KR20180012294A - 인간 il-15 분비 면역 결핍 마우스 - Google Patents

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Abstract

인간 NK 세포의 기능을 검토할 수 있는 마우스를 제공하는 것을 과제로 한다. 인간 인터루킨 2(IL-2)의 신호 펩타이드를 코딩하는 cDNA 서열에 인터루킨 15(IL-15)를 코딩하는 cDNA 서열이 작동 가능하도록 연결된 DNA를 포함하는 유전자 영역인 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 면역 결핍 마우스의 cDNA에 삽입함으로써, 제작된 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스에 의하면 이식 후 적어도 6개월은 인간 성숙 NK 세포의 연구를 인비보에서 수행하기 위해 충분한 농도의 hCD56＋ 세포가 검출된다.

Description

인간 IL-15 분비 면역 결핍 마우스
본 발명은 인간 IL-15를 분비할 수 있는 동시에, 인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포를 이식 후, h(human: 인간)CD56＋ 세포가 인비보에서 장기적으로 검출되는, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA가 게놈 DNA에 삽입되어 있는 면역 결핍 마우스에 관한 것이다.
인간 세포, 인간 조직을 인비보에서 해석할 수 있는 인간화 면역 결핍 마우스는 신약 개발을 위한 리서치 도구로서의 이용뿐 아니라, 인간 세포를 이식함으로써 인비보에서 인간 세포의 분화, 기능 해석 등의 기초 연구를 수행할 수 있는 유용한 도구로서, 의료에 대한 공헌을 기대할 수 있는 실험 동물로 여겨져, 오랜 시간에 걸쳐 보다 유용한 인간화 면역 결핍 마우스의 창출이 시도되어 왔다.
1962년, 흉선이 없기 때문에, 흉선에서 유래하는 T세포를 결손한 누드 마우스가 면역 결핍 마우스로서 발견되었으나, 이 마우스에는 다른 면역 세포가 존재하고, 일부 인간 암세포는 생착되었지만 통상적인 인간 세포는 생착되지 않았다. 1980년에 Melvin Bosma들에 의해, C. B-17 계통 마우스에서 발견된 자연 발증 돌연변이체에서 중증의 SCID(Severe Combined ImmunoDeficiency) 변이를 보이는 SCID 면역 결핍 마우스가 발견되었다(예를 들어 비특허 문헌 1 참조). 상기 scid 변이란, 정염색체 열성의 유전 양식을 취하며, T세포 및 B세포가 없기 때문에, SCID 마우스의 신장 피막하에 인간 태아의 흉선을 이식할 수 있는 등의 일정한 성과가 있었지만, 기대된 정도의 인간 세포의 생착률은 향상되지 않았다.
마찬가지로 1980년 즈음, 백내장 마우스 중에 다뇨·요당 강양성을 보이는 메스 개체가 발견되었으며, 그 증상이 인간의 1형 당뇨병(인슐린 의존형 당뇨병)과 유사하다는 점에서 NOD(Non Obese Diabetes)라고 명명된 NOD 마우스가 마키노에 의해 확립되었다(예를 들어 비특허 문헌 2 참조). 이와 같은 NOD 마우스와 상기 SCID 마우스를 교배시킴으로써, SCID 마우스를 웃도는 인간 세포의 생착이 가능해지는 NOD/scid 마우스가 만들어졌다. NOD/scid 마우스에서는, NOD 계통에서 유래하는 보체 활성, 대식 세포 기능이나 자연 살해(NK) 세포 활성 등의 감퇴가 보이며, 인간 조혈간세포를 이식해도 거절되지 않았지만, 생착 효율이 높지 않다는 것이나 마우스의 수명이 짧다는 것 등의 문제가 지적되고 있었다.
또한 본 발명자들은 NOD 마우스에 C. B-17-scid 마우스를 여교배함으로써 수득되는 마우스에, 인터루킨 2 수용체 γ사슬 유전자를 녹아웃(knock out)한 마우스를 여교배함으로써, 기능적인 T세포 및 B세포를 모두 결실하고, 대식 세포 기능이 감퇴하며, NK 세포 또는 NK 활성을 소실하는 동시에 수상 세포 기능이 감퇴하고 있으며, 뛰어난 이종 세포 생착성을 갖는 NOD/SCID/γcnull 마우스(단순히 'NOG 마우스'라고도 함.)를 만들어냈다(예를 들어 특허 문헌 1 등 참조). NOG 마우스는 종래의 마우스와 비교하여 현격히 인간의 세포나 조직의 생착성이 높은 동시에, 이식한 인간 간세포(幹細胞)가 성숙 세포로도 분화하는 것이 가능하며, 또한 다양한 인간화 마우스 모델의 제작에 유용하다고 여겨지고 있다(예를 들어 비특허 문헌 3 참조).
한편, NK 세포란, 선천 면역의 주요 인자로서 기능하는 세포 상해성 림프구의 일종으로 여겨지며, 항원 감작 없이 종양 세포나 바이러스 감염 세포를 장해할 수 있고, CD56을 포함하는 표면 항원이 발현하고 있다는 특성을 갖는다. 그러나, 상기 NOG 마우스에서는, 제대혈 유래의 조혈간세포를 이식한 경우에는 인간 NK 세포로의 분화 효율이 낮고, 말초혈 유래의 인간 성숙 NK 세포를 이식한 경우에도 인간 NK 세포는 단기간 유지되는 것에 그친다고 여겨졌다.
특허 문헌 1: 일본 특허 제3753321호
비특허 문헌 1: Nature. 301, 527-530, 1983. 비특허 문헌 2: Jikken Dobutsu. 29:1-13, 1980 비특허 문헌 3: Blood, 100, no. 9, 3175-3182, 2002
본 발명의 과제는 인간 NK 세포의 기능을 검토할 수 있는 마우스를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 인간 인터루킨 2(hIL-2)의 신호 펩타이드와 hIL-2 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자 영역을 NOD-IL2rγnull 마우스의 게놈 DNA에 삽입하고, NOG 마우스와 교배함으로써 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-2 Tg 마우스를 제작하였으며, 이러한 마우스에서는, 인간 제대혈 유래 조혈간세포를 이식함으로써 hCD56이 양성을 나타내는 성숙형 인간 NK 세포가 인비보에서 분화, 증식했으나(Katano et al., J. Immunol. February 23, 2015 1401323), 인간 말초혈을 이식한 경우에는, hCD56이 양성을 나타내는 인간 NK 형태 세포가 증식하는 경우가 거의 없었던 것을 확인했다.
상기 hIL-2의 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을, hIL-15 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 상류에 설치한 서열을 포함하는 DNA를 COS 세포로 트랜스펙트(transfect)하여, hIL-2 신호 펩타이드-hIL-15 융합 단백질을 발현시킨 바, hIL-15의 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 hIL-15를 코딩하는 DNA 서열의 상류에 설치한 서열을 포함하는 DNA를 이용해 hIL-15 단백질을 산생(産生)시킨 경우와 비교해, 세포 외에 분비된 hIL-15 단백질 양이 15배 내지 20배에 이른다는 보고(J. Immunol. 1998; 160; 4418-4426)가 있다.
본 발명자들은 인간 인터루킨 2(IL-2)의 신호 펩타이드를 코딩하는 cDNA 서열에 인터루킨 15(IL-15)를 코딩하는 cDNA 서열이 작동 가능하도록 연결된 DNA를 포함하는 유전자 영역인 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 공지된 면역 결핍 마우스의 cDNA에 삽입함으로써, NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스를 제작하고, 제대혈 유래 인간 조혈간세포를 이식한 바, NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-2 Tg 마우스에 대한 상기 결과와 마찬가지로, 인간 CD56＋ NK 세포가 분화, 증식하고 있는 것이 확인되었다.
본 발명자들은 더욱 검토를 계속하여, NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스에 인간 말초혈 유래의 hCD56＋ NK 세포를 이식했는데, 놀랍게도 hCD56이 양성을 나타내는 세포수가 서서히 증가하여, 이식 후 5주간 경과 시에는 마우스 혈액 내에서 8000세포/μL이라는 매우 고농도의 피크 값을 나타냈다. 그 후에는 hCD56이 양성을 나타내는 세포수는 점차 감소했지만, 이식 후 적어도 6개월은 인간 성숙 NK 세포의 연구를 인비보에서 수행하기 위해 충분한 농도의 hCD56＋ 세포가 본 발명의 마우스 혈액 내에 검출되는 것이 확인되었다. 또한, 인간 말초혈 유래의 hCD56＋ NK 세포를 이식한 후의 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스에서는, 인간 종양의 생육이 인비트로뿐 아니라 인비보에서도 억제되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 인간 IL-15를 분비할 수 있는 동시에, 인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포를 이식 후에 hCD56＋ 세포가 인비보에서 장기적으로 검출되는 것을 특징으로 하는, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA가 게놈 DNA에 삽입되어 있는 면역 결핍(부전(不全)) 마우스.
[2] hCD56＋ 세포가 또한 hCD16이 양성을 나타내는 hCD56＋hCD16＋ 세포인 것을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재된 면역 결핍 마우스.
[3] hCD56＋ 세포가 비장, 간장 및/또는 폐에서 검출되지만, 골수에서 검출되지 않는 세포인 것을 특징으로 하는 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 면역 결핍 마우스.
[4] hCD56＋ 세포가 세포 표면 분자로서 hNKG2A, hNKG2C, hNKG2D, hCD94, hNKp30, hNKp46, hNKp44, hNKp80, hCD57, hCD158a/h(KIR), hCD158b(KIR), hCD158d(KIR), hCD158e(KIR), 또는 hCD158f(KIR)에 대해 양성을 나타내는 세포인 것을 특징으로 하는 상기 [1]~[3] 중 어느 하나에 기재된 면역 결핍 마우스.
