ＤＬ１／Ｓ１／Ｓ３／Ｓ５）：FITC-conjugated anti-CD158a/h （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１５８ｂ抗体（ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３，ＮＫＡＴ２）：anti-CD158b （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１５８ｄ抗体（ＫＩＲ２ＤＬ４）：anti-CD158d （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１５８ｅ抗体（ＫＩＲ３ＤＬ１，ＮＫＢ１）：anti-CD158e （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１５８ｆ抗体（ＫＩＲ２ＤＬ５）；anti-CD158f （BioLegend社製）、
抗ｍＣＤ４５抗体: anti-mouse CD45-allophycocyanin（BioLegend社製）、
［実施例４］
（ヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４＋造血幹細胞移植ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスの作製）
　上記８～１２週齢の成体ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスにヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４＋造血幹細胞を移植した。２．５ＧｙのＸ線を照射し、照射後２４時間以内にヒト臍帯血由来のｈＣＤ３４＋造血幹細胞２×１０４個を尾静脈より移植し、ヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４＋造血幹細胞を移植したＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウス（以下「幹細胞移植ｈＩＬ－１５マウス」ともいう。）を作製した。同様に、ヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４＋造血幹細胞を移植したＮＯＧマウス（以下「幹細胞移植ｎｏｎ－Ｔｇマウス」ともいう。）を作製し、ネガティブコントロールとした。また、ヒトＮＫ細胞が選択的に分化・増殖することが既に確認されている、インターロイキン２（ｈＩＬ－２）のシグナルペプチドとｃＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されているＮＯＧ－ｈＩＬ－２ Ｔｇマウスに、ヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４＋造血幹細胞移植したマウス（以下「幹細胞移植ｈＩＬ－２マウス」ともいう。）をポジティブコントロールとした。
［実施例５］
(臍帯血由来ｈＩＬ－１５マウスの末梢血中のヒト細胞分化能の検討)
　上記３種類のｈＣＤ３４＋造血幹細胞移植マウスについて、移植後４週経過時に末梢血から採血を行い、ＮＫ細胞の指標となるｈＣＤ５６抗原、白血球の指標となるｈＣＤ４５抗原、Ｂ細胞の指標となるｈＣＤ１９抗原、Ｔ細胞の指標となるｈＣＤ３抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。図４（ａ）に単核細胞（ＭＮＣ）中のヒト免疫細胞量（／μＬ）を示し、及び図４（ｂ）に単核細胞中に占める細胞数（％）を示す。
（結果１）
　図４（ａ）から明らかなとおり、移植後４週目の幹細胞移植ｈＩＬ－１５マウス及び幹細胞移植ｈＩＬ－２マウスの末梢血においては、ｈＣＤ５６＋細胞の発現が多く、ヒトＮＫ細胞が選択的に分化、増殖していることが確認された。一方、幹細胞移植ｎｏｎ－Ｔｇマウスの末梢血においては、ｈＣＤ５６陽性細胞の発現はほとんどなかった。また、ｈＣＤ１９＋細胞の発現は、幹細胞移植ｈＩＬ－２マウスの末梢血において約３細胞／μＬであり、また、幹細胞移植ｈＩＬ－１５マウス、及び幹細胞移植ｎｏｎ－Ｔｇマウスの末梢血においては１～２細胞／μＬ程度であって、いずれのマウスにおいてもヒトＢ細胞への分化、増殖はほとんど観察されなかった。
(結果２)
　図４（ｂ）から明らかなとおり、移植後４週目の幹細胞移植ｈＩＬ－１５マウス及び幹細胞移植ｈＩＬ－２マウスの末梢血においてはｈＣＤ５６＋細胞の発現が非常に多く、ヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞が分化、増殖していることが確認された。
［実施例６］
(幹細胞移植ｈＩＬ－１５マウスの各組織におけるヒト細胞分化能の検討)
　ｈＣＤ３４＋造血幹細胞移植した上記３種類の被検マウスについて、移植後６週経過時に骨髄、脾臓、末梢血を採取し、ヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞を単離し、各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス各組織中のヒト細胞分化能を解析した。結果を図５に示す。
