KR102581970B1 - 면역 부전 마우스 - Google Patents
면역 부전 마우스 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102581970B1 KR102581970B1 KR1020217010969A KR20217010969A KR102581970B1 KR 102581970 B1 KR102581970 B1 KR 102581970B1 KR 1020217010969 A KR1020217010969 A KR 1020217010969A KR 20217010969 A KR20217010969 A KR 20217010969A KR 102581970 B1 KR102581970 B1 KR 102581970B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- human
- mice
- mouse
- nog
- Prior art date
Links
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 title claims abstract description 123
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 360
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 289
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 86
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 84
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 44
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims abstract description 35
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 101100179540 Homo sapiens IL15 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 130
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 claims description 36
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 claims description 36
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 31
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 15
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 claims description 5
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 174
- 239000012636 effector Substances 0.000 abstract description 8
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 59
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 50
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 44
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 44
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 39
- 101150107205 FCGR2 gene Proteins 0.000 description 37
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 36
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 35
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 34
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 33
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 29
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 28
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 27
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 27
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 27
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 24
- 230000006870 function Effects 0.000 description 21
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 19
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 18
- 101150114401 Fcer1g gene Proteins 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 17
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 16
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 15
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 15
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 15
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 14
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 14
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 13
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 13
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 12
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 12
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 9
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 8
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 8
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 8
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 7
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 6
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 5
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 5
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 5
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 210000005132 reproductive cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 4
- 230000002100 tumorsuppressive effect Effects 0.000 description 4
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 3
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 3
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 3
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 3
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 3
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 3
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 3
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 102000005768 DNA-Activated Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010006124 DNA-Activated Protein Kinase Proteins 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 206010066896 HER-2 positive gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000011789 NOD SCID mouse Methods 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000012827 T-B+ severe combined immunodeficiency due to gamma chain deficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 208000023940 X-Linked Combined Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 201000007146 X-linked severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 201000008627 kidney hypertrophy Diseases 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 2
- 229950007699 mogamulizumab Drugs 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 229940124292 CD20 monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100193633 Danio rerio rag2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010048469 Kidney enlargement Diseases 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699729 Muridae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100193635 Mus musculus Rag2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010038468 Renal hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 101710183568 Serine/threonine-protein kinase PknK Proteins 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000011562 hybrid animal model Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 인간 항체에 대한 면역 부전 마우스 유래의 면역 세포의 영향을 배제할 수 있고 또한 인간 세포의 생착성이 높은 면역 부전 마우스를 제공하는 것을 과제로 한다. NOG 마우스로부터 마우스 FcgR 유전자를 더 결손시킨 경우에, 상기 마우스는 종양에 대한 항체 의존성의 세포 상해 활성을 나타내지 않으며, NOG 마우스와 비교하여 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착된다. 또한 상기 마우스에 인간 IL-15 유전자를 도입한 마우스에 인간 NK세포를 생착시킴으로써 인간 NK세포만이 이펙터 세포가 되어 ADCC 활성을 평가할 수 있다.
Description
본 발명은 IL-2(인터루킨 2) 수용체 γ쇄의 유전자에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손되고, 또한 FcgR(IgG Fc수용체)이 기능적으로 발현하지 않는 유전자 개변 면역 부전 마우스, 및 해당 유전자 개변 면역 부전 마우스에 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착되어 있는 인간 세포 생착 면역 부전 마우스 등에 관한 것이다.
인간 세포, 인간 조직을 인비보로 해석할 수 있는 인간화 면역 부전 마우스는 창약(創藥)을 위한 리서치 툴로서의 이용 뿐 아니라 인간 세포를 이식함으로써 인비보로 인간 세포의 분화, 기능 해석 등의 기초 연구를 실시할 수 있는 유용한 툴로서 의료에 대한 공헌을 기대할 수 있는 실험동물이라고 볼 수 있으며, 오랜 세월에 걸쳐 보다 유용한 인간화 면역 부전 마우스의 제작이 시도되어 왔다.
예를 들면, 인간 세포의 생착이 가능하고 보체 활성, 대식 세포(macrophage) 기능의 감퇴나 내추럴 킬러(NK) 세포 활성의 감퇴 등이 보이는 NOD-scid 마우스에 사이토카인 리셉터 공통 도메인인 IL-2 수용체 γ쇄 유전자를 녹아웃시킨 마우스(IL2RγKO마우스)를 역교배함으로써 기능적인 T세포 및 B세포를 함께 결실시키고 NK세포의 활성을 소실시켜 대식 세포 기능이 감퇴하고 또한 수상 세포 기능이 감퇴하며, 우수한 이종 세포 생착성을 가진 NOG 마우스(「NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/ShiJic」, 「NOD-scid, il2rgnull」등이라고도 표시된다)가 이토(伊藤) 등에 의해 제작되었다(예를 들면, 특허 문헌 1 참조). NOG 마우스는 인간의 세포나 조직의 생착성이 매우 높은 면역 부전 마우스이다.
한편, 면역 시스템에서 IgG 항체는 그 구조에 가변 영역과 정상 영역을 포함하고 가변 영역에서 병원체 등의 이종 항원과 결합된다. 한편, 많은 면역 세포의 표면에는 IgG 항체의 정상 영역에 결합되는 수용체인 FcgR이 존재하고 있으며, 항원 등과 결합한 항원 특이적 IgG 항체는 그 정상 영역을 통해 FcgR에 결합한다. 그 결과, 면역 세포의 활성화가 유도되어 병원체 등의 이물이 배제된다.
상술한 NOG 마우스에 종양 관련 항원을 고(高)발현하는 인간 암세포를 이식하고 또한 종양 관련 항원을 인식하는 IgG 항체를 투여하면 NOG 마우스 내에서의 인간 암의 성장이 현저히 억제되는 것으로 알려져 있지만, 상기 종양 관련 항원에 결합한 항체를 포착하고 인간 암세포를 상해하는 항체 의존적 암 억제 반응에서는 NOG 마우스에서 IgG 항체가 마우스 FcgR을 통해 관여하는 것을 발명자들은 확인하였다. 따라서 인간 항체를 투여하는 항체 의약품의 기능 평가 실험 등을 실시한 경우, 항체에의 면역 응답이 인간 면역 세포에서 유래한 것인지, 마우스 면역 세포에서 유래한 것인지를 판별하기가 어렵다는 문제가 있었다.
본 발명의 과제는 인간 항체에 대한 면역 부전 마우스 유래의 면역 세포의 영향을 배제할 수 있으며 또한 인간 세포의 생착성이 종전보다 높은 면역 부전 마우스를 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 NOG 마우스로부터 마우스 FcgR 유전자를 더 결손시킨 경우 상기 마우스는 종양에 대한 항체 의존성의 세포 상해(Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity: ADCC) 활성을 나타내지 않으며, NOG 마우스와 비교하여 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착되는 것을 발견했다. 또한 상기 마우스에 인간 IL-15 유전자를 도입하여 인간 NK세포를 생착시킴으로써 인간 NK세포만이 이펙터 세포가 되어 ADCC 활성을 평가할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
［1］IL-2 수용체 γ쇄 유전자에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손되고, 또한 T세포 및 B세포의 항원 수용체 유전자의 재구성에 관한 유전자의 변이가 양대립 유전자 좌위(座位)에 있으며, 또한 FcgR이 기능적으로 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 유전자 개변 면역 부전 마우스.
［2］T세포 및 B세포의 항원 수용체 유전자의 재구성에 관한 유전자의 변이가 SCID 변이 또는 RAG 변이인 것을 특징으로 하는 상기［1］에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스.
［3］NOG-FcgR KO마우스인 것을 특징으로 하는 상기［1］ 또는 ［2］에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스.
［4］FcgR의 유전자가 Fcer1g 및 Fcgr2b를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기［1］∼［3］ 중 어느 한 항에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스.
［5］종양에 대한 항체 의존성 세포 상해 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 상기［1］∼［4］ 중 어느 한 항에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스.
［6］상기［1］∼［5］ 중 어느 한 항에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스에서 유래하는 조직.
［7］상기［1］∼［5］ 중 어느 한 항에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스에서 유래하는 체세포.
［8］상기［1］∼［5］ 중 어느 한 항에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스에서 유래하는 생식 세포.
［9］상기［1］∼［5］ 중 어느 한 항에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스에 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착되어 있는 것을 특징으로 하는 인간 세포 생착 면역 부전 마우스.
［10] 인간 세포가 인간 말초혈 단핵구인 것을 특징으로 하는 상기［9］에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스.
［11］상기［9］ 또는［10］에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스에서 유래하는 인간 세포가 생착된 조직.
［12］상기［9］ 또는 ［10］에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스에서 유래하는 인간 체세포.
［13］상기［9］ 또는 ［10］에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스에서 유래하는 생식 세포.
［14］상기［1］∼［5］ 중 어느 한 항에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스와 인간 IL-15 유전자를 도입한 유전자 개변 면역 부전 마우스(I)를 교배함으로써 제작된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II).
［15]유전자 개변 면역 부전 마우스(I)가 인간 NK세포를 증폭·유지할 수 있는 NOG-hIL-15 Tg마우스인 것을 특징으로 하는 상기 [14］에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II).
［16］상기［14］ 또는 ［15］에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)에서 유래하는 조직.
［17］상기［14］ 또는 ［15］에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)에서 유래하는 체세포.
［18］상기［14］ 또는 ［15］에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)에서 유래하는 생식 세포.
［19］상기［14］또는［15］에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)에 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착되어 있는 것을 특징으로 하는 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II).
［20］인간 세포가 인간 말초혈 단핵구인 것을 특징으로 하는 상기［19］에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II).
［21］상기［19］ 또는 ［20］에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)에서 유래하는 조직.
［22］상기［19］ 또는 ［20］에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)에서 유래하는 체세포.
［23］상기［19］ 또는 ［20］에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)에서 유래하는 생식 세포.
［24］상기［9］ 또는 ［10］에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스를 이용하여 인간 세포에 대한 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 활성이나 작용 메커니즘을 평가하는 방법.
［25］상기［14］ 또는 ［15］에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)를 이용하여 인간 NK세포의 ADCC 활성을 평가하는 방법.
［26］상기［19］ 또는 ［20］에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)를 이용하여 인간 NK세포의 ADCC 활성을 평가하는 방법.
［27］유전자 개변 면역 부전 마우스에 인간 면역 세포와 인간 종양 세포를 공존시킴으로써 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 기능을 평가할 수 있는 것을 특징으로 하는 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(III).
［28］인간 세포 생착 면역 부전 마우스(III)를 이용하여 인간 세포에 대한 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 기능을 평가하는 방법.
［29］인간 세포 생착 면역 부전 마우스(III)를 이용하여 인간 면역 세포에 대한 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 기능을 평가하는 방법.
본 발명에 의하면 종양에 대해 마우스 세포 유래의 ADCC 활성을 나타내지 않으며 또한 인간 세포 생착성이 현저히 높은 유전자 개변 면역 부전 마우스를 제공할 수 있다. 또 상기 마우스에 인간 조혈 줄기세포를 이식하여 T세포 등의 인간 면역 세포를 분화시킨 후, 인간 종양 세포를 더 이식하여 항인간 PD-1 항체 등의 면역 체크 포인트 저해제로서 작용하는 항인간 세포 표면 단백 분자 항체를 투여한 경우에, 투여한 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 인간 종양 면역 반응을 평가할 수 있다. 또한 상기 마우스의 게놈에 인간 IL-15 유전자를 도입하여 인간 NK세포를 생착시킴으로써 인간 NK세포를 이펙터 세포로 하는 ADCC 활성을 평가할 수 있다.
[도 1] 각 마우스에 대해 mouse CD45(mCD45)＋백혈구 중의 mouse FcgRIII/II(mCD16/32)의 발현 유무를 도시한 도면이다. (b)는 NOG 마우스, (c)는 NOG-FcgR KO/+마우스, (d)는 NOG-FcgR KO/KO마우스의 결과를 각각 나타내 보인다. (a)는 음성 대조군(negative control)이다.
[도 2] mouse CD45(mCD45)＋백혈구 중의 mFcgRIII 및 mFcgRII 발현 세포의 비율을 도시한 도면이다.
[도 3] 트라스투주맙(인간 IgG 항체) 투여 후의 mCD45＋백혈구 중의 F4/80＋CD11b＋단구/대식 세포 분획에서의 FcgRIII/II(mCD16/32)의 발현 및 인간 IgG 항체의 결합의 유무를 도시한 도면이다. (a)는 NOG-FcgR KO/+마우스에서의 트라스투주맙을 투여하지 않는 음성 대조군, (b)는 인간 IgG 항체 투여 NOG-FcgR KO/+마우스, (c)는 NOG-FcgR KO/KO마우스의 결과를 각각 나타낸다.
[도 4] 마우스 IgG1 단일 클론 항체(mIgG1) 투여 후의 혈장 중의 마우스 IgG 항체의 농도 측정 결과를 도시한 그래프이다. (a)는 NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 마우스 IgG1 항체를 100μg 각각 투여한 경우, (b)는 NOG-FcgR KO/KO마우스에 100μg 각각 투여한 경우, (c)는 NOG-FcgR KO/KO마우스에 20μg 각각 투여한 경우의 결과를 나타낸다.
[도 5] 인간 IgG 항체 의약 3종류를 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG-FcgR KO/+마우스 및/또는 NOG 마우스의 복강 내에 각각 100μg 투여한 경우의, 혈장 중의 각 인간 IgG 항체의 농도 측정 결과를 도시한 그래프이다. (a)는 리툭시맙을 각각 투여한 경우, (b)는 트라스투주맙을 각각 투여한 경우, (c)는 모가물리주맙을 각각 투여한 경우의 결과를 나타낸다.
[도 6] NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 Her2 양성 위암 세포주 4-1 ST를 피하 이식한 후의, 종양 사이즈의 측정 결과를 도시한 그래프이다. (a)는 생리 식염수(Saline)를 각각의 마우스에 투여한 경우, (b)는 트라스투주맙(Herceptin)을 각각의 마우스에 투여한 경우의 결과를 나타낸다.
[도 7] NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 인간 부유계 암세포주 Daudi를 이식한 후의, 혈액 중의 hCD20＋Daudi 세포 비율의 측정 결과를 도시한 그래프이다. (a)는 PBS를 NOG 마우스, NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 투여한 경우, (b)는 리툭시맙을 NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 투여한 경우의 결과를 나타낸다.
[도 8] Daudi 이식한 각 마우스에 리툭시맙 또는 PBS를 투여하고 Daudi 이식 후 23일째에 부검한 신장의 사진(a), 및 중량의 측정 결과(b)를 나타낸다.
[도 9] NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해 인간 조혈 줄기세포를 이식한 후의 총 백혈구 중의 h(human: 인간) CD45＋세포의 비율을 도시한 그래프이다. (a)는 수컷의 각 마우스, (b)는 암컷의 각 마우스의 결과를 나타낸다.
[도 10] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/마우스에 대해 hCD45＋세포의 상세를 도시한 그래프이다. (a)는 수컷의 hCD33＋골수성(myeloid)계 세포, (b)는 수컷의 hCD19＋B세포, (c)는 수컷의 hCD3＋T세포, (d)는 암컷의 hCD33＋골수성계 세포, (e)는 암컷의 hCD19＋B세포, (f)는 암컷의 hCD3＋T세포의 결과를 나타낸다.
[도 11] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스를 부검하여 조혈 장기(골수·비장·혈액) 중의 hCD45＋세포의 생착율과 생착 세포수를 측정한 그래프이다. (a)는 골수에서의 생착율, (b)는 비장에서의 생착율, (c)는 혈액에서의 생착율, (d)는 골수에서의 생착 세포수, (e)는 비장에서의 생착 세포수, 및 (f)는 혈액에서의 생착 세포수를 나타낸다.
[도 12] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스를 부검하여 조혈 장기(골수·비장·혈액)에서의 hCD3＋T세포, hCD19＋B세포, hCD33＋골수성 세포, hCD56＋NK세포가 차지하는 비율 및 생착 세포수를 측정한 그래프이다. (a)는 골수에서의 각 세포의 생착율, (b)는 비장에서의 각 세포의 생착율, (c)는 혈액에서의 각 세포의 생착율, (d)는 골수에서의 각 세포의 세포수, (e)는 비장에서의 각 세포의 세포수, 및 (f)은 혈액에서의 각 세포의 세포수를 나타낸다.