[5] 인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포를 이식 후에, 사이토카인 존재하에서 인간 종양의 생육을 인비트로에서 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 [1]~[4] 중 어느 하나에 기재된 면역 결핍 마우스.
[6] 사이토카인이 hIL-15인 것을 특징으로 하는 상기 [5]에 기재된 면역 결핍 마우스.
[7] 인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포를 이식 후에, 인간 종양의 생육을 인비보에서 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 [1]~[6] 중 어느 하나에 기재된 면역 결핍 마우스.
[8] 이하의 (1)~(7)의 공정을 순차적으로 포함하는 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스의 제작 방법.
(1) 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 마우스 게놈 DNA에 삽입하기 위해 필요한 영역을 포함하는 벡터에, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA를 도입함으로써, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA를 갖는 마우스 수정란 주입 DNA 조제용 벡터를 제작하는 공정;
(1-1) 필요에 따라, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 및 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 마우스 게놈 DNA에 삽입되기 위해 필요한 영역,을 포함하는 수정란 주입용 DNA 단편을 조제하는 공정;
(2) 상기 공정 (1)에서 제작된 벡터 및/또는 상기 (1-1)에서 조제된 벡터 단편을 인터루킨 2 수용체 γ사슬 유전자(IL-2Rγ) 녹아웃 마우스의 수정란에 주입함으로써 주입 수정란을 제작하는 공정;
(3) 상기 공정 (2)에서 제작된 주입 수정란을 배양함으로써 신생자(新生子) 마우스를 제작하는 공정;
(4) 상기 공정 (3)에서 제작된 마우스에서, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 NOD-IL-2rγnull 마우스의 게놈 DNA에 삽입되었는지 여부를 판정하는 공정;
(5) 상기 공정 (4)에서 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 NOD-IL-2rγnull 마우스의 게놈 DNA에 삽입되었다고 판정된 마우스가 hIL-15를 분비하고 있는지 여부를 판정하여, hIL-15를 분비하고 있는 마우스를 NOD-IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스로서 선발하는 공정;
(6) 상기 NOD-IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 교배하여, scid 변이가 도입된 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스를 제작하는 공정;
(7) NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 교배하여 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 1:1로 제작하는 공정;
본 발명에 의하면, 본 발명의 마우스에 이식된 인간 말초혈 유래 NK 세포가 마우스에서 매우 장기적으로 유지될 수 있어, 인간 NK 세포의 기능에 대해 장기간에 걸쳐 인비보에서 해석할 수 있다.
도 1의 (a)는 pCMVβ 벡터의 구성을 나타내며, (b)는 수정란 주입 DNA 조제용 벡터의 구성을 나타낸다.
도 2는 수정란 주입용 DNA 단편의 구성을 나타낸다.
도 3은 NOG-hIL-15 Tg 마우스의 혈장 내 hIL-15 농도를 나타낸다.
도 4는 간세포 이식 마우스에 대해, (a)는 단핵세포(MNC) 내의 hCD45＋ 세포, hCD19＋ 세포, hCD56＋ 세포의 세포량(/μL)을 각각 나타내며, (b)는 단핵세포 내에 차지하는 hCD45＋ 세포, hCD19＋ 세포, hCD56＋ 세포의 세포수(%)를 나타낸다.
도 5는 간세포 이식 마우스의 골수, 비장, 말초혈 각각으로부터 수득된 면역 세포에 대한 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 해석 결과를 나타낸다.
도 6은 간세포 이식 마우스에서의 인간 NK 세포의 플로우 사이토메트리 해석을 통해, 인간 NK 세포 특이적인 수용체의 발현을 해석한 결과이다.
도 7은 인간 조혈간세포 유래 NK 세포의 세포 상해 과립 분비능에 대한 플로우 사이토메트리 해석 결과를 나타내며, (a)는 GranzymeA와 Perforin의 발현에 대한 결과를 나타내고, (b)는 hIFNγ 발현에 대한 결과를 나타낸다.
도 8은 말초혈 이식 hIL-15 마우스의 말초혈의 플로우 사이토메트리 해석 결과를 나타낸다.
도 9은 말초혈 이식 마우스에 대해, (a)는 단핵세포(MNC) 내에 차지하는 hCD56＋ 세포수(%)를 나타내고, (b)는 단핵세포(MNC) 내에 차지하는 CD3＋ T세포수(%)를 나타낸다. (c)는 말초혈 이식 hIL-15 마우스 혈액 내의 hCD56＋ 세포수(/μL)를 나타내고, (d)는 말초혈 이식 non-Tg 마우스 혈액 내의 hCD56＋ 세포수(/μL)를 나타낸다.
도 10은 말초혈 이식 hIL-15 마우스의 말초혈 내 2종류의 인간 성숙 NK 세포 아종의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 11은 동결 말초혈 hIL-15 마우스의 말초혈에 대한 플로우 사이토메트리 해석 결과를 나타낸다.
도 12는 동결 말초혈 hIL-15 마우스의 말초혈 내 2 종류의 인간 성숙 NK 세포 아종의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 13은 말초혈 이식 hIL-15 마우스 각 조직 내의 인간 NK 세포의 분포에 대한 플로우 사이토메트리 해석 결과를 나타낸다.
도 14는 말초혈 이식 hIL-15 마우스의 비장으로부터 단리(單離)된 인간 NK 세포의 세포 표면 분자에 대한 플로우 사이토메트리 해석 결과를 나타낸다.
도 15는 인간 말초혈 유래 NK 세포의 세포 상해 과립 분비능에 대한 플로우 사이토메트리 해석 결과를 나타내며, (a)는 GranzymeA와 Perforin의 발현에 대한 결과를 나타내고, (b)는 hIFNγ 발현에 대한 결과를 나타낸다.
도 16은 말초혈 이식 hIL-15 마우스로부터 단리된 hCD56＋ 세포의 종양 생육 인비트로 억제능을 나타내는 그래프이다.
도 17은 말초혈 이식 hIL-15 마우스의 피하 이식 인간 종양에 대한 인비보 세포 상해 활성을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 면역 결핍 마우스는 인간 IL-15를 분비할 수 있는 동시에, 이식된 인간 NK 세포를 인비보에서 장기적으로 유지할 수 있는 것을 특징으로 하는, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA가 게놈 DNA에 삽입되어 있는 면역 결핍 마우스이면 특별히 제한되지 않으며, 인간 IL-15란, 인간 말초혈 단핵세포가 생산(산생(産生))하는 인간 사이토카인 단백질의 일종이며, 상기 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열이란, 인간 인터루킨 2(hIL-2) 신호 펩타이드를 코딩하는 cDNA(이하 'hIL-2SPcDNA'라고도 함.)에 인터루킨 15 단백질(hIL-15)을 코딩하는 cDNA(이하 'hIL-15cDNA'라고도 함.)가 작동 가능하도록 연결되어 있는 hIL-2SPcDNA/hIL-15cDNA 연결체의 염기 서열이다.
상기 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA가 마우스의 게놈 DNA에 삽입되어 있는지 여부를 판정하는 방법으로는, 마우스의 조직에서 추출된 게놈 DNA에 대해, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 검출하기 위해 적절한 프라이머 세트를 이용하여 PCR법에 의해 확인하는 방법이나, 서전 블롯(southern blot) 분석에 의해 확인하는 방법을 예시할 수 있다.
본 발명의 면역 결핍 마우스가 인간 IL-15를 분비하고 있는지 여부를 판정하는 방법으로는, hIL-15를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 면역학적 측정법을 통해, 본 발명의 마우스의 림프액, 혈청·혈장 등의 혈액의 체액이나 장기 추출물 등에서 인간 IL-15가 검출되는지 여부를 결정하는 방법을 예시할 수 있다. 상기 면역학적 측정법으로는, 면역 조직 화학 염색법, ELISA법, EIA법, RIA법, 웨스턴 블롯(western blot) 분석에 의해 확인하는 방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 채취한 마우스 말초혈에 항응고제를 첨가하고, 항hIL-15 항체를 구비하는 시판의 ELISA 키트를 이용하여 인간 IL-15가 혈장 분획에 검출되는지 여부를 결정하는 방법을 예시할 수 있다.
본 발명에서의 인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포로는, 인간 말초혈에 포함되어 있는 인간 NK 세포나, 인간 말초혈로부터 단리된 인간 NK 세포나, 인간 말초혈을 이용하여 인공적으로 배양된 인간 NK 세포나, 냉동 보존 후 해동된 인간 말초혈에 포함되어 있는 인간 NK 세포나, 인간 말초혈로부터 단리된 인간 NK 세포를 냉동 보존 후 해동한 인간 NK 세포나, 인간 말초혈을 이용하여 인공적으로 배양된 NK 세포를 냉동 보존 후 해동한 인간 NK 세포 등을 들 수 있다.
상기 인간 NK 세포를 본 발명의 면역 결핍 마우스에 이식하는 방법으로는, 이식된 이종 세포의 생착능을 향상시키기 위해 X선 등의 골수 내 환경을 파괴하는 방사선을 조사하고, 방사선 조사 후에 인간 말초혈 유래의 hCD56＋ NK 세포를 이식하는 방법을 들 수 있으며, 방사되는 방사선의 강도로는, 바람직하게는 1.5~3.5Gy를 들 수 있다. 이식 시기로는, 방사선 조사 후 24시간 이내가 바람직하다. 또한, 이식되는 NK 세포 이식수로는, 바람직하게는 0.2~10×106개, 바람직하게는 0.5~3×106개, 보다 바람직하게는 1~2×106개를 들 수 있다.