（結果）
　図５から明らかなとおり、幹細胞移植ｈＩＬ－１５マウス及び幹細胞移植ｈＩＬ－２マウスの骨髄（ＢＭ）、脾臓（ＳＰＬ）、末梢血（ＰＢ）のいずれにおいても、ヒトＮＫ細胞の局在が、ｈＣＤ５６＋、ｈＣＤ４５＋の分画で示される赤枠内に確認されたが、幹細胞移植ｎｏｎ-Ｔｇマウスにおいては、ヒトＮＫ細胞の局在はほとんど確認されなかった。
［実施例７］
（ヒト造血細胞由来ＮＫ細胞に特異的な受容体の発現解析）
　前記幹細胞移植ｈＩＬ－１５マウス及び幹細胞移植ｈＩＬ－２マウスの脾臓から単離されたヒトＮＫ細胞について、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞の亜分画で特異的な細胞表面分子であるとされるｈＣＤ１６抗原、ヒト末梢血でＮＫ活性を持つ細胞サブセットに発現されるとされるｈＣＤ５７抗原、ＮＫ細胞表面に発現する抑制型受容体とされるｈＮＫＧ２Ａ抗原、ＮＫ細胞表面に発現する活性型受容体とされるｈＮＫＧ２Ｃ抗原、ＮＫ細胞表面に発現する活性型受容体とされるｈＮＫＧ２Ｄ抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、ヒトＮＫ細胞特異的な受容体の発現を解析した。ヒト末梢血成熟ＮＫ細胞であるＪａｐａｎｅｓｅ ＰＢ－ＮＫ細胞（インフォームドコンセントを受けた、日本人ドナーの末梢血より単離したヒトＮＫ細胞）をポジティブコントロールとした。結果を図６に示す。
(結果)
　図６からも明らかなとおり、幹細胞移植ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウス、幹細胞移植ｈＩＬ－２ Ｔｇマウスいずれの末梢血におけるＮＫ細胞においても、ｈＣＤ１６抗原、ｈＣＤ５７抗原、ｈＮＫＧ２Ａ抗原、ｈＮＫＧ２Ｃ抗原、ｈＮＫＧ２Ｄ抗原の発現が確認された。しかしながら、その発現パターンは、ｈＣＤ５６抗原の発現強度が高い点と、ｈＣＤ５６＋ＣＤ１６－分画の割合が多い点で、ヒト末梢血成熟ＮＫ細胞とは発現様式が異なっており、臨床において、ＩＬ－２投与療法を受けた患者の血液中で増加するｈＣＤ５６＋ＣＤ１６－活性化ＮＫ細胞と類似したＮＫ細胞特異抗原の発現パターンを示してしていたことから、幹細胞移植ｈＩＬ－１５マウス・幹細胞移植ｈＩＬ－２マウスの中で分化したヒト造血幹細胞由来ＮＫ細胞は、マウス内のｈＩＬ－１５又はｈＩＬ－２によって活性化したＮＫ細胞が多く存在している事が推定された。
［実施例８］
（ヒト造血細胞由来ＮＫ細胞の細胞傷害顆粒分泌能の検証）
　前記幹細胞移植ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウス及び幹細胞移植ｈＩＬ－２ Ｔｇマウスの脾臓から単離されたヒトＮＫ細胞が、細胞傷害顆粒の分泌能／サイトカイン産生能を有する否かを検証した。移植後６週経過時に各マウスの脾臓を摘出し細胞調製を行い、ヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞を単離し、ブレフェルディンＡ（BioLegend社製）存在下で２０時間培養した後に蛍光標識抗体（ＦＩＴＣ－抗ｈＧｒａｎｚｙｍｅＡ抗体、ＦＩＴＣ－抗Ｐｅｒｆｏｒｉｎ抗体（BioLegend社製）で細胞内染色をして、フローサイトメトリーで測定した。結果を図７（ａ）に示す。また、ヒト上記単離したヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ存在下で培養した後、蛍光標識抗体ＰＥ－抗ｈＩＦＮｇ抗体（BioLegend社製）で細胞内染色を行い、フローサイトメトリーで測定した。結果を図７（ｂ）に示す。
(結果)
　図７（ａ）から明らかなとおり、上記いずれのマウス由来のヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞においても、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞の結果（データ示さず）と同等の細胞傷害顆粒であるＧｒａｎｚｙｍｅＡの発現が確認された。Ｐｅｒｆｏｒｉｎについても発現が確認されたが、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞の結果（データ示さず）と比較して発現がやや少ない結果となった。また、図７（ｂ）から明らかなとおり、上記いずれのマウス由来のヒトＮＫ細胞においても、ＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ刺激により、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の産生が認められた。
［実施例９］
（ヒト末梢血由来ｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞移植ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスの作製）