[도 13] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해 T세포 아집단의 분화 상황을 평가한 그래프이다. (a)는 CD4＋T세포·CD8＋T세포·CD4＋CD8＋DP T세포의 아집단에 대한 비장과 혈액에서의 평가를 나타내고, (b)는 hPD-1에 대한 평가가 나타나 있다.
[도 14] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/마우스에 대해 항인간 PD-1 항체 투여 후 마우스를 부검하고 골수·비장·혈액의 각 조혈 조직 중의, 인간 T세포를 포함한 인간 면역 세포의 증감을 상기 장치를 이용하여 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 해석한 그래프이다. (a)는 골수에서의 hCD45＋세포 생착율, (b)는 비장에서의 hCD45＋세포 생착율, (c)는 혈액에서의 hCD45＋세포 생착율, (d)는 골수에서의 hCD45＋세포수, (e)는 비장에서의 hCD45＋세포수, 및 (f)는 혈액에서의 hCD45＋세포수를 나타낸다.
[도 15] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해 항인간 PD-1 항체 투여 후에 마우스를 부검하여 조혈 장기(골수·비장·혈액)에서의 hCD3＋T세포, hCD19＋B세포, hCD33＋골수성 세포, hCD56＋NK세포가 차지하는 비율 및 생착 세포수를 측정한 그래프이다. (a)는 골수에서의 각 세포의 생착율, (b)는 비장에서의 각 세포의 생착율, (c)는 혈액에서의 각 세포의 생착율, (d)는 골수에서의 각 세포의 세포수, (e)는 비장에서의 각 세포의 세포수, 및 (f)는 혈액에서의 각 세포의 세포수를 나타낸다.
[도 16] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해 항인간 PD-1 항체 투여 후 마우스를 부검하고 비장 조직중의 hCD3＋T세포에 대해 T세포의 아집단을 더 검증한 그래프이다. (a)는 CD4＋T세포·CD8＋T세포·CD4＋CD8＋DP T세포의 아집단에 대한 비장에서의 생착율을 나타내고, (b)는 CD4＋T세포·CD8＋T세포·CD4＋CD8＋DP T세포의 아집단에 대한 비장에서의 세포수를 나타낸다.
[도 17] 인간 PBMC(말초혈 단핵구)를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG 마우스에 대해, (a) 2500000개 이식한 경우의 hCD45＋세포의 생착율, (b) 2500000개 이식한 경우의 hCD45＋세포의 생착 세포수, (c) 1500000개 이식한 경우의 hCD45＋세포의 생착율, (d) 1500000개 이식한 경우의 hCD45＋세포의 생착 세포수를 도시한 그래프이다.
[도 18] 인간 PBMC 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG 마우스를 부검한 경우의, (a) 2500000개 이식한 경우의 hCD3＋T세포, hCD19＋B세포의 hCD45＋세포 중에 차지하는 비율 및 생착율, (b) 2500000개 이식한 경우의 CD4＋T세포·CD8＋T세포·CD4＋CD8＋DP T세포의 아집단에 대한 생착율, (c) 1500000개 이식한 경우의 hCD3＋T세포, hCD19＋B세포의 hCD45＋세포 중에 차지하는 비율 및 생착율, (d) 1500000개 이식한 경우의 CD4＋T세포·CD8＋T세포·CD4＋CD8＋DP T세포의 아집단에 대한 생착율을 나타낸다.
[도 19] (a)는 인간 PBMC 이식한 NOG 마우스, NOG-FcgR KO/마우스 및 NOG-FcgR KO/KO마우스의 hCD3＋T세포의 유세포 분석에 의한 해석 결과를 나타낸다. (b)는 PBMC 이식 후 항인간 PD-1 항체를 투여한 경우의 인간 PD-1＋T세포에 대한 ADCC 활성 유도의 유무를 도시한 그래프이다.
[도 20] NOG-hIL-15 Tg마우스를 교배시킨 마우스에 대해 hCD45＋세포의 생착성(a) 및 NK세포의 비율(b)을 도시한 그래프이다.
[도 21] Daudi 이식한 각 hIL-15 Tg마우스에 리툭시맙 또는 PBS를 투여하고 Daudi 이식 후에 부검한 신장의 중량 측정 결과를 나타낸다.
[도 22] (a)는 HSC-4 이식 NOG(-FcgR＋/＋) 마우스에 PBS 또는 니볼루맙을 투여한 경우, (b)는 HSC-4 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에 PBS 또는 니볼루맙을 투여한 경우의 결과를 도시한 그래프이다.
[도 23] HSC-4 이식 후 4주 경과한 NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG(-FcgR＋/＋) 마우스를 부검한 후의 조혈 장기(비장·혈액) 중 및 종양 중의 hCD45＋CD3＋T세포의 비율(a, b, c) 및 세포수(d, e, f)를 도시한 그래프이다. (a)는 종양 내의 hCD3＋T세포의 비율, (b)는 비장 내의 hCD3＋T세포의 비율, (c)는 혈액 중의 hCD3＋T세포의 비율, (d)는 종양 내의 hCD3＋T세포의 생착수, (e)는 비장 내의 hCD3＋T세포의 생착수, (f) 혈액에서의 hCD3＋T세포의 생착수를 나타낸다.
[도 2] mouse CD45(mCD45)＋백혈구 중의 mFcgRIII 및 mFcgRII 발현 세포의 비율을 도시한 도면이다.
[도 3] 트라스투주맙(인간 IgG 항체) 투여 후의 mCD45＋백혈구 중의 F4/80＋CD11b＋단구/대식 세포 분획에서의 FcgRIII/II(mCD16/32)의 발현 및 인간 IgG 항체의 결합의 유무를 도시한 도면이다. (a)는 NOG-FcgR KO/+마우스에서의 트라스투주맙을 투여하지 않는 음성 대조군, (b)는 인간 IgG 항체 투여 NOG-FcgR KO/+마우스, (c)는 NOG-FcgR KO/KO마우스의 결과를 각각 나타낸다.
[도 4] 마우스 IgG1 단일 클론 항체(mIgG1) 투여 후의 혈장 중의 마우스 IgG 항체의 농도 측정 결과를 도시한 그래프이다. (a)는 NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 마우스 IgG1 항체를 100μg 각각 투여한 경우, (b)는 NOG-FcgR KO/KO마우스에 100μg 각각 투여한 경우, (c)는 NOG-FcgR KO/KO마우스에 20μg 각각 투여한 경우의 결과를 나타낸다.
[도 5] 인간 IgG 항체 의약 3종류를 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG-FcgR KO/+마우스 및/또는 NOG 마우스의 복강 내에 각각 100μg 투여한 경우의, 혈장 중의 각 인간 IgG 항체의 농도 측정 결과를 도시한 그래프이다. (a)는 리툭시맙을 각각 투여한 경우, (b)는 트라스투주맙을 각각 투여한 경우, (c)는 모가물리주맙을 각각 투여한 경우의 결과를 나타낸다.
[도 6] NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 Her2 양성 위암 세포주 4-1 ST를 피하 이식한 후의, 종양 사이즈의 측정 결과를 도시한 그래프이다. (a)는 생리 식염수(Saline)를 각각의 마우스에 투여한 경우, (b)는 트라스투주맙(Herceptin)을 각각의 마우스에 투여한 경우의 결과를 나타낸다.
[도 7] NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 인간 부유계 암세포주 Daudi를 이식한 후의, 혈액 중의 hCD20＋Daudi 세포 비율의 측정 결과를 도시한 그래프이다. (a)는 PBS를 NOG 마우스, NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 투여한 경우, (b)는 리툭시맙을 NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 투여한 경우의 결과를 나타낸다.
[도 8] Daudi 이식한 각 마우스에 리툭시맙 또는 PBS를 투여하고 Daudi 이식 후 23일째에 부검한 신장의 사진(a), 및 중량의 측정 결과(b)를 나타낸다.
[도 9] NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해 인간 조혈 줄기세포를 이식한 후의 총 백혈구 중의 h(human: 인간) CD45＋세포의 비율을 도시한 그래프이다. (a)는 수컷의 각 마우스, (b)는 암컷의 각 마우스의 결과를 나타낸다.
[도 10] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/마우스에 대해 hCD45＋세포의 상세를 도시한 그래프이다. (a)는 수컷의 hCD33＋골수성(myeloid)계 세포, (b)는 수컷의 hCD19＋B세포, (c)는 수컷의 hCD3＋T세포, (d)는 암컷의 hCD33＋골수성계 세포, (e)는 암컷의 hCD19＋B세포, (f)는 암컷의 hCD3＋T세포의 결과를 나타낸다.
[도 11] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스를 부검하여 조혈 장기(골수·비장·혈액) 중의 hCD45＋세포의 생착율과 생착 세포수를 측정한 그래프이다. (a)는 골수에서의 생착율, (b)는 비장에서의 생착율, (c)는 혈액에서의 생착율, (d)는 골수에서의 생착 세포수, (e)는 비장에서의 생착 세포수, 및 (f)는 혈액에서의 생착 세포수를 나타낸다.
[도 12] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스를 부검하여 조혈 장기(골수·비장·혈액)에서의 hCD3＋T세포, hCD19＋B세포, hCD33＋골수성 세포, hCD56＋NK세포가 차지하는 비율 및 생착 세포수를 측정한 그래프이다. (a)는 골수에서의 각 세포의 생착율, (b)는 비장에서의 각 세포의 생착율, (c)는 혈액에서의 각 세포의 생착율, (d)는 골수에서의 각 세포의 세포수, (e)는 비장에서의 각 세포의 세포수, 및 (f)은 혈액에서의 각 세포의 세포수를 나타낸다.
[도 13] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해 T세포 아집단의 분화 상황을 평가한 그래프이다. (a)는 CD4＋T세포·CD8＋T세포·CD4＋CD8＋DP T세포의 아집단에 대한 비장과 혈액에서의 평가를 나타내고, (b)는 hPD-1에 대한 평가가 나타나 있다.
[도 14] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/마우스에 대해 항인간 PD-1 항체 투여 후 마우스를 부검하고 골수·비장·혈액의 각 조혈 조직 중의, 인간 T세포를 포함한 인간 면역 세포의 증감을 상기 장치를 이용하여 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 해석한 그래프이다. (a)는 골수에서의 hCD45＋세포 생착율, (b)는 비장에서의 hCD45＋세포 생착율, (c)는 혈액에서의 hCD45＋세포 생착율, (d)는 골수에서의 hCD45＋세포수, (e)는 비장에서의 hCD45＋세포수, 및 (f)는 혈액에서의 hCD45＋세포수를 나타낸다.
[도 15] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해 항인간 PD-1 항체 투여 후에 마우스를 부검하여 조혈 장기(골수·비장·혈액)에서의 hCD3＋T세포, hCD19＋B세포, hCD33＋골수성 세포, hCD56＋NK세포가 차지하는 비율 및 생착 세포수를 측정한 그래프이다. (a)는 골수에서의 각 세포의 생착율, (b)는 비장에서의 각 세포의 생착율, (c)는 혈액에서의 각 세포의 생착율, (d)는 골수에서의 각 세포의 세포수, (e)는 비장에서의 각 세포의 세포수, 및 (f)는 혈액에서의 각 세포의 세포수를 나타낸다.
[도 16] 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해 항인간 PD-1 항체 투여 후 마우스를 부검하고 비장 조직중의 hCD3＋T세포에 대해 T세포의 아집단을 더 검증한 그래프이다. (a)는 CD4＋T세포·CD8＋T세포·CD4＋CD8＋DP T세포의 아집단에 대한 비장에서의 생착율을 나타내고, (b)는 CD4＋T세포·CD8＋T세포·CD4＋CD8＋DP T세포의 아집단에 대한 비장에서의 세포수를 나타낸다.
[도 17] 인간 PBMC(말초혈 단핵구)를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG 마우스에 대해, (a) 2500000개 이식한 경우의 hCD45＋세포의 생착율, (b) 2500000개 이식한 경우의 hCD45＋세포의 생착 세포수, (c) 1500000개 이식한 경우의 hCD45＋세포의 생착율, (d) 1500000개 이식한 경우의 hCD45＋세포의 생착 세포수를 도시한 그래프이다.
[도 18] 인간 PBMC 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG 마우스를 부검한 경우의, (a) 2500000개 이식한 경우의 hCD3＋T세포, hCD19＋B세포의 hCD45＋세포 중에 차지하는 비율 및 생착율, (b) 2500000개 이식한 경우의 CD4＋T세포·CD8＋T세포·CD4＋CD8＋DP T세포의 아집단에 대한 생착율, (c) 1500000개 이식한 경우의 hCD3＋T세포, hCD19＋B세포의 hCD45＋세포 중에 차지하는 비율 및 생착율, (d) 1500000개 이식한 경우의 CD4＋T세포·CD8＋T세포·CD4＋CD8＋DP T세포의 아집단에 대한 생착율을 나타낸다.
[도 19] (a)는 인간 PBMC 이식한 NOG 마우스, NOG-FcgR KO/마우스 및 NOG-FcgR KO/KO마우스의 hCD3＋T세포의 유세포 분석에 의한 해석 결과를 나타낸다. (b)는 PBMC 이식 후 항인간 PD-1 항체를 투여한 경우의 인간 PD-1＋T세포에 대한 ADCC 활성 유도의 유무를 도시한 그래프이다.
[도 20] NOG-hIL-15 Tg마우스를 교배시킨 마우스에 대해 hCD45＋세포의 생착성(a) 및 NK세포의 비율(b)을 도시한 그래프이다.
[도 21] Daudi 이식한 각 hIL-15 Tg마우스에 리툭시맙 또는 PBS를 투여하고 Daudi 이식 후에 부검한 신장의 중량 측정 결과를 나타낸다.
[도 22] (a)는 HSC-4 이식 NOG(-FcgR＋/＋) 마우스에 PBS 또는 니볼루맙을 투여한 경우, (b)는 HSC-4 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에 PBS 또는 니볼루맙을 투여한 경우의 결과를 도시한 그래프이다.
[도 23] HSC-4 이식 후 4주 경과한 NOG-FcgR KO/KO마우스 및 NOG(-FcgR＋/＋) 마우스를 부검한 후의 조혈 장기(비장·혈액) 중 및 종양 중의 hCD45＋CD3＋T세포의 비율(a, b, c) 및 세포수(d, e, f)를 도시한 그래프이다. (a)는 종양 내의 hCD3＋T세포의 비율, (b)는 비장 내의 hCD3＋T세포의 비율, (c)는 혈액 중의 hCD3＋T세포의 비율, (d)는 종양 내의 hCD3＋T세포의 생착수, (e)는 비장 내의 hCD3＋T세포의 생착수, (f) 혈액에서의 hCD3＋T세포의 생착수를 나타낸다.
본 발명의 유전자 개변 면역 부전 마우스로서는 IL-2 수용체 γ쇄 유전자에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손되고, 또한 FcgR이 기능적으로 발현하지 않는 마우스라면 특별히 제한되지 않으며, 상기 유전자 개변 면역 부전 마우스로서는 특정 면역 기능을 하는 단백질을 코딩하는 야생형 유전자의 염기 서열에 대해, 1 또는 2 이상의 염기의 다른 염기로의 치환, 1 또는 2 이상의 염기의 결실, 1 또는 2 이상의 염기의 삽입, 아미노산의 읽기 프레임이 어긋난 아웃 오브 프레임 및/또는 이들 조합 등의 유전자 변이가 도입되는 유전자 개변에 의해 야생형 유전자가 발휘하는 면역 작용이 기능하지 않는 마우스를 말한다. 아울러 상기 야생형으로서는 집단에서 보여지는 가장 일반적인 대립 유전자 또는 다형(多型)으로서 돌연변이에 의해 또는 인위적 조작에 의한 유전자 개변이 이루어져 있지 않은 마우스를 들 수 있다.
본 발명은 또한 상기 유전자 개변 면역 부전 마우스와 유전자 개변 면역 부전 마우스에 인간 IL-15 유전자를 도입한 유전자 개변 면역 부전 마우스(I)를 교배함으로써 제작된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)도 포함한다.
본 발명에서의 마우스로서는 설치목 쥐과 생쥐(Mus musculus)속에 속한 포유동물을 들 수 있다.