본 발명의 면역 결핍 마우스가, hCD56＋ 세포가 인비보에서 검출되는지 여부를 확인하는 방법으로는 공지된 방법을 이용할 수 있는데, 예를 들어 본 발명의 면역 결핍 마우스의 혈액 내의 세포나, 본 발명의 면역 결핍 마우스의 혈액 내로부터 단리된 세포에 대해, hCD56이 양성을 나타내는 hCD56＋ 세포인지 여부를 플로우 사이토메트리를 통한 해석에 의해 확인하는 방법을 들 수 있다.
구체적으로는, 상기 플로우 사이토메트리를 통한 해석에서, hCD56＋ 세포가 단핵세포 내에 1% 이상, 바람직하게는 3% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상, 더욱더 바람직하게는 10% 이상 존재하는 경우나, hCD56＋ 세포가 혈액 내에 적어도 40세포/μL 존재하는 경우를 들 수 있다.
본 발명에서의 hCD56＋ 세포의, 인간 생체 내에서 성숙한 NK 세포와의 표현형에 있어서의 동일성을 증강하기 위한 조건으로는, 인간 CD56＋CD16＋ 세포나 인간 CD56＋CD16- 세포가 각각 혈액, 비장, 간장 및/또는 폐에서 검출되지만, 인간 CD56＋CD16＋ 세포나 인간 CD56＋CD16- 세포가 각각 골수에서 검출되지 않는 경우를 들 수 있으며, 본 발명에 있어서, 비장, 간장, 폐, 혈액 등의 마우스의 장기·조직에서 hCD56＋ 세포가 검출되는 것을, hCD56＋ 세포가 생착했다고 표현하는 경우가 있다.
본 발명에서의 hCD56＋ 세포의, 인간 생체 내에서 성숙한 NK 세포와의 표현형에 있어서의 동일성을 보완하기 위한 추가적인 조건으로는, 인간 조직에서의 성숙 NK 세포의 특이적인 세포 표면 분자로서 알려져 있는 hNKG2A, hNKG2C, hNKG2D, hCD94, hNKp30, hNKp46, hNKp44, hNKp80, hCD57, hCD158a/h(Killer Immunoglobulin-like Receptor: KIR), hCD158b(KIR), hCD158d(KIR), hCD158e(KIR), hCD158f(KIR) 등의 각 항원 중 몇몇이 양성을 나타내는(발현하고 있는) 세포인 것을 들 수 있으며, hNKG2A, hNKG2C, hNKG2D, hCD94, hNKp30, hNKp46, hNKp44, hNKp80, hCD57, hCD158a/h(KIR), hCD158b(KIR), hCD158d(KIR), hCD158e(KIR), hCD158f(KIR) 모두가 이식 전의 NK 세포(도너)와 동일한 발현을 나타내는 세포인 것을 바람직하게 들 수 있다.
본 발명에서의 hCD56＋ 세포의, 인간 생체 내에서 성숙한 NK 세포와의 표현형에 있어서의 동일성을 증강하기 위한 더 추가적인 조건으로는, NK 세포의 세포 상해 활성을 유도하는 natural cytotoxicity receptor(NCR) 패밀리의 일원으로 알려져 있는 hNKp46이 양성을 나타내는 세포인 것이나, GranzymeA가 양성을 나타내는 세포인 것을 들 수 있다.
본 발명의 면역 결핍 마우스가 인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포를 이식 후에 인간 종양의 생육을 인비트로에서 억제할 수 있는지 여부를 확인하는 방법으로는, 비장으로부터 단리한 hCD56＋ NK 세포를 사이토카인 존재하에서 배양 후에 표적 인간 종양 세포와 공배양하고, 그 배양 상청에 대해, 죽은 세포 유래 세포질성 효소 LDH와 반응 기질의 공익 효소 반응에 의한 정색도로 평가함으로써, 세포 상해 활성(cytotoxicity(%))을 측정하는 방법을 예시할 수 있다. 상기 사이토카인으로는 인간 IL-2, 인간 IL-15, 인간 IL-2와 인간 IL-15의 혼합 조성물 등을 들 수 있으나, 인간 IL-15가 바람직하다.
본 발명의 면역 결핍 마우스가 인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포를 이식 후에 인간 종양의 생육을 인비보에서 억제할 수 있는지 여부를 확인하는 방법으로는, 인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포를 이식 후에, 다시 NK 감수성 인간 종양 세포주를 이식하고 경시적으로 종양 지름을 측정한 경우, 종양의 사이즈가 축소하는지 여부에 따라 판정하는 방법을 들 수 있다.
상기 hCD56＋ 세포가 인비보에서 검출되는 장기 기간으로는, 8주간 이상을 들 수 있으며, 12주간 이상이 바람직하고, 16주간 이상이 보다 바람직하고, 20주간 이상이 더욱더 바람직하고, 24주간 이상이 특히 바람직하다.
본 발명의 면역 결핍 마우스로는 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스를 바람직하게 예시할 수 있으며, 본 발명의 면역 결핍 마우스의 제작 방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 이하의 (1)~(7)의 공정을 순차적으로 포함하는 상기 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스의 제작 방법을 예시할 수 있다.
(1) 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 마우스 게놈 DNA에 삽입하기 위해 필요한 영역을 포함하는 벡터에, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA를 도입함으로써, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA를 갖는 마우스 수정란 주입 DNA 조제용 벡터를 제작하는 공정;
(1-1) 필요에 따라, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 및 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 마우스 게놈 DNA에 삽입되기 위해 필요한 영역,을 포함하는 수정란 주입용 DNA 단편을 조제하는 공정;
(2) 상기 공정 (1)에서 제작된 벡터 및/또는 상기 (1-1)에서 조제된 벡터 단편을 인터루킨 2 수용체 γ사슬 유전자(IL-2Rγ) 녹아웃 마우스의 수정란에 주입함으로써 주입 수정란을 제작하는 공정;
(3) 상기 공정 (2)에서 제작된 주입 수정란을 배양함으로써 신생자 마우스를 제작하는 공정;
(4) 상기 공정 (3)에서 제작된 마우스에서, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 NOD-IL-2rγnull 마우스의 게놈 DNA에 삽입되었는지 여부를 판정하는 공정;
(5) 상기 공정 (4)에서 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 NOD-IL-2rγnull 마우스의 게놈 DNA에 삽입되었다고 판정된 마우스가 hIL-15를 분비하고 있는지 여부를 판정하여, hIL-15를 분비하고 있는 마우스를 NOD-IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스로 선발하는 공정;
(6) 상기 NOD-IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG(NOD-scid, IL-2rγnull) 마우스를 교배하여, scid 변이가 도입된 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스를 제작하는 공정;
(7) NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 교배하여 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 1:1로 제작하는 공정;
공정 (1)에서, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 마우스 게놈 DNA에 삽입하기 위해 필요한 삽입 영역으로는, 사이토메갈로바이러스 프로모터(pCMV-IE) 등의 마우스 세포에서 작동 가능한 프로모터, SV40SS/SA, 및 SV40PolyA를 포함하는 영역을 예시할 수 있으며, 이와 같은 삽입 영역을 포함하는 발현 벡터로는 pCMVβ를 예시할 수 있다.
상기 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 포함하는 마우스 수정란 주입 DNA 조제용 벡터를 제작하는 방법으로는, 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하는 방법을 들 수 있으며, 구체적으로는 pCMV-LacZ를 제한 효소 NotI로 잘라 내고, β-갈락토시다아제를 코딩하는 DNA를 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA에 치환하는 방법을 예시할 수 있다.
공정 (1-1)에서의 수정란 주입용 DNA 단편을 제작하는 방법으로는, 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하는 방법을 들 수 있으며, 구체적으로는 상기 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA를 갖는 마우스 수정란 주입 DNA 조제용 벡터를 제한 효소 PｖuII로 잘라 내고, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 삽입 영역을 포함하는 DNA를 갖는 벡터 단편을 정제하는 방법을 들 수 있다.
공정 (2)에서의 주입 수정란을 제작하는 방법으로는, 상기 마우스 수정란 주입 DNA 조제용 벡터나 수정란 주입용 DNA 단편을 마우스의 수정란에 주입할 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않으며, 미세주입(microinjection)법에 의한 방법, 전기 천공법, 바이러스 벡터법 등을 들 수 있다. 인터루킨 2 수용체 γ사슬 유전자(IL-2Rγ) 녹아웃 마우스로는 NOD-IL-2rγnull 마우스를 바람직하게 들 수 있다.
공정 (3)에서의 주입 수정란을 배양하는 방법으로는, 신생자 마우스를 취득할 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않으며, 주입 수정란을 체외에서 18~24시간 37℃로 배양한 후, 가친(假親)의 자궁에 이식·착상시키고, 출산 직전에 제왕 절개를 수행하여 신생자 마우스를 취득하는 방법을 예시할 수 있다. 이와 같은 신생자 마우스는 다시 양자 조작을 수행함으로써 산자(産子) 마우스로 하는 것이 바람직하다.
공정 (4)에서의 상기 신생자 마우스나 산자 마우스에서, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열이 게놈 DNA에 삽입되어 있는지 여부를 판정하는 방법으로는, 각 마우스가 3-4주령 이상에 이른 시점에서 마우스의 조직으로부터 추출된 게놈 DNA에 대해 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열이 삽입되었는지 여부를 PCR법에 의해 확인하는 방법을 들 수 있다.
공정 (5)에서의, 공정 (4)에서 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 NOD-IL-2rγnull 마우스의 게놈 DNA에 삽입되었다고 판정된 마우스가 hIL-15를 분비하고 있는지 여부를 판정하는 방법으로는, hIL-15를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 상기 면역학적 측정법을 들 수 있다.