　上記８～１２週齢の成体ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスにヒト末梢血由来ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を移植した。２．５ＧｙのＸ線を照射し、照射後２４時間以内にヒト末梢血由来のｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞１～２×１０６個を尾静脈より移植し、ヒト末梢血由来ＣＤ５６＋ＮＫ細胞移植ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウス（以下「末梢血移植ｈＩＬ－１５マウス」ともいう。）を作製した。同様に、ヒト末梢血由来ｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞移植ＮＯＧ－ｈＩＬ－２ Ｔｇマウス（以下「末梢血移植ｈＩＬ－２マウス」ともいう。）を作製した。ヒト末梢血由来ｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞を移植したＮＯＧマウス（以下「末梢血移植ｎｏｎ－Ｔｇマウス」ともいう。）を作製し、ネガティブコントロールとした。
［実施例１０］
(末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスの末梢血中細胞の検討)
　移植後３週間経過時に採血し、ｍＣＤ４５抗原、ｈＣＤ３抗原、ｈＣＤ１６抗原、ｈＣＤ４５抗原、ｈＣＤ５６抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、各マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。ヒト白血球の指標となるｈＣＤ４５抗原陽性分画（マウス白血球の指標となるｍＣＤ４５は陰性の分画）にゲートし、さらにヒトＮＫ細胞の指標となるｈＣＤ５６抗原とＴ細胞の指標となるｈＣＤ３抗原に対するパターンで展開した。ｈＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞にゲートし、さらにｈＣＤ５６抗原とｈＣＤ１６抗原に対するパターンで展開し、ｈＣＤ５６＋ｈＣＤ１６＋ＮＫ細胞の割合を解析した。ヒトＴ細胞の混入を確認するため、ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３＋Ｔ細胞の割合も確認した。結果を図８に示す。
(結果)
　図８において、「ＰＢＭＣ」は、健常人由来のヒト末梢血中の単核球を表す。「ＣＤ５６＋ｓｏｒｔｅｄ （ｐｒｅ－ｔｒａｎｓｆｅｒ）」は、移植前のＰＢＭＣより単離したｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞を表す。「Ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ（３ｗ）」は、移植後３週経過時の末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスの末梢血を表す。移植後３週経過時の末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスにおいては、ｈＣＤ４５＋ヒト白血球内ではＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞分画が大部分（９９．７％）を占めていた。「ＰＢＭＣ」、「ＣＤ５６＋ｓｏｒｔｅｄ （ｐｒｅ－ｔｒａｎｓｆｅｒ）」においても、ヒト末梢血中の成熟ＮＫ細胞は、ｈＣＤ４５＋ヒト白血球中のｈＣＤ５６＋ｈＣＤ１６＋分画において９０％以上を占めていることから、移植されたｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞は、移植後３週間経過時においても、健常人由来のヒト末梢血中の単核球と同様のｈＣＤ５６＋ｈＣＤ１６＋ＮＫ細胞という性質を維持したまま生着し、増殖していると判断することができた。
［実施例１１］
　移植後経時的に採血し、単核細胞中のＮＫ細胞とＴ細胞の占める割合を計測した。上記３種類の末梢血移植マウスについて、移植後経過時に末梢血から採血を行い、ＮＫ細胞の指標となるｈＣＤ５６抗原、白血球の指標となるｈＣＤ４５抗原、Ｔ細胞の指標となるｈＣＤ３抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。図９（ａ）に単核細胞（ＭＮＣ）中に占めるＮＫ細胞数（％）を、図９（ｂ）にＭＮＣ中に占めるＴ細胞数（％）を示す。また、図９（ｃ）に末梢血移植ｈＩＬ－１５マウス血液中のＮＫ細胞数（／μＬ）を示し、図９（ｄ）に末梢血移植ｎｏｎ－Ｔｇマウス血液中のＮＫ細胞数（／μＬ）を示す。
（結果）