본 발명에서의 IL-2 수용체 γ쇄 유전자에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손된 마우스로서는 IL-2 수용체 γ쇄가 기능적으로 발현하지 않는 마우스를 들 수 있다.
상기 IL-2 수용체는 알파(α)쇄, 베타(β)쇄 및 감마(γ)쇄로 불리는 3종류의 단백질로 구성된 것이 인간 및 마우스로 알려져 있으며, 상기 IL-2 수용체 γ쇄는 γ쇄 단독으로는 IL-2와의 결합 능력을 가지지 않지만, β쇄와 γ쇄의 헤테로 2량체는 IL-2에 대한 중(中)친화성 수용체가 되며, α쇄와 β쇄와 γ쇄의 헤테로 3량체는 IL-2에 대한 고(高)친화성 수용체가 된다.
상기 IL-2는 사이토카인의 일종이며, IL-2의 작용으로서는 세포 표면에 존재하는 IL-2 수용체와 결합함으로써 IL-2의 시그널을 세포질에서 핵 안으로 전달하여 T세포나 B세포의 증식이나 NK세포의 활성화로 유도하는 것 등을 들 수 있다. 따라서 IL-2 수용체 γ쇄가 기능적으로 발현하지 않는 경우로서는 IL-2 수용체 γ쇄 유전자에 변이가 도입됨으로써 IL-2 수용체가 IL-2와의 결합 능력을 상실한 경우, 또는 시그널 전달이 일어나지 않는 경우를 들 수 있다.
상기 FcgR이 기능적으로 발현하지 않는 유전자 개변 면역 부전 마우스로서는 FcR을 코딩하는 유전자의 변이에 의해 FcgR이 수용체 단백질로서 기능하지 않게 된 마우스를 들 수 있다. FcgR의 수용체 단백질로서의 기능으로서는 항원과 IgG 항체가 결합한 복합체에 특이적으로 결합함으로써 세포 내에 시그널을 전달하는 것을 들 수 있는 본 발명의 마우스에서는 상기 변이가 양대립 유전자 좌위에 있는 것이 필수이다.
상기 FcgR은 T세포, B세포, NK세포, 대식 세포, 수상 세포 등의 면역계 세포의 표면상에 통상 존재하는 수용체 단백질로서 유전자 구조의 유사성에 기초하여 FcgrI 유전자가 코딩하는 FcgRI(CD64 항원), FcgrII 유전자가 코딩하는 FcgRII(CD32 항원), FcgrIII 유전자가 코딩하는 FcgRIII(CD16 항원)의 3종으로 크게 분류된다. 아울러 FcR 공통 γ쇄(FcRg 혹은 FceRIg라고도 한다)가 FcgRI과 FcgRIII에 공통된 구성 인자를 이룬다.
본 발명의 마우스에서는 또한 T세포 및 B세포의 항원 수용체 유전자의 재구성에 관련된 유전자의 변이가 양대립 유전자 좌위에 있는 것이 필수이며, 예를 들면 해당 변이로서 SCID 변이 또는 RAG 변이를 들 수 있다. 상기 SCID 변이는 중증 복합 면역 부전(Severe Combined Immuno-Deficiency: SCID)을 나타내는 마우스에서 발견된 DNA 의존성 단백질키나제(Protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide: Prkdc) 유전자의 변이이다.
상기 RAG 변이로서는 Rag(Recombination activating gene)-1 유전자 또는 Rag-2 유전자에서의 변이를 들 수 있다. 상기 2개의 유전자는 미숙한 임파구에서 발현하는 유전자로서 면역 글로블린 유전자 및 T세포 수용체의 재구성에 필수인 작용을 가지며 T세포나 B세포의 성숙에 불가결한 유전자이다.
상기 SCID 변이 및/또는 RAG 변이를 비롯한 T세포 및 B세포의 항원 수용체 유전자의 재구성에 관련된 유전자의 변이가 양대립 유전자 좌위에 있는 마우스는 DNA의 수복 이상에 의해 T세포 및 B세포의 유전자 재구성을 할 수 없기 때문에 T세포와 B세포가 성숙 단계에 이르지 않고 T세포 및 B세포의 기능이 누락되는 변이이다. 본 발명의 마우스에서 상기 변이는 모두 양대립 유전자 좌위에 있는 것이 필수이다.
본 발명의 IL-2 수용체 γ쇄 유전자에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손되고, 또한 FcgR이 기능적으로 발현하지 않는 유전자 개변 면역 부전 마우스를 제작하는 방법으로서는 IL-2 수용체 γ쇄 유전자에 도입된 변이와 FcgR 유전자의 변이를 종래 공지의 게놈 편집법에 의해 마우스에 도입하는 방법이나, 종래 공지의 마우스를 이용하여 교배에 의해 제작하는 방법을 들 수 있으며, 또 공지의 게놈 편집법에 의해 마우스에 도입하는 방법과 교배에 의한 방법을 조합하여 제작할 수도 있다.
상기 공지의 게놈 편집법으로서는 전사 활성화형 이펙터 뉴클레아제를 이용하는 TALEN 시스템, Zn핑거 뉴클레아제 시스템, CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins) 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 CRISPR/Cas9은, DNA 2본쇄를 절단(Double Strand Breaks)하여 게놈 서열의 임의의 장소를 삭제, 치환, 삽입함으로써 게놈을 편집함으로써 IL-2 수용체 γ쇄 유전자에 도입된 변이나 FcgR 유전자의 변이를 마우스 ES세포나 마우스 iPS 세포에 도입할 수 있는 점에서 바람직한 유전자 개변 기술로서 들 수 있다.
상기 종래 공지의 마우스를 이용하여 교배에 의해 제작하는 방법으로서는 IL-2 수용체 γ쇄의 유전자에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손되고 또한 FcgR(IgG Fc수용체)이 기능적으로 발현하지 않는 유전자 개변 면역 부전 마우스를 제작할 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않고, IL-2 수용체 γ쇄 유전자에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손된 마우스와 FcgR이 기능적으로 발현하지 않는 마우스(FcgR KO마우스)를 교배하는 방법을 예시할 수 있다. 아울러 본 명세서에서 "FcgR KO마우스"란, 야생형(＋/＋)에 대해 양대립 유전자 좌위의 변이에 의한 기능의 결손(KO/KO)에 의해 FcgR의 기능이 발현하지 않는 것을 의미하며, 헤테로형(KO/+)은 포함하지 않는다.
상기 IL-2 수용체 γ쇄에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손된 마우스로서는 구체적으로는 NOG 마우스, C57BL/6-IL2rgnull 마우스, C57BL/6-Rag2nullIL2rgnull 마우스, NOD/Shi-Rag2nullIL2rgnull 마우스, BALB/c-Rag2null-IL2rgnull 마우스, BALB/c-IL2rgnull 마우스 등의 공지의 마우스를 들 수 있지만, 양대립 유전자 좌위에 SCID 변이 혹은 RAG 변이를 더 가지는 점에서 NOG 마우스, C57BL/6-Rag2nullIL2rgnull 마우스, NOD/Shi-Rag2nullIL2rgnull 마우스, BALB/c-Rag2null-IL2rgnull 마우스가 바람직하고, T세포 및 B세포의 기능이 누락되고 NK세포의 활성이 소실되어 대식 세포의 기능이 감퇴하고, 수상 세포의 기능이 감퇴한 NOG 마우스가 특히 바람직하다.
상기 FcgR의 유전자의 구체예로서는 FcerI 유전자, FcgrI 유전자, FcgrII 유전자, FcgrIII 유전자를 들 수 있으며 상기 FcgR KO마우스의 구체예로서는 FcerI 유전자가 결손된 NOD-Fcer1gnull/null 마우스, FcgrII 유전자가 결손된 NOD-Fcgr2bnull/null 마우스, FcgrIII 유전자가 결손된 NODIII-／-마우스, FcerI 유전자와 FcgrII 유전자가 결손된 NOD-Fcer1gnull/nullFcgr2bnull/null 마우스를 들 수 있지만, 기능적으로 발현하지 않는 FcgR이 Fcer1g 및 Fcgr2b를 포함하고 있는 NOD-Fcer1gnull/nullFcgr2bnull/null 마우스를 바람직하게 예시할 수 있다.
IL-2 수용체 γ쇄의 유전자에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손되고 또한 FcgR이 기능적으로 발현하지 않는 유전자 개변 면역 부전 마우스의 교배에 의한 제작 방법으로서 IL-2 수용체 γ쇄가 결손되어 있는 마우스로서 예를 들면 NOG 마우스를 이용하고, FcgR이 기능적으로 발현하지 않는 마우스(FcgR KO/KO마우스(유전자형), FcgR KO마우스(표현형))로서 예를 들면 기능하지 않는 FcgR의 유전자가 Fcer1g 및 Fcgr2b인 NOD-Fcer1gnull/nullFcgr2bnull/null 마우스를 이용한 경우의 제작 방법을 예로 들어 이하에 설명하기로 한다. 아울러 IL-2 rg가 X염색체에 존재하기 때문에 수컷 마우스의 유전자형이 il2rgnull/Y, 암컷 마우스의 유전자형은 il2rgnull/null인 경우에 IL-2rg가 양대립 유전자 좌위에서 결손된 마우스가 된다.
상기 NOG 마우스는 인간의 1형 당뇨병(인슐린 의존형 당뇨병)의 병태(病態)와 유사하기 때문에 NOD(Non Obese Diabetes)로 명명된 마우스(예를 들면, Jikken Dobutsu. 29: 1-13, 1980 참조)와 DNA 의존성 단백질키나제(Prkdc) 유전자의 변이에 의해 T세포 및 B세포의 기능이 결실되며, 중증의 면역 부전을 보이는 SCID 마우스를 조합한 NOD-scid 마우스에 면역 부전증 XSCID(X-linked severe combined immunodeficiency)의 원인 유전자이며, 여러 종류의 사이토카인 리셉터 공통 도메인인 IL-2 리셉터 γ쇄를 녹아웃시킨 마우스(IL-2RγKO마우스)(Ohbo K et al., Blood 1996)를, Cross Intercross법(Inbred Strains in Biomedical Research, M.F.W.Festing, 1979, The Macmillan Press, LondonAnd Basingstoke)에 따라 역교배하는 방법에 의해 제작된 마우스이며, 구체적으로는 일본 특허 제3753321호 공보를 참조함으로써 제작할 수 있으며 또 공익 재단법인 실험동물 중앙연구소로부터 입수 가능하다.
상기 NOD-Fcer1gnull/nullFcgr2bnull/null 마우스는 도호쿠 대학의 다카이 도시유키(高井俊行)에 의해 제작된 마우스로서 국립 연구개발 법인 이화학 연구소 바이오 자원 연구 센터(RIKEN BRC)에 보존되어 있으며 동결배 또는 개체 복원 마우스로서 입수 가능하다.
NOG 마우스와 NOD-Fcer1gnull/nullFcgr2bnull/null 마우스를 이용한 경우의 본 발명의 유전자 개변 면역 부전 마우스의 제작 방법으로서는 이하의 A)∼f)의 공정을 순서대로 구비하는 방법을 예시할 수 있다.
a) 수컷의 NOD-Fcer1gnull/nullFcgr2bnull/null 마우스와 암컷의 NOG 마우스를 교배하는 공정;
b) 암컷의 NOD-scid/+, il2rgnull/+-Fcer1gnull/+Fcgr2bnull/+ 마우스를 선택하는 공정;
c) b)에서 선택된 마우스와 수컷의 NOG 마우스를 역교배하는 공정;
d) 수컷의 NOD-scid, il2rgnull/Y-Fcer1gnull/+Fcgr2bnull/+ 마우스와 암컷의 NOD-scid, il2rgnull/null-Fcer1gnull/+Fcgr2bnull/+ 마우스를 선택하는 공정;
e) d)에서 선택된 수컷의 마우스와 암컷의 마우스를 남매 교배하는 공정;
f) 1) 수컷의 NOD-scid, il2rgnull/Y-Fcer1gnull/null, Fcgr2bnull/null과 2) 암컷의 NOD-scid, il2rgnull/null-Fcer1gnull/null, Fcgr2bnull/null을 "NOG-FcgR KO/KO마우스"로서 선택하는 공정;
상기 제작 공정에서의 마우스의 각 유전자형에 대해서는 적당한 프라이머를 이용한 PCR법을 이용한 통상의 방법에 의해 확인할 수 있다.
본 발명은 상기 유전자 개변 면역 부전 마우스에서 유래하는 조직이나 체세포나 생식 세포에 관한 것이기도 하다.
상기 유전자 개변 면역 부전 마우스에 유래한 조직으로서는 간장, 비장, 뇌, 신장, 폐, 피부, 방광, 위, 담낭, 취장, 부신, 전립선, 대장, 소장, 식도, 근육, 유선, 흉선, 림프절, 신경, 기관, 안구, 뼈, 심장, 지방, 생식기(예를 들면 난소, 자궁, 정소, 정낭선), 배 또는 갑상선을 예시할 수 있지만, 비장, 골수, 간장을 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 유전자 개변 면역 부전 마우스에 유래한 체세포로서는 간엽계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 지방조직 유래 간질세포, 지방조직 유래 간질 줄기세포, 신경 줄기세포, 정자 줄기세포 등의 조직 줄기세포나, 조직 전구 세포나, 근육 세포, 선유아 세포, 상피 세포, 임파구, 백혈구, T세포, B세포, 골수성 세포 등을 들 수 있다.
상기 유전자 개변 면역 부전 마우스에 유래한 생식 세포로서는 마우스의 정자, 난자를 들 수 있다.
본 발명의 마우스의 유리한 특성으로서는 마우스 FcgR을 통해 작용하는 마우스 탐식 세포가 암항원 특이적인 인간 항체에 결합한 고형 종양이나 부유 암세포(총칭하여 "종양"이라고도 함)에 대한 ADCC 활성을 나타내지 않는 것, 또한 종래 공지의 마우스와 비교하여 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착되는 것을 들 수 있다.
본 발명의 마우스가 상기 ADCC 활성을 나타내는지 여부를 확인하는 방법으로서는 본 발명의 마우스와 비교 대상 마우스 각각에 인간 고형 암세포주를 피하 이식 등으로 이식하여 인간 항체를 투여 후 적시에 상기 인간 고형 암세포주에 의한 종양의 사이즈를 계측하는 방법을 들 수 있으며, 예를 들면 인간 항체 투여 후 약 20일 정도의 본 발명의 마우스의 종양 덩어리의 사이즈(용적)가 마우스 FcgR이 발현하는 비교 대상 마우스에서의 종양 사이즈의 3배, 바람직하게는 4배, 보다 바람직하게는 5배 이상인 경우에 상기 종양에 대한 ADCC 활성을 나타내지 않는다고 판정할 수 있다.
본 발명의 마우스가 상기 ADCC 활성을 나타내는지 여부를 확인하는 다른 방법으로서는 본 발명의 마우스와 비교 대상 마우스 각각에 인간 부유계 암세포주를 혈액중에 이식하여 인간 항체를 투여 후 적시에 혈액 중의 인간 부유계 암세포의 증식 상황을 확인하는 방법을 들 수 있으며, 예를 들면 인간 항체 투여 후 약 20일 정도의 본 발명의 마우스의 총 백혈구 중의 인간 부유계 암세포의 비율이 마우스 FcgR이 발현하는 비교 대상 마우스의 총 백혈구 중의 인간 부유계 암세포의 비율의 3배, 바람직하게는 4배, 보다 바람직하게는 5배, 한층 더 바람직하게는 8배 이상인 경우를 들 수 있으며, 상기 인간 부유계 암세포에 대한 ADCC 활성을 나타내지 않는다고 판정할 수 있다.
본 발명의 마우스가 상기 ADCC 활성을 나타내는지 여부를 확인하는 또 다른 방법으로서는 인간 부유계 암세포를 혈액 중에 이식하고 인간 항체를 투여한 마우스에 대해 이식 후 23일째의 암세포가 국소적으로 존재하는 조직의 중량을 측정하여 마우스 FcgR이 발현하는 비교 대상 마우스에서의 해당 조직의 중량과 비교하여 본 발명의 마우스에서의 해당 조직의 중량이 현저히 무거운 경우에 ADCC 활성을 나타내지 않는다고 판단하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 인간 항체 투여 후 약 20일 정도의 본 발명의 마우스에서의 암세포가 국소적으로 존재하는 조직 중 하나인 신장의 중량이 비교 대상 마우스의 신장의 1.5배, 바람직하게는 1.7배, 보다 바람직하게는 2배인 경우를 들 수 있으며, 상기 경우에 인간 부유계 암세포에 대한 ADCC 활성을 나타내지 않는다고 판정할 수 있다.