공정 (6)에서의 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스를 제작하는 방법으로는, 상기 NOD-IL-2rγnull 마우스-hIL-15 Tg 마우스로 선발된 마우스에 scid 변이를 도입할 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않으며, 구체적으로는 NOD-IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG(NOD-scid, IL-2rγnull) 마우스를 교배하는 방법을 들 수 있다.
공정 (7)에서는, NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 교배함으로써 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 1:1로 취득할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위가 이들 예시에 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1]
[IL-15를 생산하는 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스의 제작]
(개요)
공익 재단 법인 실험 동물 중앙 연구소(이하, '실중연(實中硏)'이라고도 함.)의 동물 실험 위원회의 승인을 얻은 가이던스에 따라, NOD-IL-2rγnull 마우스와 NOD-scid, IL-2rγnull 마우스(이하, 'NOG 마우스'라고도 함.)를 이용하여 인간 IL-15를 분비하는 형질전환 마우스(transgenic mouse)인 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스를 제작했다. 이들 마우스는 실중연의 SPF 사육실에서 특별히 관리되고 있으며, 일정 조건하에서 분양 가능하다.
(수정란 주입용 DNA의 조제)
포유류용 리포터 벡터인 pCMVβ(인비트로젠(Invitrogen)사 제조)(도 1(a) 참조)를 이용하여, 사이토메갈로바이러스 프로모터(pCMV-IE) DNA의 하류에, SV40SD/SV DNA, hIL-2SPcDNA/hIL-15cDNA 연결체인 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 및 폴리 A 서열 DNA가 순차적으로 편입된 수정란 주입 DNA 조제용 벡터를 구축했다. 구체적으로는, 상기 pCMV-LacZ를 제한 효소 NotI로 잘라 내고, β-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자를 Genbank(접근 번호(accession number): hIL-2(NM_000586)와 hIL-15(NM_000585 또는 BC100962)를 참조함으로써 결정된 hIL-2SPcDNA/hIL-15cDNA 연결체의 염기 서열을 포함하는 DNA와 치환했다.
구체적으로는, pCMVβ를 제한 효소 NotI로 처리하고, β-갈락토시다아제 유전자 서열 부분을 제거하여, 그 속에 NotI로 잘라 낸 hIL-2SPcDNA/hIL-15cDNA 연결체를 삽입했다. hIL-2SPcDNA/hIL-15cDNA 연결체는 별도 조제되었다. 즉, 정상인 말초혈 단핵구로부터 제작한 cDNA에서, PrimerA: ATAGCGGCCGCTCACAGTAACCTCAACTCCTGCAA(서열 번호 2) 및 PrimerB: ATCACTAGTTGCACTGTTTGTGACAAGTGC(서열 번호 3)를 이용하여 인간 hIL-2SP 부분을 증폭하고, PrimerC: GGGACTAGTAACTGGGTGAATGTAATAAGTG(서열 번호 4) 및 PrimerD: CAACTAGTTCACTTGTCACGTCGTCCTTGTAGTCAGAAGTGTTGATGAA(서열 번호 5)로 인간 hIL-15MP 부분을 증폭하여, 각각의 증폭 단편을 PCR2.1 벡터(등록 상표)(인비트로젠사 제품)에 각각 삽입했다. 그 후, 인간 hIL-2SP 부분을 Not1로 잘라 내고, β-갈락토시다아제 유전자 서열 부분을 제거한 pCMVβ에 삽입했다. 그 후, 다시 그 벡터에 인간 IL-15cDNA 부분을 포함하는 영역을 SpeI로 잘라 내고, 삽입했다. 구축된 수정란 주입 DNA 조제용 벡터의 구성을 도 1(b)에 나타낸다.
상기 수정란 주입 DNA 조제용 벡터를 제한 효소 PｖuII로 잘라 내고, 수정란에 주입하기 위해 필요한 영역을 포함하는 벡터 단편을 정제하여, 1840bp로 이루어지는 수정란 주입용 DNA 단편(도 2 참조)을 조제했다. 수정란 주입용 DNA 단편의 서열을 서열 번호 6에 나타낸다.
(NOD-IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스의 제작)
NOD-IL-2rγnull 마우스의 전핵기 수정란 123개에 상기 수정란 주입용 DNA를 1.5ng/mL 농도로 조제하고, 마이크로머니퓰레이터가 장착된 도립 현미경(라이카(Leica)사 제품)을 이용해 미세 주입했다.
상기 수정란 주입용 DNA가 미세 주입된 전핵기 수정란 중, 배양 후 정상적으로 2세포기가 된 수정란으로 판단된 2세포기 배아 63개를 가친 마우스의 난관에 이식하고, 출산 직전에 제왕 절개를 수행하여 신생자 마우스를 얻었으며, 다시 양자 조작을 수행함으로써 24마리의 산자 마우스를 얻었다.
(유전자 해석)
상기 산자 마우스가 3-4주령에 이른 시점에서, 각 산자 마우스의 꼬리 선단 1-2mm에서 채취한 조직편으로부터 자동 DNA 추출 장치(TOYOBO사 제품)에 의해 추출된 게놈 DNA에 대해, 이하에 나타나는 프라이머 세트를 이용하여 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열이 각 산자의 게놈 DNA에 삽입되었는지 여부를 이하의 조건에 의해 PCR법으로 확인했다.
(프라이머)
IL2SPS1: 5'-ATAGCGGCCGCTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCA-3'(포워드 프라이머)(서열 번호 7)
IL15mpAS3: 5'-CAACTAGTTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCAGAA-3'(리버스 프라이머)(서열 번호 8)
(PCR 반응액)
A액:
2.5μL Ex-taq용×10 buffer
2μL dNTPmix
1.25μL IL2SPS1(5μM)
1.25μL IL15mpAS3(5μM)
0.125μL Ex-taq
6.875μL DW
B액:
8.5μL DW
1.5μL 게놈 DNA
A액과 B액을 혼합하여, PCR 반응액을 조제했다.
(PCR 증폭 조건)
24μL의 상기 PCR 반응액을 이용하여, 94℃로 3분 가열 처리; 94℃로 30초, 60℃로 30초, 72℃로 1분을 1 사이클로 하여 35 사이클; 그 후 72℃로 2분 가열 처리;의 조건으로 증폭 처리가 수행되었다. 상기 PCR에 의해 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로스 겔 내에서 전기 영동에 제공하고, 480bp 부근의 증폭 산물 밴드의 유무를 확인함으로써, 상기 각 산자 마우스에서, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 게놈 DNA에 삽입되었는지 여부를 판정했다.
상기 유전자 해석에서, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 게놈 DNA에 삽입되었다고 판정된 산자 마우스로부터 채혈을 수행하고, 혈청/혈장 분획에의 hIL-15의 분비 유무를 BioLegend Human IL-15 키트(cat no. 435108)를 이용하여 ELISA법으로 확인했다. hIL-15가 분비되고 있는 것이 확인된 마우스를 NOD-IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스라고 부르기로 했다.
(NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스의 제작)
상기 NOD-IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스(암컷)와 NOD-scid, IL-2rγnull 마우스(이하 'NOG 마우스'라고도 함)(수컷)를 교배함으로써, NOD-IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스에 면역계의 주요한 담당 세포인 T세포 및 B세포가 결손된 scid 변이를 더 도입하여, NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스(이하 'NOG-hIL-15 Tg 마우스'라고도 함.)를 제작했다.
상기 NOG-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 교배함으로써 NOG-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 1:1의 비율로 취득했다. 실시예 2 이후에서는, NOG 마우스(이하 'non-Tg 마우스'라고 표기되는 경우도 있음.)를 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 갖는 유전자가 게놈 DNA에 삽입되어 있지 않은 네가티브 컨트롤로 하여, NOG-hIL-15 Tg 마우스에 대해 검토를 수행했다.
[실시예 2]
[NOG-hIL-15 Tg 마우스에 대한 검토]
(혈장 내 hIL-15 농도)
NOG-hIL-15 Tg 마우스의 혈장 내의 hIL-15 농도를 측정했다. 4~6주령의 마우스 개체로부터 헤파린(Novo-heparin, 모치다세이야쿠 가부시키가이샤(MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO.,LTD.) 제품)을 이용하여 마취하에서 말초혈을 수집했다. 혈장 내 hIL-15 농도는 상기 ELISA 키트를 이용하여 측정했다. 결과를 도 3에 나타낸다.
(결과)
도 3으로부터 명백한 바와 같이, NOG-hIL-15 Tg 마우스(도면에서는 'hIL-15 Tg')(N=126)에서의 혈장 내 hIL-15 농도는 47.7±27.5pg/mL였으며, non-Tg 마우스에서의 혈장 내 hIL-15 농도는 1.3±1.5pg/mL였다. 따라서, 게놈 DNA에 삽입된 NOG-hIL-15 Tg 마우스에서는 NOG 마우스에 비해 현저히 많았으며, 게놈 DNA에 삽입된 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 갖는 유전자에 의해 전신적으로 생산된 hIL-15가 혈액 내에 분비되고 있는 것이 확인되었다.