　図９(ａ)から明らかなとおり、ＮＫ細胞については、末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスにおいて、移植後２週経過時には単核細胞中の約３０～約４６％を占め、４週経過時に約１０～約２０％を占め、６週経過時に約８～約１５％を占めた。図９（ｂ）から明らかなとおり、末梢血移植ｈＩＬ－２マウスにおいては、一番増加した移植後４週経過時で１０％未満にとどまった。Ｔ細胞については、末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスではほとんど検出されなかった一方、末梢血移植ｈＩＬ－２マウスでは移植後３～４週経過時に約１８～約２３％を占めた。末梢血移植ｎｏｎ－Ｔｇマウスにおいては、ＮＫ細胞もＴ細胞もほとんど確認されなかった。以上の結果より、末梢血移植ｈＩＬ－２マウスでは、ＮＫ細胞が血液中で増殖せず、移植細胞に極めて少数混入していたＴ細胞が増殖してしまうことが確認されたため、これ以降の実験は、末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスについてのみ検討を行うこととした。また、ヒト末梢血ｈＩＬ－１５Ｔｇマウスにおいては、血液中のヒトＮＫ細胞数が徐々に増加し、移植後４－５週経過時には８０００個／μＬまで増加した。その後は徐々に減少したが、移植後２４週経過しても、約４０細胞／μＬが確認された（図９（ｃ）参照）。ヒト末梢血ｎｏｎ－Ｔｇマウスでは、移植後２週経過の時には約４０細胞／ｕＬ確認されたのが最大値であって、増殖はほとんど観察されなかった（図９（ｄ）参照）。
［実施例１２］
（ヒト成熟ＮＫ細胞亜種の推移についての検討）
　ヒトＮＫ細胞は、ｈＣＤ５６＋ｈＣＤ１６＋分画を占める細胞傷害能に特化された亜集団と、ｈＣＤ５６＋ｈＣＤ１６－分画を占めるサイトカイン産生能に特化された亜集団とが存在することが知られている。末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスに移植されたヒト成熟ＮＫ細胞が、どちらの分画において増殖するのかを確認するために、細胞亜集団（sub-population）の経時的変動を解析した。結果を図１０に示す。
（結果)
　図１０から明らかなとおり、ｈＣＤ５６＋ｈＣＤ１６＋分画は、移植後１週目～８週目にわたりほぼ９０％以上を維持した。一方、ｈＣＤ５６＋ｈＣＤ１６－分画は、移植後１週経過時に約１１％を占めたがその後漸減した。したがって、末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスの末梢血においては、ｈＣＤ５６＋ｈＣＤ１６＋分画を示す細胞傷害能に特化された亜集団が増殖していることが確認された。
［実施例１３］
［凍結末梢血ｈＩＬ－１５マウスの調製］
　上記８～１２週齢の成体ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスにヒト末梢血由来ｈＣＤ５６＋凍結ＮＫ細胞を解凍して移植した。２．５ＧｙのＸ線を照射し、照射後２４時間経過時に解凍されたヒト末梢血由来ＣＤ５６＋ＮＫ細胞１～２×１０６個を尾静脈より移植し、ヒト末梢血由来ＣＤ５６＋凍結ＮＫ細胞移植ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウス（以下「凍結末梢血ｈＩＬ－１５マウス」ともいう。）を作製した。
［実施例１４］
(凍結末梢血ｈＩＬ－１５マウスの末梢血中のヒト細胞分化能の検討)
　凍結末梢血ｈＩＬ－１５マウスについて、移植後経時的に採血し、各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。ヒト白血球の指標となるｈＣＤ４５抗原陽性分画（マウス白血球の指標となるｍＣＤ４５は陰性の分画）にゲートし、さらにヒトＮＫ細胞の指標となるｈＣＤ５６抗原とＴ細胞の指標となるｈＣＤ３抗原に対するパターン、及びヒトｈＣＤ５６抗原とｈＣＤ１６抗原に対するパターンで展開し、ヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞、及びヒトＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の割合を解析した。ヒトＴ細胞の混入を確認するため、ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３＋Ｔ細胞の割合も確認した。結果を図１１及び図１２に示す。
（結果１）
　図１１において、移植していない凍結ヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞を表す「ＦｒｏｚｅｎＰＢ－ＮＫ（Ｐｒｅ－ｔｒａｎｓｆｅｒ）」から明らかなとおり、解凍後のヒト末梢血中の成熟ＮＫ細胞は、ｈＣＤ１６＋ｈＣＤ５６＋分画において８５．２％を占めている。凍結ヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞を移植後４週目の凍結末梢血ｈＩＬ－１５マウスにおいても、ｈＣＤ１６＋ｈＣＤ５６＋分画において８１．３％を占めているので、新鮮血由来ヒトＮＫ細胞移植実験と同様に、移植された解凍後のヒトＮＫ細胞は、ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスに移植後４週経過時においても生着し、増殖していることを確認することができた。
（結果２）
