JP3753321B2 - 異種細胞の生着、分化および増殖に適したマウスの作出方法、該方法により作出されたマウスならびにそのマウスの用途 - Google Patents
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【０００２】
【従来の技術】
ヒトを始めとする異種細胞を生着させた実験動物は、種々の病態発症機序の解析、その治療や予防のための薬剤開発に極めて重要であり、そのための受容体としての動物の開発は実験動物学の大きなテーマの１つである。特に近年では、幹細胞より分化させた組織や細胞の移植による治療（いわゆる再生治療）などが世界的に注目されるに至って、さらにこれらの動物の重要性が増している。
【０００３】
本発明者らは以前からこうした実験動物の開発・改良を続けてきた。特にヌードマウスやSCIDマウスの改良等を行い、これまでにこの目的の為に作製した免疫不全マウス等に関しては既に特許出願を行っている(特開平9-94040号公報)。中でも、多機能免疫不全(機能的なT細胞およびB細胞の欠失、マクロファージ機能減退、補体活性の低下およびナチュラルキラー(NK)活性低下等)を示すNOD/Shi-scidマウスおよびNOD/LtSz-scidマウスは異種細胞の生着に適した実験動物として最も注目されており、幹細胞分化・増殖を初めとして多様な研究に用い得ることが明らかとなってからは更に適用範囲が拡がっているのが現状である。
しかしながら、上記NOD/Shi-scidマウスはヒト細胞の生着は高いものの、その生着性にかなりのバラつきが認められる。
【０００４】
NOD/Shi-scidマウスの生着性を高めるためには、抗IL-2Rβ鎖抗体(TMβ1)や抗アシアロ-GM1抗体等を投与して前記マウスのNK活性を減退させることが重要であることが既に明らかにされている(Koyanagi,Y.ら、1997. "Primary human immunodeficiency virus type 1 viremia and central nervous system invasion in a novel hu-PBL-immunodeficient mouse strain."J Virol 71:2417；Koyanagi,Y.ら、1997.“High levels of viremia in hu-PBL-NOD-scid mice with HIV-1 infection.”Leukemia 11 Suppl. 3:109； Yoshino H,ら、2000. "Natural killer cell depletion by anti-asialo GM1 antiserum treatment enhances human hematopoietic stem cell engraftment in NOD/Shi-scid mice." Bone Marrow Transplant 26:1211-6)。しかし、そうした抗体は極めて高価であり、またその効果も個体によってバラつきが認められる。さらに、抗アシアロ-GM1抗体を用いる場合、実験期間中は11日に１度という頻度で投与を行わなくてはならず、煩雑さも付きまとう。
【０００５】
このために、米国Jackson研究所のDr.Shultz,L.D.らは、ヒト細胞高生着性NOD/LtSz-scidマウスに、NK活性を消失しているβ2m KOマウスと交配することによって、NOD/LtSz-scid, β2m null（β2m (null) NOD/SCID）マウス (Kollet O, Peled A, Byk Tら、beta2 microglobulin-deficient (β2m(null))NOD/SCID mice are excellent recipients for studying human stem cell function. Blood 2000;95(10):3102-5)を作製している。
【０００６】
上記のNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスにおいては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー(NK)細胞が消失しており、またマクロファージ、補体の機能が減退している。しかし、移植異種細胞、組織の拒絶には、それら以外の細胞（例えば、樹状細胞）や因子（例えば、IFNγ）も関与している。
【０００７】
このため、上記のNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスよりもさらに異種細胞の生着性にバラつきが無く、抗体が不要で、かつ異種細胞の生着性に優れているマウスが望まれる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、上記問題点を解決し、異種細胞の生着性に優れているマウスの作出方法および該方法により作出されたマウスを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、NOD/ShiマウスにC.B-17-scidマウスを戻し交配することにより得られるマウスに、インターロイキン２受容体γ鎖（IL-2Rγ）遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配することにより、異種細胞の生着性にバラつきが無く、かつ抗体が不要な（すなわち、異種細胞の生着に適した）マウスが得られるという知見を得た。本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１） 以下のＡのマウスにＢのマウスを戻し交配することを特徴とする、異種細胞の生着に適したマウスの作出方法；
Ａ：NOD/ShiマウスにC.B-17-scidマウスを戻し交配することにより得られるマウス、
Ｂ：インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウス。
（２） ＡのマウスがNOD/Shi-scidマウスである、（１）のマウスの作出方法。
（３） ＢのマウスがIL-2RγKOマウスである、（１）または（２）のマウスの作出方法。
（４） （１）〜（３）のいずれかのマウスの作出方法により作出されたマウス。
（５） 機能的なT細胞およびB細胞を共に欠失し、マクロファージ機能が減退し、NK細胞またはNK活性を消失し、かつ樹状細胞機能が減退しており、優れた異種細胞生着性を有していることを特徴とする、NOG（NOD/Shi-scid, IL-2Rγ KO）マウス。
（６） 移植したヒト幹細胞が、排除されることなく、効率良く分化、増殖する（４）または（５）のマウス。
（７） （４）〜（６）のいずれかのマウスにヒト幹細胞を移植し、分化・増殖する細胞を解析することを含む、幹細胞アッセイ方法。
（８） T細胞およびB細胞の分化・増殖を解析する、（７）の幹細胞アッセイ方法。
（９） （４）〜（６）のいずれかのマウスにヒト幹細胞を移植し増殖させた後に、該マウスの骨髄からヒト幹細胞を回収しさらに、（４）〜（６）のいずれかのマウスに移植することを繰り返し行うことを含むヒト幹細胞を増殖させる方法。
（１０） 繰り返しが少なくとも３回である（９）のヒト幹細胞を増殖させる方法。
（１１） （９）または（１０）の方法で得られた純度が99.7％以上のヒト幹細胞。
（１２） ヒト幹細胞が外来遺伝子を導入したものである、（９）または（１０）の方法。
（１３） ヒトT細胞およびB細胞を安定に保持し、ヒト抗体を産生することが可能な、（４）〜（６）のいずれかのマウス。
（１４） ヒトT細胞およびB細胞を保持する、（４）〜（６）のいずれかのマウスを抗原で免疫することを含む、ヒト抗体の産生方法。
（１５） ヒトT細胞およびB細胞を保持する、（４）〜（６）のいずれかのマウスを抗原で免疫した後に該マウスから該抗原に対する抗体産生細胞を回収し、株化することを含む、ヒト抗体を産生する抗体産生細胞株を製造する方法。
（１６） ヒト腫瘍細胞を保持した（４）〜（６）のいずれかのマウスである、ヒト腫瘍モデルマウス。
（１７） ヒト腫瘍細胞がHTLV-1白血病由来細胞である、（１６）のヒト腫瘍モデルマウス。
（１８） ヒト腫瘍細胞を耳介に保持した、（１６）または（１７）のヒト腫瘍モデルマウス。
（１９） （１６）〜（１８）のいずれかのマウスを用いて抗癌剤をスクリーニングする方法。
（２０） （４）〜（６）のいずれかのマウスにヒト腫瘍細胞を移植することを含む、ヒト腫瘍モデルマウスを作出する方法。
（２１） ヒト腫瘍細胞がHTLV-1白血病由来細胞である、（２０）の方法。
（２２） ヒト腫瘍細胞をマウスの耳介に移植する、（２０）または（２１）の方法。
（２３） マクロファージトロピックなウイルスばかりでなく、Tトロピック(T 細胞親和性)なウイルスに感染したT細胞を保持した（４）〜（６）のいずれかのマウスである、ウイルス感染モデルマウス。
（２４） ウイルスがHIVである、（２３）のウイルス感染モデルマウス。
（２５） ウイルスがHTLV-1である、（２３）のウイルス感染モデルマウス。
（２６） （２３）〜（２５）のマウスを用いて抗ウイルス剤をスクリーニングする方法。
（２７） （４）〜（６）のマウスを用いて、NOGマウスよりも異種細胞の生着性が向上した免疫不全マウスを作出する方法。
（２８） NOGマウスよりも異種細胞の生着性が向上した免疫不全マウスを作出するための、（４）〜（６）のマウス。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の一般的実施態様について説明する。
１．本発明のマウスの作出
本発明の異種細胞の生着に適したマウスの作出方法は、以下のＡのマウスにＢのマウスを戻し交配することを特徴とする；
Ａ：NOD/ShiマウスにC.B-17-scidマウスを戻し交配することにより得られるマウス、
Ｂ：インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウス。
【００１２】
ここで異種細胞としては、ヒトを始めとしてマウス、ラット等の哺乳動物由来の細胞や組織、特にヒトの幹細胞、リンパ球や腫瘍細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１３】
ＡのマウスにおけるNOD/ShiマウスへのC.B-17-scidマウスの戻し交配は、当業者に公知の手法、例えば、Cross Intercross法による戻し交配(Inbred Strains in Biomedical Research, M.F.W.Festing, 1979, ISBN 0-333-23809-5, The Macmillan Press, London and Basingstoke)に従い、C.B-17-scidマウスとNOD/Shiマウスとを交配し、そのF1マウス同士を更に交配して得たF2マウスの血清中の免疫グロブリン量を測定し、検出できないマウスを選別する。このマウスを再びNOD/Shiマウスと交配する。この操作を9回以上繰り返し(Cross Intercross法)行うことによって実施できる。
【００１４】
尚、NOD/ShiマウスおよびC.B-17-scidマウスは共に日本クレア株式会社から販売されている。また、これらのマウスの交配により得られるマウスとしては、例えば、本発明者らが以前に樹立したNOD/Shi-scidマウス（または、NOD-scidとも呼ぶ）(特開平9-94040号公報)があり、これを日本クレア株式会社から入手して直接Ａのマウスとして用いることもできる。尚、NOD/ShiマウスおよびNOD/Shi-scidマウスについては、上記以外に本出願人も所持しており、必要に応じていつでも分譲することができる。
【００１５】
また、Ｂのマウスにおけるインターロイキン２受容体γ鎖（IL-2Rγ）遺伝子のノックアウトは、当業者に公知の手法、例えば、マウスES細胞を用いた相同組換えの手法(Capecchi, M. R., Altering the genome by homologous recombination, Science, (1989) 244, 1288-1292)に従い、マウス由来の特定の遺伝子と例えばネオマイシン等の薬剤耐性遺伝子を含む相同遺伝子とをES細胞の段階で置き換えた後、該ES細胞を受精卵に注入することにより実施できる。
【００１６】
具体的には、例えば、129/SVマウスのゲノムライブラリーからヒトのIL-2RγcDNAをプローブとしてマウスIL-2Rγを含む遺伝子クローンを単離し、該クローンのうちIL-2Rγ全長を含む8.6kbの大きさの断片を使用してターゲッティングベクターを作製する。すなわち、前記断片のIL-2Rのエクソン7と8との間にネオマイシン耐性遺伝子を発現するPMC1-neoポリAを挿入し、またエクソン8から1kb離れた3'側にジフテリア毒素-A遺伝子を配置する。次いで、前記ベクターを直鎖状にし、E14 ES細胞1×107個に電気穿孔法で導入する。その後、G418を含む培養液の中で相同的組換えを起こしたESクローンを選択し(PCRまたはサザン法で確認)、該ESクローンをC57BL/6マウスの胚盤胞に注入した後、仮親マウスの子宮に移植する。この仮親マウスから生まれたキメラマウスを更にC57BL/6マウスと交配することによって、生殖細胞系に伝達したIL-2RγKOヘテロマウスを得ることができる。
【００１７】
あるいは、既に確立されているインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子（IL-2Rγ）ノックアウトマウス系統を直接入手して用いてもよく、こうしたマウス系統として、例えば、IL-2RγKOマウス系統(菅村和男教授[東北大学医学部生体防御学講座・免疫分野]より作出されたインターロイキン２受容体γ鎖（IL-2Rγ）ノックアウトマウス(Ohbo K, Suda T, Hashiyama Mら、Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood 1996;87(3):956-67))がある。尚、IL-2RγKOマウスは、作出者である菅原教授の委嘱によって、現在は本出願人ら(財)実験動物中央研究所)の胚保存バンクの中で保存されており、必要に応じていつでも凍結胚または融解復元マウスとして提供することができる。
【００１８】
さらに、ＡのマウスへのＢのマウスの戻し交配は、上記と同様に、当業者に公知の手法、例えば、上述の戻し交配に従い、すなわちNOD/Shi-scidマウスとIL-2RγKOマウスとを交配し、そのF1マウスをNOD/Shi-scidマウスに戻し交配することにより実施できる。
【００１９】
また、本発明のマウスは、上記本発明の方法により作出されたマウスであることを特徴とする。本発明のマウスをNOG マウス(NOGマウス；NOD/Shi-scid, γc nullマウス； NOD/Shi-scid, IL-2Rγchain-/-マウス； NOD/Shi-scid, IＬ-2R(γc)nullマウスなど）と称する。
【００２０】
本発明のマウスは、機能的なT細胞およびB細胞を共に欠失し、マクロファージ機能が減退し、NK細胞またはNK活性を消失している重度の免疫不全マウスである。このため、本発明のマウスに異種細胞(例えば、ヒト末梢血単核球)を移入した場合、抗NK抗体処理を施した従来の免疫不全マウスと比較してもさらに高率の生着・増殖が認められる(後述の実施例１を参照されたい)。また、本発明のマウスは樹状細胞の機能も不全であり、サイトカインの産生も著しく減退している。従って、本発明のマウスは従来の免疫不全マウスと比較して最も優れた異種細胞生着性を有しており、このマウスに生着する様々な移入異種細胞(幹細胞、分化細胞および癌細胞を含む)の解析に有効であると考えられる。さらに、HIV、HTLV-1や癌の病態モデルマウスの確立、ヒト型抗体の作製に利用することも可能である。
以下、本発明のマウスの用途について述べる。用いるマウスは、通常8〜12週齢のものが好ましいが、限定はされない。
【００２１】
２．本発明のマウスを用いたヒト幹細胞アッセイ系の確立
本発明のマウスを用いて、ヒト幹細胞の分化、増殖に関与する因子、機構の検討を行うためのヒト幹細胞アッセイ系を確立することができる。また、ヒト幹細胞アッセイ系を用いることにより種々の治療薬の探索も可能になる。
【００２２】
ヒト幹細胞アッセイ系の確立は、本発明のマウスに、ヒト幹細胞を移入することにより行うことができる。ここで、幹細胞とは造血幹細胞の他、神経幹細胞等の造血系由来ではない幹細胞も含む。ヒト幹細胞は、抗体によって同定される特異的なエピトープ部位と関連する細胞表面マーカーの存在によって同定され、例えばヒト骨髄、臍帯血、末梢血等からCD34陽性細胞として単離することができる。
【００２３】
幹細胞を生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の細胞および生体に影響を与えない溶液に懸濁させて、1×104〜1×106細胞をマウスの静脈内に投与することにより移植することができる。
【００２４】
移植後、数週間後に細胞を移植したマウスの末梢血、脾臓、骨髄、胸腺等の各臓器から細胞を回収し、その表面抗原を例えばFACS(Fluorescence-activated cell sorter)を用いて調べることにより移植した細胞の分化を調べることができる。この際指標となる細胞表面の抗原マーカーとしては、幹細胞に関連するものとしてCD34、T細胞に関連するものとしてCD3、CD4、CD8等、B細胞に関連するものとしてCD10、CD19、CD20等、B1a細胞に関連するものとしてCD5等、骨髄系細胞に関連するものとしてCD33等、樹状細胞に関連するものとしてCD11c等、白血球全体に関連するものとしてCD45等、マクロファージに関連するものとしてCD11a、CD11b等、NK細胞に関連するものとしてCD56等、形質細胞に関連するものとしてCD38等、血小板に関連するものとしてCD41等、赤血球に関連するものとしてグリコフォリンA等が挙げられ、必要に応じて各種の関連マーカーを選択することができる。
【００２５】
また、回収した細胞からのインターフェロン、インターロイキン、TNFa等のサイトカインの産生をELISA等により測定することによっても、幹細胞の分化を調べることができる。
【００２６】