[실시예 3]
[인간 제대혈 유래 CD34＋ 조혈간세포 이식 NOG-hIL-15 Tg 마우스의 인간 세포 분화능의 검토]
(플로우 사이토메트리 측정 순서)
실시예 3 이후의 플로우 사이토메트리를 이용하는 검토는 이하의 순서로 수행되었다. hCD56＋ 세포가 인간 NK 세포인 것으로 판단하여, 각각의 검토 항목에 적합한 항체에 의해 해석을 수행했다. 구체적으로는, 4℃로 어두운 곳에서 30분간 염색 후, FACS 완충액(1% FBS와 0.1% NaN3를 포함하는 PBS)으로 세정하고, 세포는 요오드화 프로피디움 함유 FACS 완충액으로 재현탁되고, 그 후 플로우 사이토메트리 측정에 제공되었다. 플로우 사이토메트리 측정은 BD FACSCantoTM 플로우 사이토미터(BD사 제품)를 이용하여 수행되었으며, 데이터는 FACSDiva 소프트웨어(ver. 6.1.3)(BD사 제품)에 의해 해석되었다. 세포수의 절대값은 Flow-Count(Beckman Coulter사 제품)를 이용하여 취급 설명서에 따라 산출되었다.
(항체)
사용된 항체는 구체적으로는 이하와 같다.
항hCD3 항체: anti-human CD3-FITC(BioLegend사 제품) anti-human CD3-PE (BioLegend사 제품),
항hCD16 항체: anti-human CD16-FITC(BioLegend사 제품),
항hCD19 항체: anti-CD19(BioLegend사 제품),
항hCD33 항체: anti-human CD33-FITC(BD Biosciences사 제품),
항hCD45 항체: anti-human CD45-allophycocyanin-Cy7(BioLegend사 제품),
항hCD56 항체: anti-human CD56-PE(BioLegend사 제품),
항hCD57 항체: anti-CD57(BioLegend사 제품),
항NKG2A 항체: anti-human CD159a (NKG2A)-PE(Beckman Coulter사 제품),
항NKG2C 항체: Alexa Fluor 488-conjugated anti-human NK group 2 membrane C(R&D Systems사 제품),
항NKG2D 항체: anti-NKG2D(BioLegend사 제품),
항hCD94 항체: anti-CD94(BioLegend사 제품),
항hNKp30 항체: anti-NKp30(BioLegend사 제품),
항hNKp46 항체: anti-NKp46(BioLegend사 제품),
항hNKp44 항체: anti-NKp44(BioLegend사 제품),
항hNKp80 항체: anti-human NKp80-PE(Beckman Coulter사 제품),
항hCD158a/h항체(Killer Immunoglobulin-like Receptor: KIR)(KIR2DL1/S1/S3/S5): FITC-conjugated anti-CD158a/h(BioLegend사 제품),
항hCD158b 항체(KIR2DL2/L3, NKAT2): anti-CD158b(BioLegend사 제품),
항hCD158d 항체(KIR2DL4): anti-CD158d(BioLegend사 제품),
항hCD158e 항체(KIR3DL1, NKB1): anti-CD158e(BioLegend사 제품),
항hCD158f 항체(KIR2DL5); anti-CD158f(BioLegend사 제품),
항mCD45 항체: anti-mouse CD45-allophycocyanin(BioLegend사 제품),
[실시예 4]
(인간 제대혈 유래 hCD34＋ 조혈간세포 이식 NOG-hIL-15 Tg 마우스의 제작)
상기 8~12주령의 성체 NOG-hIL-15 Tg 마우스에 인간 제대혈 유래 hCD34＋ 조혈간세포를 이식했다. 2.5Gy의 X선을 조사하고, 조사 후 24시간 이내에 인간 제대혈 유래의 hCD34＋ 조혈간세포 2×104개를 꼬리 정맥으로부터 이식하고, 인간 제대혈 유래 hCD34＋ 조혈간세포를 이식한 NOG-hIL-15 Tg 마우스(이하 '간세포 이식 hIL-15 마우스'라고도 함.)를 제작했다. 마찬가지로, 인간 제대혈 유래 hCD34＋ 조혈간세포를 이식한 NOG 마우스(이하 '간세포 이식 non-Tg 마우스'라고도 함.)를 제작하여, 네가티브 컨트롤로 했다. 또한, 인간 NK 세포가 선택적으로 분화·증식하는 것이 이미 확인된, 인터루킨 2(hIL-2)의 신호 펩타이드와 cDNA가 게놈 DNA에 삽입되어 있는 NOG-hIL-2 Tg 마우스에 인간 제대혈 유래 hCD34＋ 조혈간세포 이식한 마우스(이하 '간세포 이식 hIL-2 마우스'라고도 함.)를 포지티브 컨트롤로 했다.
[실시예 5]
(제대혈 유래 hIL-15 마우스의 말초혈 내의 인간 세포 분화능의 검토)
상기 3종류의 hCD34＋ 조혈간세포 이식 마우스에 대해, 이식 후 4주 경과 시에 말초혈로부터 채혈을 수행하여, NK 세포의 지표가 되는 hCD56 항원, 백혈구의 지표가 되는 hCD45 항원, B세포의 지표가 되는 hCD19 항원, T세포의 지표가 되는 hCD3 항원에 대한 각 특이 항체로 염색한 후 플로우 사이토메트리로 측정함으로써, 마우스 혈액 내의 인간 백혈구 키메라율을 해석했다. 도 4(a)에 단핵세포(MNC) 내 인간 면역 세포량(/μL)을 나타내고, 도 4(b)에 단핵세포 내에 차지하는 세포수(%)를 나타낸다.
(결과 1)
도 4(a)로부터 명백한 바와 같이, 이식 후 4주째의 간세포 이식 hIL-15 마우스 및 간세포 이식 hIL-2 마우스의 말초혈에서는 hCD56＋ 세포의 발현이 많고, 인간 NK 세포가 선택적으로 분화, 증식하고 있는 것이 확인되었다. 한편, 간세포 이식 non-Tg 마우스의 말초혈에서는 hCD56 양성 세포의 발현이 거의 없었다. 또한, hCD19＋ 세포의 발현은 간세포 이식 hIL-2 마우스의 말초혈에서 약 3세포/μL이었으며, 또한 간세포 이식 hIL-15 마우스, 및 간세포 이식 non-Tg 마우스의 말초혈에서는 1~2세포/μL 정도로, 모든 마우스에서 인간 B세포로의 분화, 증식이 거의 관찰되지 않았다.
(결과 2)
도 4(b)로부터 명백한 바와 같이, 이식 후 4주째의 간세포 이식 hIL-15 마우스 및 간세포 이식 hIL-2 마우스의 말초혈에서는 hCD56＋ 세포의 발현이 매우 많아, 인간 CD56＋ NK 세포가 분화, 증식하고 있는 것이 확인되었다.
[실시예 6]
(간세포 이식 hIL-15 마우스의 각 조직에서의 인간 세포 분화능의 검토)
hCD34＋ 조혈간세포 이식한 상기 3종류의 피검 마우스에 대해, 이식 후 6주 경과 시에 골수, 비장, 말초혈을 채취하여, 인간 CD56＋ NK 세포를 단리하고, 각 특이 항체로 염색한 후 플로우 사이토메트리로 측정함으로써, 마우스 각 조직 내의 인간 세포 분화능을 해석했다. 결과를 도 5에 나타낸다.
(결과)
도 5로부터 명백한 바와 같이, 간세포 이식 hIL-15 마우스 및 간세포 이식 hIL-2 마우스의 골수(BM), 비장(SPL), 말초혈(PB) 모두에서, 인간 NK 세포의 국부적인 존재가 hCD56＋, hCD45＋의 분획에서 나타나는 붉은 틀 내에 확인되었으나, 간세포 이식 non-Tg 마우스에서는 인간 NK 세포의 국부적인 존재가 거의 확인되지 않았다.
[실시예 7]
(인간 조혈 세포 유래 NK 세포에 특이적인 수용체의 발현 해석)
상기 간세포 이식 hIL-15 마우스 및 간세포 이식 hIL-2 마우스의 비장으로부터 단리된 인간 NK 세포에 대해, 인간 생체 내에서 분화한 성숙 NK 세포의 아분획에서 특이적인 세포 표면 분자로 여겨지는 hCD16 항원, 인간 말초혈에서 NK 활성을 갖는 세포 서브세트에 발현된다고 여겨지는 hCD57 항원, NK 세포 표면에 발현하는 억제형 수용체로 여겨지는 hNKG2A 항원, NK 세포 표면에 발현하는 활성형 수용체로 여겨지는 hNKG2C 항원, NK 세포 표면에 발현하는 활성형 수용체로 여겨지는 hNKG2D 항원에 대한 각 특이 항체로 염색한 후 플로우 사이토메트리로 측정함으로써, 인간 NK 세포 특이적인 수용체의 발현을 해석했다. 인간 말초혈 성숙 NK 세포인 Japanese PB-NK 세포(사전 동의를 받은 일본인 도너의 말초혈로부터 단리한 인간 NK 세포)를 포지티브 컨트롤로 했다. 결과를 도 6에 나타낸다.
(결과)
도 6으로부터도 명백한 바와 같이, 간세포 이식 hIL-15 Tg 마우스, 간세포 이식 hIL-2 Tg 마우스의 모든 말초혈에서의 NK 세포에서, hCD16 항원, hCD57 항원, hNKG2A 항원, hNKG2C 항원, hNKG2D 항원의 발현이 확인되었다. 그러나, 그 발현 패턴은 hCD56 항원의 발현 강도가 높다는 점과 hCD56＋CD16- 분획의 비율이 많다는 점에서, 인간 말초혈 성숙 NK 세포와는 발현 양식이 상이하며, 임상에서 IL-2 투여 요법을 받은 환자의 혈액 내에서 증가하는 hCD56＋CD16- 활성화 NK 세포와 유사한 NK 세포 특이 항원의 발현 패턴을 나타낸다는 것으로부터, 간세포 이식 hIL-15 마우스·간세포 이식 hIL-2 마우스 내에서 분화한 인간 조혈간세포 유래 NK 세포는, 마우스 내의 hIL-15 또는 hIL-2에 의해 활성화한 NK 세포가 많이 존재하고 있다는 것이 추정되었다.