　図１２から明らかなとおり、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋分画を占める亜集団が選択的に増幅し、移植後１週目～２週目にわたり急激に増加し、３週目以降漸減した。一方、ＣＤ５６＋ＣＤ１６－分画を占めるサイトカイン産生能に特化された亜集団はほとんど増加することはなかった。したがって、ＣＤ５６＋凍結ＮＫ細胞移植ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスにおいては、細胞傷害能に特化されたＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞が顕著に増殖することが確認された。
［実施例１５］
（末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスの各組織におけるヒト細胞の検討）
　末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスについて、移植後６週経過時に麻酔下にて全採血することで安楽死処置を施した後、骨髄、脾臓、肝臓、肺を採取して細胞調製を行った。各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス各組織中のヒト化細胞を解析した。結果を図１３に示す。
（結果）
　図１３から明らかなとおり、末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスの脾臓（ＳＰＬ）、末梢血（ＰＢ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、肺（Ｌｕｎｇ）のいずれにおいても、ヒトＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の局在が認められたが、骨髄（ＢＭ）では局在が認められなかった。この結果は、ヒト組織における成熟ＮＫ細胞は、主に血液・脾臓・リンパ節・扁桃腺・肝臓・肺等に局在するが、骨髄では成熟ＮＫ細胞はほとんど存在しないという結果と一致した。しかし、前記幹細胞移植ｈＩＬ－１５マウス及び幹細胞移植ｈＩＬ－２マウスにおいては、骨髄において、ヒトＮＫ細胞の局在が認められたという結果とは相違した。また、ＮＫ細胞マーカーの１種である、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を誘導するnatural cytotoxicity receptor（ＮＣＲ）ファミリーの一員として知られているｈＮＫｐ４６＋の分画で強く発現していることも確認された。
［実施例１６］
（ヒトＮＫ細胞の特異的な細胞表面分子の発現解析）
　末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスについて、移植後８週経過時に脾臓から単離されたヒトＮＫ細胞は、ヒト組織における成熟ＮＫ細胞と同じ特異的な細胞表面分子が発現しているか否かを解析した。ヒト組織における成熟ＮＫ細胞の特異的な細胞表面分子として知られている、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（Killer Immunoglobulin-like Receptor:ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）の各抗原に対する各特異的な抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、ヒトＮＫ細胞特異的な細胞表面分子発現解析を行った。マウス結果を図１４に示す。各細胞表面分子の陰性対象として、Isotype Abで染色したパターンも示す。
（結果）
　図１４から明らかなとおり、ヒト組織における成熟ＮＫ細胞の特異的な細胞表面分子として知られている、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（Killer Immunoglobulin-like Receptor:ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）の各抗原の発現が確認された。また、末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスにおいて増殖したヒトＮＫ細胞は、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞の結果（データ示さず）とほぼ同一のＮＫ細胞の表面分子発現パターンを有することが確認された。
［実施例１７］
（ヒト末梢血由来ＮＫ細胞の細胞傷害顆粒分泌能の検証）