さらに、本発明のマウスを用いれば、ヒト幹細胞の継代移植が可能であり、すなわち自己複製可能な真のヒト幹細胞を得ることができる。具体的には、本発明のマウスにヒト幹細胞を移植し、数週間後にマウス骨髄から未分化のヒト幹細胞を回収し、さらに回収した該幹細胞を本発明のマウスに移植する。この移植および回収を繰り返すことにより、他の細胞の混入のない純度の高いヒト幹細胞を大量に得ることができる。継代移植により、少なくとも純度99％以上、好適には99.7%以上のヒト幹細胞を得ることができる。従来のマウスにおいては、2次移植までしか可能でなかったが、本発明のマウスでは2回を超える継代移植も可能となった。
【００２７】
本発明のマウスを用いて得られたヒト幹細胞を、白血病等の治療のためにヒトに移植することが可能であるし、またヒト幹細胞に外来遺伝子を導入し、本発明のマウスに移植して、増殖させることによりヒト幹細胞を標的とした遺伝子治療に用いることもできる。幹細胞への遺伝子導入は、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて可能である。ここで用いる遺伝子として例えば、アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症患者に対してADA遺伝子等が挙げられる。これらの遺伝子をヒト幹細胞に導入した後に、本発明のマウスに移植し、増殖・純化し患者に投与することにより遺伝子治療が可能になる。
【００２８】
３．本発明のマウスを用いたヒト抗体の産生
本発明のマウスを用いて、ヒト抗体を産生するヒト株化細胞およびヒト抗体を得ることができる。本発明のマウスに上述のヒト幹細胞を移植して、T細胞、B細胞等の免疫担当細胞を分化・増殖させるか、あるいはマウスにヒトT細胞、B細胞等の免疫担当細胞を移植してマウス体内に生着させることにより、ヒト抗体を産生し得るヒト免疫担当細胞を保持したマウスを得ることができる。ヒト幹細胞を移植した場合、6〜8週間でT細胞およびB細胞の分化・増殖が認められ、ヒト抗体の産生が可能になる。
【００２９】
ヒトのT細胞およびB細胞を生着・保持したマウスに抗原を投与することにより該抗原に対するヒト抗体および該抗体を産生する細胞を得ることができる。本発明のマウスへの抗原投与は、通常マウスに免疫を行うときと同様の方法で行えばよい。
【００３０】
ヒト抗体産生細胞は、マウスの各臓器、特に脾臓、リンパ節等から回収することができる。ヒト抗体産生細胞の割合が多い場合は回収細胞をそのまま株化に用いることができるが、割合が小さい場合は、適宜抗ヒトB細胞抗体を用いたアフィニティーカラム法等で精製すればよい。また、混入しているマウス細胞を抗マウス抗体および補体を用いた細胞溶解法等により除去しておくのが望ましい。
【００３１】
このようにして得られたヒト抗体産生細胞をエプスタインバールウイルス(EBV)による形質転換法、適当な増殖生細胞と融合することによる細胞融合法等により株化し、抗体を産生しつつ長期継代が可能なヒト抗体産生株化細胞を得ることができる。
【００３２】
４．腫瘍病態モデルマウスの作出
本発明のマウス中でヒト腫瘍を生着・増殖させることも可能であり、本発明のマウスに腫瘍細胞を移植することにより、ヒト腫瘍の動物モデルを得ることができる。例えば、ヒト腫瘍細胞を投与することによりマウス体内で増殖し、ヒト腫瘍を有するマウスを得ることができる。この際用いる細胞として、従来のヌードマウスでのヒト腫瘍継代株、ED-40515(-)、MT-1、TL-Oml等のHTLV-1白血病由来細胞株等が挙げられる。また、ヒトの腫瘍組織を数mmの大きさに切り刻んでその癌組織片を直接、本発明のマウスに移植して生着させてもよい。この際、腫瘍細胞、組織を移植するマウスの部位は限られず、細胞の場合はマウスの腹腔内、静脈内または皮下に移植し、組織の場合はマウスの皮下に移植することができる。皮下は臀部皮下等マウスのどの部分の皮下でもよいが、切開することなく腫瘍を確認することができるという点で、耳介皮下や背部皮下へ移植することが望ましい。また、抗癌剤の臨床効果を反映した結果を得ようとする場は、同所移植（大腸癌細胞の場合は大腸に移植する）が望ましい。細胞を移植した場合、数週間から数ヶ月で腫瘍が形成され、特にHTLV-1細胞を耳介後部皮下に移植した場合、2週間で腫瘍が形成され、実用的な腫瘍モデルマウスを迅速に作出することができる。
さらに、本発明のマウスに腫瘍を移植した場合、白血化等の腫瘍細胞の転移も認められ、腫瘍の転移のモデル動物として利用することもできる。
【００３３】
このようにして得られたヒト腫瘍モデルマウスを用いて、抗癌剤、癌転移抑制剤等のスクリーニングを行うことができる。この方法としては、腫瘍を形成したマウスに、経口、経皮等の適当な方法で候補薬剤を投与し、腫瘍の大きさ、転移巣の数・大きさ、マウスの生死等を観察することにより薬剤の効果を判定することができる。
【００３４】
５．ウイルス感染症病態モデルマウスの作出
本発明のマウスを用いてウイルス感染症病態モデルマウスを得ることができる。すなわち、本発明のマウスにヒトウイルスが感染しうる細胞を移植し該ウイルスを感染させることにより、あるいはウイルスの感染した細胞を移植することにより、ウイルス感染細胞を体内に生着・保持したウイルス感染症病態モデル動物を得ることができる。
【００３５】
従来のマウスでは、マクロファージに感染するMトロピック（M-tropic）ウイルスのみの増殖が可能であったが、本発明のマウスを用いてT細胞に感染するHIV、HTLV-1等のTトロピック(T-tropic)ウイルスの増殖も可能になった。
【００３６】
例えば、1×107〜1×108のヒト末梢血単核細胞を本発明のマウス腹腔内に投与し、数日後に数百〜数千TCID50のHIVを接種することにより、ヒト細胞にHIVが感染したHIV感染モデルマウスを得ることができる。HIVの感染は、p24陽性細胞等のHIV抗原の発現を指標に検出することができる。
HIVの代わりに、HTLV-1を接種させることにより、HTLV-1感染モデルマウスを得ることができる。
【００３７】
本発明により得られた病態モデル動物を用いて、HIV、HTLV-1等のin vivoにおける増殖機構の研究を行うことができ、またウイルス感染治療法の開発、ウイルス感染治療剤のスクリーニング等を行うことができる。
【００３８】
６．NOGマウスを用いた異種細胞生着性の向上したマウスの作出
本発明のNOGマウスを用いて、より異種細胞生着性の向上したマウスを作出することができる。例えば、本発明のNOGマウスにマウスの免疫系に関与する遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配することにより得ることができる。免疫系に関与する遺伝子として、例えばサイトカイン受容体遺伝子、サイトカイン遺伝子等がある。
【００３９】
また、ヒト細胞の分化、増殖に関与するヒトサイトカイン遺伝子等（例えば、hGM-CSFやhSCF等）を導入することによってもより異種細胞生着性の向上したマウスを作出することができる。例えば、Pro.Natl.Acad.Sci.USA 77:7380-7384, 1980の方法等に従って、上記遺伝子をマウスの前核期受精卵に注入し、この導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによってヒトサイトカイン遺伝子等を発現するマウスを作出し、これと本発明のNOGマウスを交配することによりする異種細胞生着性の向上したマウスを作出することができる。
【００４０】
【実施例】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１ NK活性を消失かつ、樹状細胞機能を減退させた免疫不全マウス（NOGマウス）の作製、該マウスにおける異種細胞生着性の検討および該マウスを用いたヒト幹細胞のアッセイ系の確立
（１） NK活性を消失かつ、樹状細胞機能を減退させた免疫不全マウス（NOGマウス）の作製
NK活性を消失させた多機能免疫不全マウスを得るために、（財）実験動物中央研究所で維持しているNOD/Shi-scidマウス(日本クレアK.K.からも入手可)(8週齢)に、菅村和夫教授(東北大学医学部生体防御学講座・免疫分野)より譲渡されたインターロイキン２受容体γ鎖ノックアウトマウス(IL-2RγKOマウス)(8週齢)を戻し交配することによって、IL-2Rγ変異遺伝子を導入したF1マウスを作製した。F1マウスでの変異IL-2Rγ鎖遺伝子の導入は、該遺伝子をPCRで増幅して検出することにより確認した。具体的には、まずF1マウスの眼底より採取した血液100μLからDNA自動抽出機(MagExtractor、TOYOBO社製)によりDNAを抽出した。このDNA1.5μLに、23.5μLの1.5mM MgCl2、0.4mM dNTPおよび25pmolの２セットのプライマー(野生型の判定には下記プライマーPIとPIIIのセット、変異型を判定するには同PIとPIIのセットを用いた)を含むPCR緩衝液を添加し、IL-2Rγ鎖遺伝子の野生型と変異型とを判定するPCRを下記増幅条件下で行った。
【００４１】
（プライマー）
PI： 5'-CTGCTCAGAATGATGCCTCCAATTCC-3'（配列番号１）
PII： 5'-CCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAAT-3'（配列番号２）
PIII： 5'-GATCCAGATTGCCAAGGTGAGTAG-3' （配列番号３）
【００４２】
（PCR増幅条件）
94℃で5分の加熱処理後、94℃で1分,55℃で1分,72℃で1分を1サイクルとして30〜35サイクル実施し、その後72℃で10分加熱した。
上記PCRで得られたPCR産物を2％アガロースゲル中で電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後に検出される発色バンドのサイズで判定した。野生型では約660bp、変異型では約350bpのサイズのバンドが認められた。
【００４３】
（戻し交配）
次に、この変異IL-2Rγ遺伝子を導入したF1マウスをNOD/Shi-scidマウスと交配することによりF2マウスを得た。さらにF2マウスでの変異IL-2Rγ鎖遺伝子の導入を上記同様に検出し、かつ血清中の免疫グロブリンを単純免疫拡散法により検出することにより、変異IL-2Rγ鎖遺伝子を有し、かつscid遺伝子がホモであるマウス個体を選別した。その後、上記マウス個体をNOD/Shi-scidマウスに掛け合わせて、得られた産仔のうち変異IL-2Rγ鎖遺伝子を有するものをさらにNOD/Shi-scidマウスと交配した。
以上の戻し交配を少なくとも９回行うことにより、NOG(NOG)マウスを作出した(概略を図１に示す)。ここで、IL-2Rγ鎖遺伝子はＸ鎖染色体上にあるため、雄マウスにIL-2RγKOマウスを使用することが有効である。
【００４４】
（２） NOGマウスにおける異種細胞生着性の検討
次に、上記交配により得られたNOGマウスと従来の免疫不全マウスであるNOD/Shi-scidマウスとを用いて、これらのマウスへの異種細胞生着性に抗NK抗体処理が与える影響の程度について試験した。
▲１▼（抗IL-2受容体β鎖モノクローナル抗体）
抗IL-2受容体β鎖モノクローナル抗体(クローンTMβ1)は、大阪大学医学部の宮坂昌之教授により作製され(Tanaka T, Tsudo M, Karasuyama Hら、A novel monoclonal antibody against murine IL-2Receptor beta-chain. Characterization of receptor expression in normal lymphoid cells and EL-4 cells. J Immunol 1991;147(7):2222-8)、供与されたハイブリドーマから作製した。具体的には、該ハイブリドーマをBALB/cA-nuマウスに腹腔内投与し、その数週間後の腹水より採取した。
【００４５】
この抗体を、NOD/Shi-scidマウス5匹(8〜12週齢)、NOGマウス3匹(8〜12週齢)に、マウス１匹当たり1 mgずつ腹腔内投与した。また、抗体非投与対照として、NOGマウス4匹(8〜12週齢)に生理食塩水を投与した。
【００４６】
また、ヒト末梢血リンパ球は、ボランティアより採取した血液より、リンホプレップによる比重遠心法を用いて採取した。
得られたヒト末梢血単核球1×107個を、TMβ1投与後2日目の上記マウスの腹腔内に投与した。
【００４７】
ヒト末梢血単核球の投与から２週間後にマウスを処分し、全腹腔滲出細胞を含む腹水をRPMI-1640培養液で十分洗浄することにより回収した。全腹腔細胞中の全腹腔滲出細胞をフローサイトメトリーを用いて計測し、その数により、ヒト細胞のマウスへの生着性・増殖性を判定した。抗体非投与対照についても同様の操作を行った。この結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
表１に示す結果から、ヒト末梢血単核球を移入したNOGマウスでは、従来のTMβ1処置マウスと比較して、該抗体処置無しでも極めて高率のヒト細胞が分化、生着、増殖することが明らかとなった。
【００５０】
▲２▼ (抗アシアロ-GM1抗体)
次に、NOGマウスおよびNOD/Shi-scidマウスを用いて、これらのマウスへのヒト臍帯血由来細胞の生着性に抗アシアロ-GM1抗体（AGM1）(ウサギ)(和光純薬工業K.K.、014-09801)が与える影響の程度について試験した。
【００５１】
先ず、表２に示すように番号付けしたNOGマウス(8〜12週齢)およびNOD/Shi-scidマウス(8〜12週齢)に2.4 GyのＸ線を照射した。次に、これらのマウスに、投与直前にマウス1匹当たり20μLの抗アシアロ-GM1抗体を400μLのPBSで希釈したものを投与した。また、抗体非投与対照のマウス(表２中、5,6,10,11,15,16番のマウス)には生理食塩水を腹腔内投与した。
【００５２】
ヒト臍帯血CD34陽性細胞は、予め承認を得たボランティアより採取した臍帯血からFicoll-Hypaque比重遠心により単核球を採取し、さらにDynabeads M-450 CD34およびDETACHaBEAD CD34(Dynal As, Oslo, Norway)によって、CD34陽性細胞を分離した(Ueda T, Tsuji K, Yoshino Hら、Expansion of human NOD/SCID -repopulating cells by stem cell factor, Flk2/Flt3 ligand, thrombopoietin, IL-6, and soluble IL-6 receptor. J Clin Invest 2000;105(7):1013-21)。
上記で得られたヒト臍帯血由来CD34陽性細胞1×105個を、抗アシアロ-GM1抗体投与直後にマウスの尾静脈より移入した。
【００５３】
ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞の投与から４週間後にマウスを処分し、末梢血を採取し、単核球中のヒト細胞(CD45+)および全血中のヒト血小板(CD41+)をフローサイトメトリーを用いて計測し、その数により、ヒト細胞のマウスへの生着性・増殖性を判定した。抗体非投与対象についても同様の操作を行った。この結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
表２に示す結果から、ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞を移入したNOGマウスでは、従来の抗アシアロ-GM1抗体処置マウスと比較して、該抗体処置無しでも極めて高率のヒト細胞が分化、生着、増殖することが明らかとなった。
【００５６】
（３） NOGマウスを用いたヒト幹細胞のアッセイ系の確立
マウスは、NOD/Shi-scidマウスおよび本発明のNOGマウスを用いた。ヒト臍帯血（CB）から採取したCD34陽性細胞の1×105細胞を2.4 Gyの放射線照射した上述のマウスに移植した。
【００５７】
末梢血、骨髄、脾臓および胸腺中のヒト細胞をFACSで解析した。移植8週間後の末梢血中のCD45陽性細胞の比率は、NOGマウスでは37％で、NOD/Shi-scidマウスでは7％であった。骨髄ではそれぞれ65％および20％であった。高率なキメリズムに加えて、NOGマウスでは、移植3ヶ月後の末梢血、骨髄、脾臓、胸腺において、BおよびTリンパ球を含む多様な細胞系列への分化が認められた。骨髄では、ヒトCD33+骨髄細胞、CD19+B細胞、CD3+T細胞、CD56+NK細胞、CD41a+巨大核細胞およびグリコフォリンA+赤血球が認められた。さらに、興味深いことに、胸腺で認められたヒトT細胞は少なかったが、脾臓ではCD4+/CD8- T細胞、CD4-/CD8+T細胞およびCD4+/CD8+T細胞が認められた。このことは、ヒト造血幹細胞は胸腺以外の場所で成熟T細胞へ分化増殖することを示している。
【００５８】
予め同意を得た正常妊娠の母の健康な新生児の出生時に臍帯血を得た。臍帯血はヘパリン化して保存し、採取より24時間以内に以下の操作により処理し、移植実験に使用した。
【００５９】
CD34陽性細胞純化は以下のようにして行った。ヘパリン化した臍帯血はリン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline)に5%のウシ胎児血清(Fetal BovineSerum)を混ぜた緩衝液にて2倍希釈した後、Ficollを用いて単核球を分離した。分離した単核球はDynal社のDynabeads（商標）M-450 CD34を用いてCD34陽性細胞に純化した。方法はDynal社の指示通りであるが、概説すると2%ウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin)とクエン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を用いて単核球を4×107/mLの濃度に調整した。よく懸濁したDynabeads CD34を単核球浮遊液1mLあたり100μL加え、氷上で30分間、混和しながら反応させた。細胞とロゼットを形成したBeadsは磁石を用いて回収した。続いてロゼットを形成しているBeadsにDetachabead（商標）CD34を必要量加え37℃で混和しながら15分反応させた。CD34陽性細胞はBeadsから遊離するため、磁石を用いてBeadsのみを除去し、CD34陽性細胞を得た。
【００６０】
移植にはSPF（specific pathogen free）の環境下で飼育された8〜12週齢のNOD/Shi-scidマウス、NOGマウスおよびNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスを用いた。これらのマウスは京都大学医学部動物実験施設にて施設の規約に則って飼育された。
【００６１】
前2者の比較の実験ではそれぞれ1.2Gyのガンマ線(ガンマセル137Cs)を2回照射し、マウス1匹につき10万個のCD34陽性細胞を尾静脈より移植した。NOD/Shi-scidマウスについては移植直前と移植後11日おきに腹腔内に抗アシアロGM1抗体（和光純薬）を200μg投与した。
【００６２】
NOGマウスとNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスの比較実験では、上記と同様に両者に1.2Gyのガンマ線を2回照射したのちCD34陽性細胞4万個もしくは1万個を尾静脈から移植した。
移植後のマウスには飲料水に硫酸ネオマシン732mg/Lを加えて、感染を防御した。
【００６３】
マウスは示された時期にエーテル麻酔の上、眼窩静脈叢より末梢血を採血してヒト血球陽性率をフローサイトメトリーを用いて測定した。フローサイトメトリーは広く行われている一般的方法によるが、概説すると、採血した血液は直ちにEDTA-2Na に十分混和し、解析まで室温に放置した。全血の50〜100μLに至適量の抗体を加え、4℃で30分間反応させた後、FACS 溶解液(Beckton Dickinson社)を用いて溶血、固定し、FACS Calibur (Beckton Dickinson社)を用いて測定した。骨髄、脾臓の場合は頸椎脱臼にてマウスを処分したのち大腿骨、脾臓を取り出し、5%ウシ胎児血清を含む培養液中にそれぞれ、骨髄、脾細胞を遊離させ、細胞浮遊液として、後は末梢血とほぼ同様に処理し、フローサイトメトリー法によって解析した。
【００６４】
解析に用いた抗体は、抗ヒトCD45FITC抗体、抗ヒトCD10PE抗体、抗ヒトCD33PE抗体、抗ヒトCD3PE抗体、抗ヒトCD34PE抗体、抗ヒトCD41PE抗体(Beckton Dickinson)、抗ヒトCD38PC5抗体、抗ヒトCD56PC5抗体、抗ヒトCD19PC5抗体（Immunotech）、抗マウスCD45APC、抗マウスCD41FITC抗体(BD Pharmingen)であった。
【００６５】
マウス末梢血中におけるヒトCD45陽性細胞とヒトCD41陽性細胞の比率（％）と絶対数（/μL）の推移を4週おきに12週まで調べた（図２Aおよび図２B）。図２Aおよび図２Bに示すとおり、NOGマウスにおいて、有意な高い比率と絶対数が認められた。移植12週以降でマウスを処分し、骨髄、脾臓で同様にヒトCD45陽性細胞の比率を調べたところNOGマウスで非常に高い陽性率を示した（図３）。
【００６６】
NOGマウスとNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスの比較実験ではマウス末梢血中におけるヒトCD45陽性細胞の陽性率を調べた（図４）。図４に示すように、NOGマウスにおいてNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスより高いヒト細胞陽性率を示し、ヒト細胞の生着性に優れていた。
【００６７】
実施例２ NOGマウスのNK活性およびサイトカイン産生における樹状細胞の機能不全の検討
本発明のNOGマウス（10〜12週齢）の雌3匹、NOD/ShiマウスにC.B-17-scidマウスを戻し交配して得られたNOD/Shi-scidマウス（10〜12週齢）の雌4匹および雄4匹、ならびにNOD/LtSz-scid, β2m nullマウス（または、nullβ2m(null)NOD/LtSz-SCID、β2m ミクログロブリン欠損NOD/SCIDマウスとも称する；Jackson研究所のDr.Shultz,L.D.らにより作製「Kollet O, Peled A, Byk Tら、beta2 microglobulin-deficient (β2m(null))NOD/SHI-SCID mice are excellent recipients for studying human stem cell function. Blood 2000;95(10):3102-5」）（10〜12週齢）の雌2匹および雄2匹を用いて以下の検討を行った。
【００６８】
NOD/Shi-scidマウスに抗アシアロGM1抗体（αAGM）で処置後、脾細胞を採取した。得られた細胞を2つに分け、１つをマグネティックセルソーター（Magnetic cell sorter、MACS）を用い、CD11c抗原陽性細胞（樹状細胞として考える）を除去した。同様に無処置NOD/LtSz-scid, β2m nullマウスおよびNOGマウスより、脾細胞を回収した。これら細胞の少量をとって、FACS解析に供した。さらに、この4種の細胞を第I群：NOGマウス（3匹）；第II群：αAGM無処置NOD/Shi-scidマウス（雄2匹）、αAGM処置NOD/Shi-scidマウス（3匹）およびαAGM処置後、さらにCD11c を除去したNOD/Shi-scidマウス（3匹）；第III群．NOD/LtSz-scid, β2m nullマウス（4匹）の３群に分け、細胞を1×107/ml in RPMI-1640に調整しその100μlをウェルに入れ、等量のリステリアモノサイトジェネス（Listeria monocytogenes、LM）抗原で刺激して培養した（Triplicateで実施した）。LMは1011Units/mLであるので、使用時にRPMI-1640で2×107Units/mLとなるように希釈して用いた。この際、LM不添加のものを対照として用いた。24時間後に上清採取、ELISAでIFN-γなどのサイトカイン量を測定した。
【００６９】
脾細胞におけるサブクラス(特にCD11c,CD11b)をFACSで解析した。
T細胞マーカーとしてFITC標識CD3、NK細胞マーカーとしてビオチン標識Pan NK(DX 5)、マクロファージおよび樹状細胞マーカーとして、FITC標識CD11c、PE標識CD11bを用いた。
【００７０】
また、NOG、C.B-17-scid、NOD/Shi-scidおよびNOD/LtSz-scid, β2m nullマウス（10〜12週齢）でのNK活性を、51Cr標識NK感受性YAC-1細胞を標的とした細胞障害性試験で検討した。すなわち、マウスより脾細胞を単離し、51Cr標識YAC-1細胞と種々の比率で混合培養した。37℃、5% CO2下で4時間培養後、上清中の放射能活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。NK活性は下記の算定法で示される。
%特異的細胞障害性＝(特異的放射能活性−自然放射能活性)/（最大放射能活性−自然放射能活性）×100。
図５Aおよび図５Bに各種系統マウスより得られた脾細胞のFACSパターンを示す。
【００７１】
NK細胞は、NOD/Shi-scidおよびNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスで検出された。しかし、抗アシアロGM1抗体処置NOD/Shi-scidマウスおよびNOGマウスでは全く検出できなかった。また、樹状細胞マーカーであるCD11c陽性細胞は極めて高率にこれら全てのマウスから検出された。抗アシアロGM1抗体処置NOD/Shi-scidマウス脾細胞からの磁気ビーズによるCD11c陽性細胞の除去はほぼ完全であることが確認された。
【００７２】
図６A、図６Bおよび図６Cに上記脾細胞のLM刺激下でのサイトカインの産生量をELISAで検出した結果を示している。抗アシアロGM1抗体無処置NOD/Shi-scidおよびNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスではIFNγの産生が認められるに係わらず、NOGマウスでは全く検出できないこと、抗アシアロGM1抗体処置NOD/Shi-scidマウスからCD11c陽性細胞を除去することによって、NOGマウスと同様にIFNγの産生が認められなくなることが分かった。
【００７３】
図７に各種系統マウスより得られた脾細胞のNK活性を示す。
C.B-17-scidマウスと比較して、NOD/Shi-scidマウスではNK活性の減退が認められたが、NOGマウスとNOD/LtSz-scid, β2m null マウスではNK活性は全く認められなかった。
【００７４】
以上のことから、NOGマウスおよびNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスでは、NK活性が全く消失していることが明らかとなった。しかし、FACS解析の結果から、NOGマウスではNK細胞が消失しているが、NOD/LtSz-scid, β2m null マウスではNK細胞は存在するが、NK活性が消失していることが明らかとなった。
【００７５】
また、NOGマウスで認められる脾細胞サイトカイン産生の減退には樹状細胞の機能不全が原因であることが明らかとなった。一方で、NOD/LtSz-scid, β2m nullマウスでは、そのFACSおよびサイトカイン産生パターンは抗アシアロGM1抗体処置NOD/Shi-scidマウスとほぼ同等であることが示唆され、このマウスではNK細胞が消失しており、樹状細胞は正常であることが明らかであった。
【００７６】
実施例３ NOGマウスを用いたヒト幹細胞の継代移植
遺伝子導入ヒト幹細胞の自己複製能を検討するためにNOGマウスに臍帯血幹細胞を移植し、２次、３次移植の不可を検討した。
【００７７】
妊婦の同意と承諾の上で臍帯血を得て実験に使用した。臍帯血からCD34陽性細胞をFicoll-Hypaque (Lymphoprep, 1.077±0.001 g/ml; Nycomed, Oslo, Norway)を用いて単核細胞を分離後CD34陽性細胞分離カラム(MACS, Miltenyi Biotec, Glodbach, Germany)を用いて純化した。CD34陽性細胞の純度は96±3％であった。
【００７８】
レンチウィルスベクターpCS-CGはCMPプロモーターによりGFP遺伝子が発現するベクターであり、三好博士（筑波大学医学部免疫学）より供与された。TPO、SCF、Flk-2/Flt-3リガンド(FL)をそれぞれ50ng/mL含む無血清培地StemPro TM-34SFM(Gibco BRL)にて臍帯血CD34陽性細胞を24時間培養後、組み換えレンチウィルスCS-CGをMOI30で5時間感染させた（Kawada H et al., Exp. Hematol. 27:904-915, 1999）。その後細胞を洗浄し、マウス骨髄ストローマ細胞HESS-5存在下に同様の無血清培地中で5日間体外増幅培養を行った(Oki M et al., Exp. Hematol. Inpress. 2001)。
【００７９】
7週齢のNOD/Shi-scidマウスに3Gy照射後、3×105個の培養により増幅させた遺伝子導入細胞を尾静脈より移入した。6週後にマウス骨髄細胞の表面抗原を解析し、1×107細胞を照射NOGマウスに移植した（２次移植）。6週後に同様の解析をおこない1×107細胞を照射NOGマウスに移植した（３次移植）。さらに、6週後に同様の解析を行った。
【００８０】
表面抗原の解析はFACSCalibur (Becton Dickinson)を用いて行った。使用した抗体はFITC標識抗ヒトCD45 (T-200)、PE標識抗ヒトCD2(39C1.5)、CD3(UCHT1)、CD4(SK3)、CD14(LeuM3)、CD19(4G7)、CD20(2H7)、CD33(WM53)、CD41(P2)、CD56(N901)およびグリコフォリン(glycophorin A)(KC16)であり、いずれもBecton Dickinsonより購入した。
【００８１】
CD34陽性細胞への遺伝子導入効率は40±5％(n=5)であった。１次、２次、３次移植マウス骨髄細胞をヒトCD45で染色したFACSの結果を図８に示す。いずれのマウスにも遺伝子導入ヒト細胞の存在が認められる。
【００８２】
本発明のNOGマウスを宿主として利用することにより世界で初めて３次宿主まで移植可能な造血幹細胞に発現可能な遺伝子導入に成功した。従来のNOD-scidマウスを利用した場合には２次移植までしか可能ではなかった点(Guenechea G et al., Nature Immunol, 2, 75-82, 2001)より、本マウスは造血幹細胞のアッセイ系としてより感度が高く有用であることが示された。
【００８３】
実施例４ NOGマウスによる完全ヒト型抗体の産生
NOGマウス（8週齢）は2.5Gy、NOD/Shi-scidマウス（8週齢）は3.5Gyの照射をした後、ヒト臍帯血（妊婦の同意と承諾の上で、東海大学細胞移植研究センターより供与）よりマグネットビーズで精製したCD34+細胞〜1×106を静脈内に移植した。具体的には、臍帯血よりMNCをFicollを用いて分離した後、CD34+細胞をMACS immunomagnetic separation system (Miltenyl Biotec, Glodach, Germany)により単離した。CD34+細胞はFACSにより97%以上の純度であることを確認した後、移植に用いた。
【００８４】
経時的に眼窩採血し、MNC分画をFicollにより得た後、蛍光標識したCD45、CD19、CD3抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色し、ヒトリンパ球の再構成をCD45により、B細胞、T細胞の割合をそれぞれ蛍光標識したCD19、CD3により、FACSで確認した。
【００８５】
また、これらのマウスより胸腺、脾臓を摘出し、細胞を調製した後、細胞数を計測し、各種蛍光抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色して、上記の再構成確認と同様、FACSにより解析した。
【００８６】
これらのマウスに、移植後6週ないし8週から抗原を投与した。抗原としてはDNP-KLHを用いた。100μg/匹のDNP-KLHを水酸化アルミニュウム（ALUM）をアジュバントとして腹腔内に免疫した。2週間ごとに同様の免疫を行い、血清を採取してELISAにより抗体価を測定した。
この際の、ELISAは以下のようにして行った。
【００８７】
96wellプレートを、抗ヒトIGs(ICN, Aurora, Ohio)またはDNP-KLHでコーティングした後、3％BSAでブロッキングし、洗浄した後、希釈した抗血清を添加した。2時間室温で反応させた後、洗浄し、ビオチン化抗ヒトIgMまたは抗ヒトIgGモノクローナル抗体（Phermingen, San Diego, CA）を添加した。37℃2時間反応させた後、洗浄し、アビジン化パーオキシダーゼを添加し、室温1時間反応させた。プレートを洗浄した後、TMBペルオキシダーゼEIA基質キット溶液(Bio-Rad Laboratories, USA)を添加し、室温30分反応させた後、10%HClで反応停止し、450nmの吸光度を測定した。Ig濃度は標準曲線より算出した。
【００８８】
（１）臍帯血由来CD34+細胞の移植と再構成の効率
NOGマウスの臍帯血幹細胞移植後のヒトCD45+細胞の割合については、4週以降、漸次末梢血ではヒトCD45の割合が減少しつつあるが、12週以降に突然T細胞の増加の割合が高くなり、これに伴ってヒトCD45の割合も増加したものが観察された（表３）。いままでNOD/Shi-scid末梢血においては、このようなT細胞の増加によるCD45+の割合の増加は一度も観察されなかった。このNOGマウスは、14週まで一度もGVHDを発症しなかった。
【００８９】
【表３】
【００９０】
（２） NOGマウスにおけるT細胞分化について
A. 胸腺内 T 細胞分化について
図９A、図９B、図１０Aおよび図１０Bに胸腺内のT細胞分化パターンを示した。図に示すように、このマウスにおいて胸腺内でCD3陽性細胞が分化し、これらの細胞は通常の胸腺あるいはhu/m-RTOCによって検出されたものと同様に、CD4/CD8 DN（Double negative）、DP(Double positive)、SP(Single positive)を含み、移植後11ないし13週ですでにその一部がCD1a-low T細胞にまで成熟していることが示された。胸腺細胞数は1〜2×106と、通常のマウス胸腺細胞数の約1/100であった。この現象は、NOD/Shi-scidにおいても観察されたが、その頻度は著しく低く、8/28(28.6%)であったのに対し、NOGマウスでは、7/7(100%)であった。
【００９１】
B. 末梢の T 細胞について
図１１A、図１１B、図１２A、図１２B、図１３Aおよび図１３Bに、さらに脾臓細胞あるいは末梢血中のT細胞について解析したものを示す。胸腺内でT細胞分化が観察されたマウスにおいて、末梢でもCD3陽性細胞が観察された。これらはCD4/CD8陽性細胞群であり、胸腺内で分化したものを含む可能性が示唆された。
【００９２】
（３） NOGマウスにおけるB細胞分化について
A. B 細胞サブセット分化について
また、図１４Aおよび図１４Bに、骨髄細胞中のB細胞が、CD5を発現する割合について示した。骨髄中では、CD5陽性のいわゆるB1a細胞の分化は亢進しておらず、CD19陽性、IgM陽性の細胞群が優勢であった。また、これらのIgM highの細胞群は、CD20を発現していた。このマウス骨髄でのヒトB細胞の分化については、特に異常は検出されなかった。この現象はNOD/Shi-scidマウスにおけるB細胞分化においても観察されることであり、共通の性質と考えられる。
【００９３】
B. 末梢の B 細胞について
図１３Aおよび図１３Bに、末梢でのB細胞のFACSパターンを示した。B細胞の割合はNOD/Shi-scidと殆ど変わらなかった。しかしながら、脾臓においてはCD5陽性のいわゆるB細胞の亜群であるB1a細胞が優勢であり、骨髄の分化パターンと大きな差が検出された。しかし、IgM陽性CD5陰性の細胞群も20％程度検出されており、B1a細胞のみが検出されているわけではないことが確認された。
【００９４】
（４） NOGマウスにおける抗体産生能について
このマウスに、抗原としてDNP-KLHを投与し、経時的にIgMおよびIgG抗体産生量を測定した。その結果、抗原非特異的IgMおよびIgG抗原特異的IgMが3回の繰返し投与により検出された。T細胞が胸線及び末梢で検出されたにもかかわらず、抗原特異的IgG産生は検出されなかった（図１５A、図１５Bおよび図１５C）。図１５A、図１５Bおよび図１５Cには、骨髄(BM)（図１５B）、末梢血(PBSC)（図１５C）由来CD34+細胞移植マウスの結果も同時に示した。これらでは、特異的IgMおよび特異性と無関係なIgG産生が臍帯血と比較して低い傾向が見られた。