[실시예 8]
(인간 조혈 세포 유래 NK 세포의 세포 상해 과립 분비능의 검증)
상기 간세포 이식 hIL-15 Tg 마우스 및 간세포 이식 hIL-2 Tg 마우스의 비장으로부터 단리된 인간 NK 세포가 세포 상해 과립의 분비능/사이토카인 생산능을 갖는지 여부를 검증했다. 이식 후 6주 경과 시에 각 마우스의 비장을 적출해 세포 조제를 수행하고, 인간 CD56＋ NK 세포를 단리하고, 브레펠딘 A(BioLegend사 제품) 존재하에서 20시간 배양한 후에 형광 표지 항체(FITC-항hGranzymeA 항체, FITC-항Perforin 항체(BioLegend사 제품)로 세포 내 염색을 하여, 플로우 사이토메트리로 측정했다. 결과를 도 7(a)에 나타낸다. 또한, 인간 상기 단리한 인간 CD56＋ NK 세포를 PMA/ionomycin 존재하에서 배양한 후, 형광 표지 항체 PE-항hIFNg 항체(BioLegend사 제품)로 세포 내 염색을 수행하여, 플로우 사이토메트리로 측정했다. 결과를 도 7(b)에 나타낸다.
(결과)
도 7(a)로부터 명백한 바와 같이, 상기 모든 마우스 유래의 인간 CD56＋ NK 세포에서, 인간 생체 내에서 분화한 성숙 NK 세포의 결과(데이터 미표시)와 동등한 세포 상해 과립인 GranzymeA의 발현이 확인되었다. Perforin에 대해서도 발현이 확인되었지만, 인간 생체 내에서 분화한 성숙 NK 세포의 결과(데이터 미표시)와 비교해 발현이 약간 적은 결과가 되었다. 또한, 도 7(b)으로부터 명백한 바와 같이, 상기 모든 마우스 유래의 인간 NK 세포에서, PMA/ionomycin 자극에 의해 인터페론 감마(IFN γ)의 생산이 인정되었다.
[실시예 9]
(인간 말초혈 유래 hCD56＋ NK 세포 이식 NOG-hIL-15 Tg 마우스의 제작)
상기 8~12주령의 성체 NOG-hIL-15 Tg 마우스에 인간 말초혈 유래 CD56＋ NK 세포를 이식했다. 2.5Gy의 X선을 조사하고, 조사 후 24시간 이내에 인간 말초혈 유래의 hCD56＋ NK 세포 1~2×106개를 꼬리 정맥으로부터 이식하여, 인간 말초혈 유래 CD56＋ NK 세포 이식 NOG-hIL-15 Tg 마우스(이하 '말초혈 이식 hIL-15 마우스'라고도 함.)를 제작했다. 마찬가지로, 인간 말초혈 유래 hCD56＋ NK 세포 이식 NOG-hIL-2 Tg 마우스(이하 '말초혈 이식 hIL-2 마우스'라고도 함.)를 제작했다. 인간 말초혈 유래 hCD56＋ NK 세포를 이식한 NOG 마우스(이하 '말초혈 이식 non-Tg 마우스'라고도 함.)를 제작해 네가티브 컨트롤로 했다.
[실시예 10]
(말초혈 이식 hIL-15 마우스의 말초혈 내 세포의 검토)
이식 후 3주간 경과 시에 채혈하고, mCD45 항원, hCD3 항원, hCD16 항원, hCD45 항원, hCD56 항원에 대한 각 특이 항체로 염색한 후 플로우 사이토메트리로 측정함으로써, 각 마우스 혈액 내의 인간 백혈구 키메라율을 해석했다. 인간 백혈구의 지표가 되는 hCD45 항원 양성 분획(마우스 백혈구의 지표가 되는 mCD45는 음성 분획)에 게이팅하고, 다시 인간 NK 세포의 지표가 되는 hCD56 항원과 T세포의 지표가 되는 hCD3 항원에 대한 패턴으로 전개했다. hCD45＋CD56＋ NK 세포에 게이팅하고, 다시 hCD56 항원과 hCD16 항원에 대한 패턴으로 전개하여, hCD56＋hCD16＋ NK 세포의 비율을 해석했다. 인간 T세포의 혼입을 확인하기 위해, hCD45＋hCD3＋ T세포의 비율도 확인했다. 결과를 도 8에 나타낸다.
(결과)
도 8에서, 'PBMC'는 정상인 유래의 인간 말초혈 내 단핵구를 나타낸다. 'CD56＋ sorted (pre-transfer)'는 이식 전의 PBMC로부터 단리한 hCD56＋ NK 세포를 나타낸다. 'After transfer(3w)'는 이식 후 3주 경과 시의 말초혈 이식 hIL-15 마우스의 말초혈을 나타낸다. 이식 후 3주 경과 시의 말초혈 이식 hIL-15 마우스에서는, hCD45＋ 인간 백혈구 내에서는 CD56＋CD16＋ NK 세포 분획이 대부분(99.7%)을 차지하고 있었다. 'PBMC', 'CD56＋ sorted (pre-transfer)'에서도, 인간 말초혈 내 성숙 NK 세포는 hCD45＋ 인간 백혈구 내의 hCD56＋hCD16＋ 분획에서 90% 이상을 차지하고 있는 것으로부터, 이식된 hCD56＋ NK 세포는 이식 후 3주간 경과 시에도 정상인 유래의 인간 말초혈 내 단핵구와 동일한 hCD56＋hCD16＋ NK 세포라는 성질을 유지한 채로 생착하여, 증식하고 있다고 판단할 수 있었다.
[실시예 11]
이식 후 경시적으로 채혈하여, 단핵세포 내의 NK 세포와 T세포가 차지하는 비율을 계측했다. 상기 3종류의 말초혈 이식 마우스에 대해, 이식 후 경과 시에 말초혈로부터 채혈을 수행하여, NK 세포의 지표가 되는 hCD56 항원, 백혈구의 지표가 되는 hCD45 항원, T세포의 지표가 되는 hCD3 항원에 대한 각 특이 항체로 염색한 후 플로우 사이토메트리로 측정함으로써, 마우스 혈액 내의 인간 백혈구 키메라율을 해석했다. 도 9(a)에 단핵세포(MNC) 내에 차지하는 NK 세포수(%)를, 도 9(b)에 MNC 내에 차지하는 T세포수(%)를 나타낸다. 또한, 도 9(c)에 말초혈 이식 hIL-15 마우스 혈액 내의 NK 세포수(/μL)를 나타내고, 도 9(d)에 말초혈 이식 non-Tg 마우스 혈액 내의 NK 세포수(/μL)를 나타낸다.
(결과)
도 9(a)로부터 명백한 바와 같이 NK 세포에 대해서는, 말초혈 이식 hIL-15 마우스에서, 이식 후 2주 경과 시에는 단핵세포 내의 약 30~약 46%를 차지하였으며, 4주 경과 시에 약 10~약 20%를 차지하였고, 6주 경과 시에 약 8~약 15%를 차지했다. 도 9(b)로부터 명백한 바와 같이, 말초혈 이식 hIL-2 마우스에서는, 가장 증가한 이식 후 4주 경과 시에 10% 미만에 머물렀다. T세포에 대해서는, 말초혈 이식 hIL-15 마우스에서는 거의 검출되지 않은 반면, 말초혈 이식 hIL-2 마우스에서는 이식 후 3~4주 경과 시에 약 18~약 23%를 차지했다. 말초혈 이식 non-Tg 마우스에서는, NK 세포도 T세포도 거의 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, 말초혈 이식 hIL-2 마우스에서는, NK 세포가 혈액 내에서 증식하지 않고, 이식 세포에 극히 소수 혼입되어 있던 T세포가 증식하는 것이 확인되었기 때문에, 이 이후의 실험은 말초혈 이식 hIL-15 마우스에 대해서만 검토를 수행하기로 했다. 또한, 인간 말초혈 hIL-15 Tg 마우스에서는, 혈액 내의 인간 NK 세포수가 서서히 증가하여, 이식 후 4-5주 경과 시에는 8000개/μL까지 증가했다. 그 후는 서서히 감소했으나, 이식 후 24주 경과하여도 약 40세포/μL이 확인되었다(도 9(c) 참조). 인간 말초혈 non-Tg 마우스에서는, 이식 후 2주 경과 시에는 약 40세포/μL 확인된 것이 최대값이며, 증식은 거의 관찰되지 않았다(도 9(d) 참조).
[실시예 12]
(인간 성숙 NK 세포 아종의 추이에 대한 검토)
인간 NK 세포는 hCD56＋hCD16＋ 분획을 차지하는 세포 상해능에 특화된 아집단과, hCD56＋hCD16- 분획을 차지하는 사이토카인 생산능에 특화된 아집단이 존재한다는 것이 알려져 있다. 말초혈 이식 hIL-15 마우스에 이식된 인간 성숙 NK 세포가 어느 분획에서 증식하는지를 확인하기 위해, 세포 아집단(sub-population)의 경시적 변동을 해석했다. 결과를 도 10에 나타낸다.
(결과)
도 10으로부터 명백한 바와 같이, hCD56＋hCD16＋ 분획은 이식 후 1주째~8주째에 걸쳐 거의 90% 이상을 유지했다. 한편, hCD56＋hCD16- 분획은 이식 후 1주 경과 시에 약 11%를 차지했지만 그 후 점차 감소했다. 따라서, 말초혈 이식 hIL-15 마우스의 말초혈에서는, hCD56＋hCD16＋ 분획을 나타내는 세포 상해능에 특화된 아집단이 증식하고 있는 것이 확인되었다.