　末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスの脾臓から単離されたヒトＮＫ細胞が、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞と同様に細胞傷害顆粒の分泌能／サイトカイン産生能を有する否かを検証した。上記移植８週経過時に末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスより脾臓を採取して細胞調製し、ヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞を単離し、ブレフェルディンＡ存在下及びヒトＩＬ－２もしくはＩＬ－１５サイトカイン存在下で２０時間培養した後に蛍光標識抗体ＦＩＴＣ－抗ｈＧｒａｎｚｙｍｅＡ抗体、ＦＩＴＣ－抗Ｐｅｒｆｏｒｉｎ抗体（Biolegend社製）で細胞内染色をして、フローサイトメトリーで測定した。結果を図１５（ａ）に示す。また、ヒト上記単離したヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎｅ存在下で培養した後、蛍光標識抗体ＰＥ－抗ｈＩＦＮｇ抗体（Biolegend社製）を用いて細胞内染色を行い、フローサイトメトリーで測定した。結果を図１５（ｂ）に示す。
（結果）
　図１５（ａ）から明らかなとおり、ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウス由来のヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞においても、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞の結果（データ示さず）と同等の細胞傷害顆粒（ＧｒａｎｚｙｍｅＡ）の発現が確認された。しかし、Ｐｅｒｆｏｒｉｎは各種サイトカインで刺激してもほとんど検出できなかった。また、図１５（ｂ）から明らかなとおり、ＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎｅ刺激により、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の産生が認められた。この結果は、ｈＩＬ－１５マウスで増殖したヒトＮＫ細胞は、刺激因子に対する反応性（サイトカイン産生能）を保持していることを示していた。
（腫瘍生育インビトロ抑制実験）
　末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスから単離されたヒトＮＫ細胞が、標的細胞にたいして細胞傷害能を示すか検証した。ヒトＮＫ細胞移植後８週経過時に末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスより脾臓を採取して細胞調製し、ｈＣＤ５６＋細胞を単離し、ヒトＩＬ－２、ヒトＩＬ－１５、ヒトＩＬ－２とヒトＩＬ－１５との混合組成物の、各サイトカイン存在下で２日間培養した後に、標的腫瘍細胞（ヒトＮＫ高感受性腫瘍細胞株Ｋ５６２）と４時間共培養し、培養上清を用いて細胞傷害活性（cytotoxicity(%)）を測定した。測定の方法は、得られた培養上清とＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Promega社製）を用い、培養上清中に遊離した死細胞由来細胞質性酵素ＬＤＨと反応基質との共益酵素反応による呈色度によって評価した。結果を図１６に示す。
（結果）
　図１６から明らかなとおり、ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウス内で分化したヒトＮＫ細胞は、ｈＩＬ－１５存在下で培養した場合に一番強い細胞傷害活性を示した。かかる結果により、末梢血移植ｈＩＬ－１５マウス内で分化したヒトＮＫ細胞が、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞と同様に、ヒト腫瘍の生育をインビトロで抑制できることが確認された。
（腫瘍生育インビボ抑制実験）
　末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスが、ヒト腫瘍に対する細胞傷害活性を観察することが可能かを検討した。成体ＮＯＧ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスに、２．５ＧｙのＸ線を照射し、骨髄抑制を行った。照射後１日以内にヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来ＮＫ細胞を２×１０６個ｉｖ移植して（ｈｕ－ＰＢ－ＮＫ ｈＩＬ－１５ Ｔｇを作製した。陰性コントロールとしては、ＮＫ細胞未移植（ｈＩＬ－１５－Ｔｇ）マウスを用いた。ヒトＰＢＭＣ）由来ＮＫ細胞移植後４週経過時に２．５×１０５個のＮＫ感受性ヒト腫瘍細胞株Ｋ５６２を皮下移植し、継時的に腫瘍径を測定した。結果を図１７に示す。
（結果）
　図１７から明らかなとおり、皮下移植後２１日目には、ヒトＮＫ細胞移植マウスにおける腫瘍のサイズは５００～９５０ｍｍ３程度であり、ＮＫ細胞未移植（ｈＩＬ－１５－Ｔｇ）マウスにおける腫瘍のサイズは４９５～１７３０ｍｍ３程度であり、ヒトＮＫ細胞移植マウスにおける腫瘍のサイズは、ＮＫ細胞未移植（ｈＩＬ－１５－Ｔｇ）マウスにおける腫瘍のサイズの約３分の２であった。ヒトＮＫ細胞移植群で腫瘍抑制効果が認められた（ｄ７－２１；ｐ＜０．０５）。かかる結果により、末梢血移植ｈＩＬ－１５マウスは、ヒト腫瘍の生育をインビボで抑制することが確認された。