以上の結果より、このマウスは、ヒトT細胞及びB細胞を分化させ、ヒト型抗体産生系に用いるのに有用であることが示された。
【００９５】
実施例５ 新生物増殖系
NOD/Shi-scidマウスおよびNOGマウスおよびBALB/cAJcl-nuマウス（クレアより入手）およびC.B-17/Icr-scidマウス（クレアより入手）を用いた。総てのマウスは5週齢以上のものを用いた。
【００９６】
マウスに移植する細胞として、移植ヒト腫瘍細胞株、LM-2-JCKを用いた。LM-2-JCKは、13歳の女性患者のリンパ芽球リンパ腫から確立し、ヌードマウスへの継代異種移植で維持されている細胞株である。LM-2JCKは、T細胞抗原CD4およびCD5を発現するが、抗体も含め他の細胞抗原を発現しないことが報告されている。
【００９７】
異種移植アッセイのための固形腫瘍はヌードマウスの皮下で12代継代したものを用いた。腫瘍をF-10栄養補足培地（GIBCO BRL）中にハサミを用いて細切後、ピペットで十分分散させた後、ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液を得た。懸濁液中の生細胞の濃度はトリパンブルー（GIBO BRL）染色により算定した。遠心後、腫瘍細胞を1×107および1×106生細胞/mlの濃度で生理食塩水に分散させた。腫瘍細胞分散液をマウスの両脇腹皮下に25ゲージの針を付けた1mLシリンジを用いて0.1mL注入した。腫瘍細胞の注入後、1週間毎に腫瘍の大きさと体重を測定した。1×106を移植し、腫瘍が大きくなった移植後21日目に、マウスを処分して腫瘍の重量およびサイズを測定した。
異なるバックグラウンドのマウスのLM-2-JCKの移植性の違いを表４に記した。
【００９８】
【表４】
【００９９】
1×106の移植では、NOGマウスとNOD/Shi-scidマウスにおいてすべての腫瘍が生着した、一方C.B-17/Icr-scidでの生着率は80%であった。
これらの系統での腫瘍の生着率は1×105移植のとき減少し、とくにC.B-17/Icr-scidではすべてのマウスで腫瘍増殖が観察されなかった。
1×106移植時の腫瘍の増殖曲線を図１６に示した。
【０１００】
NOGマウスの腫瘍増殖は他の2系統に比べ勝っていた。
NOGマウスにおける21日めの平均腫瘍体積は、NOD/Shi-scidマウスとC.B-17/Icr-scidの同日の平均腫瘍体積のそれぞれ2.89倍と3.97倍であり、Student t検定において有意な差がみられた(p<0.001)。
NOD/Shi-scidマウスに生着した腫瘍の21日めの平均体積とC.B-17/Icr-scidに生着した腫瘍の同日の平均体積との間には有意差は認められなかった。
【０１０１】
実施例６ NOGマウスを用いたHIV感染モデル系の確立
NOGマウスを用いたHIV感染モデル系の確立を種々のHIV株を用いて検討した。代表例を以下に示す。
マウスとしては、NOGマウスを用いた。比較のためC.B-17-scidマウスとNOD/Shiマウスの両ミュ−タントマウスの戻し交配により以前作製されたNOD/Shi-scidマウスも用いた。
使用したHIV-1はエイズ脳症の前頭葉組織より分離されDNAクローン化されたマクロファージとT細胞に感染性を有するJRFLウイルスである。さらに、env V3領域をこのJRFLウイルス、gp41の下流にGFP遺伝子を挿入したGFP-HIV-1を用いた。
【０１０２】
（１）ヒト単核球細胞を移植したマウスの（hu-PBL-NOGマウス）の作製
NOGマウスに直接マウス当たり1×107個の実験使用の同意と承諾を得た正常人の末梢血ヒト単核球（peripheral blood lymphocyte(PBL)）を腹腔内接種した。比較にIL-2Rγ鎖が正常なNOD/Shi-scidマウスに同じドナーからのPBLを腹腔内接種した。
【０１０３】
（２）マウスへのHIV-1の感染
PBL接種後6日目にマウスに1,000TCID50のウイルスを腹腔内に接種した。ウイルス感染後2週目にマウスを処分し、腹腔滲出細胞を含む腹水を回収し、その中のヒト細胞数をFACSにて算出した。また、脾臓を摘出し、パラフォルムアルデヒドで固定後パラフィン包埋切片を作製した。
【０１０４】
（３）病理学的解析
脾臓組織切片をHE染色し、さらに、ヒトCD3、CD4、CD8、HIV-1p24抗原に対する抗体を用いて免疫染色を行った。免疫組織染色は、従来報告されているABC法に加え、EPOS法、Envisiont法を用いた。
hu-PBL-NOGマウスにおけるヒト細胞の定着を評価した。
表５に一連の検討の結果を示す。
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
ヒト末梢血を移植したマウスの脾臓にヒトCD4陽性T細胞ならびにCD8陽性T細胞がそれぞれ脾臓中心動脈周辺に定着されることを見出した。ヒトCD3陽性細胞数は明らかにNOD/Shi-scidマウスよりNOGマウスにおけるヒト細胞数は明らかに多かった。FACSによる測定では腹水中のヒトCD4陽性細胞は平均1×107個以上であった。
【０１０７】
一方、NOD/Shi-scidマウスではCD4陽性細胞はほとんど検出されず、CD8陽性細胞がほとんどであった。前述の実施例においてはNOD/Shi-scidマウスにNK細胞の分化を抑制するマウスIL-2レセプターβ鎖に対する抗体（TMβ-1）（マウス当り0.5mg）をヒトPBLの接種３日前に腹腔に注射したが、本実施例においては行なわなかった。抗体の処理を行なったマウスは多くのCD4ならびにCD8陽性のヒト細胞が定着することを別の実験にて確認している。しかし、この抗体処理を行なったNOD/Shi-scidマウスからのヒト細胞数よりもNOGマウスからのヒト細胞数が3から4倍は明らかに多かった。
【０１０８】
HIV感染マウスにおいてはHIV抗原であるp24陽性細胞が脾動脈周囲に検出された。さらにGFPを発現するHIV感染マウスにおいては明らかにGFP発現細胞が脾臓ならびに腹水中に検出された。ウイルス感染細胞数は明らかにNOD/Shi-scidマウスにおけるそれより多かった。
【０１０９】
実施例７ NOGマウスを用いたHTLV-1感染モデル系の確立
NOGマウスに、HTLV-1白血病由来細胞株であるMT-2細胞をマウスあたり2×107細胞移植した。
移植後4週目に、リンパ腫瘍形成マウスの数を数え（表６）、リンパ腫瘍マウスにHTLV遺伝子が感染しているか否かをサザンブロット法とPCR法にて確認した。プロウイルス数は病理学的検索の結果、明らかに皮膚内リンパ腫と後腹腔内両側性のリンパ腫瘍さらに、腫瘍の大きなマウスは胃周辺リンパ節に転移と胸膜内に癌細胞が浸潤していた。また、末梢血にHTLV陽性細胞が増えていた。このことは、典型的白血病となっていることを示す。さらに、肺間質内にも浸潤しているのが認められた。これらの細胞はすべてTaxタンパク質を発現していた。但し、脳内には浸潤していなかった。
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
実施例８ 新生物細胞の移入による白血病化およびNOGマウスを用いたHTLV-1陽性細胞などの可移植性の検討
NOGマウスに各種のHTLV-1細胞株の移植、腫瘍形成実験を行い、その有用性について検討した。
【０１１２】
3例のHTLV-1白血病由来細胞株[L=Leukemic cell lines:ED-40515(-), MT-1 and TL-Oml ]、6例のHTLV-1感染細胞株[IT=Infected transformed cell lines:SLB-1, M8116, HUT-102, MT-2, MT-4 and TY9-31MT ] 107-8個/0.5mLをNOGマウスおよびNOD/Shi-scidマウスの左耳介後部皮下に、一部では臀部皮下に移植し、マウス内の腫瘍の大きさ、組織像、白血化の有無を経時的に比較検討し、NFkBなどの転写因子、Taxタンパクの増減との関係についても解析した。
【０１１３】
HTLV-1白血病由来細胞株[L]の全例及び例外的にHTLV-1感染細胞株[IT]のSLB-1は2週間以内に24×17×11mm大の腫瘍を形成したのに対し、ITの6例中5例はせいぜい10×10×7mmにとどまり、M8116やTY9-31MTではほとんど腫瘤を形成しなかった（表７）。
【０１１４】
【表７】
【０１１５】
この腫瘍形成性細胞株の例では末梢血中の白血病細胞の出現及び臓器浸潤の度合いは比較的高いが、非腫瘍形成性細胞の例のなかにはそれ以上のものもあり（例えばHUT-102、MT-2など）、腫瘍形成性と末梢血中の白血病細胞の出現及び臓器浸潤の程度とは必ずしも相関しなかった(表８)。
【０１１６】
【表８】
【０１１７】
腫瘍形成性のED-40515(-) 107をNOGマウスおよびNOD/Shi-scidマウスの左耳介後部皮下に移植して2週間目の腫瘍形成性を比較したところ、NOGマウスでは22×17×10mm大の腫瘤を形成したのに反し、NOD/Shi-scidではほとんど腫瘤を形成せず、NOGマウスでの易腫瘍形成性が明らかになった(表９)。
【０１１８】
【表９】
【０１１９】
NOGマウスでの易腫瘍形成性がT細胞系のみならず、B細胞系でも同様であるかどうかを調べる目的で、EBER(EBV-Encoded Small RNA)およびベクターだけを形質転換したBJAB細胞7×107個をNOGマウスの左耳介後部皮下に移植して3週間目の腫瘍形成性を比較した。BJAB-EBERでは対照であるBJAB-VECTORに比較し、有意に大きな腫瘤を形成した(26×18×7/13×18×3mm)。その大きさは前例のED-40515(-)の場合の腫瘤に匹敵した(表１０)。
【０１２０】
【表１０】
【０１２１】
NOGマウスにおけるED-40515(-) 107 による効率的な腫瘤形成性は腫瘍細胞のCXCR4を介する、腫瘍血管の活発な新生によるものであれば、内皮細胞にあるそのリガンドであるSDF-1の競合剤(competitive agent)であるKRH-1636を持続投与しておけば、腫瘤形成が抑制されることが期待された。しかしED-40515(-)及び出血を伴う（組織学的にはアンジオトロピック(angiotropic)な）SLB-1の場合、KRH-1636を毎日腹腔内投与したに関わらず、非投与群と変わらない25×18×12mm及び20×10×18mmの大きさの腫瘤を形成した(表１１)。
【０１２２】
【表１１】
【０１２３】
ED-40515(-)及びSLB-1のin vitroの培養細胞のサイトスピン標本と、in vivoの腫瘤形成細胞の凍結切片標本を用いて、酵素抗体法によるCD4、CD8、CD3、CXCR4、CCR5、SDF-1免疫染色の態度を比較検討した。CD4、CD3、CXCR4、SDF-1ではいずれもほぼ同様に陽性で、CCR5はいずれも陰性だった。CD8はin vitroでは陰性であったが、in vivoでは陽性であった(表１２)。
【０１２４】
【表１２】
【０１２５】
ED-40515(-)のin vitroの培養細胞とin vivoの腫瘤形成細胞を用いて、Tax、CXCR4、OX40、OX40Lのウエスタンブロット分析をおこなった。Taxはいずれも陰性であったが、CXCR4、OX40、OX40Lはいずれも陽性であり、その強さに有意の差はみとめられなかった(表１３)。
【０１２６】
【表１３】
【０１２７】
ED-40515(-)のin vitroの培養細胞とin vivoの腫瘤形成細胞を用いてNFkBの転写因子活性を電気泳動移動度シフトアッセイ（electrophoretic mobility shift assay(EMSA)）で検討したが、両者に差をみとめなかった（表１４）。
【０１２８】
【表１４】
【０１２９】
NOGマウスの耳介後部皮下に移植する系において、以下の事項が認められた。
1）NOGマウスでは、接種後15日という、今まで考えられなかった極めて短期間内に大きな腫瘤形成を確実に確認できた。それに反しNOD/Shi-scidマウス（IL-2Rγchain+/+）では全く腫瘤を形成しなかった。
2）NOGマウスでは、遺伝的にNK細胞が欠損することが明らかにされており、したがって、C.B-17/Icr-scidやNOD/Shi-scidマウス（IL-2Rγchain+/+）の場合に必須とされる抗NK細胞に対するモノクローナル抗体などの前処置を必要としなかった。
3)耳介後部皮下に移植することにより、すなわち腹腔内よりも解剖学的にもNK細胞がさらに少ないとされる部位を選択したことになり、腫瘤の形成を容易にするとともに、その結果、切開するまでもなく外観より腫瘍の大きさを容易に確認できた。
4)内山ら（Imada K, Takaori-Kondo A, Akagi T, Shimotohno K, Sugamura K, Hattori T, Yamabe H, Okuma M, Uchiyama T: Tumorigenicity of human T-cell leukemia virus type I-infected cell lines in severe combined immunodeficient mice and characterization of the cells proliferating in vivo. Blood86:2350-7., 1995, Uchiyama,T: Human T cell leukemia virus type I (HTLV-I) and human diseases. Annu Rev Immunol 15:15-37, 1997）が腫瘤形成しないとしたMT-1、T-2、TL-Omlでもそれほど大きくはないものの腫瘤を形成した。
【０１３０】
従ってNOGマウスの耳介後部皮下に移植する系は画期的な腫瘍移植系であり、さらにT 細胞系腫瘍のみならずB細胞腫瘍でも同様であることが明らかになった。すなわち、この系ががん細胞やヒト正常リンパ組織の移植にとっても有用な移植系であることを示している。
【０１３１】
さらに実験動物モデルのない、あるいはあっても実用に供するのに困難な場合、このNOGマウスにヒトの細胞、組織を移植してヒト疾患モデルを構築することにより、in vitroの実験にのみ頼らざるを得なかった疾患の研究を、よりヒトのin vivoに限りなく肉迫した実験系で実験できることになり、疾患の成立機序の解明、治療法の開発等にこのマウスは多大な貢献をすると考えられる。例えばHIV-1感染では強力なHAART療法に関わらず、ウイルス血症（viremia）のリバウンド（rebound）や変異ウイルス出現が最重要課題であり、その感染性ウイルスのリザーバー（reservoir）はリンパ濾胞のFDC(follicular dendritic cells、濾胞樹状細胞)とされており、この研究のためには、ヒトリンパ濾胞を含むリンパ組織の移植をしたヒト型モデルマウスを構築することが不可欠であり、それにはこのNOGマウスが有用である。
【０１３２】
さらに、この系の易腫瘍形成性の要因について、in vitro における培養細胞と比して、移植された細胞ではどんな因子が増加、あるいは活性化されているかを検討した。今回使用した細胞株はすべてIL-2非依存性であり、IL-2産生性、さらにTax、CXCR4-SDF-1系は直接関係していないことがあきらかになった。しかしそのほかの因子については検索した限りin vitroの培養細胞とin vivoの腫瘤構成細胞との比較で有意の差を認めるものはなかった。
【０１３３】
【発明の効果】
本発明により、従来免疫不全マウスとして知られていたNOD/Shi-scidマウスやNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスに比較して、異種細胞、特にヒトの細胞の生着に適したNOGマウスの作出方法、および該方法により作出されるマウスが提供される。このようにして得られたマウスにヒト幹細胞を移植することによりヒト幹細胞アッセイ系を確立することができる。また、ヒトの免疫担当細胞を移植することにより、本発明のマウスを用いてヒト抗体を作成することができる。さらに、ヒト腫瘍を移植・生着させることによりヒト腫瘍モデルマウスを作出することができ、腫瘍の治療方法、治療剤のスクリーニング等に利用することができる。さらにまた、HIVまたはHTLV1に感染したヒトリンパ球が生着したHIVまたはHTLV-1感染モデルマウスを作出することができHIV-1、HTLV-1等のin vivoにおける増殖機構の研究を行うことができ、またウイルス感染治療法の開発、ウイルス感染治療剤のスクリーニング等を行うことができる。
【０１３４】
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、異種細胞の生着に優れたマウスの作出方法、その方法により作出されたマウスおよびそのマウスの用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトを始めとする異種細胞を生着させた実験動物は、種々の病態発症機序の解析、その治療や予防のための薬剤開発に極めて重要であり、そのための受容体としての動物の開発は実験動物学の大きなテーマの１つである。特に近年では、幹細胞より分化させた組織や細胞の移植による治療（いわゆる再生治療）などが世界的に注目されるに至って、さらにこれらの動物の重要性が増している。
【０００３】
本発明者らは以前からこうした実験動物の開発・改良を続けてきた。特にヌードマウスやSCIDマウスの改良等を行い、これまでにこの目的の為に作製した免疫不全マウス等に関しては既に特許出願を行っている(特開平9-94040号公報)。中でも、多機能免疫不全(機能的なT細胞およびB細胞の欠失、マクロファージ機能減退、補体活性の低下およびナチュラルキラー(NK)活性低下等)を示すNOD/Shi-scidマウスおよびNOD/LtSz-scidマウスは異種細胞の生着に適した実験動物として最も注目されており、幹細胞分化・増殖を初めとして多様な研究に用い得ることが明らかとなってからは更に適用範囲が拡がっているのが現状である。
しかしながら、上記NOD/Shi-scidマウスはヒト細胞の生着は高いものの、その生着性にかなりのバラつきが認められる。
【０００４】