[실시예 13]
[동결 말초혈 hIL-15 마우스의 조제]
상기 8~12주령의 성체 NOG-hIL-15 Tg 마우스에 인간 말초혈 유래 hCD56＋ 동결 NK 세포를 해동하여 이식했다. 2.5Gy의 X선을 조사하고, 조사 후 24시간 경과 시에 해동된 인간 말초혈 유래 CD56＋ NK 세포 1~2×106개를 꼬리 정맥으로부터 이식하여, 인간 말초혈 유래 CD56＋ 동결 NK 세포 이식 NOG-hIL-15 Tg 마우스(이하 '동결 말초혈 hIL-15 마우스'라고도 함.)를 제작했다.
[실시예 14]
(동결 말초혈 hIL-15 마우스의 말초혈 내 인간 세포 분화능의 검토)
동결 말초혈 hIL-15 마우스에 대해, 이식 후 경시적으로 채혈하여, 각 특이 항체로 염색한 후 플로우 사이토메트리로 측정함으로써, 마우스 혈액 내의 인간 백혈구 키메라율을 해석했다. 인간 백혈구의 지표가 되는 hCD45 항원 양성 분획(마우스 백혈구의 지표가 되는 mCD45는 음성 분획)에 게이팅하고, 다시 인간 NK 세포의 지표가 되는 hCD56 항원과 T세포의 지표가 되는 hCD3 항원에 대한 패턴, 및 인간 hCD56 항원과 hCD16 항원에 대한 패턴으로 전개하여, 인간 CD56＋ NK 세포, 및 인간 CD56＋CD16＋ NK 세포의 비율을 해석했다. 인간 T세포의 혼입을 확인하기 위해, hCD45＋hCD3＋ T세포의 비율도 확인했다. 결과를 도 11 및 도 12에 나타낸다.
(결과 1)
도 11에서, 이식하지 않은 동결 인간 CD56＋ NK 세포를 나타내는 'FrozenPB-NK(Pre-transfer)'로부터 명백한 바와 같이, 해동 후의 인간 말초혈 내의 성숙 NK 세포는 hCD16＋hCD56＋ 분획에서 85.2%를 차지하고 있다. 동결 인간 CD56＋ NK 세포를 이식 후 4주째의 동결 말초혈 hIL-15 마우스에서도, hCD16＋hCD56＋ 분획에서 81.3%를 차지하고 있으므로, 신선혈 유래 인간 NK 세포 이식 실험과 마찬가지로, 이식된 해동 후의 인간 NK 세포는 NOG-hIL-15 Tg 마우스에 이식 후 4주 경과 시에도 생착하여 증식하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
(결과 2)
도 12로부터 명백한 바와 같이, CD56＋CD16＋ 분획을 차지하는 아집단이 선택적으로 증폭하여, 이식 후 1주째~2주째에 걸쳐 급격히 증가하고, 3주째 이후 점차 감소했다. 한편, CD56＋CD16- 분획을 차지하는 사이토카인 생산능에 특화된 아집단은 거의 증가하지 않았다. 따라서, CD56＋ 동결 NK 세포 이식 NOG-hIL-15 Tg 마우스에서는, 세포 상해능에 특화된 CD56＋CD16＋ NK 세포가 현저히 증식하는 것이 확인되었다.
[실시예 15]
(말초혈 이식 hIL-15 마우스의 각 조직에서의 인간 세포의 검토)
말초혈 이식 hIL-15 마우스에 대해, 이식 후 6주 경과 시에 마취하에서 모두 채혈함으로써 안락사 처치를 실시한 후, 골수, 비장, 간장, 폐를 채취하여 세포 조제를 수행했다. 각 특이 항체로 염색한 후 플로우 사이토메트리로 측정함으로써, 마우스 각 조직 내의 인간화 세포를 해석했다. 결과를 도 13에 나타낸다.
(결과)
도 13으로부터 명백한 바와 같이, 말초혈 이식 hIL-15 마우스의 비장(SPL), 말초혈(PB), 간장(Liver), 폐(Lung) 모두에서 인간 CD56＋CD16＋ NK 세포의 국부적인 존재가 인정되었으나, 골수(BM)에서는 국부적인 존재가 인정되지 않았다. 이 결과는, 인간 조직에서의 성숙 NK 세포는 주로 혈액·비장·림프절·편도선·간장·폐 등에 국부적으로 존재하지만, 골수에서는 성숙 NK 세포가 거의 존재하지 않는다는 결과와 일치했다. 그러나, 상기 간세포 이식 hIL-15 마우스 및 간세포 이식 hIL-2 마우스에서는, 골수에서 인간 NK 세포의 국부적인 존재가 인정되었다는 결과와는 상이했다. 또한, NK 세포 마커의 1종인, NK 세포의 세포 상해 활성을 유도하는 natural cytotoxicity receptor(NCR) 패밀리의 일원으로서 알려져 있는 hNKp46＋의 분획에서 강하게 발현하고 있는 것도 확인되었다.
[실시예 16]
(인간 NK 세포의 특이적인 세포 표면 분자의 발현 해석)
말초혈 이식 hIL-15 마우스에 대해, 이식 후 8주 경과 시에 비장으로부터 단리된 인간 NK 세포는, 인간 조직에서의 성숙 NK 세포와 동일한 특이적인 세포 표면 분자가 발현하고 있는지 여부를 해석했다. 인간 조직에서의 성숙 NK 세포의 특이적인 세포 표면 분자로서 알려져 있는 hNKG2A, hNKG2C, hNKG2D, hCD94, hNKp30, hNKp46, hNKp44, hNKp80, hCD57, hCD158a/h(Killer Immunoglobulin-like Receptor: KIR), hCD158b(KIR), hCD158d(KIR), hCD158e(KIR), hCD158f(KIR)의 각 항원에 대한 각 특이적인 항체로 염색한 후 플로우 사이토메트리로 측정함으로써, 인간 NK 세포 특이적인 세포 표면 분자 발현 해석을 수행했다. 마우스 결과를 도 14에 나타낸다. 각 세포 표면 분자의 음성 대상으로서, Isotype Ab로 염색한 패턴도 나타낸다.
(결과)
도 14로부터 명백한 바와 같이, 인간 조직에서의 성숙 NK 세포의 특이적인 세포 표면 분자로서 알려져 있는 hNKG2A, hNKG2C, hNKG2D, hCD94, hNKp30, hNKp46, hNKp44, hNKp80, hCD57, hCD158a/h(Killer Immunoglobulin-like Receptor: KIR), hCD158b(KIR), hCD158d(KIR), hCD158e(KIR), hCD158f(KIR)의 각 항원의 발현이 확인되었다. 또한, 말초혈 이식 hIL-15 마우스에서 증식한 인간 NK 세포는 인간 생체 내에서 분화한 성숙 NK 세포의 결과(데이터 미표시)와 거의 동일한 NK 세포의 표면 분자 발현 패턴을 갖는 것이 확인되었다.
[실시예 17]
(인간 말초혈 유래 NK 세포의 세포 상해 과립 분비능의 검증)
말초혈 이식 hIL-15 마우스의 비장으로부터 단리된 인간 NK 세포가, 인간 생체 내에서 분화한 성숙 NK 세포와 마찬가지로 세포 상해 과립의 분비능/사이토카인 생산능을 갖는지 여부를 검증했다. 상기 이식 8주 경과 시에 말초혈 이식 hIL-15 마우스로부터 비장을 채취해 세포 조제하고, 인간 CD56＋ NK 세포를 단리하고, 브레펠딘 A 존재하 및 인간 IL-2 혹은 IL-15 사이토카인 존재하에서 20시간 배양한 후에 형광 표지 항체 FITC-항hGranzymeA 항체, FITC-항Perforin 항체(Biolegend사 제품)로 세포 내 염색을 하여, 플로우 사이토메트리로 측정했다. 결과를 도 15(a)에 나타낸다. 또한, 인간 상기 단리한 인간 CD56＋ NK 세포를 PMA/ionomycine 존재하에서 배양한 후, 형광 표지 항체 PE-항hIFNg 항체(Biolegend사 제품)를 이용하여 세포 내 염색을 수행하여, 플로우 사이토메트리로 측정했다. 결과를 도 15(b)에 나타낸다.
(결과)
도 15(a)로부터 명백한 바와 같이, NOG-hIL-15 Tg 마우스 유래의 인간 CD56＋ NK 세포에서도, 인간 생체 내에서 분화한 성숙 NK 세포의 결과(데이터 미표시)와 동등한 세포 상해 과립(GranzymeA)의 발현이 확인되었다. 그러나, Perforin은 각종 사이토카인으로 자극해도 거의 검출할 수 없었다. 또한, 도 15(b)로부터 명백한 바와 같이, PMA/ionomycine 자극에 의해, 인터페론 감마(IFN γ)의 생산이 인정되었다. 이 결과는, hIL-15 마우스에서 증식한 인간 NK 세포는 자극 인자에 대한 반응성(사이토카인 생산능)을 유지하고 있다는 것을 나타내고 있었다.