본 발명의 마우스에는 IL-2 수용체 γ쇄 유전자에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손되고 또한 FcgR이 기능적으로 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 유전자 개변 면역 부전 마우스에 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착되어 있는, 인간 세포 생착 면역 부전 마우스를 포함할 수 있으며, 상기 마우스의 제작 방법으로서는 인간 세포 이식 전의 본 발명의 유전자 개변 면역 부전 마우스에 인간 세포의 생착 능력을 향상시키기 위해 X선 등의 골수내 환경을 파괴하는 방사선을 조사하고 방사선 조사 후에 인간 세포를 이식하는 방법을 들 수 있다. 방사되는 방사선의 강도로서는 바람직하게는 0.5∼2.0 Gy를 예시할 수 있으며, 이식 시기로는 방사선 조사 후 24시간 이내가 바람직하다. 아울러 본 발명에서 본 발명의 마우스에 이식할 수 있는 인간 세포로서는 인간 조혈 줄기세포, 인간 말초혈 단핵구, 인간 NK세포를 예시할 수 있다.
상기 유전자 개변 면역 부전 마우스에 이식된 인간 세포의 생착성을 평가하는 방법으로서는 마우스에서의 인간 세포를 항체가 결합되는 특이적인 에피토프 부위를 가진 세포 표면 마커의 존재에 의해 동정(同定)하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 말초혈의 총백혈구 중에서의 인간 백혈구(hCD45＋세포)의 생착성은 항hCD45 항체를 이용한 유세포 분석에 의한 해석에 의해 hCD45＋세포가 존재하는 경우에 생착되어 있다고 판단할 수 있다. 인간 혈액 세포의 근본인 인간 조혈 줄기세포(hCD34＋세포)가 유전자 개변 면역 부전 마우스에 생착된 경우 백혈구나 적혈구나 혈소판을 포함하는 인간 혈액 세포는 생착된 인간 조혈 줄기세포로부터 분화, 증폭되는데, 면역 세포인 백혈구는 마우스의 혈액중이나 각 면역 조직에 저장되기 때문이다.
본 발명의 마우스에서 인간 세포(조직)가 현저히 높은 생착성을 가진 경우로서는 NOG 마우스와 비교한 경우 이식 후 16주째의 Two-way ANOVA의 해석(p＜0.05)에 의해 유의미하게 높은 인간 조직의 생착성을 나타내는 것을 들 수 있다. 예를 들면, NOD-Fcer1gnull/nullFcgr2bnull/null 마우스에서는 인간 조직의 생착성은 거의 인정되지 않는다는 지견으로는 NOG 마우스와 비교하여 상기 높은 인간 조직의 생착성을 본건 마우스가 나타내는 것은 당업자가 예상할 수 없었던 효과이다.
상기 인간 세포가 인간 조혈 줄기세포인 경우의 인간 조혈 줄기세포를 이식하는 방법으로서는 성체 마우스에 X선 조사 후 1일 이내에 1000∼250000개, 바람직하게는 10000∼100000개, 보다 바람직하게는 25000∼75000개의 hCD34＋조혈 줄기세포를 꼬리정맥으로부터 이식하는 방법을 들 수 있다.
상기 인간 조혈 줄기세포가 생착된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스의 특징으로서는 비장에서 B세포로의 분화의 지표가 되는 hCD19＋세포수가 현저히 많이 검출되는 것을 들 수 있으며, 현저히 많은 경우로서는 NOG 마우스에 비해 1.5배, 바람직하게는 2배, 보다 바람직하게는 2.5배 이상 검출되는 경우를 들 수 있다. 상기 hCD19＋세포가 존재하는지 여부는 예를 들면, 항hCD19 항체를 이용한 유세포 분석에 의한 해석에 의해 확인할 수 있다.
상기 인간 조혈 줄기세포가 생착된 마우스의 비장의 특징으로서는 hCD3＋T세포로부터 hCD4＋T세포나 hCD8＋T세포나 hCD4＋CD8＋이중 양성(double positive: DP) T세포의 아집단으로 정상적으로 더 분화되어 있으며, 혈액 면역계가 재구축되는 것을 들 수 있다. 그리고 상기 분화된 hCD4＋T세포나 hCD8＋T세포나 hCD4＋CD8＋ 이중 양성(double positive: DP) T세포에서는 인간 T세포에 발현되는 Programmed cell death 1(PD-1) 단백 분자(hPD-1)가 발현된다. 상기 hCD3＋T세포, hCD4＋T세포, hCD8＋T세포, hCD4＋CD8＋ 이중 양성 T세포, hCD19＋세포, PD-1＋세포가 존재하는지 여부는 예를 들면, 일련의 항체를 이용한 유세포 분석에 의한 해석에 의해 확인할 수 있다.
상기 인간 세포가 인간 말초혈 단핵구인 경우의 인간 말초혈 단핵구를 이식하는 방법으로서는 100000∼1×107개, 바람직하게는 500000∼5000000개, 바람직하게는 1000000∼3000000개, 보다 바람직하게는 1250000∼2750000개, 한층 더 바람직하게는 1300000∼2500000개, 특히 바람직하게는 1450000∼1750000개의 인간 말초혈 단핵구를 꼬리정맥에서 이식하는 방법을 들 수 있다.
인간 말초혈 단핵구가 생착된 마우스로서는 인간 말초혈 단핵구 이식 후 6주째에 hCD45 양성의 백혈구(hCD45＋세포)의 생착 세포수가 NOG 마우스에서의 생착 세포수의 2배, 바람직하게는 3배, 보다 바람직하게는 5배, 한층 더 바람직하게는 10배인 것; 인간 말초혈 단핵구 이식 후 6주째인 인간 말초혈 단핵구 중의 hCD45＋세포의 비율이 1% 이상, 바람직하게는 2% 이상, 보다 바람직하게는 4% 이상, 한층 더 바람직하게는 5% 이상, 특히 바람직하게는 6% 이상인 것 및/또는 hCD45＋세포의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 한층 더 바람직하게는 97% 이상이 hCD3＋T세포로 점유되어 있는; 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착되어 있는 인간 세포 생착 면역 부전 마우스를 들 수 있다.
이상과 같이 유전자 개변 면역 부전 마우스에 이식된 인간 세포의 생착성을 평가함으로써 상기 인간 세포 생착 면역 부전 마우스를 이용하여 인간 세포에 대한 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 활성이나 작용 메커니즘을 평가할 수 있다.
본 발명은 상기 인간 세포 생착 면역 부전 마우스에 유래하는 조직이나 체세포나 생식 세포에 관한 것이기도 하다. 상기 인간 세포에 대한 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 활성이나 작용 메커니즘의 평가는 상기 인간 세포 생착 면역 부전 마우스에 유래한 조직이나 체세포나 생식 세포를 이용하여 행할 수도 있다.
상기 인간 세포 생착 면역 부전 마우스에 유래한 조직으로서는 간장, 비장, 뇌, 신장, 폐, 피부, 방광, 위, 담낭, 취장, 부신, 전립선, 대장, 소장, 식도, 근육, 유선, 흉선, 림프절, 신경, 기관, 안구, 뼈, 심장, 지방, 생식기(예를 들면 난소, 자궁, 정소, 정낭선), 배 또는 갑상선을 예시할 수 있지만, 비장, 골수, 간장을 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 인간 세포 생착 면역 부전 마우스에서 유래한 체세포로서는 간엽계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 지방조직 유래 간질세포, 지방조직 유래 간질 줄기세포, 신경 줄기세포, 정자 줄기세포 등의 조직 줄기세포나, 조직 전구 세포나, 근육 세포, 선유아 세포, 상피 세포, 임파구, 백혈구, T세포, B세포, 골수성 세포 등을 들 수 있다.
상기 인간 세포 생착 면역 부전 마우스에서 유래한 생식 세포로서는 마우스의 정자, 난자를 들 수 있다.
상기 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)로서는 본 발명의 유전자 개변 면역 부전 마우스와 인간 IL-15 유전자가 도입된 유전자 개변 면역 부전 마우스(I)를 교배함으로써 제작된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)라면 특별히 제한되지 않으며, 인간 IL-15 유전자가 도입된 유전자 개변 면역 부전 마우스(I)로서는 NOG 마우스에 인간 IL-15 유전자를 도입한 NOG-hIL-15 Tg마우스("NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg마우스"라고도 한다)(예를 들면, 일본 특개 2016-220559 공보 참조)를 구체적으로 들 수 있다. 또 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)로서는 상기 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)에 인간 말초혈 단핵구나 인간 NK세포를 비롯한 인간 세포가 생착되어 있는 마우스를 들 수 있다. 상기 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)나 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)도 본 발명의 마우스에 포함시킬 수 있다.
상기 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)에 인간 NK세포를 이식한 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)로서는 hCD56＋세포가 생착된 hCD45＋세포의 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상 검출되는 마우스가 바람직하고, 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)로서는 NOG-FcgR KO/KO hIL-15 Tg마우스를 바람직하게 예시할 수 있다. 상기 hCD56＋세포가 존재하는지 여부는 예를 들면 항hCD56 항체를 이용한 유세포 분석에 의한 해석에 의해 확인할 수 있다.
상기 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)나 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)에서는 마우스 탐식 세포에 영향을 받지 않고 인간 NK세포만이 이펙터 세포가 되어 ADCC 활성을 평가할 수 있다.
즉, 상기 인간 NK세포가 이펙터 세포가 된 상기 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)나 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)에서는 마우스 FcgR을 통해 작용하는 마우스 탐식 세포가 암항원 특이적인 인간 항체에 결합한 종양에 대한 ADCC 활성을 나타내지 않는다. 따라서 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)나 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)를 이용하여 종양에 대한 항체 의약의 후보 약제를 스크리닝할 수 있다.
예를 들면, 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)에 인간 암세포를 이식 후, 인간 NK세포와 항체 의약의 후보 약제로서 암항원 특이적인 인간 항체를 투여함으로써 인간 NK세포만이 이펙터 세포인 경우의 인간 암세포에 대한 ADCC 활성을 평가할 수 있다. 구체적으로는 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)에 인간 암세포를 이식 후, 인간 NK세포와 상기 후보 약제를 투여하여 암세포가 국소적으로 존재하는 조직의 중량 증가가 억제된 경우에 해당 후보 약제가 암세포에 대한 억제 효과를 가진다고 판정할 수 있다. 동일한 판정 기준에 의해 NK세포가 생착된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)에 인간 암세포를 이식 후, 암항원 특이적인 인간 항체를 항체 의약의 후보 약제로서 투여함으로써 인간 NK세포만이 이펙터 세포인 경우의 인간 암세포에 대한 ADCC 활성을 평가하여 상기 후보 약제를 스크리닝할 수 있다.
또 본 발명은 상기 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)나 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)에 유래하는 조직이나 체세포나 생식 세포에도 관한 것이다. 상기 후보 약제의 스크리닝은 상기 조직이나 체세포나 생식 세포를 이용하여 실시할 수도 있다.
상기 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)나 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)에서 유래하는 조직으로서는 간장, 비장, 뇌, 신장, 폐, 피부, 방광, 위, 담낭, 췌장 부신, 전립선, 대장, 소장, 식도, 근육, 유선, 흉선, 림프절, 신경, 기관, 안구, 뼈, 심장, 지방, 생식기(예를 들면 난소, 자궁, 정소, 정낭선), 배 또는 갑상선을 예시할 수 있지만, 비장, 골수, 간장을 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)나 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)에서 유래하는 체세포로서는 간엽계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 지방조직 유래 간질세포, 지방조직 유래 간질 줄기세포, 신경 줄기세포, 정자 줄기세포 등의 조직 줄기세포나, 조직 전구 세포나, 근육 세포, 선유아 세포, 표피 세포, 임파구, 혈액 세포, 및 이들 세포로부터 분화된 NK세포, T세포, B세포, 골수성 세포 등을 들 수 있다.
상기 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)나 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)에서 유래하는 생식 세포로서는 정자, 난자를 들 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만 본 발명의 기술적 범위는 이들 예시로 한정되지는 않는다.
실시예
［실시예 1］
［NOG-FcgR KO/KO마우스의 제작］
NOG 마우스를 실험동물 중앙연구소로부터 입수하였다. NOD-Fcer1gnull/nullFcgr2bnull/null 마우스(NOD-FcgR KO/KO마우스)의 동결 보존배(RBRC02330)를 RIKEN BRC를 통해 입수하였다.
(NOG-FcgR KO/KO마우스의 제작 순서)
상기 NOG 마우스와 상기 NOD-Fcer1gnullFcgr2bnull 마우스로부터 NOG-FcgR KO/KO마우스를 이하의 공정에 의해 제작하였다.
(1)(제0세대(F=0)∼제1세대(F=1)
동결 보존배로부터 개체 복원한 수컷의 NOD-FcgR KO/KO마우스를 암컷의 NOG 마우스와 교배함으로써 4마리의 암컷의 NOD-scid/+, il2rgnull/+Fcer1gnull/+Fcgr2bnull/+ 마우스(F=1)를 얻었다.
(2)(제1세대∼제2세대)
상기 4마리의 암컷의 각 마우스에 대해 NOG 마우스와 역교배하여 2마리의 수컷의 NOD-scid, il2rgnull/Y-Fcer1gnull/+Fcgr2bnull/+ 마우스, 2마리의 암컷의 NOD-scid, il2rgnull/null-Fcer1gnull/+Fcgr2bnull/+ 마우스(이하 "NOG-FcgR KO/마우스(유전자형)"라고 총칭함)를 얻었다.
(3)(제2세대∼제3세대))
상기 NOG-FcgR KO/마우스끼리 남매 교배하여 수컷의 NOD-scid, il2rgnull/Y-Fcer1gnull/null, Fcgr2bnull/null과 암컷의 NOD-scid, il2rgnull/null-Fcer1gnull/null, Fcgr2bnull/null을 선택하여 "NOG-FcgR KO/KO마우스(유전자형), NOG-FcgR KO마우스(표현형)"를 얻었다.
상기 각 공정에서의 마우스의 유전자 검사는 마우스의 조직편에 100μg/mL의 단백질키나제K 함유 Lysis buffer를 첨가하여 55℃에서 용해시킨 후, 85℃로 가열하여 조제한 조직 용해액을 이용하여 각 유전자에 대해 야생형이나 헤테로 결손형이나 호모 결손형 등에 대해 이하의 프라이머를 이용하여 PCR법으로 측정함으로써 검증을 하였다.
(1) Fcer1g 검사용 프라이머
5'-CTCGTGCTTTACGGTATCGCC-3' (서열 번호 1) (Fcer1g 검사용 프라이머 1)
5'-CCTACTCTACTGTCGACTCAAG-3' (서열 번호 2) (Fcer1g 검사용 프라이머 2)
5'-GGCTGGCTATAGCTGCCTTTC-3' (서열 번호 3) (Fcer1g 검사용 프라이머 3)
(Fcer1g 검사용 PCR 반응액)
12.5μL Go-Taq용 ×2 buffer
1.0μL Fcer1g 검사용 프라이머 1 (5μM)
1.0μL Fcer1g 검사용 프라이머 2 (5μM)
1.0μL Fcer1g 검사용 프라이머 3 (5μM)
8.0μL Distilled H2O
1.5μL 게놈 DNA(조직 용해액)
상기 시약을 혼합하여 PCR 반응액을 조제하였다.
(PCR 증폭 조건)
25μL의 상기 PCR 반응액을 이용하여 94℃에서 3분의 가열 처리; 94℃에서 30초, 63℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1사이클로 하여 35사이클; 그 후 72℃에서 3분 가열 처리;의 조건으로 증폭 처리를 행하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로스겔 중에서 전기 영동에 제공하여 목적으로 하는 밴드 사이즈 부근의 증폭 산물 밴드의 유무를 확인함으로써 각 마우스에서의 표적 유전자가 야생형인지 KO형인지를 판정하였다. 즉, 상기 PCR 산물이 240 bp사이즈라면 Fcer1g KO로 판정하고 198 bp사이즈이면 Fcer1g 야생형(wild type)(＋)으로 판정하였다.