NOD/Shi-scidマウスの生着性を高めるためには、抗IL-2Rβ鎖抗体(TMβ1)や抗アシアロ-GM1抗体等を投与して前記マウスのNK活性を減退させることが重要であることが既に明らかにされている(Koyanagi,Y.ら、1997. "Primary human immunodeficiency virus type 1 viremia and central nervous system invasion in a novel hu-PBL-immunodeficient mouse strain."J Virol 71:2417；Koyanagi,Y.ら、1997.“High levels of viremia in hu-PBL-NOD-scid mice with HIV-1 infection.”Leukemia 11 Suppl. 3:109； Yoshino H,ら、2000. "Natural killer cell depletion by anti-asialo GM1 antiserum treatment enhances human hematopoietic stem cell engraftment in NOD/Shi-scid mice." Bone Marrow Transplant 26:1211-6)。しかし、そうした抗体は極めて高価であり、またその効果も個体によってバラつきが認められる。さらに、抗アシアロ-GM1抗体を用いる場合、実験期間中は11日に１度という頻度で投与を行わなくてはならず、煩雑さも付きまとう。
【０００５】
このために、米国Jackson研究所のDr.Shultz,L.D.らは、ヒト細胞高生着性NOD/LtSz-scidマウスに、NK活性を消失しているβ2m KOマウスと交配することによって、NOD/LtSz-scid, β2m null（β2m (null) NOD/SCID）マウス (Kollet O, Peled A, Byk Tら、beta2 microglobulin-deficient (β2m(null))NOD/SCID mice are excellent recipients for studying human stem cell function. Blood 2000;95(10):3102-5)を作製している。
【０００６】
上記のNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスにおいては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー(NK)細胞が消失しており、またマクロファージ、補体の機能が減退している。しかし、移植異種細胞、組織の拒絶には、それら以外の細胞（例えば、樹状細胞）や因子（例えば、IFNγ）も関与している。
【０００７】
このため、上記のNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスよりもさらに異種細胞の生着性にバラつきが無く、抗体が不要で、かつ異種細胞の生着性に優れているマウスが望まれる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、上記問題点を解決し、異種細胞の生着性に優れているマウスの作出方法および該方法により作出されたマウスを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、NOD/ShiマウスにC.B-17-scidマウスを戻し交配することにより得られるマウスに、インターロイキン２受容体γ鎖（IL-2Rγ）遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配することにより、異種細胞の生着性にバラつきが無く、かつ抗体が不要な（すなわち、異種細胞の生着に適した）マウスが得られるという知見を得た。本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１） 以下のＡのマウスにＢのマウスを戻し交配することを特徴とする、異種細胞の生着に適したマウスの作出方法；
Ａ：NOD/ShiマウスにC.B-17-scidマウスを戻し交配することにより得られるマウス、
Ｂ：インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウス。
（２） ＡのマウスがNOD/Shi-scidマウスである、（１）のマウスの作出方法。
（３） ＢのマウスがIL-2RγKOマウスである、（１）または（２）のマウスの作出方法。
（４） （１）〜（３）のいずれかのマウスの作出方法により作出されたマウス。
（５） 機能的なT細胞およびB細胞を共に欠失し、マクロファージ機能が減退し、NK細胞またはNK活性を消失し、かつ樹状細胞機能が減退しており、優れた異種細胞生着性を有していることを特徴とする、NOG（NOD/Shi-scid, IL-2Rγ KO）マウス。
（６） 移植したヒト幹細胞が、排除されることなく、効率良く分化、増殖する（４）または（５）のマウス。
（７） （４）〜（６）のいずれかのマウスにヒト幹細胞を移植し、分化・増殖する細胞を解析することを含む、幹細胞アッセイ方法。
（８） T細胞およびB細胞の分化・増殖を解析する、（７）の幹細胞アッセイ方法。
（９） （４）〜（６）のいずれかのマウスにヒト幹細胞を移植し増殖させた後に、該マウスの骨髄からヒト幹細胞を回収しさらに、（４）〜（６）のいずれかのマウスに移植することを繰り返し行うことを含むヒト幹細胞を増殖させる方法。
（１０） 繰り返しが少なくとも３回である（９）のヒト幹細胞を増殖させる方法。
（１１） （９）または（１０）の方法で得られた純度が99.7％以上のヒト幹細胞。
（１２） ヒト幹細胞が外来遺伝子を導入したものである、（９）または（１０）の方法。
（１３） ヒトT細胞およびB細胞を安定に保持し、ヒト抗体を産生することが可能な、（４）〜（６）のいずれかのマウス。
（１４） ヒトT細胞およびB細胞を保持する、（４）〜（６）のいずれかのマウスを抗原で免疫することを含む、ヒト抗体の産生方法。
（１５） ヒトT細胞およびB細胞を保持する、（４）〜（６）のいずれかのマウスを抗原で免疫した後に該マウスから該抗原に対する抗体産生細胞を回収し、株化することを含む、ヒト抗体を産生する抗体産生細胞株を製造する方法。
（１６） ヒト腫瘍細胞を保持した（４）〜（６）のいずれかのマウスである、ヒト腫瘍モデルマウス。
（１７） ヒト腫瘍細胞がHTLV-1白血病由来細胞である、（１６）のヒト腫瘍モデルマウス。
（１８） ヒト腫瘍細胞を耳介に保持した、（１６）または（１７）のヒト腫瘍モデルマウス。
（１９） （１６）〜（１８）のいずれかのマウスを用いて抗癌剤をスクリーニングする方法。
（２０） （４）〜（６）のいずれかのマウスにヒト腫瘍細胞を移植することを含む、ヒト腫瘍モデルマウスを作出する方法。
（２１） ヒト腫瘍細胞がHTLV-1白血病由来細胞である、（２０）の方法。
（２２） ヒト腫瘍細胞をマウスの耳介に移植する、（２０）または（２１）の方法。
（２３） マクロファージトロピックなウイルスばかりでなく、Tトロピック(T 細胞親和性)なウイルスに感染したT細胞を保持した（４）〜（６）のいずれかのマウスである、ウイルス感染モデルマウス。
（２４） ウイルスがHIVである、（２３）のウイルス感染モデルマウス。
（２５） ウイルスがHTLV-1である、（２３）のウイルス感染モデルマウス。
（２６） （２３）〜（２５）のマウスを用いて抗ウイルス剤をスクリーニングする方法。
（２７） （４）〜（６）のマウスを用いて、NOGマウスよりも異種細胞の生着性が向上した免疫不全マウスを作出する方法。
（２８） NOGマウスよりも異種細胞の生着性が向上した免疫不全マウスを作出するための、（４）〜（６）のマウス。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の一般的実施態様について説明する。
１．本発明のマウスの作出
本発明の異種細胞の生着に適したマウスの作出方法は、以下のＡのマウスにＢのマウスを戻し交配することを特徴とする；
Ａ：NOD/ShiマウスにC.B-17-scidマウスを戻し交配することにより得られるマウス、
Ｂ：インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウス。
【００１２】
ここで異種細胞としては、ヒトを始めとしてマウス、ラット等の哺乳動物由来の細胞や組織、特にヒトの幹細胞、リンパ球や腫瘍細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１３】
ＡのマウスにおけるNOD/ShiマウスへのC.B-17-scidマウスの戻し交配は、当業者に公知の手法、例えば、Cross Intercross法による戻し交配(Inbred Strains in Biomedical Research, M.F.W.Festing, 1979, ISBN 0-333-23809-5, The Macmillan Press, London and Basingstoke)に従い、C.B-17-scidマウスとNOD/Shiマウスとを交配し、そのF1マウス同士を更に交配して得たF2マウスの血清中の免疫グロブリン量を測定し、検出できないマウスを選別する。このマウスを再びNOD/Shiマウスと交配する。この操作を9回以上繰り返し(Cross Intercross法)行うことによって実施できる。
【００１４】
尚、NOD/ShiマウスおよびC.B-17-scidマウスは共に日本クレア株式会社から販売されている。また、これらのマウスの交配により得られるマウスとしては、例えば、本発明者らが以前に樹立したNOD/Shi-scidマウス（または、NOD-scidとも呼ぶ）(特開平9-94040号公報)があり、これを日本クレア株式会社から入手して直接Ａのマウスとして用いることもできる。尚、NOD/ShiマウスおよびNOD/Shi-scidマウスについては、上記以外に本出願人も所持しており、必要に応じていつでも分譲することができる。
【００１５】
また、Ｂのマウスにおけるインターロイキン２受容体γ鎖（IL-2Rγ）遺伝子のノックアウトは、当業者に公知の手法、例えば、マウスES細胞を用いた相同組換えの手法(Capecchi, M. R., Altering the genome by homologous recombination, Science, (1989) 244, 1288-1292)に従い、マウス由来の特定の遺伝子と例えばネオマイシン等の薬剤耐性遺伝子を含む相同遺伝子とをES細胞の段階で置き換えた後、該ES細胞を受精卵に注入することにより実施できる。
【００１６】
具体的には、例えば、129/SVマウスのゲノムライブラリーからヒトのIL-2RγcDNAをプローブとしてマウスIL-2Rγを含む遺伝子クローンを単離し、該クローンのうちIL-2Rγ全長を含む8.6kbの大きさの断片を使用してターゲッティングベクターを作製する。すなわち、前記断片のIL-2Rのエクソン7と8との間にネオマイシン耐性遺伝子を発現するPMC1-neoポリAを挿入し、またエクソン8から1kb離れた3'側にジフテリア毒素-A遺伝子を配置する。次いで、前記ベクターを直鎖状にし、E14 ES細胞1×107個に電気穿孔法で導入する。その後、G418を含む培養液の中で相同的組換えを起こしたESクローンを選択し(PCRまたはサザン法で確認)、該ESクローンをC57BL/6マウスの胚盤胞に注入した後、仮親マウスの子宮に移植する。この仮親マウスから生まれたキメラマウスを更にC57BL/6マウスと交配することによって、生殖細胞系に伝達したIL-2RγKOヘテロマウスを得ることができる。
【００１７】
あるいは、既に確立されているインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子（IL-2Rγ）ノックアウトマウス系統を直接入手して用いてもよく、こうしたマウス系統として、例えば、IL-2RγKOマウス系統(菅村和男教授[東北大学医学部生体防御学講座・免疫分野]より作出されたインターロイキン２受容体γ鎖（IL-2Rγ）ノックアウトマウス(Ohbo K, Suda T, Hashiyama Mら、Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood 1996;87(3):956-67))がある。尚、IL-2RγKOマウスは、作出者である菅原教授の委嘱によって、現在は本出願人ら(財)実験動物中央研究所)の胚保存バンクの中で保存されており、必要に応じていつでも凍結胚または融解復元マウスとして提供することができる。
【００１８】
さらに、ＡのマウスへのＢのマウスの戻し交配は、上記と同様に、当業者に公知の手法、例えば、上述の戻し交配に従い、すなわちNOD/Shi-scidマウスとIL-2RγKOマウスとを交配し、そのF1マウスをNOD/Shi-scidマウスに戻し交配することにより実施できる。
【００１９】
また、本発明のマウスは、上記本発明の方法により作出されたマウスであることを特徴とする。本発明のマウスをNOG マウス(NOGマウス；NOD/Shi-scid, γc nullマウス； NOD/Shi-scid, IL-2Rγchain-/-マウス； NOD/Shi-scid, IＬ-2R(γc)nullマウスなど）と称する。
【００２０】
本発明のマウスは、機能的なT細胞およびB細胞を共に欠失し、マクロファージ機能が減退し、NK細胞またはNK活性を消失している重度の免疫不全マウスである。このため、本発明のマウスに異種細胞(例えば、ヒト末梢血単核球)を移入した場合、抗NK抗体処理を施した従来の免疫不全マウスと比較してもさらに高率の生着・増殖が認められる(後述の実施例１を参照されたい)。また、本発明のマウスは樹状細胞の機能も不全であり、サイトカインの産生も著しく減退している。従って、本発明のマウスは従来の免疫不全マウスと比較して最も優れた異種細胞生着性を有しており、このマウスに生着する様々な移入異種細胞(幹細胞、分化細胞および癌細胞を含む)の解析に有効であると考えられる。さらに、HIV、HTLV-1や癌の病態モデルマウスの確立、ヒト型抗体の作製に利用することも可能である。
以下、本発明のマウスの用途について述べる。用いるマウスは、通常8〜12週齢のものが好ましいが、限定はされない。
【００２１】
２．本発明のマウスを用いたヒト幹細胞アッセイ系の確立
本発明のマウスを用いて、ヒト幹細胞の分化、増殖に関与する因子、機構の検討を行うためのヒト幹細胞アッセイ系を確立することができる。また、ヒト幹細胞アッセイ系を用いることにより種々の治療薬の探索も可能になる。
【００２２】
ヒト幹細胞アッセイ系の確立は、本発明のマウスに、ヒト幹細胞を移入することにより行うことができる。ここで、幹細胞とは造血幹細胞の他、神経幹細胞等の造血系由来ではない幹細胞も含む。ヒト幹細胞は、抗体によって同定される特異的なエピトープ部位と関連する細胞表面マーカーの存在によって同定され、例えばヒト骨髄、臍帯血、末梢血等からCD34陽性細胞として単離することができる。
【００２３】
幹細胞を生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の細胞および生体に影響を与えない溶液に懸濁させて、1×104〜1×106細胞をマウスの静脈内に投与することにより移植することができる。
【００２４】
移植後、数週間後に細胞を移植したマウスの末梢血、脾臓、骨髄、胸腺等の各臓器から細胞を回収し、その表面抗原を例えばFACS(Fluorescence-activated cell sorter)を用いて調べることにより移植した細胞の分化を調べることができる。この際指標となる細胞表面の抗原マーカーとしては、幹細胞に関連するものとしてCD34、T細胞に関連するものとしてCD3、CD4、CD8等、B細胞に関連するものとしてCD10、CD19、CD20等、B1a細胞に関連するものとしてCD5等、骨髄系細胞に関連するものとしてCD33等、樹状細胞に関連するものとしてCD11c等、白血球全体に関連するものとしてCD45等、マクロファージに関連するものとしてCD11a、CD11b等、NK細胞に関連するものとしてCD56等、形質細胞に関連するものとしてCD38等、血小板に関連するものとしてCD41等、赤血球に関連するものとしてグリコフォリンA等が挙げられ、必要に応じて各種の関連マーカーを選択することができる。
【００２５】
また、回収した細胞からのインターフェロン、インターロイキン、TNFa等のサイトカインの産生をELISA等により測定することによっても、幹細胞の分化を調べることができる。
【００２６】
さらに、本発明のマウスを用いれば、ヒト幹細胞の継代移植が可能であり、すなわち自己複製可能な真のヒト幹細胞を得ることができる。具体的には、本発明のマウスにヒト幹細胞を移植し、数週間後にマウス骨髄から未分化のヒト幹細胞を回収し、さらに回収した該幹細胞を本発明のマウスに移植する。この移植および回収を繰り返すことにより、他の細胞の混入のない純度の高いヒト幹細胞を大量に得ることができる。継代移植により、少なくとも純度99％以上、好適には99.7%以上のヒト幹細胞を得ることができる。従来のマウスにおいては、2次移植までしか可能でなかったが、本発明のマウスでは2回を超える継代移植も可能となった。
【００２７】
本発明のマウスを用いて得られたヒト幹細胞を、白血病等の治療のためにヒトに移植することが可能であるし、またヒト幹細胞に外来遺伝子を導入し、本発明のマウスに移植して、増殖させることによりヒト幹細胞を標的とした遺伝子治療に用いることもできる。幹細胞への遺伝子導入は、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて可能である。ここで用いる遺伝子として例えば、アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症患者に対してADA遺伝子等が挙げられる。これらの遺伝子をヒト幹細胞に導入した後に、本発明のマウスに移植し、増殖・純化し患者に投与することにより遺伝子治療が可能になる。
【００２８】
３．本発明のマウスを用いたヒト抗体の産生
本発明のマウスを用いて、ヒト抗体を産生するヒト株化細胞およびヒト抗体を得ることができる。本発明のマウスに上述のヒト幹細胞を移植して、T細胞、B細胞等の免疫担当細胞を分化・増殖させるか、あるいはマウスにヒトT細胞、B細胞等の免疫担当細胞を移植してマウス体内に生着させることにより、ヒト抗体を産生し得るヒト免疫担当細胞を保持したマウスを得ることができる。ヒト幹細胞を移植した場合、6〜8週間でT細胞およびB細胞の分化・増殖が認められ、ヒト抗体の産生が可能になる。