(종양 생육 인비트로 억제 실험)
말초혈 이식 hIL-15 마우스로부터 단리된 인간 NK 세포가 표적 세포에 대해 세포 상해능을 나타내는지 검증했다. 인간 NK 세포 이식 후 8주 경과 시에 말초혈 이식 hIL-15 마우스로부터 비장을 채취해 세포 조제하고, hCD56＋ 세포를 단리하고, 인간 IL-2, 인간 IL-15, 인간 IL-2와 인간 IL-15의 혼합 조성물의, 각 사이토카인 존재하에서 2일간 배양한 후에 표적 종양 세포(인간 NK 고감수성 종양 세포주 K562)와 4시간 공배양하고, 배양 상청을 이용하여 세포 상해 활성(cytotoxicity(%))을 측정했다. 측정 방법은 수득된 배양 상청과 CytoTox96 Non-radioactive Cytotoxicity Assay(Promega사 제품)를 이용하여 배양 상청 내에 유리(遊離)된 죽은 세포 유래 세포질성 효소 LDH와 반응 기질의 공익 효소 반응에 의한 정색도로 평가했다. 결과를 도 16에 나타낸다.
(결과)
도 16으로부터 명백한 바와 같이, NOG-hIL-15 Tg 마우스 내에서 분화한 인간 NK 세포는 hIL-15 존재하에서 배양한 경우에 가장 강한 세포 상해 활성을 나타냈다. 이러한 결과로부터, 말초혈 이식 hIL-15 마우스 내에서 분화한 인간 NK 세포가 인간 생체 내에서 분화한 성숙 NK 세포와 마찬가지로 인간 종양의 생육을 인비트로에서 억제할 수 있다는 것이 확인되었다.
(종양 생육 인비보 억제 실험)
말초혈 이식 hIL-15 마우스가 인간 종양에 대한 세포 상해 활성을 관찰하는 것이 가능한지를 검토했다. 성체 NOG-hIL-15 Tg 마우스에 2.5Gy의 X선을 조사하고, 골수 억제를 수행했다. 조사 후 1일 이내에 인간 말초혈 단핵세포(PBMC) 유래 NK 세포를 2×106개 iv이식하여 (hu-PB-NK hIL-15 Tg를 제작했다. 음성 컨트롤로서는, NK 세포 미이식(hIL-15-Tg) 마우스를 이용했다. 인간 PBMC) 유래 NK 세포 이식 후 4주 경과 시에 2.5×105개의 NK 감수성 인간 종양 세포주 K562를 피하 이식하고, 계시적으로 종양 지름을 측정했다. 결과를 도 17에 나타낸다.
(결과)
도 17로부터 명백한 바와 같이, 피하 이식 후 21일째에는 인간 NK 세포 이식 마우스에서의 종양의 사이즈가 500~950mm3 정도이고, NK 세포 미이식(hIL-15-Tg) 마우스에서의 종양의 사이즈는 495~1730mm3 정도로, 인간 NK 세포 이식 마우스에서의 종양의 사이즈는 NK 세포 미이식(hIL-15-Tg) 마우스에서의 종양의 사이즈의 약 3분의 2였다. 인간 NK 세포 이식군에서 종양 억제 효과가 인정되었다(d7-21; p＜0.05). 이러한 결과로부터, 말초혈 이식 hIL-15 마우스는 인간 종양의 생육을 인비보에서 억제하는 것이 확인되었다.
본 발명의 마우스는 인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포를 이식 후에 인간 NK 세포의 기능을 장기적으로 검토할 수 있는 인간화 면역 결핍 마우스로서 의학 분야에서 매우 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Central Institute for Experimental Animals <120> hIL-15-secreting immunodeficient mouse <130> 2016C9389 <150> JP 2015-107932 <151> 2015-05-27 <160> 8 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 440 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hIL-2SPcDNA-hIL-15cDNA <220> <221> misc_feature <223> Inventor: ITO, Mamoru; KATANO, Ikumi <400> 1 tcacagtaac ctcaactcct gccacaatgt acaggatgca actcctgtct tgcattgcac 60 taagtcttgc acttgtcaca aacagtgcaa ctagtaactg ggtgaatgta ataagtgatt 120 tgaaaaaaat tgaagatctt attcaatcta tgcatattga tgctacttta tatacggaaa 180 gtgatgttca ccccagttgc aaagtaacag caatgaagtg ctttctcttg gagttacaag 240 ttatttcact tgagtccgga gatgcaagta ttcatgatac agtagaaaat ctgatcatcc 300 tagcaaacaa cagtttgtct tctaatggga atgtaacaga atctggatgc aaagaatgtg 360 aggaactgga ggaaaaaaat attaaagaat ttttgcagag ttttgtacat attgtccaaa 420 tgttcatcaa cacttcttga 440 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 2 atagcggccg ctcacagtaa cctcaactcc tgcaa 35 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 3 atcactagtt gcactgtttg tgacaagtgc 30 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 4 gggactagta actgggtgaa tgtaataagt g 31 <210> 5 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 caactagttc acttgtcacg tcgtccttgt agtcagaagt gttgatgaa 49 <210> 6 <211> 1840 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA fragment <400> 6 ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc 60 ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgag cttgcatgcc tgcaggtcgt 120 tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 180 gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 240 ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 300 tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 360 gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 420 ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 480 tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 540 ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 600 gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca 660 tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga tccagcctcc ggactctaga 720 ggatccggta ctcgaggaac tgaaaaacca gaaagttaac tggtaagttt agtctttttg 780 tcttttattt caggtcccgg atccggtggt ggtgcaaatc aaagaactgc tcctcagtgg 840 atgttgcctt tacttctagg cctgtacgga agtgttactt ctgctctaaa agctgcggaa 900 ttgtacccgc ggccgctcac agtaacctca actcctgcca caatgtacag gatgcaactc 960 ctgtcttgca ttgcactaag tcttgcactt gtcacaaaca gtgcaactag taactgggtg 1020 aatgtaataa gtgatttgaa aaaaattgaa gatcttattc aatctatgca tattgatgct 1080 actttatata cggaaagtga tgttcacccc agttgcaaag taacagcaat gaagtgcttt 1140 ctcttggagt tacaagttat ttcacttgag tccggagatg caagtattca tgatacagta 1200 gaaaatctga tcatcctagc aaacaacagt ttgtcttcta atgggaatgt aacagaatct 1260 ggatgcaaag aatgtgagga actggaggaa aaaaatatta aagaattttt gcagagtttt 1320 gtacatattg tccaaatgtt catcaacact tctgactaca aggacgacga tgacaagtga 1380 actagttgat aagccgaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgcg gggatccaga 1440 catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg 1500 ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa 1560 acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga 1620 ggttttttcg gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc 1680 atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 1740 aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 1800 gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 1840 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 atagcggccg ctcacagtaa cctcaactcc tgcca 35 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 caactagttc acttgtcatc gtcgtccttg tagtcagaa 39

Claims (8)

  1. 인간 IL-15를 분비할 수 있는 동시에, 인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포를 이식 후에 hCD56＋ 세포가 인비보에서 장기적으로 검출되는 것을 특징으로 하는, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA가 게놈 DNA에 삽입되어 있는 면역 결핍 마우스.
  2. 제1항에 있어서,
    hCD56＋ 세포가 또한 hCD16이 양성을 나타내는 hCD56＋hCD16＋ 세포인 것을 특징으로 하는 면역 결핍 마우스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    hCD56＋ 세포가 비장, 간장 및/또는 폐에서 검출되지만, 골수에서 검출되지 않는 세포인 것을 특징으로 하는 면역 결핍 마우스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    hCD56＋ 세포가 세포 표면 분자로서 hNKG2A, hNKG2C, hNKG2D, hCD94, hNKp30, hNKp46, hNKp44, hNKp80, hCD57, hCD158a/h(KIR), hCD158b(KIR), hCD158d(KIR), hCD158e(KIR), 또는 hCD158f(KIR)에 대해 양성을 나타내는 세포인 것을 특징으로 하는 면역 결핍 마우스.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포를 이식 후에, 사이토카인 존재하에서 인간 종양의 생육을 인비트로에서 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 면역 결핍 마우스.
  6. 제5항에 있어서,
    사이토카인이 hIL-15인 것을 특징으로 하는 면역 결핍 마우스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 말초혈 유래의 인간 NK 세포를 이식 후에, 인간 종양의 생육을 인비보에서 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 면역 결핍 마우스.
  8. 이하의 (1)~(7)의 공정을 순차적으로 포함하는 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스의 제작 방법.
    (1) 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 마우스 게놈 DNA에 삽입하기 위해 필요한 영역을 포함하는 벡터에, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA를 도입함으로써, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA를 갖는 마우스 수정란 주입 DNA 조제용 벡터를 제작하는 공정;
    (1-1) 필요에 따라, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 및 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 마우스 게놈 DNA에 삽입되기 위해 필요한 영역,을 포함하는 수정란 주입용 DNA 단편을 조제하는 공정;
    (2) 상기 공정 (1)에서 제작된 벡터 및/또는 상기 (1-1)에서 조제된 벡터 단편을 인터루킨 2 수용체 γ사슬 유전자(IL-2Rγ) 녹아웃 마우스의 수정란에 주입함으로써 주입 수정란을 제작하는 공정;
    (3) 상기 공정 (2)에서 제작된 주입 수정란을 배양함으로써 신생자 마우스를 제작하는 공정;
    (4) 상기 공정 (3)에서 제작된 마우스에서, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 NOD-IL-2rγnull 마우스의 게놈 DNA에 삽입되었는지 여부를 판정하는 공정;
    (5) 상기 공정 (4)에서 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA가 NOD-IL-2rγnull 마우스의 게놈 DNA에 삽입되었다고 판정된 마우스가 hIL-15를 분비하고 있는지 여부를 판정하여, hIL-15를 분비하고 있는 마우스를 NOD-IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스로 선발하는 공정;
    (6) 상기 NOD-IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 교배하여, scid 변이가 도입된 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스를 제작하는 공정;
    (7) NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 교배하여 NOD-scid, IL-2rγnull-hIL-15 Tg 마우스와 NOG 마우스를 1:1로 제작하는 공정;
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