(2) Fcgr2b 검사용 프라이머
5'-CTCGTGCTTTACGGTATCGCC-3'(서열 번호 4)(Fcgr2b 검사용 프라이머 1)
5'-AAACTCGACCCCCCGTGGATC-3'(서열 번호 5)(Fcgr2b 검사용 프라이머 2)
5'-TTGACTGTGGCCTTAAACGTGTAG-3'(서열 번호 6)(Fcgr2b 검사용 프라이머 3)
(Fcgr2b 검사용 PCR 반응액)
12.5μL Go-Taq용 ×2 buffer
1.0μL Fcgr2b 검사용 프라이머 1 (5μM)
1.0μL Fcgr2b 검사용 프라이머 2 (5μM)
1.0μL Fcgr2b 검사용 프라이머 3 (5μM)
8.0μL Distilled H2O
1.5μL 게놈 DNA(조직 용해액)
상기 시약을 혼합하여 PCR 반응액을 조제하였다.
(PCR 증폭 조건)
25μL의 상기 PCR 반응액을 이용하여 94℃에서 3분간 가열 처리; 94℃에서 30초, 63℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1사이클로 하여 35 사이클; 그 후 72℃에서 3분 가열 처리;의 조건으로 증폭 처리를 행하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로스겔 중에서 전기 영동에 제공하여 목적으로 하는 밴드 사이즈 부근의 증폭 산물 밴드의 유무를 확인함으로써 각 마우스에서의 표적 유전자가 야생형인지 KO형인지를 판정하였다. 즉, 상기 PCR 산물이 232 bp사이즈이면 Fcgr2b KO로 판정하고, 161 bp사이즈이면 Fcgr2b wild type(＋)로 판정하였다.
(3) IL-2rg 검사용 프라이머
5'-CTGCTCAGAATGCCTCCAATTCC-3'(서열 번호 7) (IL-2 rg 검사용 프라이머 1)
5'-CCTCCGTGCAATCCATCTTGTTCAAT-3'(서열 번호 8) (IL-2 rg 검사용 프라이머 2)
5'-GATCCAGATTGCCAAGGTGAGTAG-3'(서열 번호 9) (IL-2 rg 검사용 프라이머 3)
(IL-2 rg 검사용 PCR 반응액)
7.5μL PCR 버퍼(with dNTP, MgCl2)×2 buffer
0.15μL IL-2rg 검사용 프라이머 1 (20μM)
0.15μL IL-2 rg 검사용 프라이머 2 (20μM)
0.15μL IL-2 rg 검사용 프라이머 3 (20μM)
0.3μL Tks Gflex DNA 중합효소 (1.25U/μL)
5.25μL Distilled H2O
1.5μL 게놈 DNA(조직 용해액)
상기 시약을 혼합하여 PCR 반응액을 조제하였다.
(PCR 증폭 조건)
25μL의 상기 PCR 반응액을 이용하여 94℃에서 3분간 가열 처리; 98℃에서 10초, 65℃에서 15초, 68℃에서 30초를 1사이클로 하여 30 사이클; 그 후 68℃에서 3분 가열 처리;의 조건으로 증폭 처리를 행하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로스겔 중에서 전기 영동에 제공하고 목적으로 하는 밴드 사이즈 부근의 증폭 산물 밴드의 유무를 확인함으로써 각 마우스에서의 표적 유전자의 야생형이 KO형인지를 판정하였다. 즉, 상기 PCR 산물이 340 bp사이즈이면 IL-2rg KO로 판정하고, 660 bp사이즈이면 IL-2rg wild type(＋)로 판정하였다.
(4) scid 검사용 프라이머
5'-GCTAGAGAGCTGTTCCAGTT-3'(서열 번호 10) (scid 검사용 프라이머 1)
5'-TTTGAACACACACTGATTCTG-3'(서열 번호 11) (scid 검사용 프라이머 2)
5'-ACGCTAAGC-3'(서열 번호 12) (scid 검사용 프라이머 3)
5'-CGCTATGCT-3'(서열 번호 13) (scid 검사용 프라이머 4)
(scid 검사용 PCR 반응액)
5.0μL CycleavePCR Reaction Mix×2 buffer
0.2μL scid 검사용 프라이머 1(10μM)
0.2μL scid 검사용 프라이머 2(10μM)
0.4μL scid 검사용 프라이머 3(5μM)
0.4μL scid 검사용 프라이머 4(5μM)
0.2μL ROX Reference DyeII (50x)
3.1μL Distilled H2O
0.5μL 게놈 DNA(조직 용해액)
상기 시약을 혼합하여 PCR 반응액을 조제하였다.
(PCR 증폭 조건)
10μL의 상기 PCR 반응액을 이용하여 multiplex real-time PCRAssay를 실시하였다. 95℃에서 10초의 가열 처리; 95℃에서 5초, 55℃에서 10초, 72℃에서 31초를 1사이클로 하여 45 사이클;의 조건에서 증폭 처리를 행하였다. 증폭 반응의 Threshold cycles (Ct)값으로부터 이 scid 검사용 프라이머 1·2·3을 조합하여 Real-time PCR를 실시한 경우에 증폭 반응이 인정된 경우를 Scid 변이 있음, scid 검사용 프라이머 1·2·4를 조합하여 Real-time PCR를 실시한 경우에 증폭 반응이 인정된 경우를 Scid 변이 없음(wild type(＋))으로 판정하였다.
［실시예 2］
［NOG-FcgR KO/KO마우스의 특성］
(IgG 항체 수용체 FcgR의 결손)
상기 제작된 NOG-FcgR KO/KO마우스에서 FcgR 분자의 발현이 소실되었는지 여부에 대해 검증을 행하였다. NOG-FcgR KO/KO마우스의 말초혈을 채취하고 적혈구 용혈 반응액으로 반응시켜 적혈구를 제거함으로써 백혈구 분획을 얻었다. 상기 백혈구 분획을 이하에 도시하는 형광 색소 표지 항원 특이 항체를 이용하여 항체 염색을 한 후, 유세포 분석(장치명: BD LSRFortessaTM X-20, Becton Dickinson사제)에 의해 형광 강도를 측정함으로써 mouse CD45(mCD45)＋백혈구 중에서의 mouse FcgRIII/II(mCD16/32)의 유무, 및 mFceRI 분자의 발현 및 mCD45＋백혈구 중에서의 비율을 검증하였다. 상기 NOG-FcgR KO/마우스 및 NOG 마우스에 대해서도 동일한 실험을 행하여 비교 대상으로 하였다. 결과를 도 1 및 도 2에 나타낸다.
여기서 사용한 형광 색소 표지 항원 특이 항체 및 항체의 비특이 결합을 억제하기 위한 FcgR 블로킹 항체는 이하와 같다.
PE/Cy7 표지 항마우스 CD16/32(FcgRIII/II) 항체(BioLegend사),
APC/Cy7 표지 항마우스 CD45 항체(BioLegend사)
(결과)
이후, 실시예의 기재나 도면에서 NOG 마우스를 "＋/＋": NOD-scid, il2rgnull-Fcer1gnull/+Fcgr2bnull/+(NOG-FcgR KO/+) 마우스를 "KO/+"; NOD-scid, il2rgnull-Fcer1gnull/null, Fcgr2bnull/null(NOG-FcgR KO/KO) 마우스를 "KO/KO"로 표시하는 경우가 있다.
도 1로부터 알 수 있듯이 NOG-FcgR KO/KO마우스(KO/KO)(도 1(d))에서는 mCD45＋백혈구 중에서 mFcgRIII나 mFcgRII는 소실되어 있었다. 한편, NOG 마우스(도 1(b)) 및 NOG-FcgR KO/마우스(도 1(c))에서는, mFcgRIII 및 mFcgRII가 발현되어 있는 것이 확인되었다. 도 2에서도 같은 결과가 나타났다.
［실시예 3］
(인간 IgG 항체 결합능)
NOG-FcgR KO/KO마우스에서 FcgR 분자의 발현이 소실됨으로써 인간 IgG 항체로의 결합능이 소실되었는지 여부에 대해 검증을 행하였다. NOG-FcgR KO/KO마우스에 인간 IgG형 항체 의약 트라스투주맙 100μg을 복강 내에 투여한 후 3일째에 말초혈을 채취하고 실시예 2와 동일한 방법으로 백혈구 분획을 얻었다. 상기 백혈구 분획을 이하에 도시하는 형광 색소 표지 항원 특이 항체를 이용하여 항체 염색을 한 후, 상기 장치를 이용하여 유세포 분석에 의해 형광 강도를 측정함으로써 mCD45＋백혈구 중의 F4/80＋CD11b＋단구/대식 세포 분획에서의 FcgRIII/II(mCD16/32)의 발현 및 인간 IgG 항체의 결합 유무를 검증하였다. 상기 NOG-FcgR KO/마우스에 대해서도 동일한 실험을 실시하여 비교 대상으로 하였다. 또한 NOG-FcgR KO/마우스에 상기 인간 IgG형 항체 의약을 투여하지 않는 것을 음성 대조군으로 하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.
여기서 사용한 형광 색소 표지 항원 특이 항체는 이하와 같다.
AlexaFluor488 표지 인간 IgG Fc항체(BioLegend사),
PE표지 항마우스 CD11b 항체(BioLegend사),
PE/Cy7 표지 항마우스 CD16/32(FcgRIII/II) 항체(BioLegend사),
APC 표지 항마우스 F4/80 항체(eBioscience사)
APC/Cy7 표지 항마우스 CD45 항체(BioLegend사)
(결과)
도 3(c)로부터 알 수 있듯이 인간 항체 투여 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 mCD45＋백혈구 중의 F4/80＋CD11b＋단구/대식 세포 분획에서 인간 FcgRIII/II의 양성 분획 및 인간 IgG 항체는 검출되지 않아 인간 IgG와 마우스 FcgR의 결합은 확인되지 않았다. 한편, 도 3(b)로부터 알 수 있듯이 인간 IgG 항체 투여 NOG-FcgR KO/마우스에서는 mCD45＋F4/80＋CD11b＋단구/대식 세포 분획에서 FcgRIII/II가 양성인 세포 중에 인간 IgG＋의 분획이 검출되고 투여된 인간 IgG는 마우스 FcgR에 결합되어 있는 것이 확인되었다. 한편 음성 대조군에서는 FcgRIII/II는 양성이었으나 인간 IgG 항체는 검출되지 않았다(도 3(a)). 이상으로부터 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 인간 IgG형 항체에 대한 항체 결합능이 상실된 것이 확인되었다.
［실시예 4］
(마우스 항체 대사능)
상기 NOG-FcgR KO/KO마우스에서 FcgR 분자의 결손에 의해 마우스 항체의 대사능이 변화하는지를 검증하였다. NOG-FcgR KO/KO마우스에 마우스 IgG1 단일 클론 항체(mIgG1, clone MOPC-21)를 마우스의 복강 내에 100μg 혹은 20μg 투여한 후 12주간에 걸쳐 계시(繼時)적으로 혈액을 채취하여 혈장 분획을 얻었다. 얻어진 혈장 중의 마우스 IgG 항체의 농도를 Mouse IgG ELISA Quantitation set(Bethyl laboratories, Inc사제)를 이용하여 ELISA법에 의해 측정하였다. NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해서도 동일한 실험을 실시하여 비교 대상으로 하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.
(결과)
도 4(b)로부터 알 수 있듯이 NOG-FcgR KO/KO마우스에 마우스 IgG1 항체를 100μg 투여한 경우 마우스 IgG1 항체는 투여 후 1주째에 혈장 중에서의 농도가 최대값이 되고, 그 후 서서히 감소하였으나 12주째에도 검출되었다. NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스와 비교한 경우에도 항체 농도에 차이는 인정되지 않았다(도 4(a)). 따라서 NOG-FcgR KO/KO마우스에서의 FcgR 분자의 결손은 마우스 항체의 대사 속도에 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다. 또 NOG-FcgR KO/KO마우스에만 주목하여 마우스 IgG1의 100μg 투여군과 20μg 투여군을 비교하면 20μg 투여군이 혈장중의 항체 농도가 낮은 값이므로 혈장 중의 마우스 IgG 농도는 항체 투여량에 의존적이라는 것이 확인되었다(도 4(c)).
［실시예 5］
(인간 항체 대사능)
상기 NOG-FcgR KO/KO마우스에서 FcgR 분자의 결손에 의해 인간 항체의 대사능이 변화하는지를 검증하였다. NOG-FcgR KO/KO마우스에, 인간 IgG 단일 클론(monoclonal) 항체로서 이하에 도시하는 시판되는 항체 의약 3종류를 마우스의 복강 내에 각각 100μg 투여한 후, 28일간에 걸쳐 계시적으로 혈액을 채취하여 혈장 분획을 얻었다. 얻어진 혈장 중의 각 인간 IgG 항체의 농도를 Human IgG ELISA Quantitation set (Bethyl laboratories, Inc사제)를 이용하여 ELISA법에 의해 측정하였다. NOG-FcgR KO/+마우스 및 NOG 마우스에 대해서도 동일한 실험을 실시하여 비교 대상으로 하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.
여기서 사용한 항체 의약은 이하와 같다.
리툭시맙(Rituximab): 항CD20 단일 클론 항체: Rituxan(츄우가이 제약 주식회사제);
트라스투주맙(Trastuzumab): 항HER2 인간화 단일 클론 항체 허셉틴(Herceptin)(Her2 특이적 항체 의약품)(츄우가이 제약 주식회사제);
모가물리주맙(Mogamulizumab): 인간화 항CCR4 단일 클론 항체 포텔리지오(Poteligeo)(교와 발효 기린 주식회사제);
(결과) 도 5(a)∼(c)로부터 알 수 있듯이 NOG-FcgR KO/KO마우스에 상기 3종류의 인간 단일 클론 항체를 각각 100μg 투여한 경우, 어떠한 인간 IgG 항체라도 투여 후 2주간 이내에 거의 소실하였다. NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에서도 상기 3종류의 어느 항체에 대해서도 동일한 경향이 인정되었다. 따라서 NOG-FcgR KO/KO마우스에서의 FcgR 결손은 인간 항체의 대사 속도에도 영향을 주지 않는다는 것이 확인되었다.
［실시예 6］
(마우스 탐식 세포에 의한 ADCC 활성의 소실(1))
NOG 마우스에 투여한 항원 특이적 항체가 마우스 FcgR을 통해 마우스 탐식 세포에 인식됨으로써 탐식 반응이 유도되는 것이 알려져 있다. 그래서 인간 고형 암세포주를 이용하여 NOG-FcgR KO/KO마우스에서 마우스 FcgR이 결손됨으로써 마우스 탐식 세포에 의한 ADCC 활성이 소실되는지 여부를 검증하였다.
인간 고형 암세포주의 일종인 Her2 양성 위암 세포주 4-1 ST의 3mm 정사각형의 종양 덩어리를 NOG-FcgR KO/KO마우스에 피하 이식함으로써 4-1 ST 피하 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스를 조제하였다. NOG-FcgR KO/마우스에 대해서도 동일한 처리를 행하고 4-1 ST 피하 이식 NOG-FcgR KO/+마우스를 조제하여 비교 대상으로 하였다. 4-1 ST를 이식 후 일주일째부터 50μg의 트라스투주맙을 상기 각 4-1 ST 피하 이식 마우스에 주 2회 복강내 투여하고 22일간에 걸쳐 계시적으로 종양 사이즈를 측정하였다. 또 항체 대신에 PBS를 투여한 상기 2종류의 마우스를 PBS 투여 컨트롤군으로 하였다. 결과를 도 6에 나타낸다.
(결과 1)
도 6(b)로부터 알 수 있듯이 4-1 ST 피하 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는, 트라스투주맙을 투여한 경우 22일째의 종양 사이즈는 평균 850mm3이었다. 한편 4-1 ST 피하 이식 NOG-FcgR KO/+마우스에서는 트라스투주맙을 투여한 경우 22일째의 종양 사이즈는 평균 150mm3로서 4-1 ST 피하 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스와 비교하여 트라스투주맙 항체 투여에 의한 종양 억제 효과가 확인되었다. 상기 결과는 마우스 FcgR를 통해 작용하는 마우스 탐식 세포가 암항원 특이적인 인간 항체에 결합한 종양(인간 고형 암)을 인식하여 상해하고 종양 덩어리의 성장을 억제하고 있는 것, 또 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 마우스 탐식 세포에 의한 ADCC 활성이 야기되지 않는 것을 나타내고 있다.