【００２９】
ヒトのT細胞およびB細胞を生着・保持したマウスに抗原を投与することにより該抗原に対するヒト抗体および該抗体を産生する細胞を得ることができる。本発明のマウスへの抗原投与は、通常マウスに免疫を行うときと同様の方法で行えばよい。
【００３０】
ヒト抗体産生細胞は、マウスの各臓器、特に脾臓、リンパ節等から回収することができる。ヒト抗体産生細胞の割合が多い場合は回収細胞をそのまま株化に用いることができるが、割合が小さい場合は、適宜抗ヒトB細胞抗体を用いたアフィニティーカラム法等で精製すればよい。また、混入しているマウス細胞を抗マウス抗体および補体を用いた細胞溶解法等により除去しておくのが望ましい。
【００３１】
このようにして得られたヒト抗体産生細胞をエプスタインバールウイルス(EBV)による形質転換法、適当な増殖生細胞と融合することによる細胞融合法等により株化し、抗体を産生しつつ長期継代が可能なヒト抗体産生株化細胞を得ることができる。
【００３２】
４．腫瘍病態モデルマウスの作出
本発明のマウス中でヒト腫瘍を生着・増殖させることも可能であり、本発明のマウスに腫瘍細胞を移植することにより、ヒト腫瘍の動物モデルを得ることができる。例えば、ヒト腫瘍細胞を投与することによりマウス体内で増殖し、ヒト腫瘍を有するマウスを得ることができる。この際用いる細胞として、従来のヌードマウスでのヒト腫瘍継代株、ED-40515(-)、MT-1、TL-Oml等のHTLV-1白血病由来細胞株等が挙げられる。また、ヒトの腫瘍組織を数mmの大きさに切り刻んでその癌組織片を直接、本発明のマウスに移植して生着させてもよい。この際、腫瘍細胞、組織を移植するマウスの部位は限られず、細胞の場合はマウスの腹腔内、静脈内または皮下に移植し、組織の場合はマウスの皮下に移植することができる。皮下は臀部皮下等マウスのどの部分の皮下でもよいが、切開することなく腫瘍を確認することができるという点で、耳介皮下や背部皮下へ移植することが望ましい。また、抗癌剤の臨床効果を反映した結果を得ようとする場は、同所移植（大腸癌細胞の場合は大腸に移植する）が望ましい。細胞を移植した場合、数週間から数ヶ月で腫瘍が形成され、特にHTLV-1細胞を耳介後部皮下に移植した場合、2週間で腫瘍が形成され、実用的な腫瘍モデルマウスを迅速に作出することができる。
さらに、本発明のマウスに腫瘍を移植した場合、白血化等の腫瘍細胞の転移も認められ、腫瘍の転移のモデル動物として利用することもできる。
【００３３】
このようにして得られたヒト腫瘍モデルマウスを用いて、抗癌剤、癌転移抑制剤等のスクリーニングを行うことができる。この方法としては、腫瘍を形成したマウスに、経口、経皮等の適当な方法で候補薬剤を投与し、腫瘍の大きさ、転移巣の数・大きさ、マウスの生死等を観察することにより薬剤の効果を判定することができる。
【００３４】
５．ウイルス感染症病態モデルマウスの作出
本発明のマウスを用いてウイルス感染症病態モデルマウスを得ることができる。すなわち、本発明のマウスにヒトウイルスが感染しうる細胞を移植し該ウイルスを感染させることにより、あるいはウイルスの感染した細胞を移植することにより、ウイルス感染細胞を体内に生着・保持したウイルス感染症病態モデル動物を得ることができる。
【００３５】
従来のマウスでは、マクロファージに感染するMトロピック（M-tropic）ウイルスのみの増殖が可能であったが、本発明のマウスを用いてT細胞に感染するHIV、HTLV-1等のTトロピック(T-tropic)ウイルスの増殖も可能になった。
【００３６】
例えば、1×107〜1×108のヒト末梢血単核細胞を本発明のマウス腹腔内に投与し、数日後に数百〜数千TCID50のHIVを接種することにより、ヒト細胞にHIVが感染したHIV感染モデルマウスを得ることができる。HIVの感染は、p24陽性細胞等のHIV抗原の発現を指標に検出することができる。
HIVの代わりに、HTLV-1を接種させることにより、HTLV-1感染モデルマウスを得ることができる。
【００３７】
本発明により得られた病態モデル動物を用いて、HIV、HTLV-1等のin vivoにおける増殖機構の研究を行うことができ、またウイルス感染治療法の開発、ウイルス感染治療剤のスクリーニング等を行うことができる。
【００３８】
６．NOGマウスを用いた異種細胞生着性の向上したマウスの作出
本発明のNOGマウスを用いて、より異種細胞生着性の向上したマウスを作出することができる。例えば、本発明のNOGマウスにマウスの免疫系に関与する遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配することにより得ることができる。免疫系に関与する遺伝子として、例えばサイトカイン受容体遺伝子、サイトカイン遺伝子等がある。
【００３９】
また、ヒト細胞の分化、増殖に関与するヒトサイトカイン遺伝子等（例えば、hGM-CSFやhSCF等）を導入することによってもより異種細胞生着性の向上したマウスを作出することができる。例えば、Pro.Natl.Acad.Sci.USA 77:7380-7384, 1980の方法等に従って、上記遺伝子をマウスの前核期受精卵に注入し、この導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによってヒトサイトカイン遺伝子等を発現するマウスを作出し、これと本発明のNOGマウスを交配することによりする異種細胞生着性の向上したマウスを作出することができる。
【００４０】
【実施例】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１ NK活性を消失かつ、樹状細胞機能を減退させた免疫不全マウス（NOGマウス）の作製、該マウスにおける異種細胞生着性の検討および該マウスを用いたヒト幹細胞のアッセイ系の確立
（１） NK活性を消失かつ、樹状細胞機能を減退させた免疫不全マウス（NOGマウス）の作製
NK活性を消失させた多機能免疫不全マウスを得るために、（財）実験動物中央研究所で維持しているNOD/Shi-scidマウス(日本クレアK.K.からも入手可)(8週齢)に、菅村和夫教授(東北大学医学部生体防御学講座・免疫分野)より譲渡されたインターロイキン２受容体γ鎖ノックアウトマウス(IL-2RγKOマウス)(8週齢)を戻し交配することによって、IL-2Rγ変異遺伝子を導入したF1マウスを作製した。F1マウスでの変異IL-2Rγ鎖遺伝子の導入は、該遺伝子をPCRで増幅して検出することにより確認した。具体的には、まずF1マウスの眼底より採取した血液100μLからDNA自動抽出機(MagExtractor、TOYOBO社製)によりDNAを抽出した。このDNA1.5μLに、23.5μLの1.5mM MgCl2、0.4mM dNTPおよび25pmolの２セットのプライマー(野生型の判定には下記プライマーPIとPIIIのセット、変異型を判定するには同PIとPIIのセットを用いた)を含むPCR緩衝液を添加し、IL-2Rγ鎖遺伝子の野生型と変異型とを判定するPCRを下記増幅条件下で行った。
【００４１】
（プライマー）
PI： 5'-CTGCTCAGAATGATGCCTCCAATTCC-3'（配列番号１）
PII： 5'-CCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAAT-3'（配列番号２）
PIII： 5'-GATCCAGATTGCCAAGGTGAGTAG-3' （配列番号３）
【００４２】
（PCR増幅条件）
94℃で5分の加熱処理後、94℃で1分,55℃で1分,72℃で1分を1サイクルとして30〜35サイクル実施し、その後72℃で10分加熱した。
上記PCRで得られたPCR産物を2％アガロースゲル中で電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後に検出される発色バンドのサイズで判定した。野生型では約660bp、変異型では約350bpのサイズのバンドが認められた。
【００４３】
（戻し交配）
次に、この変異IL-2Rγ遺伝子を導入したF1マウスをNOD/Shi-scidマウスと交配することによりF2マウスを得た。さらにF2マウスでの変異IL-2Rγ鎖遺伝子の導入を上記同様に検出し、かつ血清中の免疫グロブリンを単純免疫拡散法により検出することにより、変異IL-2Rγ鎖遺伝子を有し、かつscid遺伝子がホモであるマウス個体を選別した。その後、上記マウス個体をNOD/Shi-scidマウスに掛け合わせて、得られた産仔のうち変異IL-2Rγ鎖遺伝子を有するものをさらにNOD/Shi-scidマウスと交配した。
以上の戻し交配を少なくとも９回行うことにより、NOG(NOG)マウスを作出した(概略を図１に示す)。ここで、IL-2Rγ鎖遺伝子はＸ鎖染色体上にあるため、雄マウスにIL-2RγKOマウスを使用することが有効である。
【００４４】
（２） NOGマウスにおける異種細胞生着性の検討
次に、上記交配により得られたNOGマウスと従来の免疫不全マウスであるNOD/Shi-scidマウスとを用いて、これらのマウスへの異種細胞生着性に抗NK抗体処理が与える影響の程度について試験した。
▲１▼（抗IL-2受容体β鎖モノクローナル抗体）
抗IL-2受容体β鎖モノクローナル抗体(クローンTMβ1)は、大阪大学医学部の宮坂昌之教授により作製され(Tanaka T, Tsudo M, Karasuyama Hら、A novel monoclonal antibody against murine IL-2Receptor beta-chain. Characterization of receptor expression in normal lymphoid cells and EL-4 cells. J Immunol 1991;147(7):2222-8)、供与されたハイブリドーマから作製した。具体的には、該ハイブリドーマをBALB/cA-nuマウスに腹腔内投与し、その数週間後の腹水より採取した。
【００４５】
この抗体を、NOD/Shi-scidマウス5匹(8〜12週齢)、NOGマウス3匹(8〜12週齢)に、マウス１匹当たり1 mgずつ腹腔内投与した。また、抗体非投与対照として、NOGマウス4匹(8〜12週齢)に生理食塩水を投与した。
【００４６】
また、ヒト末梢血リンパ球は、ボランティアより採取した血液より、リンホプレップによる比重遠心法を用いて採取した。
得られたヒト末梢血単核球1×107個を、TMβ1投与後2日目の上記マウスの腹腔内に投与した。
【００４７】
ヒト末梢血単核球の投与から２週間後にマウスを処分し、全腹腔滲出細胞を含む腹水をRPMI-1640培養液で十分洗浄することにより回収した。全腹腔細胞中の全腹腔滲出細胞をフローサイトメトリーを用いて計測し、その数により、ヒト細胞のマウスへの生着性・増殖性を判定した。抗体非投与対照についても同様の操作を行った。この結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
表１に示す結果から、ヒト末梢血単核球を移入したNOGマウスでは、従来のTMβ1処置マウスと比較して、該抗体処置無しでも極めて高率のヒト細胞が分化、生着、増殖することが明らかとなった。
【００５０】
▲２▼ (抗アシアロ-GM1抗体)
次に、NOGマウスおよびNOD/Shi-scidマウスを用いて、これらのマウスへのヒト臍帯血由来細胞の生着性に抗アシアロ-GM1抗体（AGM1）(ウサギ)(和光純薬工業K.K.、014-09801)が与える影響の程度について試験した。
【００５１】
先ず、表２に示すように番号付けしたNOGマウス(8〜12週齢)およびNOD/Shi-scidマウス(8〜12週齢)に2.4 GyのＸ線を照射した。次に、これらのマウスに、投与直前にマウス1匹当たり20μLの抗アシアロ-GM1抗体を400μLのPBSで希釈したものを投与した。また、抗体非投与対照のマウス(表２中、5,6,10,11,15,16番のマウス)には生理食塩水を腹腔内投与した。
【００５２】
ヒト臍帯血CD34陽性細胞は、予め承認を得たボランティアより採取した臍帯血からFicoll-Hypaque比重遠心により単核球を採取し、さらにDynabeads M-450 CD34およびDETACHaBEAD CD34(Dynal As, Oslo, Norway)によって、CD34陽性細胞を分離した(Ueda T, Tsuji K, Yoshino Hら、Expansion of human NOD/SCID -repopulating cells by stem cell factor, Flk2/Flt3 ligand, thrombopoietin, IL-6, and soluble IL-6 receptor. J Clin Invest 2000;105(7):1013-21)。
上記で得られたヒト臍帯血由来CD34陽性細胞1×105個を、抗アシアロ-GM1抗体投与直後にマウスの尾静脈より移入した。
【００５３】
ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞の投与から４週間後にマウスを処分し、末梢血を採取し、単核球中のヒト細胞(CD45+)および全血中のヒト血小板(CD41+)をフローサイトメトリーを用いて計測し、その数により、ヒト細胞のマウスへの生着性・増殖性を判定した。抗体非投与対象についても同様の操作を行った。この結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
表２に示す結果から、ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞を移入したNOGマウスでは、従来の抗アシアロ-GM1抗体処置マウスと比較して、該抗体処置無しでも極めて高率のヒト細胞が分化、生着、増殖することが明らかとなった。
【００５６】
（３） NOGマウスを用いたヒト幹細胞のアッセイ系の確立
マウスは、NOD/Shi-scidマウスおよび本発明のNOGマウスを用いた。ヒト臍帯血（CB）から採取したCD34陽性細胞の1×105細胞を2.4 Gyの放射線照射した上述のマウスに移植した。
【００５７】
末梢血、骨髄、脾臓および胸腺中のヒト細胞をFACSで解析した。移植8週間後の末梢血中のCD45陽性細胞の比率は、NOGマウスでは37％で、NOD/Shi-scidマウスでは7％であった。骨髄ではそれぞれ65％および20％であった。高率なキメリズムに加えて、NOGマウスでは、移植3ヶ月後の末梢血、骨髄、脾臓、胸腺において、BおよびTリンパ球を含む多様な細胞系列への分化が認められた。骨髄では、ヒトCD33+骨髄細胞、CD19+B細胞、CD3+T細胞、CD56+NK細胞、CD41a+巨大核細胞およびグリコフォリンA+赤血球が認められた。さらに、興味深いことに、胸腺で認められたヒトT細胞は少なかったが、脾臓ではCD4+/CD8- T細胞、CD4-/CD8+T細胞およびCD4+/CD8+T細胞が認められた。このことは、ヒト造血幹細胞は胸腺以外の場所で成熟T細胞へ分化増殖することを示している。
【００５８】
予め同意を得た正常妊娠の母の健康な新生児の出生時に臍帯血を得た。臍帯血はヘパリン化して保存し、採取より24時間以内に以下の操作により処理し、移植実験に使用した。
【００５９】
CD34陽性細胞純化は以下のようにして行った。ヘパリン化した臍帯血はリン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline)に5%のウシ胎児血清(Fetal BovineSerum)を混ぜた緩衝液にて2倍希釈した後、Ficollを用いて単核球を分離した。分離した単核球はDynal社のDynabeads（商標）M-450 CD34を用いてCD34陽性細胞に純化した。方法はDynal社の指示通りであるが、概説すると2%ウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin)とクエン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を用いて単核球を4×107/mLの濃度に調整した。よく懸濁したDynabeads CD34を単核球浮遊液1mLあたり100μL加え、氷上で30分間、混和しながら反応させた。細胞とロゼットを形成したBeadsは磁石を用いて回収した。続いてロゼットを形成しているBeadsにDetachabead（商標）CD34を必要量加え37℃で混和しながら15分反応させた。CD34陽性細胞はBeadsから遊離するため、磁石を用いてBeadsのみを除去し、CD34陽性細胞を得た。
【００６０】
移植にはSPF（specific pathogen free）の環境下で飼育された8〜12週齢のNOD/Shi-scidマウス、NOGマウスおよびNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスを用いた。これらのマウスは京都大学医学部動物実験施設にて施設の規約に則って飼育された。
【００６１】
前2者の比較の実験ではそれぞれ1.2Gyのガンマ線(ガンマセル137Cs)を2回照射し、マウス1匹につき10万個のCD34陽性細胞を尾静脈より移植した。NOD/Shi-scidマウスについては移植直前と移植後11日おきに腹腔内に抗アシアロGM1抗体（和光純薬）を200μg投与した。
【００６２】
NOGマウスとNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスの比較実験では、上記と同様に両者に1.2Gyのガンマ線を2回照射したのちCD34陽性細胞4万個もしくは1万個を尾静脈から移植した。
移植後のマウスには飲料水に硫酸ネオマシン732mg/Lを加えて、感染を防御した。
【００６３】
マウスは示された時期にエーテル麻酔の上、眼窩静脈叢より末梢血を採血してヒト血球陽性率をフローサイトメトリーを用いて測定した。フローサイトメトリーは広く行われている一般的方法によるが、概説すると、採血した血液は直ちにEDTA-2Na に十分混和し、解析まで室温に放置した。全血の50〜100μLに至適量の抗体を加え、4℃で30分間反応させた後、FACS 溶解液(Beckton Dickinson社)を用いて溶血、固定し、FACS Calibur (Beckton Dickinson社)を用いて測定した。骨髄、脾臓の場合は頸椎脱臼にてマウスを処分したのち大腿骨、脾臓を取り出し、5%ウシ胎児血清を含む培養液中にそれぞれ、骨髄、脾細胞を遊離させ、細胞浮遊液として、後は末梢血とほぼ同様に処理し、フローサイトメトリー法によって解析した。
【００６４】
解析に用いた抗体は、抗ヒトCD45FITC抗体、抗ヒトCD10PE抗体、抗ヒトCD33PE抗体、抗ヒトCD3PE抗体、抗ヒトCD34PE抗体、抗ヒトCD41PE抗体(Beckton Dickinson)、抗ヒトCD38PC5抗体、抗ヒトCD56PC5抗体、抗ヒトCD19PC5抗体（Immunotech）、抗マウスCD45APC、抗マウスCD41FITC抗体(BD Pharmingen)であった。
【００６５】
マウス末梢血中におけるヒトCD45陽性細胞とヒトCD41陽性細胞の比率（％）と絶対数（/μL）の推移を4週おきに12週まで調べた（図２Aおよび図２B）。図２Aおよび図２Bに示すとおり、NOGマウスにおいて、有意な高い比率と絶対数が認められた。移植12週以降でマウスを処分し、骨髄、脾臓で同様にヒトCD45陽性細胞の比率を調べたところNOGマウスで非常に高い陽性率を示した（図３）。
【００６６】
NOGマウスとNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスの比較実験ではマウス末梢血中におけるヒトCD45陽性細胞の陽性率を調べた（図４）。図４に示すように、NOGマウスにおいてNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスより高いヒト細胞陽性率を示し、ヒト細胞の生着性に優れていた。
【００６７】
実施例２ NOGマウスのNK活性およびサイトカイン産生における樹状細胞の機能不全の検討
本発明のNOGマウス（10〜12週齢）の雌3匹、NOD/ShiマウスにC.B-17-scidマウスを戻し交配して得られたNOD/Shi-scidマウス（10〜12週齢）の雌4匹および雄4匹、ならびにNOD/LtSz-scid, β2m nullマウス（または、nullβ2m(null)NOD/LtSz-SCID、β2m ミクログロブリン欠損NOD/SCIDマウスとも称する；Jackson研究所のDr.Shultz,L.D.らにより作製「Kollet O, Peled A, Byk Tら、beta2 microglobulin-deficient (β2m(null))NOD/SHI-SCID mice are excellent recipients for studying human stem cell function. Blood 2000;95(10):3102-5」）（10〜12週齢）の雌2匹および雄2匹を用いて以下の検討を行った。
【００６８】
NOD/Shi-scidマウスに抗アシアロGM1抗体（αAGM）で処置後、脾細胞を採取した。得られた細胞を2つに分け、１つをマグネティックセルソーター（Magnetic cell sorter、MACS）を用い、CD11c抗原陽性細胞（樹状細胞として考える）を除去した。同様に無処置NOD/LtSz-scid, β2m nullマウスおよびNOGマウスより、脾細胞を回収した。これら細胞の少量をとって、FACS解析に供した。さらに、この4種の細胞を第I群：NOGマウス（3匹）；第II群：αAGM無処置NOD/Shi-scidマウス（雄2匹）、αAGM処置NOD/Shi-scidマウス（3匹）およびαAGM処置後、さらにCD11c を除去したNOD/Shi-scidマウス（3匹）；第III群．NOD/LtSz-scid, β2m nullマウス（4匹）の３群に分け、細胞を1×107/ml in RPMI-1640に調整しその100μlをウェルに入れ、等量のリステリアモノサイトジェネス（Listeria monocytogenes、LM）抗原で刺激して培養した（Triplicateで実施した）。LMは1011Units/mLであるので、使用時にRPMI-1640で2×107Units/mLとなるように希釈して用いた。この際、LM不添加のものを対照として用いた。24時間後に上清採取、ELISAでIFN-γなどのサイトカイン量を測定した。
【００６９】
脾細胞におけるサブクラス(特にCD11c,CD11b)をFACSで解析した。
T細胞マーカーとしてFITC標識CD3、NK細胞マーカーとしてビオチン標識Pan NK(DX 5)、マクロファージおよび樹状細胞マーカーとして、FITC標識CD11c、PE標識CD11bを用いた。
【００７０】
また、NOG、C.B-17-scid、NOD/Shi-scidおよびNOD/LtSz-scid, β2m nullマウス（10〜12週齢）でのNK活性を、51Cr標識NK感受性YAC-1細胞を標的とした細胞障害性試験で検討した。すなわち、マウスより脾細胞を単離し、51Cr標識YAC-1細胞と種々の比率で混合培養した。37℃、5% CO2下で4時間培養後、上清中の放射能活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。NK活性は下記の算定法で示される。
%特異的細胞障害性＝(特異的放射能活性−自然放射能活性)/（最大放射能活性−自然放射能活性）×100。
図５Aおよび図５Bに各種系統マウスより得られた脾細胞のFACSパターンを示す。
【００７１】
NK細胞は、NOD/Shi-scidおよびNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスで検出された。しかし、抗アシアロGM1抗体処置NOD/Shi-scidマウスおよびNOGマウスでは全く検出できなかった。また、樹状細胞マーカーであるCD11c陽性細胞は極めて高率にこれら全てのマウスから検出された。抗アシアロGM1抗体処置NOD/Shi-scidマウス脾細胞からの磁気ビーズによるCD11c陽性細胞の除去はほぼ完全であることが確認された。
【００７２】
図６A、図６Bおよび図６Cに上記脾細胞のLM刺激下でのサイトカインの産生量をELISAで検出した結果を示している。抗アシアロGM1抗体無処置NOD/Shi-scidおよびNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスではIFNγの産生が認められるに係わらず、NOGマウスでは全く検出できないこと、抗アシアロGM1抗体処置NOD/Shi-scidマウスからCD11c陽性細胞を除去することによって、NOGマウスと同様にIFNγの産生が認められなくなることが分かった。
【００７３】
図７に各種系統マウスより得られた脾細胞のNK活性を示す。
C.B-17-scidマウスと比較して、NOD/Shi-scidマウスではNK活性の減退が認められたが、NOGマウスとNOD/LtSz-scid, β2m null マウスではNK活性は全く認められなかった。
【００７４】
以上のことから、NOGマウスおよびNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスでは、NK活性が全く消失していることが明らかとなった。しかし、FACS解析の結果から、NOGマウスではNK細胞が消失しているが、NOD/LtSz-scid, β2m null マウスではNK細胞は存在するが、NK活性が消失していることが明らかとなった。
【００７５】
また、NOGマウスで認められる脾細胞サイトカイン産生の減退には樹状細胞の機能不全が原因であることが明らかとなった。一方で、NOD/LtSz-scid, β2m nullマウスでは、そのFACSおよびサイトカイン産生パターンは抗アシアロGM1抗体処置NOD/Shi-scidマウスとほぼ同等であることが示唆され、このマウスではNK細胞が消失しており、樹状細胞は正常であることが明らかであった。
【００７６】
実施例３ NOGマウスを用いたヒト幹細胞の継代移植
遺伝子導入ヒト幹細胞の自己複製能を検討するためにNOGマウスに臍帯血幹細胞を移植し、２次、３次移植の不可を検討した。
【００７７】
妊婦の同意と承諾の上で臍帯血を得て実験に使用した。臍帯血からCD34陽性細胞をFicoll-Hypaque (Lymphoprep, 1.077±0.001 g/ml; Nycomed, Oslo, Norway)を用いて単核細胞を分離後CD34陽性細胞分離カラム(MACS, Miltenyi Biotec, Glodbach, Germany)を用いて純化した。CD34陽性細胞の純度は96±3％であった。
【００７８】
レンチウィルスベクターpCS-CGはCMPプロモーターによりGFP遺伝子が発現するベクターであり、三好博士（筑波大学医学部免疫学）より供与された。TPO、SCF、Flk-2/Flt-3リガンド(FL)をそれぞれ50ng/mL含む無血清培地StemPro TM-34SFM(Gibco BRL)にて臍帯血CD34陽性細胞を24時間培養後、組み換えレンチウィルスCS-CGをMOI30で5時間感染させた（Kawada H et al., Exp. Hematol. 27:904-915, 1999）。その後細胞を洗浄し、マウス骨髄ストローマ細胞HESS-5存在下に同様の無血清培地中で5日間体外増幅培養を行った(Oki M et al., Exp. Hematol. Inpress. 2001)。
【００７９】
7週齢のNOD/Shi-scidマウスに3Gy照射後、3×105個の培養により増幅させた遺伝子導入細胞を尾静脈より移入した。6週後にマウス骨髄細胞の表面抗原を解析し、1×107細胞を照射NOGマウスに移植した（２次移植）。6週後に同様の解析をおこない1×107細胞を照射NOGマウスに移植した（３次移植）。さらに、6週後に同様の解析を行った。
【００８０】
表面抗原の解析はFACSCalibur (Becton Dickinson)を用いて行った。使用した抗体はFITC標識抗ヒトCD45 (T-200)、PE標識抗ヒトCD2(39C1.5)、CD3(UCHT1)、CD4(SK3)、CD14(LeuM3)、CD19(4G7)、CD20(2H7)、CD33(WM53)、CD41(P2)、CD56(N901)およびグリコフォリン(glycophorin A)(KC16)であり、いずれもBecton Dickinsonより購入した。
【００８１】
CD34陽性細胞への遺伝子導入効率は40±5％(n=5)であった。１次、２次、３次移植マウス骨髄細胞をヒトCD45で染色したFACSの結果を図８に示す。いずれのマウスにも遺伝子導入ヒト細胞の存在が認められる。
【００８２】
本発明のNOGマウスを宿主として利用することにより世界で初めて３次宿主まで移植可能な造血幹細胞に発現可能な遺伝子導入に成功した。従来のNOD-scidマウスを利用した場合には２次移植までしか可能ではなかった点(Guenechea G et al., Nature Immunol, 2, 75-82, 2001)より、本マウスは造血幹細胞のアッセイ系としてより感度が高く有用であることが示された。
【００８３】
実施例４ NOGマウスによる完全ヒト型抗体の産生
NOGマウス（8週齢）は2.5Gy、NOD/Shi-scidマウス（8週齢）は3.5Gyの照射をした後、ヒト臍帯血（妊婦の同意と承諾の上で、東海大学細胞移植研究センターより供与）よりマグネットビーズで精製したCD34+細胞〜1×106を静脈内に移植した。具体的には、臍帯血よりMNCをFicollを用いて分離した後、CD34+細胞をMACS immunomagnetic separation system (Miltenyl Biotec, Glodach, Germany)により単離した。CD34+細胞はFACSにより97%以上の純度であることを確認した後、移植に用いた。
【００８４】
経時的に眼窩採血し、MNC分画をFicollにより得た後、蛍光標識したCD45、CD19、CD3抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色し、ヒトリンパ球の再構成をCD45により、B細胞、T細胞の割合をそれぞれ蛍光標識したCD19、CD3により、FACSで確認した。
【００８５】
また、これらのマウスより胸腺、脾臓を摘出し、細胞を調製した後、細胞数を計測し、各種蛍光抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）で染色して、上記の再構成確認と同様、FACSにより解析した。
【００８６】
これらのマウスに、移植後6週ないし8週から抗原を投与した。抗原としてはDNP-KLHを用いた。100μg/匹のDNP-KLHを水酸化アルミニュウム（ALUM）をアジュバントとして腹腔内に免疫した。2週間ごとに同様の免疫を行い、血清を採取してELISAにより抗体価を測定した。
この際の、ELISAは以下のようにして行った。
【００８７】
96wellプレートを、抗ヒトIGs(ICN, Aurora, Ohio)またはDNP-KLHでコーティングした後、3％BSAでブロッキングし、洗浄した後、希釈した抗血清を添加した。2時間室温で反応させた後、洗浄し、ビオチン化抗ヒトIgMまたは抗ヒトIgGモノクローナル抗体（Phermingen, San Diego, CA）を添加した。37℃2時間反応させた後、洗浄し、アビジン化パーオキシダーゼを添加し、室温1時間反応させた。プレートを洗浄した後、TMBペルオキシダーゼEIA基質キット溶液(Bio-Rad Laboratories, USA)を添加し、室温30分反応させた後、10%HClで反応停止し、450nmの吸光度を測定した。Ig濃度は標準曲線より算出した。
【００８８】
（１）臍帯血由来CD34+細胞の移植と再構成の効率
NOGマウスの臍帯血幹細胞移植後のヒトCD45+細胞の割合については、4週以降、漸次末梢血ではヒトCD45の割合が減少しつつあるが、12週以降に突然T細胞の増加の割合が高くなり、これに伴ってヒトCD45の割合も増加したものが観察された（表３）。いままでNOD/Shi-scid末梢血においては、このようなT細胞の増加によるCD45+の割合の増加は一度も観察されなかった。このNOGマウスは、14週まで一度もGVHDを発症しなかった。
【００８９】
【表３】
（２） NOGマウスにおけるT細胞分化について
A. 胸腺内 T 細胞分化について
図９A、図９B、図１０Aおよび図１０Bに胸腺内のT細胞分化パターンを示した。図に示すように、このマウスにおいて胸腺内でCD3陽性細胞が分化し、これらの細胞は通常の胸腺あるいはhu/m-RTOCによって検出されたものと同様に、CD4/CD8 DN（Double negative）、DP(Double positive)、SP(Single positive)を含み、移植後11ないし13週ですでにその一部がCD1a-low T細胞にまで成熟していることが示された。胸腺細胞数は1〜2×106と、通常のマウス胸腺細胞数の約1/100であった。この現象は、NOD/Shi-scidにおいても観察されたが、その頻度は著しく低く、8/28(28.6%)であったのに対し、NOGマウスでは、7/7(100%)であった。
【００９１】
B. 末梢の T 細胞について
図１１A、図１１B、図１２A、図１２B、図１３Aおよび図１３Bに、さらに脾臓細胞あるいは末梢血中のT細胞について解析したものを示す。胸腺内でT細胞分化が観察されたマウスにおいて、末梢でもCD3陽性細胞が観察された。これらはCD4/CD8陽性細胞群であり、胸腺内で分化したものを含む可能性が示唆された。
【００９２】
（３） NOGマウスにおけるB細胞分化について
A. B 細胞サブセット分化について
また、図１４Aおよび図１４Bに、骨髄細胞中のB細胞が、CD5を発現する割合について示した。骨髄中では、CD5陽性のいわゆるB1a細胞の分化は亢進しておらず、CD19陽性、IgM陽性の細胞群が優勢であった。また、これらのIgM highの細胞群は、CD20を発現していた。このマウス骨髄でのヒトB細胞の分化については、特に異常は検出されなかった。この現象はNOD/Shi-scidマウスにおけるB細胞分化においても観察されることであり、共通の性質と考えられる。
【００９３】
B. 末梢の B 細胞について
図１３Aおよび図１３Bに、末梢でのB細胞のFACSパターンを示した。B細胞の割合はNOD/Shi-scidと殆ど変わらなかった。しかしながら、脾臓においてはCD5陽性のいわゆるB細胞の亜群であるB1a細胞が優勢であり、骨髄の分化パターンと大きな差が検出された。しかし、IgM陽性CD5陰性の細胞群も20％程度検出されており、B1a細胞のみが検出されているわけではないことが確認された。
【００９４】
（４） NOGマウスにおける抗体産生能について
このマウスに、抗原としてDNP-KLHを投与し、経時的にIgMおよびIgG抗体産生量を測定した。その結果、抗原非特異的IgMおよびIgG抗原特異的IgMが3回の繰返し投与により検出された。T細胞が胸線及び末梢で検出されたにもかかわらず、抗原特異的IgG産生は検出されなかった（図１５A、図１５Bおよび図１５C）。図１５A、図１５Bおよび図１５Cには、骨髄(BM)（図１５B）、末梢血(PBSC)（図１５C）由来CD34+細胞移植マウスの結果も同時に示した。これらでは、特異的IgMおよび特異性と無関係なIgG産生が臍帯血と比較して低い傾向が見られた。
以上の結果より、このマウスは、ヒトT細胞及びB細胞を分化させ、ヒト型抗体産生系に用いるのに有用であることが示された。
【００９５】
実施例５ 新生物増殖系
NOD/Shi-scidマウスおよびNOGマウスおよびBALB/cAJcl-nuマウス（クレアより入手）およびC.B-17/Icr-scidマウス（クレアより入手）を用いた。総てのマウスは5週齢以上のものを用いた。
【００９６】
マウスに移植する細胞として、移植ヒト腫瘍細胞株、LM-2-JCKを用いた。LM-2-JCKは、13歳の女性患者のリンパ芽球リンパ腫から確立し、ヌードマウスへの継代異種移植で維持されている細胞株である。LM-2JCKは、T細胞抗原CD4およびCD5を発現するが、抗体も含め他の細胞抗原を発現しないことが報告されている。
【００９７】
異種移植アッセイのための固形腫瘍はヌードマウスの皮下で12代継代したものを用いた。腫瘍をF-10栄養補足培地（GIBCO BRL）中にハサミを用いて細切後、ピペットで十分分散させた後、ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液を得た。懸濁液中の生細胞の濃度はトリパンブルー（GIBO BRL）染色により算定した。遠心後、腫瘍細胞を1×107および1×106生細胞/mlの濃度で生理食塩水に分散させた。腫瘍細胞分散液をマウスの両脇腹皮下に25ゲージの針を付けた1mLシリンジを用いて0.1mL注入した。腫瘍細胞の注入後、1週間毎に腫瘍の大きさと体重を測定した。1×106を移植し、腫瘍が大きくなった移植後21日目に、マウスを処分して腫瘍の重量およびサイズを測定した。
異なるバックグラウンドのマウスのLM-2-JCKの移植性の違いを表４に記した。
【００９８】
【表４】
1×106の移植では、NOGマウスとNOD/Shi-scidマウスにおいてすべての腫瘍が生着した、一方C.B-17/Icr-scidでの生着率は80%であった。
これらの系統での腫瘍の生着率は1×105移植のとき減少し、とくにC.B-17/Icr-scidではすべてのマウスで腫瘍増殖が観察されなかった。
1×106移植時の腫瘍の増殖曲線を図１６に示した。
【０１００】
NOGマウスの腫瘍増殖は他の2系統に比べ勝っていた。
NOGマウスにおける21日めの平均腫瘍体積は、NOD/Shi-scidマウスとC.B-17/Icr-scidの同日の平均腫瘍体積のそれぞれ2.89倍と3.97倍であり、Student t検定において有意な差がみられた(p<0.001)。
NOD/Shi-scidマウスに生着した腫瘍の21日めの平均体積とC.B-17/Icr-scidに生着した腫瘍の同日の平均体積との間には有意差は認められなかった。
【０１０１】
実施例６ NOGマウスを用いたHIV感染モデル系の確立
NOGマウスを用いたHIV感染モデル系の確立を種々のHIV株を用いて検討した。代表例を以下に示す。
マウスとしては、NOGマウスを用いた。比較のためC.B-17-scidマウスとNOD/Shiマウスの両ミュ−タントマウスの戻し交配により以前作製されたNOD/Shi-scidマウスも用いた。
使用したHIV-1はエイズ脳症の前頭葉組織より分離されDNAクローン化されたマクロファージとT細胞に感染性を有するJRFLウイルスである。さらに、env V3領域をこのJRFLウイルス、gp41の下流にGFP遺伝子を挿入したGFP-HIV-1を用いた。
【０１０２】
（１）ヒト単核球細胞を移植したマウスの（hu-PBL-NOGマウス）の作製
NOGマウスに直接マウス当たり1×107個の実験使用の同意と承諾を得た正常人の末梢血ヒト単核球（peripheral blood lymphocyte(PBL)）を腹腔内接種した。比較にIL-2Rγ鎖が正常なNOD/Shi-scidマウスに同じドナーからのPBLを腹腔内接種した。
【０１０３】
（２）マウスへのHIV-1の感染
PBL接種後6日目にマウスに1,000TCID50のウイルスを腹腔内に接種した。ウイルス感染後2週目にマウスを処分し、腹腔滲出細胞を含む腹水を回収し、その中のヒト細胞数をFACSにて算出した。また、脾臓を摘出し、パラフォルムアルデヒドで固定後パラフィン包埋切片を作製した。
【０１０４】
（３）病理学的解析
脾臓組織切片をHE染色し、さらに、ヒトCD3、CD4、CD8、HIV-1p24抗原に対する抗体を用いて免疫染色を行った。免疫組織染色は、従来報告されているABC法に加え、EPOS法、Envisiont法を用いた。
hu-PBL-NOGマウスにおけるヒト細胞の定着を評価した。
表５に一連の検討の結果を示す。
【０１０５】
【表５】
ヒト末梢血を移植したマウスの脾臓にヒトCD4陽性T細胞ならびにCD8陽性T細胞がそれぞれ脾臓中心動脈周辺に定着されることを見出した。ヒトCD3陽性細胞数は明らかにNOD/Shi-scidマウスよりNOGマウスにおけるヒト細胞数は明らかに多かった。FACSによる測定では腹水中のヒトCD4陽性細胞は平均1×107個以上であった。
【０１０７】
一方、NOD/Shi-scidマウスではCD4陽性細胞はほとんど検出されず、CD8陽性細胞がほとんどであった。前述の実施例においてはNOD/Shi-scidマウスにNK細胞の分化を抑制するマウスIL-2レセプターβ鎖に対する抗体（TMβ-1）（マウス当り0.5mg）をヒトPBLの接種３日前に腹腔に注射したが、本実施例においては行なわなかった。抗体の処理を行なったマウスは多くのCD4ならびにCD8陽性のヒト細胞が定着することを別の実験にて確認している。しかし、この抗体処理を行なったNOD/Shi-scidマウスからのヒト細胞数よりもNOGマウスからのヒト細胞数が3から4倍は明らかに多かった。
【０１０８】
HIV感染マウスにおいてはHIV抗原であるp24陽性細胞が脾動脈周囲に検出された。さらにGFPを発現するHIV感染マウスにおいては明らかにGFP発現細胞が脾臓ならびに腹水中に検出された。ウイルス感染細胞数は明らかにNOD/Shi-scidマウスにおけるそれより多かった。
【０１０９】
実施例７ NOGマウスを用いたHTLV-1感染モデル系の確立
NOGマウスに、HTLV-1白血病由来細胞株であるMT-2細胞をマウスあたり2×107細胞移植した。
移植後4週目に、リンパ腫瘍形成マウスの数を数え（表６）、リンパ腫瘍マウスにHTLV遺伝子が感染しているか否かをサザンブロット法とPCR法にて確認した。プロウイルス数は病理学的検索の結果、明らかに皮膚内リンパ腫と後腹腔内両側性のリンパ腫瘍さらに、腫瘍の大きなマウスは胃周辺リンパ節に転移と胸膜内に癌細胞が浸潤していた。また、末梢血にHTLV陽性細胞が増えていた。このことは、典型的白血病となっていることを示す。さらに、肺間質内にも浸潤しているのが認められた。これらの細胞はすべてTaxタンパク質を発現していた。但し、脳内には浸潤していなかった。
【０１１０】
【表６】
実施例８ 新生物細胞の移入による白血病化およびNOGマウスを用いたHTLV-1陽性細胞などの可移植性の検討
NOGマウスに各種のHTLV-1細胞株の移植、腫瘍形成実験を行い、その有用性について検討した。
【０１１２】
3例のHTLV-1白血病由来細胞株[L=Leukemic cell lines:ED-40515(-), MT-1 and TL-Oml ]、6例のHTLV-1感染細胞株[IT=Infected transformed cell lines:SLB-1, M8116, HUT-102, MT-2, MT-4 and TY9-31MT ] 107-8個/0.5mLをNOGマウスおよびNOD/Shi-scidマウスの左耳介後部皮下に、一部では臀部皮下に移植し、マウス内の腫瘍の大きさ、組織像、白血化の有無を経時的に比較検討し、NFkBなどの転写因子、Taxタンパクの増減との関係についても解析した。
【０１１３】
HTLV-1白血病由来細胞株[L]の全例及び例外的にHTLV-1感染細胞株[IT]のSLB-1は2週間以内に24×17×11mm大の腫瘍を形成したのに対し、ITの6例中5例はせいぜい10×10×7mmにとどまり、M8116やTY9-31MTではほとんど腫瘤を形成しなかった（表７）。
【０１１４】
【表７】
この腫瘍形成性細胞株の例では末梢血中の白血病細胞の出現及び臓器浸潤の度合いは比較的高いが、非腫瘍形成性細胞の例のなかにはそれ以上のものもあり（例えばHUT-102、MT-2など）、腫瘍形成性と末梢血中の白血病細胞の出現及び臓器浸潤の程度とは必ずしも相関しなかった(表８)。
【０１１６】
【表８】
腫瘍形成性のED-40515(-) 107をNOGマウスおよびNOD/Shi-scidマウスの左耳介後部皮下に移植して2週間目の腫瘍形成性を比較したところ、NOGマウスでは22×17×10mm大の腫瘤を形成したのに反し、NOD/Shi-scidではほとんど腫瘤を形成せず、NOGマウスでの易腫瘍形成性が明らかになった(表９)。
【０１１８】
【表９】
NOGマウスでの易腫瘍形成性がT細胞系のみならず、B細胞系でも同様であるかどうかを調べる目的で、EBER(EBV-Encoded Small RNA)およびベクターだけを形質転換したBJAB細胞7×107個をNOGマウスの左耳介後部皮下に移植して3週間目の腫瘍形成性を比較した。BJAB-EBERでは対照であるBJAB-VECTORに比較し、有意に大きな腫瘤を形成した(26×18×7/13×18×3mm)。その大きさは前例のED-40515(-)の場合の腫瘤に匹敵した(表１０)。
【０１２０】
【表１０】
NOGマウスにおけるED-40515(-) 107 による効率的な腫瘤形成性は腫瘍細胞のCXCR4を介する、腫瘍血管の活発な新生によるものであれば、内皮細胞にあるそのリガンドであるSDF-1の競合剤(competitive agent)であるKRH-1636を持続投与しておけば、腫瘤形成が抑制されることが期待された。しかしED-40515(-)及び出血を伴う（組織学的にはアンジオトロピック(angiotropic)な）SLB-1の場合、KRH-1636を毎日腹腔内投与したに関わらず、非投与群と変わらない25×18×12mm及び20×10×18mmの大きさの腫瘤を形成した(表１１)。
【０１２２】
【表１１】
ED-40515(-)及びSLB-1のin vitroの培養細胞のサイトスピン標本と、in vivoの腫瘤形成細胞の凍結切片標本を用いて、酵素抗体法によるCD4、CD8、CD3、CXCR4、CCR5、SDF-1免疫染色の態度を比較検討した。CD4、CD3、CXCR4、SDF-1ではいずれもほぼ同様に陽性で、CCR5はいずれも陰性だった。CD8はin vitroでは陰性であったが、in vivoでは陽性であった(表１２)。
【０１２４】
【表１２】
ED-40515(-)のin vitroの培養細胞とin vivoの腫瘤形成細胞を用いて、Tax、CXCR4、OX40、OX40Lのウエスタンブロット分析をおこなった。Taxはいずれも陰性であったが、CXCR4、OX40、OX40Lはいずれも陽性であり、その強さに有意の差はみとめられなかった(表１３)。
【０１２６】
【表１３】
ED-40515(-)のin vitroの培養細胞とin vivoの腫瘤形成細胞を用いてNFkBの転写因子活性を電気泳動移動度シフトアッセイ（electrophoretic mobility shift assay(EMSA)）で検討したが、両者に差をみとめなかった（表１４）。
【０１２８】
【表１４】
NOGマウスの耳介後部皮下に移植する系において、以下の事項が認められた。
1）NOGマウスでは、接種後15日という、今まで考えられなかった極めて短期間内に大きな腫瘤形成を確実に確認できた。それに反しNOD/Shi-scidマウス（IL-2Rγchain+/+）では全く腫瘤を形成しなかった。
2）NOGマウスでは、遺伝的にNK細胞が欠損することが明らかにされており、したがって、C.B-17/Icr-scidやNOD/Shi-scidマウス（IL-2Rγchain+/+）の場合に必須とされる抗NK細胞に対するモノクローナル抗体などの前処置を必要としなかった。
3)耳介後部皮下に移植することにより、すなわち腹腔内よりも解剖学的にもNK細胞がさらに少ないとされる部位を選択したことになり、腫瘤の形成を容易にするとともに、その結果、切開するまでもなく外観より腫瘍の大きさを容易に確認できた。
4)内山ら（Imada K, Takaori-Kondo A, Akagi T, Shimotohno K, Sugamura K, Hattori T, Yamabe H, Okuma M, Uchiyama T: Tumorigenicity of human T-cell leukemia virus type I-infected cell lines in severe combined immunodeficient mice and characterization of the cells proliferating in vivo. Blood86:2350-7., 1995, Uchiyama,T: Human T cell leukemia virus type I (HTLV-I) and human diseases. Annu Rev Immunol 15:15-37, 1997）が腫瘤形成しないとしたMT-1、T-2、TL-Omlでもそれほど大きくはないものの腫瘤を形成した。
【０１３０】
従ってNOGマウスの耳介後部皮下に移植する系は画期的な腫瘍移植系であり、さらにT 細胞系腫瘍のみならずB細胞腫瘍でも同様であることが明らかになった。すなわち、この系ががん細胞やヒト正常リンパ組織の移植にとっても有用な移植系であることを示している。
【０１３１】
さらに実験動物モデルのない、あるいはあっても実用に供するのに困難な場合、このNOGマウスにヒトの細胞、組織を移植してヒト疾患モデルを構築することにより、in vitroの実験にのみ頼らざるを得なかった疾患の研究を、よりヒトのin vivoに限りなく肉迫した実験系で実験できることになり、疾患の成立機序の解明、治療法の開発等にこのマウスは多大な貢献をすると考えられる。例えばHIV-1感染では強力なHAART療法に関わらず、ウイルス血症（viremia）のリバウンド（rebound）や変異ウイルス出現が最重要課題であり、その感染性ウイルスのリザーバー（reservoir）はリンパ濾胞のFDC(follicular dendritic cells、濾胞樹状細胞)とされており、この研究のためには、ヒトリンパ濾胞を含むリンパ組織の移植をしたヒト型モデルマウスを構築することが不可欠であり、それにはこのNOGマウスが有用である。
【０１３２】
さらに、この系の易腫瘍形成性の要因について、in vitro における培養細胞と比して、移植された細胞ではどんな因子が増加、あるいは活性化されているかを検討した。今回使用した細胞株はすべてIL-2非依存性であり、IL-2産生性、さらにTax、CXCR4-SDF-1系は直接関係していないことがあきらかになった。しかしそのほかの因子については検索した限りin vitroの培養細胞とin vivoの腫瘤構成細胞との比較で有意の差を認めるものはなかった。
【０１３３】
【発明の効果】
本発明により、従来免疫不全マウスとして知られていたNOD/Shi-scidマウスやNOD/LtSz-scid, β2m nullマウスに比較して、異種細胞、特にヒトの細胞の生着に適したNOGマウスの作出方法、および該方法により作出されるマウスが提供される。このようにして得られたマウスにヒト幹細胞を移植することによりヒト幹細胞アッセイ系を確立することができる。また、ヒトの免疫担当細胞を移植することにより、本発明のマウスを用いてヒト抗体を作成することができる。さらに、ヒト腫瘍を移植・生着させることによりヒト腫瘍モデルマウスを作出することができ、腫瘍の治療方法、治療剤のスクリーニング等に利用することができる。さらにまた、HIVまたはHTLV1に感染したヒトリンパ球が生着したHIVまたはHTLV-1感染モデルマウスを作出することができHIV-1、HTLV-1等のin vivoにおける増殖機構の研究を行うことができ、またウイルス感染治療法の開発、ウイルス感染治療剤のスクリーニング等を行うことができる。
【０１３４】
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
Claims (22)
- 以下のＡのマウスにＢのマウスを戻し交配することを特徴とする、機能的な T 細胞および B 細胞を共に欠失し、マクロファージ機能が減退し、 NK 細胞または NK 活性を消失し、かつ樹状細胞機能が減退しており、優れた異種細胞生着性を有していることを特徴とする、 NOG （ NOD/Shi-scid, IL-2R γ KO ）マウスの作出方法；
Ａ：NOD/ShiマウスにC.B-17-scidマウスを戻し交配することにより得られるマウス、
Ｂ：インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウス。 - 請求項１記載の作出方法により作出された、機能的なT細胞およびB細胞を共に欠失し、マクロファージ機能が減退し、NK細胞またはNK活性を消失し、かつ樹状細胞機能が減退しており、優れた異種細胞生着性を有していることを特徴とする、NOG（NOD/Shi-scid, IL-2Rγ KO）マウス。
- 移植したヒト幹細胞が、排除されることなく効率よく分化、増殖する請求項２記載のマウス。
- 請求項２または３記載のマウスにヒト幹細胞を移植し、分化・増殖する細胞を解析することを含む、幹細胞アッセイ方法。
- T細胞およびB細胞の分化・増殖を解析する、請求項４記載の幹細胞アッセイ方法。
- 請求項２または３記載のマウスにヒト幹細胞を移植し増殖させた後に、該マウスの骨髄からヒト幹細胞を回収しさらに、請求項２または３記載のマウスに移植することを繰り返し行うことを含むヒト幹細胞を増殖させる方法。
- 繰り返しが少なくとも３回である請求項６記載のヒト幹細胞を増殖させる方法。
- ヒト幹細胞が外来遺伝子を導入したものである、請求項６または７記載の方法。
- ヒトT細胞およびB細胞を安定に保持し、ヒト抗体を産生することが可能な、請求項２または３記載のマウス。
- ヒトT細胞およびB細胞を保持する、請求項２または３記載のマウスを抗原で免疫することを含む、ヒト抗体の産生方法。
- ヒトT細胞およびB細胞を保持する、請求項２または３記載のマウスを抗原で免疫した後に該マウスから該抗原に対する抗体産生細胞を回収し、株化することを含む、ヒト抗体を産生する抗体産生細胞株を製造する方法。
- ヒト腫瘍細胞を保持した請求項２または３記載のマウスである、ヒト腫瘍モデルマウス。
- ヒト腫瘍細胞がHTLV-1白血病由来細胞である、請求項１２記載のヒト腫瘍モデルマウス。
- ヒト腫瘍細胞を耳介に保持した、請求項１２または１３記載のヒト腫瘍モデルマウス。
- 請求項１２〜１４のいずれか１項記載のマウスを用いて抗癌剤をスクリーニングする方法。
- 請求項２または３記載のマウスにヒト腫瘍細胞を移植することを含む、ヒト腫瘍モデルマウスを作出する方法。
- ヒト腫瘍細胞がHTLV-1白血病由来細胞である、請求項１６記載の方法。
- ヒト腫瘍細胞をマウスの耳介に移植する、請求項１６または１７記載の方法。
- マクロファージトロピックなウイルスばかりでなく、Tトロピック(T 細胞親和性)なウイルスに感染したT細胞を保持した請求項２または３記載のマウスである、ウイルス感染モデルマウス。
- ウイルスがHIVである、請求項１９記載のウイルス感染モデルマウス。
- ウイルスがHTLV-1である、請求項１９記載のウイルス感染モデルマウス。
- 請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のマウスを用いて抗ウイルス剤をスクリーニングする方法。
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