　本発明のマウスは、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後にヒトＮＫ細胞の機能を長期に検討できるヒト化免疫不全マウスとして、医学分野において非常に有用である。

Claims (8)

  1. ヒトＩＬ－１５を分泌することができ、かつ、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、ｈＣＤ５６＋細胞がインビボで長期に検出されることを特徴とする、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されている免疫不全マウス。
  2. ｈＣＤ５６＋細胞がさらにｈＣＤ１６が陽性を示すｈＣＤ５６＋ｈＣＤ１６＋細胞であることを特徴とする請求項１記載の免疫不全マウス。
  3. ｈＣＤ５６＋細胞が、脾臓、肝臓及び／又は肺において検出されるが、骨髄において検出されない細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の免疫不全マウス。
  4. ｈＣＤ５６＋細胞が、細胞表面分子として、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、又はｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）について陽性を示す細胞であることを特徴とする請求項１～３いずれか記載の免疫不全マウス。
  5. ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、サイトカイン存在下で、ヒト腫瘍の生育をインビトロで抑制することができることを特徴とする請求項１～４いずれか記載の免疫不全マウス。
  6. サイトカインが、ｈＩＬ－１５であることを特徴とする請求項５記載の免疫不全マウス。
  7. ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、ヒト腫瘍の生育をインビボで抑制することができることを特徴とする請求項１～６いずれか記載の免疫不全マウス。
  8. 以下の（１）～（７）の工程を順次含むＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスの作製方法。
    （１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡをマウスゲノムＤＮＡに挿入するために必要な領域を含むベクターに、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを導入することにより、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを有するマウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを作製する工程；
    （１－１）必要に応じて、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがマウスゲノムＤＮＡに挿入されるために必要な領域とを含む受精卵注入用ＤＮＡ断片を調製する工程；
    （２）上記工程（１）において作製されたベクター及び／又は上記（１－１）で調製されたベクター断片をインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子（ＩＬ－２Ｒγ）ノックアウトマウスの受精卵に注入することにより注入受精卵を作製する工程；
    （３）上記工程（２）において作製された注入受精卵を培養することにより、新生子マウスを作製する工程；
    （４）上記工程（３）において作製されたマウスにおいて、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたか否かを判定する工程；
    （５）上記工程（４）において配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたと判定されたマウスが、ｈＩＬ－１５を分泌しているか否かを判定し、ｈＩＬ－１５を分泌しているマウスをＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５Ｔｇマウスとして選抜する工程；
    （６）上記ＮＯＤ－ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配して、ｓｃｉｄ変異が導入されたＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスを作製する工程；
    （７）ＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配してＮＯＤ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ－ｈＩＬ－１５ ＴｇマウスとＮＯＧマウスとを１：１で作製する工程；
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