(결과 2)
도 6(a)로부터 알 수 있듯이 PBS 투여 컨트롤군(saline)에서는 4-1 ST 피하 이식 NOG-FcgR KO/+마우스와 4-1 ST 피하 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스와의 사이에서 종양 덩어리의 성장 정도에 차이는 인정되지 않으며, 마우스 FcgR의 유무가 종양의 성장 정도에 영향을 주지 않는다고 확인되었다.
［실시예 7］
(마우스 탐식 세포에 의한 ADCC 활성의 소실(2))
인간 부유계 암세포주를 이용하여 NOG-FcgR KO/KO마우스에서 마우스 FcgR이 결손됨으로써 마우스 탐식 세포에 의한 ADCC 활성이 소실되는지 여부를 검증하였다. 인간 부유계 암세포주의 일종인 CD20＋버킷 림프종주 Daudi, 2.4x106개를 NOG-FcgR KO/KO마우스의 꼬리정맥으로부터 이식하여 Daudi 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스를 조제하였다. NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해서도 동일한 처리를 하고 Daudi 이식 NOG 마우스 및 Daudi 이식 NOG-FcgR KO/+마우스를 조제하여 비교 대상으로 하였다.
꼬리정맥에서 항원 특이적 항체 의약품으로서 Rituximab 50μg을 상기 각 마우스에 주 1회 복강내 투여하고 정기적으로 채혈하여 항체 염색 후 유세포 분석에 의해 혈액 중의 CD20＋Daudi 세포를 측정하였다. 또 항체 대신에 PBS를 상기 각 마우스에 투여함으로써 PBS 투여 컨트롤군으로 하였다. 이식 후 21일째의 결과를 도 7에 나타낸다.
(결과)
도 7(b)로부터 알 수 있듯이 Rituximab를 투여한 Daudi 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 혈액 중의 CD20＋Daudi 세포는 총백혈구 중 1∼2%의 비율로 검출되었다. 한편, Rituximab를 투여한 Daudi 이식 NOG-FcgR KO/마우스에서는, 혈액 중의 CD20＋Daudi 세포는 총백혈구 중 0.2% 이하까지 감소하였다. 한편, 도 7(a)로부터 알 수 있듯이 PBS 투여 컨트롤군에서는 Daudi 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스, Daudi 이식 NOG-FcgR KO/마우스 및 Daudi 이식 NOG 마우스 어느 것에서도 혈액 중의 CD20＋Daudi 세포는 총백혈구 중 약 1.5%∼약 4%의 빈도로 검출되었다.
［실시예 8］
(마우스 탐식 세포에 의한 ADCC 활성의 소실(3))
상기 Rituximab 또는 PBS를 투여한 Daudi 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스, Daudi 이식 NOG-FcgR KO/+마우스, 및 Daudi 이식 NOG 마우스에 대해 Daudi 이식 후 23일째에 부검하고 Daudi 세포가 집적된 신장을 적출하여 장기 중량을 측정함으로써 마우스 탐식 세포의 ADCC 활성이 기능하고 있는지 여부를 평가하였다. 결과에 대해서 각 마우스의 신장 사진을 도 8(a)에, 각 마우스의 신장 중량의 그래프를 도 8(b)에 나타낸다.
(결과)
도 8(a) 및 (b)로부터 알 수 있듯이 Rituximab 투여군(Rit.)에서 Daudi 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 신장의 중량은 0.5g 전후로까지 증가하였다. 한편, Daudi 이식 NOG-FcgR KO/마우스에서는 신장의 중량은 0.2g 전후로 신장의 비대화가 억제되었다. PBS 투여 컨트롤군에서는 Daudi 이식 NOG-FcgR KO/마우스, Daudi 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스 모두 신장의 중량은 0.5g 전후까지 증가하였다. 또 Daudi 이식 NOG 마우스 신장의 중량은 0.57g 정도로까지 증가하였으며, 모두 Daudi 집적에 의한 신장의 비대화가 인정되었다. 아울러 성체 NOG 마우스의 신장은, 일반적으로는 0.2g 전후인 것으로 알려져 있다. 이상의 결과는 항원 특이 항체 Rituximab를 투여하더라도, NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 마우스 탐식 세포가 마우스 FcgR을 통해 암세포 Daudi 세포를 인식·공격할 수 없다는 것을 나타내고 있다.
(ADCC 활성에 대한 결론)
실시예 6∼8의 결과로부터 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 마우스 FcgR을 결손시킴으로써 마우스 탐식 세포의 ADCC 활성이 기능하지 않는다는 것이 시사되었다.
［실시예 9］
(인간 조혈 줄기세포 생착능의 검증 1)
NOG-FcgR KO/KO마우스에서의 인간 조혈 줄기세포의 생착능에 대해 검증하였다.
(인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스의 조제)
7주령 이상의 성체 NOG-FcgR KO/KO마우스에 X선을 조사함으로써 골수를 억제했다(Day0). X선 조사 후 1일 이내에 50000개의 hCD34＋인간 조혈 줄기세포를 꼬리정맥으로부터 이식함으로써 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스를 조제하였다. NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해서도 상기 동일한 조제 처리를 함으로써 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG 마우스 및 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/+마우스를 조제하여 비교 대상으로 하였다.
(유세포 분석에 의한 검증)
상기 각 마우스에 대해 인간 조혈 줄기세포 이식 후 4주, 8주, 12주, 16주 및 20주 경과시에 말초혈을 채취하여 실시예 2과 동일한 방법으로 백혈구 분획을 얻었다. 또한 상기 백혈구 분획을 이하에 도시한 형광 색소 표지 항원 특이 항체를 이용하여 항체 염색을 한 후 유세포 분석에 의해 형광 강도를 측정함으로써 인간 면역 세포 hCD45＋세포의 비율을 측정하였다. 결과를 도 9에 나타낸다.
아울러 실시예 9∼실시예 12로 사용한 형광 색소 표지 항원 특이 항체는 이하와 같다.
BUV395 표지 항hCD33 항체(Becton Dickinson사)
Brilliant Violet421 표지 항hCD3 항체(BioLegend사)
PE/Cy7 표지 항hCD19 항체(BioLegend사)
APE/R700 표지 항hCD56 항체(Becton Dickinson사)
APC/Cy7 표지 항마우스 CD45 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet510 표지 항hCD45 항체(BioLegend사)
(결과)
도 9(a) 및 (b)로부터 알 수 있듯이 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스, 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG 마우스, 및 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/+마우스의 수컷(a), 암컷(b) 어느 것이든 총백혈구 중의 hCD45＋세포의 비율은 시간의 경과와 함께 증가하여 hCD45＋세포의 생착이 확인되었다. 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 hCD45＋세포의 생착율은 비교 대상인 마우스보다도 8∼16주에 걸쳐 유의미하게 크고, 또 인간 조혈 줄기세포 이식 후 20주 경과시에 75% 전후의 값을 나타내어 비교 대상으로 한 마우스보다 유의미하게 높은 값을 나타냈다. 한편 NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에서는 인간 조혈 줄기세포 이식 후 20주 경과시에도 hCD45＋세포의 비율은 60% 전후의 값에 머물렀다.
［실시예 10］
(인간 조혈 줄기세포 생착능의 검증 2)
상기 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스, 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG 마우스, 및 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해 인간 조혈 줄기세포 이식 후 4주부터 20주 경과시까지의, 총백혈구 중의 hCD45＋세포의 상세를 조사하였다. 결과를 도 10에 나타낸다.
(결과)
도 10으로부터 알 수 있듯이 상기 각 마우스에서는 hCD33＋골수성계 세포(수컷(a), 암컷(d)), hCD19＋B세포(수컷(b), 암컷(e)), hCD3＋T세포(수컷(c), 암컷(f))의 분획이 각각 검출되었다. 따라서 마우스 FcgR이 결손되어 있어도 인간 면역 세포의 분화능에 영향을 주지 않는 것이 확인되었다.
［실시예 11］
(인간 조혈 줄기세포 생착 능력의 검증 3)
상기 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해 인간 조혈 줄기세포 이식 후 26주 경과시에 부검하여 조혈 장기(골수·비장·혈액) 중에 hCD45＋세포가 어느 정도 생착되었는지를 유세포 분석에 의해 형광 강도를 측정함으로써 조사하였다. 결과를 도 11에 나타낸다.
(결과)
도 11(a)∼(f)로부터 알 수 있듯이 인간 조혈 줄기세포 이식 후 26주 경과시에 골수(BM)((a)(d))·비장(Spl)((b)(e))·혈액(PB)((c)(f))에서의 hCD45＋세포의 비율(Human CD45＋in MNC(%)), 및 세포수(Abs. cell number (x106 cells) 혹은 Abs. cell number (x103 cells/μL))는 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스 사이에서 유의미한 차이는 인정되지 않았다.
［실시예 12］
(인간 조혈 줄기세포 생착능의 검증 4)
계속해서 부검한 각 마우스에 대해 조혈 장기(골수·비장·혈액) 중의 hCD45＋세포 중에서 hCD3＋T세포, hCD19＋B세포, hCD33＋골수성 세포, hCD56＋NK세포가 차지하는 비율(Freq. of hCD45 (%)), 및 혈액 1μL 중의 각 세포의 세포수(Abs. cell number (x103 cells/μL))를 조사하였다. 2-way ANOVA 해석을 실시한 결과를 도 12에 나타낸다.
(결과)
도 12로부터 알 수 있듯이 상기 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스, 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG 마우스, 및 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/+마우스에서는 hCD33＋골수성계 세포, hCD19＋B세포, hCD3＋T세포, hCD56＋NK세포의 모든 분획이 검출되었지만, 특히 비장의 hCD19＋B세포(e)에 대해서는 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서 NOG 마우스의 2.5배 이상, KO/+마우스의 1.2배 이상이라는 현저히 많은 세포수가 검출되었다.
［실시예 13］
(T세포 아집단의 분화)
일반적으로 hCD3＋T세포는 CD4＋T세포·CD8＋T세포·CD4＋CD8＋ 이중 양성(double positive: DP) T세포의 아집단으로 더 나눌 수 있는 것으로 알려져 있다. 그래서 상기 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해 말초혈 채취 시료에 대해 이하에 도시한 형광 색소 표지 항원 특이 항체를 이용하여 항체 염색을 한 후, 유세포 분석에 의해 형광 강도를 측정함으로써 T세포 아집단의 분화 상황을 평가하였다. 결과를 도 13에 나타낸다.
아울러 여기서 사용한 형광 색소 표지 항원 특이 항체는 이하와 같다.
PE표지 항hCD4 항체(BioLegend사)
PE/Cy7 표지 항hCD8a 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet421 표지 항hCD3 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet510 표지 항hCD45 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet605 표지 인간 PD-1(CD279) 항체(BioLegend사)
(결과)
도 13으로부터 알 수 있듯이 인간 조혈 줄기세포를 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스, NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스 모두 hCD4＋T세포·hCD8＋T세포·hCD4＋hCD8＋hDP T세포의 아집단이 정상적으로 분화되어 있으며, 혈액 면역계의 재구축이 확인되었다(도 13(a)). 또한 인간 T세포에서 발현되는 Programmed cell death 1(PD-1) 단백 분자 hPD-1의 발현을 보았을 때 hCD4＋분획에서 hPD-1 분자가 추가로 발현되어 있는 것이 확인되었다(도 13(b)).
따라서 FcgR이 결손되어도 이러한 기능은 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다.
［실시예 14］
(인간 혈액 면역계가 재구축된 NOG-FcgR KO/KO마우스에서의 인간 면역 세포에 대한 마우스의 ADCC 활성의 검증)
7주령 이상의 성체 NOG-FcgR KO/KO마우스에 X선을 조사함으로써 골수를 억제하고 X선 조사 후 1일 이내에 50000개의 인간 조혈 줄기세포를 꼬리정맥으로부터 이식함으로써 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스를 조제하였다. 인간 조혈 세포 이식 후 16주 경과시에 hCD3＋T세포의 분화를 확인한 마우스에 대해 인간 T세포에서 발현되는 PD-1 단백 분자를 특이적으로 인식하는 항인간 PD-1 항체(OPDIVO) (Bristol-Myers Squibb 사제)를 인간 조혈 줄기세포 이식 후 18주, 19주, 및 20주 경과시에 주 1회 합계 3회, 각 100μg 투여한 후, 마우스를 부검하고 골수·비장·혈액의 각 조혈 조직 중의 인간 T세포를 포함한 인간 면역 세포의 증감을 유세포 분석에 의해 해석하였다. 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG 마우스, 및 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/+마우스에 대해서도 동일한 처리를 하여 비교 대상으로 하였다. 결과를 도 14에 나타낸다.
아울러 여기서 사용한 형광 색소 표지 항원 특이 항체는 이하와 같다.
PE표지 항hCD4 항체(BioLegend사)
PE/Cy7 표지 항hCD8a 항체(BioLegend사)
PE/Cy7 표지 항hCD19 항체(BioLegend사)
APC-R700 표지 항hCD19 항체(Becton Dickinson사)
APC-R700 표지 항hCD56 항체(Becton Dickinson사)
Brilliant Violet421 표지 항hCD3 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet510 표지 hCD45 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet605 표지 인간 PD-1(CD279) 항체(BioLegend사)
BUV395 표지 항hCD33 항체(Becton Dickinson사)
APC/Cy7 표지 항마우스 CD45 항체(BioLegend사)
(결과)
도 14(a)∼(c)로부터 알 수 있듯이 OPDIVO를 투여한 각 마우스의 골수·비장·혈액에서의 hCD45＋세포의 비율(hCD45＋in MNC (%))에 관해서는 어느 장기에서도 유의미한 차이는 인정되지 않았다. 한편 도 14(e)로부터 알 수 있듯이 비장에서는 OPDIVO를 투여한 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 OPDIVO를 투여한 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG 마우스의 4.2배, 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/+마우스의 2.2배 이상의 hCD45＋세포수(Abs. cell number (x106 cells))가 검출되며 NOG-FcgR KO/KO마우스에서 hCD45＋세포수가 감소되지 않고 생착된 것으로 나타났다.
［실시예 15］
상기 OPDIVO를 투여한 각 인간 조혈 줄기세포 이식 마우스를 해석하여 hCD45＋세포의 상세를 조사하였다. 결과를 도 15에 나타낸다.
(결과)
도 15로부터 알 수 있듯이 상기 OPDIVO를 투여한 각 마우스 모두에서 hCD3＋T세포, hCD19＋B세포, hCD33＋골수성계 세포, hCD56＋NK세포의 각 분획이 검출되었다. 또 OPDIVO 투여 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스는 비장(도 15(b)) 및 말초혈(도 15(c))에서 hCD3＋T세포가 감소 없이 생착되고 hCD3＋T세포의 비율이 NOG 마우스의 2배 이상 많았다. 또 비장(도 15(e))에서 hCD3＋T세포수가 NOG 마우스의 3배 이상이며, hCD19＋B세포도 NOG 마우스의 3배 이상이었다.
［실시예 16］
상기 검출된 비장의 hCD45＋세포 중의 hCD3＋T세포에 대해 추가적으로 T세포의 서브세트를 검증하였다. 결과를 도 16에 나타낸다.
(결과)
도 16으로부터 알 수 있듯이 OPDIVO 투여 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스는 OPDIVO를 투여한 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG 및 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/+마우스와 비교하여 비장에서 hCD45＋세포 중의 hCD4＋T세포의 비율이 유의미하게 높아 NOG 마우스나 NOG-FcgR KO/+마우스의 3배 이상이었다. hCD4＋T세포수도 NOG 마우스나 NOG-FcgR KO/+마우스의 8배 이상이며, hCD8＋T세포수도 NOG 마우스나 NOG-FcgR KO/+마우스의 4배 이상이며, T세포 서브세트 세포수도 유의미하게 많았다.
(실시예 14∼실시예 16의 결론)
이들 결과는 NOG 마우스 및 NOG-FcgR KO/+마우스에서는 마우스 FcgR 분자가 존재하므로 항PD-1 항체에 의해 hPD-1＋T세포가 마우스 생체로부터 제거되지만 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 FcgR 분자가 결손되어 있기 때문에 항PD-1 항체 의존성의 인간 T세포의 제거가 일어나지 않는 것을 시사한다.
［실시예 17］
(인간 말초혈 유래 단핵구 분획(Peripheral blood derived monoclonal cells: PBMC) 생착능의 검증)
NOG-FcgR KO/KO마우스에서의 인간 PBMC의 생착능에 대해 검증하였다. 7주령 이상의 성체 NOG-FcgR KO/KO마우스에 1500000개 또는 2500000개의 인간 PBMC를 마우스 꼬리정맥으로부터 이식함으로써 인간 PBMC 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스를 조제하였다. NOG 마우스에 대해서도 상기와 동일한 조제 처리를 함으로써 인간 PBMC 이식 NOG 마우스를 조제하여 비교 대상으로 하였다.
(유세포 분석에 의한 검증)
상기 각 마우스에 대해 인간 PBMC 이식 후 2주, 4주, 5주 및/또는 6주 경과시에 채혈을 행하여 실시예 2와 동일한 방법으로 백혈구 분획을 얻었다. 또한 백혈구 분획을 이하에 도시하는 형광 색소 표지 항원 특이 항체를 이용하여 항체 염색을 한 후, 유세포 분석에 의해 형광 강도를 측정함으로써 인간 면역 세포 hCD45＋세포의 비율을 측정하였다. 결과를 도 17에 나타낸다.
아울러 여기서 사용한 형광 색소 표지 항원 특이 항체는 이하와 같다.
FITC 표지 항hCD33 항체(BioLegend사)
PE표지 항hCD3 항체(BioLegend사)
PE/Cy7 표지 항hCD19 항체(BioLegend사)
APC 표지 항마우스 CD45 항체(BioLegend사)
APC/Cy7 표지 항hCD45 항체(BioLegend사)
FITC 표지 항hCD4 항체(BioLegend사)
PE/Cy7 표지 항hCD19 항체(BioLegend사)
APC 표지 항hCD19 항체(BioLegend사)
APC-R700 표지 항hCD56 항체(Becton Dickinson사)
APC/Cy7 표지 항마우스 CD45 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet421 표지 항hCD3 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet510 표지 hCD45 항체(BioLegend사)
(결과)
도 17(a) 및 (b)로부터 알 수 있듯이 인간 PBMC를 2500000개 이식한 NOG-FcgR KO/KO마우스 및 인간 PBMC 이식 NOG 마우스 모두에서 hCD45＋세포의 생착을 확인하였으나, 세포 생착율은 인간 PBMC 이식 NOG 마우스에서는 4주째에는 거의 평균 10% 전후인데 반해, 인간 PBMC 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 4주째에 평균 48%가 되어 4주째라는 빠른 시기에 NOG 마우스와 비교하여 3.5배 이상의 값을 나타냈다. 또 이식 세포수를 줄여 인간 PBMC를 1500000개 이식하여 2주째에 평가를 행한 경우 도 17(c)로부터 알 수 있듯이 세포 생착율은 인간 PBMC 이식 NOG 마우스에서는 0.5% 미만인데 반하여 인간 PBMC 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 1∼8%로서 NOG 마우스의 2∼16배였다. 또 도 17(d)로부터 알 수 있듯이 생착 세포수는 인간 PBMC 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스는 50-200/L인데 반하여 인간 PBMC 이식 NOG 마우스에서는 10/L 전후이기 때문에 인간 PBMC 이식 NOG 마우스와 비교하여 인간 PBMC 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 특히 PBMC 이식 후 빠른 시기에 또 PBMC의 이식수가 통상 이루어지는 것보다 적은 수여도 NOG 마우스와 비교하여 유의미하게 높은 것이 확인되었다.
［실시예 18］
(인간 PBMC 생착능)
상기 인간 PBMC 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스 및 인간 PBMC 이식 NOG 마우스에 대해 인간 PBMC 이식 후 4주 경과시에 말초혈에서의 hCD45＋세포의 상세를 조사하였다. 결과를 도 18에 나타낸다.
아울러 여기서 사용한 형광 색소 표지 항원 특이 항체는 이하와 같다.
FITC 표지 항hCD4 항체(BioLegend사)
PE/Cy7 표지 항hCD3 항체(BioLegend사)
APC/Cy7 표지 항hCD45 항체(BioLegend사)
PE/Cy7 표지 항hCD19 항체(BioLegend사)
APC 표지 항hCD8a 항체(BioLegend사)
APC-R700 표지 항hCD56 항체(Becton Dickinson사)
APC/Cy7 표지 항마우스 CD45 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet421 표지 항hCD3 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet510 표지 hCD45 항체(BioLegend사)
(결과)
도 18(a) 및 (c)로부터 알 수 있듯이 상기 인간 PBMC 이식 NOG-FcgRKO/KO마우스에서 hCD45＋세포의 97% 이상은 hCD3＋T세포가 차지하고 있는 것이 확인되었다. 1500000개의 인간 PBMC 이식 NOG 마우스에서는 hCD3＋T세포의 비율은 75%정도였다. 도 18(b) 및 (d)로부터 알 수 있듯이 T세포 아집단에 대해서는 상기 어떠한 인간 PBMC 이식 마우스에서도 CD4＋T세포, CD8＋T세포, CD4＋CD8＋DP T세포의 모든 분획이 검출되었다.
［실시예 19］
(인간 PBMC 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서의 인간 면역 세포에 대한 항체 반응성)
hCD3＋T세포의 유세포 분석에 의한 해석에 의해 인간 PBMC 이식 NOG 마우스 및 인간 PBMC 이식 NOG-FcgR KO/+마우스에서 증식한 인간 PBMC 유래 hCD3＋세포는 대부분이 PD-1 분자를 발현하고 있으며, 인간 PBMC 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서도 동일하게 PD-1 분자가 발현되고 있는 것으로 나타났다(도 19(a)). 또한 항인간 PD-1 항체(마우스 IgG1 타입(clone J116))을 PBMC 이식 후 5주째, 6주째, 7주째에 상기 각 마우스에 50μg씩 투여함으로써 인간 PD-1＋T세포에 대한 세포 상해가 유도되는지 여부를 검증하였다. 결과를 도 19(b)에 나타낸다.
(결과)
도 19(b)로부터 알 수 있듯이 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 항인간 PD-1 항체(마우스 IgG1 타입)를 투여해도 hCD45＋세포 중의 인간 T세포의 비율 감소는 일어나지 않았다. 한편, 인간 PBMC 이식 NOG 마우스 및 인간 PBMC 이식 NOG-FcgR KO/+마우스에서는 hCD45＋세포 중의 인간 T세포의 비율이 매우 낮아졌다. 따라서 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 FcgR 분자가 결손되어 있기 때문에 항인간 PD-1 항체 의존성의 인간 T세포의 제거가 일어나지 않는 것이 확인되었다.
［실시예 20］
(하이브리드형 동물 모델의 수립)
NOG-FcgR KO/KO마우스에 마우스 생체 내에서 인간 NK세포를 증폭·유지할 수 있는 NOG-hIL-15 Tg마우스를 교배시킴으로써 양자의 특성을 가진 동물 모델의 제작을 시도하였다. 즉, NOG-FcgR KO/KO마우스와 NOG-hIL-15 Tg마우스를 교배하여 NOG-FcgR KO/KO, hIL-15 Tg마우스를 제작하였다.
［실시예 21］
(in vitro 배양하여 증폭시킨 인간 말초혈 유래 NK세포(Expanded NK세포)의 생착능의 검증)
NOG-FcgR KO/KO, hIL-15 Tg마우스에서의 인간 Expanded NK세포의 생착능에 대해 검증하였다. 7주령 이상의 성체 NOG-FcgR KO/KO, hIL-15 Tg마우스에 3850000개의 인간 Expanded NK세포를 마우스 꼬리정맥으로부터 이식함으로써 인간 Expanded NK세포 이식 NOG-FcgR KO/KO, hIL-15 Tg마우스(FcgR KO/KO, hIL-15 Tg)를 조제하였다. NOG-hIL-15 Tg마우스에 대해서도 상기와 동일한 조제 처리를 함으로써 인간 Expanded NK세포 이식 NOG-hIL-15 Tg마우스(FcgR＋/＋, hIL-15 Tg)를 조제하여 비교 대상으로 하였다.
상기 인간 Expanded NK세포 이식 NOG-FcgR KO/KO, hIL-15 Tg마우스 및 인간 Expanded NK세포 이식 NOG-hIL-15 Tg마우스에 대해 인간 Expanded NK세포 이식 후 2주 경과시에 말초혈을 채취하여 hCD45＋세포의 생착성을 조사하였다. 결과를 도 20에 나타낸다.
아울러 여기서 사용한 형광 색소 표지 항원 특이 항체는 이하와 같다.
APC-R700 표지 항hCD56 항체(Becton Dickinson사)
APC/Cy7 표지 항마우스 CD45 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet421 표지 항hCD3 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet510 표지 항hCD45 항체(BioLegend사)
(결과)
도 20(a)로부터 알 수 있듯이 상기 어떠한 인간 Expanded NK세포 이식 마우스에서도 hCD45＋세포의 생착이 인정되었다. 또 도 20(b)로부터 알 수 있듯이 hCD45＋세포의 80% 이상은 hCD56＋NK세포가 차지하고 있음이 확인되었다. 이러한 결과는 NOG-FcgR KO/KO hIL-15 Tg마우스는 NOG-hIL-15 Tg마우스의 특성인, 인간 말초혈 유래의 인간 NK세포를 이식한 후에 hCD56＋세포를 인비보로 장기(長期)에 걸쳐 검출할 수 있다는, 인간 NK세포의 생착성을 보유하고 있다는 것을 시사하고 있다.
상기 NOG-FcgR KO/KO, hIL-15 Tg마우스에 Daudi 1500000개를 꼬리정맥으로부터 이식하였다. 이식 3일 후에 in vitro 배양하여 증폭시킨 인간 말초혈 유래 NK세포(Expanded NK세포)를 8500000개 꼬리정맥으로부터 이식하고, 인간 항체 의약인 항CD20 항체 리툭시맙 25μg을 주 1회 복강 내에 더 투여하였다. 3주일 후에 신장의 중량을 측정하여 평가하였다. 별도 NOG-hIL-15 Tg마우스를 교배하여 NOG-FcgR KO/, hIL-15 Tg마우스를 제작한 후에 Daudi 1500000개를 꼬리정맥으로부터 이식하고, 또 NOG-FcgR KO/+마우스에도 Daudi 1500000개를 꼬리정맥으로부터 이식하여 함께 비교 대상으로 하였다. 결과를 도 21에 나타낸다.
도 21로부터 알 수 있듯이 NOG-FcgR KO/(-non-Tg) 마우스에서는 리툭시맙 투여에 의해 신장의 중량은 억제되었다. 반대로 NOG-FcgR KO/KO, non-Tg마우스에서는 리툭시맙 투여군에서도 신장의 중량 증가는 인정되었다. 게다가 NOG-FcgR KO/KO hIL-15 Tg마우스에서는 NK세포 이식만 혹은 리툭시맙의 단독 투여로는 신장 중량은 증가한 채로 있었으나, 양자를 투여함으로써 신장의 비대화가 억제되었다. 이러한 결과는 NOG-FcgR KO/KO hIL-15 Tg마우스는 NOG-FcgR KO/KO마우스와 NOG-hIL-15 Tg마우스 각각의 특성을 가지고 있으며, 마우스 탐식 세포에 영향을 받지 않고 인간 NK세포만을 이펙터 세포로 하여 암항원 특이적인 인간 항체에 결합한 종양에 대한 ADCC 활성을 평가할 수 있다는 것을 시사하고 있다.
［실시예 22］
이하, 유전자 개변 면역 부전 마우스에 인간 면역 세포와 인간 종양 세포를 공존시키고, 나아가 항인간 항체의 생리 활성을 평가할 수 있는지 여부를 검토하였다. 즉, 인간 세포 생착 면역 부전 마우스를 이용하여 면역 체크 포인트 저해제로서 작용하는 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 활성이나 작용 메커니즘을 평가하였다.
(면역 체크 포인트 저해제의 종양 억제 반응의 항진 기능의 검증)
인간 혈액 면역계가 재구축된 NOG-FcgR KO/KO마우스에서의 인간 면역 체크 포인트 저해제의 기능을 평가하였다. 면역 체크 포인트 저해제로서 항인간 PD-1 항체, 니볼루맙(Nivolumab)(Bristol Myers Squibb사제)을 이용하였다. 8주령 이상의 성체 NOG-FcgR KO/KO마우스에 X선을 조사함으로써 골수를 억제하고, X선 조사 후 1일 이내에 50000개의 인간 조혈 줄기세포를 꼬리정맥으로부터 이식함으로써 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스를 조제하였다. 인간 조혈 줄기세포 이식 후 16주 이상 경과하여 인간 CD3＋T세포의 분화를 확인한 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에 대해 인간 조혈 줄기세포 이식 후 24주 경과시에 인간 두경부 편평 상피 암세포주 HSC-4(1500000개)를 피하 이식함으로써 HSC-4 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스를 조제했다(도 22에서의 day 0).
상기 마우스에 200μg의 니볼루맙을 HSC-4 이식 후 1주간마다 복강 내에 투여하였다. HSC-4 이식 후 7일, 14일, 21일, 28일 경과시에 종양 사이즈를 계측하였다. NOG 마우스에 대해서도 상기와 동일한 순서로 인간 조혈 줄기세포 이식 NOG 마우스를 조제하고, 그 다음에 HSC-4 이식 NOG(-FcgR＋/＋) 마우스를 조제하였다. 또 항체 대신에 PBS를 투여한 상기 2종류의 마우스를 PBS 투여 컨트롤군으로 하였다. 종양 사이즈의 측정 결과를 도 22에 나타낸다.
(결과)
도 22(b)로부터 알 수 있듯이 HSC-4 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 PBS를 투여한 경우 28일째의 종양 사이즈는 평균 1300mm3이었다. 한편, 니볼루맙을 투여한 경우 28일째의 종양 사이즈는 평균 600mm3로서 PBS 투여군과 비교하여 니볼루맙 항체 투여에 의한 종양 억제 효과가 확인되었다. 한편 도 22(a)로부터 알 수 있듯이 HSC-4 이식 NOG-FcgR＋/＋마우스에서는, 28일째의 종양 사이즈는 PBS를 투여한 경우에도 니볼루맙을 투여한 경우에도 평균 1000mm3이며, 니볼루맙 항체 투여에 의한 종양 억제 효과는 확인되지 않았다. 이 결과는 HSC-4 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 면역 체크 포인트 저해제에 의한 종양 억제 반응을 항진시키는 기능이 검출되었으나, HSC-4 이식 NOG(-FcgR＋/＋) 마우스에서는 종양 억제 반응을 항진시키는 기능이 검출되지 않은 것을 나타내며, 상기 인간 면역 세포와 인간 종양 세포를 공존시키는 HSC-4 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서 종양 억제 반응을 항진시키는 기능 등의 생리 활성을 평가할 수 있다는 것이 확인되었다.
［실시예 23］
(인간 면역 체크 포인트 저해제의 T세포 침윤의 항진 기능의 검증)
상기 HSC-4 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에 대해 인간 조혈 줄기세포 이식 후 28주 경과시에 채혈을 행하고, 인간 조혈 세포 이식 후 28주 경과시(항인간 PD-1 항체(니볼루맙)의 최종 투여를 실시한 다음날)에 마우스를 부검하여 비장과 종양을 채취하였다. 종양·비장·혈액의 각 조직 중의, 인간 T세포를 포함한 인간 면역 세포의 증감을 유세포 분석에 의해 해석하였다. 나아가 혈액과 비장에 관하여는 실시예 2와 동일한 방법으로 백혈구 분획을 얻었다. HSC-4 이식 NOG(-FcgR＋/＋) 마우스에 대해서도 동일한 처리를 하여 비교 대상으로 하였다.
아울러 상기 종양은 1mg/mL의 CollagenaseIV(시그마사제)/100μg/mL의 DNaseI(시그마사제) 함유 RPMI1640(Invitrogen사제) 배양지 내에서 세단하고 나아가 gentleMACS dissociater(Miltenyi Biotec사제)를 이용하여 현탁시키면서 37℃에서 합계 60분간 반응시킴으로써 세포를 단리시켜 세포 부유 분획으로부터 백혈구 분획을 얻었다. 나아가 백혈구 분획을 이하에 도시한 형광 색소 표지 항원 특이 항체를 이용하여 항체 염색을 한 후, 유세포 분석에 의해 형광 강도를 측정함으로써 인간 면역 세포 hCD45＋CD3＋세포의 비율을 측정하였다. 결과를 도 23에 나타낸다.
아울러 여기서 사용한 형광 색소 표지 항원 특이 항체는 이하와 같다.
FITC 표지 항hCD44 항체(BioLegend사)
PE표지 항h.PD-1 항체(BioLegend사)
PE/Cy7 표지 항hCD8a 항체(BioLegend사)
PerCP-Cy5.5 표지 항mCD45 항체(BioLegend사)
APC 표지 항hCD69 항체(BioLegend사)
Alexa Fluor-R700 표지 항hCD19 항체(Becton Dickinson사)
APC-Cy7 표지 항hCD4 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet421 표지 항hCD3 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet510 표지 hCD45 항체(BioLegend사)
Brilliant Violet605 표지 인간 PD-1(CD279) 항체(BioLegend사)
(결과 1)
도 23(a)로부터 알 수 있듯이 HSC-4 피하 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 PBS를 투여한 경우 종양 내에 침윤된 단핵구 분획 중에서 인간 T세포가 차지하는 비율은 평균 12%이지만, 니볼루맙을 투여한 경우의 인간 T세포가 차지하는 비율은 30%로서, PBS 투여군과 비교하여 니볼루맙 항체 투여에 의한 종양 내로의 인간 T세포 침윤의 항진이 확인되었다. 한편, HSC-4 피하 이식 NOG-FcgR＋/＋마우스에서는 PBS를 투여한 경우 종양 내에 침윤된 단핵구 분획 중에서 인간 T세포가 차지하는 비율은 평균 2.3%이지만, 니볼루맙을 투여한 경우의 인간 T세포가 차지하는 비율은 0.7%로서 PBS 투여군과 비교하여 니볼루맙 항체 투여에 의한 종양 내로의 인간 T세포의 감소가 확인되었다. 또 도 23(b) 및 (c)로부터 알 수 있듯이 HSC-4 피하 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스의 비장 및 혈액에서 니볼루맙을 투여한 경우의 인간 T세포가 차지하는 비율은 비장에서는 평균 31.5%, 말초혈에서는 평균 20.8%이지만, PBS를 투여한 경우의 비장은 평균 9.8%, 말초혈은 평균 11.6%로서 PBS 투여군과 비교하여 많고, 니볼루맙 항체 투여에 의해 인간 T세포의 비율 증가가 확인되었다. HSC-4 피하 이식 NOG-FcgR＋/＋마우스에서는 니볼루맙을 투여한 경우의 인간 T세포가 차지하는 비율은 비장에서는 평균 6.0%, 말초혈에서는 평균 1.8%이지만 PBS를 투여한 경우의 비장에서는 평균 9.2%, 말초혈에서는 평균 2.8%로서 니볼루맙 항체 투여에 의한 인간 T세포수의 감소가 확인되었다.
(결과 2)
도 23(d)로부터 알 수 있듯이 HSC-4 피하 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스에서는, PBS를 투여한 경우 종양 내의 인간 T세포수는 평균 600000개이지만, 한편 니볼루맙을 투여한 경우의 종양 내의 인간 T세포수는 평균 2100000개로서 PBS 투여군과 비교하여 니볼루맙 항체 투여에 의한 종양 내의 인간 T세포수가 증가하였다. 그러나 HSC-4 피하 이식 NOG-FcgR＋/＋마우스에서는 PBS를 투여한 경우 종양 내의 인간 T세포수는 평균 140000개이지만, 니볼루맙을 투여한 경우의 종양 내의 인간 T세포수는 평균 36000개로서 PBS 투여군과 비교하여 니볼루맙 항체 투여에 의한 종양 내로의 인간 T세포수의 감소가 확인되었다. 또 도 23(e) 및 (f)로부터 알 수 있듯이 HSC-4 피하 이식 NOG-FcgR KO/KO마우스의 비장 및 혈액에서 니볼루맙을 투여한 경우의 인간 T세포수는 비장에서는 평균 12400000개이며, 말초혈에서는 평균 1270000개/mL이지만, PBS를 투여한 경우의 비장에서는 평균 2600000개이며, 말초혈에서는 평균 350000개/mL로서 PBS 투여군과 비교하여 많고 니볼루맙 항체 투여에 의해 인간 T세포수의 증가가 확인되었다. HSC-4 피하 이식 NOG-FcgR＋/＋마우스에서는 니볼루맙을 투여한 경우의 인간 T세포수는 비장에서는 평균 800000개이며, 말초혈에서는 평균 60000개/mL이지만, PBS를 투여한 경우의 비장에서는 평균 2000000개이며, 말초혈에서는 평균 190000개/mL로서 니볼루맙 항체 투여에 의한 인간 T세포수의 감소가 확인되었다.
이상의 결과는 NOG(-FcgR＋/＋)마우스에서는 항PD-1 항체에 의해 종양 내의 PD-1＋T세포가 마우스 탐식 세포에 의해 상해되었으나, NOG-FcgR KO/KO마우스에서는 면역 체크 포인트 저해제의 생리 활성인 종양 내로의 T세포 침윤의 항진 효과를 검출할 수 있었던 것을 나타내고 있다.
본 발명의 마우스는 마우스 탐식 세포에 영향을 받지 않고 ADCC 활성을 평가할 수 있는 인간화 면역 부전 마우스로서 의학 분야에서 매우 유용하다.
SEQUENCE LISTING
<110> Central Institute for Experimental Animals
<120> Immunodeficient mouse
<130> 2019C11729
<150> JP2018-181930
<151> 2018-09-27
<150> JP2018-217229
<151> 2018-11-20
<160> 13
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Inventor: Takahashi, Takeshi; Katano, Ikumi
<220>
<223> Fcer1g primer 1
<400> 1
ctcgtgcttt acggtatcgc c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Fcer1g primer2
<400> 2
cctactctac tgtcgactca ag 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Fcer1g primer3
<400> 3
ggctggctat agctgccttt c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Fcgr2b primer1
<400> 4
ctcgtgcttt acggtatcgc c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Fcgr2b primer2
<400> 5
aaactcgacc ccccgtggat c 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Fcgr2b primer3
<400> 6
ttgactgtgg ccttaaacgt gtag 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IL-2rg primer1
<400> 7
ctgctcagaa tgcctccaat tcc 23
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IL-2rg primer2
<400> 8
cctccgtgca atccatcttg ttcaat 26
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IL-2rg primer3
<400> 9
gatccagatt gccaaggtga gtag 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> scid primer1
<400> 10
gctagagagc tgttccagtt 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> scid primer2
<400> 11
tttgaacaca cactgattct g 21
<210> 12
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> scid primer3
<400> 12
acgctaagc 9
<210> 13
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> scid primer4
<400> 13
cgctatgct 9
Claims (29)
- IL-2 수용체 γ쇄 유전자에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손되고, 또한 T세포 및 B세포의 항원 수용체 유전자의 재구성에 관한 유전자의 변이가 양대립 유전자 좌위에 있으며, 또한 FcgR이 기능적으로 발현하지 않음으로써 종양에 대한 항체 의존성의 세포 상해 활성을 나타내지 않고, NOG 마우스와 비교하여 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 개변 면역 부전 마우스.
- 청구항 1에 있어서, IL-2 수용체 γ쇄 유전자에 변이가 도입되어 IL-2 수용체 γ쇄가 결손되고, 또한 T세포 및 B세포의 항원 수용체 유전자의 재구성에 관한 유전자의 변이가 양대립 유전자 좌위에 있으며, RAG 변이, SCID 변이, 또는 SCID 변이 및 RAG 변이의 둘다이고, 또한 FcgR이 기능적으로 발현하지 않음으로써 종양에 대한 항체 의존성의 세포 상해 활성을 나타내지 않고, 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 개변 면역 부전 마우스.
- 삭제
- 청구항 1에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스에서 유래하는 생식 세포.
- 청구항 1에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스에, NOG 마우스와 비교하여 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착되어 있는 것을 특징으로 하는 인간 세포 생착 면역 부전 마우스.
- 청구항 5에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스에서 유래하는 생식 세포.
- 청구항 1에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스와 인간 IL-15 유전자가 도입된 유전자 개변 면역 부전 마우스(I)를 교배함으로써 제작된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II).
- 청구항 7에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)에서 유래하는 생식 세포.
- 청구항 7에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)에, NOG 마우스와 비교하여 인간 세포가 현저히 높은 비율로 생착되어 있는 것을 특징으로 하는 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II).
- 청구항 9에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)에서 유래하는 생식 세포.
- 청구항 5에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스를 이용하여 인간 세포에 대한 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 활성이나 작용 메커니즘을 평가하는 방법.
- 청구항 7에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스(II)를 이용하여 인간 NK세포의 ADCC 활성을 평가하는 방법.
- 청구항 9에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(II)를 이용하여 인간 NK세포의 ADCC 활성을 평가하는 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 유전자 개변 면역 부전 마우스에 인간 면역 세포와 인간 종양 세포를 공존시킴으로써 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 기능을 평가할 수 있는 것을 특징으로 하는 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(III).
- 청구항 14에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(III)를 이용하여 인간 세포에 대한 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 기능을 평가하는 방법.
- 청구항 14에 기재된 인간 세포 생착 면역 부전 마우스(III)를 이용하여 인간 면역 세포에 대한 항인간 세포 표면 단백 분자 항체의 기능을 평가하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018181930 | 2018-09-27 | ||
| JPJP-P-2018-181930 | 2018-09-27 | ||
| JPJP-P-2018-217229 | 2018-11-20 | ||
| JP2018217229A JP6935383B2 (ja) | 2018-09-27 | 2018-11-20 | 免疫不全マウス |
| PCT/JP2019/037675 WO2020067199A1 (ja) | 2018-09-27 | 2019-09-25 | 免疫不全マウス |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210064264A KR20210064264A (ko) | 2021-06-02 |
| KR102581970B1 true KR102581970B1 (ko) | 2023-09-22 |
Family
ID=70105451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217010969A KR102581970B1 (ko) | 2018-09-27 | 2019-09-25 | 면역 부전 마우스 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210259221A1 (ko) |
| JP (1) | JP6935383B2 (ko) |
| KR (1) | KR102581970B1 (ko) |
| CN (1) | CN111372449B (ko) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113588934A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-11-02 | 创模生物科技(北京)有限公司 | Pbmc的免疫系统重建能力的检测方法及应用 |
| WO2023183912A2 (en) * | 2022-03-25 | 2023-09-28 | The Jackson Laboratory | Immunodeficient fcgr1 knockout mouse models |
| WO2024091902A1 (en) * | 2022-10-25 | 2024-05-02 | Lapix Therapeutics, Inc. | Immune cell-engrafted non-human animals and non-human animal models |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004154058A (ja) | 2002-11-06 | 2004-06-03 | Jitsuken Doubutsu Chuo Kenkyusho | ヒト造血器腫瘍の動物モデル |
| WO2011084664A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-07-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | HUMANIZED FCγ R MICE |
| WO2016189799A1 (ja) | 2015-05-27 | 2016-12-01 | 公益財団法人実験動物中央研究所 | ヒトｉｌ－１５分泌免疫不全マウス |
| WO2017118675A1 (en) | 2016-01-08 | 2017-07-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2402459A1 (en) | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Central Institute For Experimental Animals | Method of producing a mouse suitable for engraftment, differentiation and proliferation of heterologous cells, mouse produced by this method and use of the mouse |
| US20110030072A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-02-03 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of immunodeficiency genes in animals |
| JP5073836B2 (ja) * | 2009-01-16 | 2012-11-14 | 公益財団法人実験動物中央研究所 | ヒト肝細胞が移植されたマウス |
| LT3348140T (lt) * | 2012-03-16 | 2021-01-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Histidinu pakeisti lengvosios grandinės antikūnai ir genetiškai modifikuoti graužikai, išvesti jų gamybai |
| MX2015014017A (es) * | 2013-04-02 | 2016-02-10 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Variante de la region fc. |
| CN106999556B (zh) * | 2014-07-21 | 2021-07-30 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 细胞因子诱导的杀伤细胞的双特异性抗体介导的癌症治疗 |
| LT3221356T (lt) * | 2014-11-20 | 2020-11-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | T ląstelę aktyvinančios bispecifinės antigeną surišančios molekulės prieš folr1 ir cd3 |
| EP3064507A1 (en) * | 2015-03-06 | 2016-09-07 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Fusion proteins comprising a binding protein and an interleukin-15 polypeptide having a reduced affinity for IL15ra and therapeutic uses thereof |
| WO2017025944A2 (en) * | 2015-08-13 | 2017-02-16 | Brigham Young University | Macrophage car (moto-car) in imunotherapy |
| EP3405790B1 (en) * | 2016-01-19 | 2023-06-28 | Celgene Corporation | Transgenic mouse expressing human cereblon |
| WO2018053109A1 (en) * | 2016-09-14 | 2018-03-22 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | Gene expression characterization of a glatiramer acetate related drug product in mammalian and human cells |
-
2018
- 2018-11-20 JP JP2018217229A patent/JP6935383B2/ja active Active
-
2019
- 2019-09-25 US US17/251,272 patent/US20210259221A1/en active Pending
- 2019-09-25 CN CN201980005541.4A patent/CN111372449B/zh active Active
- 2019-09-25 KR KR1020217010969A patent/KR102581970B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004154058A (ja) | 2002-11-06 | 2004-06-03 | Jitsuken Doubutsu Chuo Kenkyusho | ヒト造血器腫瘍の動物モデル |
| WO2011084664A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-07-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | HUMANIZED FCγ R MICE |
| WO2016189799A1 (ja) | 2015-05-27 | 2016-12-01 | 公益財団法人実験動物中央研究所 | ヒトｉｌ－１５分泌免疫不全マウス |
| WO2017118675A1 (en) | 2016-01-08 | 2017-07-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BLOOD vol.122(10), pp.1793-1801(2013.09.30) |
| Cancer letters, vol344(1), pp.13-19(2013.10.31)* |
| Cancer Research vol.79(13, Supplement), pp.LB-032(2019.03.29) |
| Front Immunol., 2020 Oct 7;11:532684 |
| Scientific Reports, vol.7(1), pp.7-11(2017.12.01)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20210064264A (ko) | 2021-06-02 |
| JP6935383B2 (ja) | 2021-09-15 |
| CN111372449A (zh) | 2020-07-03 |
| CN111372449B (zh) | 2023-04-18 |
| JP2020054328A (ja) | 2020-04-09 |
| US20210259221A1 (en) | 2021-08-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6732998B2 (ja) | 遺伝学的に修飾された非ヒト動物およびその使用法 | |
| Majeti | Monoclonal antibody therapy directed against human acute myeloid leukemia stem cells | |
| KR102664078B1 (ko) | 환자-유래 이종이식을 가지는 hla-비매칭의 인간화된 nsg 마우스 모델 | |
| EP1338198B1 (en) | Method of constructing mouse suitable for the take, differentiation and proliferation of heterogenous cells, mouse constructed by this method and use of the mouse | |
| KR102581970B1 (ko) | 면역 부전 마우스 | |
| Lux et al. | A humanized mouse identifies the bone marrow as a niche with low therapeutic IgG activity | |
| Menoret et al. | In vivo analysis of human immune responses in immunodeficient rats | |
| WO2020067199A1 (ja) | 免疫不全マウス | |
| US20240041925A1 (en) | Chimeric antigen receptor (car)-t cell expressing cxcl12 receptor | |
| Fanning et al. | The immunological impact of genetic drift in the B10. BR congenic inbred mouse strain | |
| JP5458359B2 (ja) | ヒト白血病幹細胞および白血病非幹細胞が増幅されたマウスおよびその製造方法 | |
| Kay | Anti-B-cell lymphoma activity mediated by CD3+ CD4-CD8-T cells activated in vitro or in vivo |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |