JPH10504454A

JPH10504454A - キメラ免疫無防備状態動物における長期間異種骨髄性およびリンパ性細胞生産

Info

Publication number: JPH10504454A
Application number: JP8507022A
Authority: JP
Inventors: チェン，ベンジャミン・ピー; フレイザー，クリストファー・シー
Original assignee: サンド・リミテッド; システミックス・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-08-12
Filing date: 1995-08-11
Publication date: 1998-05-06
Also published as: CA2192790A1; US6455756B1; EP0782386A1; WO1996004785A1; AU3383295A

Abstract

(57)【要約】免疫無防備状態哺乳動物宿主にヒト胎児骨および脾臓の組み合わせを皮下移植する。このキメラ動物は、同種ヒト胎児胸腺フラグメントを同一部位に与えた場合、ヒトＢ−細胞、骨髄性細胞、およびＴ−細胞をインビボで９カ月間まで生産できる。移植片は、ＣＤ４およびＣＤ８、ＣＤ１９またはＣＤ３３、ＣＤ１４およびＣＤ１５を発現する細胞集団を含み、これらは全て、胎児骨／脾臓のＨＬＡ型もまた発現する。胎児骨／脾臓において前駆細胞から誘導されたＴ−細胞は、成熟単一陽性ＣＤ４⁺ＣＤ８^-、ＣＤ８⁺ＣＤ４^-の両方と、高いパーセンテージの未熟二重陽性ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺集団を含む。

Description

【発明の詳細な説明】キメラ免疫無防備状態動物における長期間異種骨髄性およびリンパ性細胞生産序説技術分野本発明の分野は、骨髄性およびリンパ性細胞の長期間再構築可能な異種組織を含む免疫無防備状態哺乳動物である。背景造血は、分化および増幅の連続過程であり、正常ヒトにおいて毎日何１０億ものリンパ性細胞および骨髄性細胞が置き換わっている。この過程は、自己維持、大量増殖、および多能性の能力を有する造血幹細胞の継続交代に依存している。これらの特徴は、特に、連続骨髄移植、および染色体再編成またはレトロウイルスを用いる遺伝子マーキングの使用によってネズミ系で非常に詳細に研究されている。ヒト造血幹細胞を用いた同様の研究は遅れており、主に、長期間多能性分化に相当するモデルがないことが原因である。科学者らは、最近、免疫不全マウスにおいてヒト造血前駆体細胞の移植および分化を立証するのに成功した。特に、興味深いのは、組織についての研究、薬剤および組織環境の変化に対する応答を研究するためのかかるマウスの使用である。ヒト組織の様々な態様が、このようなキメラ動物を用いて、模擬天然環境において研究できる。ヒト細胞または組織を免疫無防備状態マウスに移植し、ヒト造血を長期間観察することにより、ヒト造血発生における最初の事象を理解する点で顕著な進展があった。しかしながら、従来技術システムはそれぞれ、共通の幹細胞プールから同時に生じるヒト成熟Ｔ細胞、成熟Ｂ細胞、および骨髄性細胞生産を研究するその能力において限界がある。ヒト胎児胸腺および肝臓の移植組織は、骨髄性細胞およびＢ細胞が発生する度合に限定される。それゆえに、骨髄性細胞並びに造血システムのＢ−およびＴ−系列双方の長期間再構築可能なキメラ動物の開発は興味深い。関連文献ＳＣＩＤ−huマウスの記載は、Ｊ.Ｍ.ＭcＣune等（1988）Science241:1632-16 39；Ｒ.Ｎamikawa等（1990）J.Exp.Med．172：1055-1063およびＪ.Ｍ.ＭcＣune 等（1991）Ann.Rev.Immunol.9：395-429に見ることができる。機能性骨髄の移植は、Ｓ.Ｋyoizumi等（1992）Blood 79：1704に記載されている。ヨーロッパ特許出願第469 632号は、胸腺−肝臓移植組織を有する免疫無防備状態哺乳動物の使用を開示している。ＳＣＩＤマウスに移植された未成熟ヒト細胞由来の多系列造血のサイトカイン刺激について、Ｔ.Ｌapidot等（1992）Ｓcience 255：1137；J．Nolta等（1994 ）Blood 83：3041およびＳ.Ｋyoizumi等（1993）Blood 81：1479−1488に記載されている。かかるマウスにおける未成熟臍帯血前駆細胞の増殖および移植は、更に、Ｊ.Ｖormeer等（1994）Blood 83：2489に論じられている。免疫無防備状態マウス株は、Ｓ.Ｎonoyama等（1993）J.Immunol １５０：3817 −3824；Ｉ.Ｇerling等（1994）Diabetes 43：433−440；Ｂosma等（1983）Natu re 301：52；およびＰ.Ｍombaerts等（1992）Cell 68：869-877に記載されている。発明の概要骨髄、脾臓、および所望により胸腺組織を含む異種個体機能性血液リンパ性組織を含んでなる免疫無防備状態宿主を提供する。この組織は、Ｂ−系列リンパ球、Ｔ−系列リンパ球、および骨髄性細胞を生産できるハイブリッド器官構造を形成するようになる。特定の実施態様の記載免疫無防備状態異種哺乳動物宿主、特にマウスにおいて、多数の系列を有するヒト造血細胞を長期間生産する方法および組成物を提供する。この方法は、骨および脾臓フラグメントを分散させないで並置状態で、所望により胸腺フラグメントとさもに、免疫無防備状態宿主の適切な部位で合わせることを含む。このキメラ動物は、実験設定のヒト造血および病原論の研究に有用である。ヒト骨と脾臓組織の同時移植は、胸腺移植組織がなくても、ＣＤ１４およびＣＤ１５の発現により証明される顆粒球；単球；およびＣＤ１９およびＣＤ２０の発現により証明されるＢ系列細胞を含む、ＣＤ３３の発現により証明される骨髄系細胞へと成熟できる造血前駆細胞の増殖を支えるのに十分である。骨髄性細胞には、好中球、単球、およびマクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞、およびそれらの前駆細胞があり得る。幾つかのＴ細胞サブセットもまた、ＣＤ４の発現により示されるように、骨および脾臓移植組織中に存在する。しかしながら、全てのＴ細胞サブセット、特に、ＣＤ８を発現するものを与えるＴ細胞前駆細胞の成熟には、分化に必要な間質細胞および上皮細胞を提供する同時移植の胸腺の存在が必要である。胸腺組織が存在すると、骨／脾臓同時移植組織由来の前駆細胞のサブセットは、ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺、ＣＤ４⁺ＣＤ８^-、およびＣＤ４^-ＣＤ８⁺サブセットを含むＴ細胞へと分化できる。宿主動物に脾臓および骨の両方を移植する場合、普通、組織移植片が造血前駆細胞の連続供給源を提供するために近接している。脾臓組織は、増殖ヒト胎児骨および胸腺を部分的または全体的に囲むように増幅して、ハイブリッド組織を形成するようであり、これが骨髄性細胞、Ｂ−細胞および他のリンパ性前駆細胞の連続供給源を提供する。Ｔ細胞の成熟のためには、ヒト胸腺も、骨および脾臓組織と近接、普通は接触させて、移植する。胸腺組織は、脾臓および骨由来の異なるＨＬＡアロタイプを有することもある。ＨＬＡの相異は、成熟Ｔ−細胞が脾臓／骨移植片に存在する幹細胞から誘導されることを示している。このような動物は、胸腺の間質および上皮成分、または造血前駆細胞のＴ−細胞成熟への貢献度を測定するのに有用である。骨、胸腺、および脾臓（ＢＴＳ）を含むハイブリッド器官は、血管形成されており、宿主内で長期間生存できる。ハイブリッド組織は、少なくとも約３週後、より普通には少なくとも６週後に使用することもあるが、このハイブリッド組織は、少なくとも約９カ月以上、機能性を保持する。適切な移植部位は、移植される組織のサイズを調整でき、かつ移植される組織を近接状態で維持できるものでなければならない。特に対象となるのは、皮下移植である。宿主体内の皮下移植組織の位置は重要ではないが、哺乳類の脂肪パッド領域が使用に便利である場合がある。組織は、好便には、宿主皮膚の切開およびトロカール等での置換により、移植される。ＢＴＳ組織移植体は、宿主に移植された他の組織の内のたった１つであることもある。例えば、ＢＴＳ移植組織の外に、その他の造血構成要素には、幹細胞、リンパ節、胚性卵黄嚢、胎児肝臓、膵臓組織、垂組織、扁桃組織、および同等物があり、これらは、様々な目的で、免疫無防備状態宿主における造血システムの発生に役立ち得るものである。更なる組織の導入部位には、脾嚢下、腹壁筋、腎嚢下、眼中、腹膜、腹膜内層、脳、皮下、血管系、脊髄、膜嚢または様々な組織の嚢、腹膜後方空間、生殖器官、等がある。第二組織の導入は、注射、移植、またはドナーおよび宿主の血管（および必要ならば他の管）の結合、静脈内カテーテル、トロカール、および／または外科的切開術の使用、その他により、達成できる。対象となる組織または細胞は、一般に、正常のもの、例えば、形質転換されておらず、悪性でない組織または細胞である。様々な器官で、器官組織自身を伴う天然周辺組織を含むこともある。周辺組織は、結合組織、または血管およびリンパ管の部分からなることができる。ある場合では、器官移植片全体を、ドナーおよび宿主血管、リンパ管、および同等物を吻合術によって結合させることにより、移植することもできる。多くの場合、正常細胞、組織、および／または器官は、安定に維持され、少なくとも約３− ６カ月、およびしばしば少なくとも約１０カ月の間、機能的な状態である。好適なものとして、分散させた細胞を採用することもでき、その場合、等価な器官をばらばらに細かく切り取って、生存能力のある細胞を懸濁状態で得る。第二移植組織として、特に対象となる細胞は、ヒト造血細胞、特に、初回抗原刺激を受けた前駆細胞および幹細胞である。この前駆細胞は、細胞を分化するためのマーカーを提供するために、ＨＬＡ型に関してハイブリッド組織と不適合であり得る。前駆細胞は、移植の前後に骨髄腔に注射でき、得られた系列の能力範囲を分析できる。骨の内生造血細胞の除去、例えば、放射線照射は、移植した細胞の頻度を改善するのに望ましいこともある。多系列幹細胞アッセイは、この方法で実施できる。特定の前駆細胞型から発生できる系列の能力範囲、およびこれらの細胞の様々な処置、例えば、成長因子、サイトカイン、突然変異誘発物質、等への曝露、の影響を測定する。懸濁状態の細胞の混合集団を、対象となる特定細胞について豊富化させることができる。例えば、骨髄細胞の場合、懸濁液を、Ficoll-hypaque密度勾配遠心分離、蛍光活性化細胞分類、パンニング(panning)、磁気ビーズ分離、遠心場内でのエルトリエーションにより、造血前駆体について豊富化させることができる。ある場合では、他の細胞を殺すかまたは除去することにより細胞を豊富化させることが望ましい場合もある。これは、補体の存在下、または毒素、例えば、リシン、アブリン、ジフテリア毒素などの細胞毒性剤、または放射性標識、例えば、¹³¹Ｉまたは同等物に結合させた望ましくない細胞に特異的なモノクローナル抗体を採用することにより、達成され得る。イムノアフィニティーカラムを採用することもあり、混合物の性質によって、所望のまたは望ましくない細胞のいずれかを特異的に分離することができる。ヒト胎児組織、ＢＴＳまたは更なる移植組織は、死後約４８時間以内に得られる新鮮組織、または死後約１２時間以内に凍結させ、約−１０℃以下、通常、およそ液体窒素温度（−７０℃）に維持した新鮮凍結組織であり得る。この組織は、キメラ宿主に移植された器官に由来するものであってもよく、その場合、組織を移植後、２−４週間またはそれ以上で摘出することができる。この方法では、元々宿主源から得られた組織を大きく拡張させることができ、得られ得るキメラ宿主の総数が実質的に増大する。キメラ宿主から得られた組織は、ヒト源から得られた組織と類似的に扱うことができる。通常、この組織は長期間のインビトロ培養を必要としないものである。胸腺および脾臓組織は、器官全体の一部として提供され、通常存在する間質細胞および内皮細胞などを含む。移植組織のサイズは、一般に、約０.５から４mm 、普通は、約１から２mmであるので、その切片は、移植用に使用するトロカール、普通、好適には約１５ないし２０ゲージ、に容易に適合し得る。骨髄は、胎児または成人のものであることができ、好ましくは胎児のものである。脛骨、大腿骨、上腕骨、その他などの長骨を採用する。骨は、一般に、少なくとも長さ約０ .５cmであり、宿主のサイズによって変わるが、長さ２cmまたはそれ以上であることもある。マウス宿主の場合、１cmが好適なサイズであることが分かっている。骨は縦軸に沿って切断することができるので、骨皮質や髄質内領域も露出させて血管新生させることができ、または、横断して、管状薄片を得ることもできる。多くの場合、ドナー組織は、ヒトであるが、宿主動物として同一ファミリーの構成員以外の供給源由来の細胞が使用されることもある。組織の供給源は、普通、胎児である。好ましくは、組織は、約３歳以下、好ましくは約１歳以下の幼児、および新生児、またはそれ以下由来のものであり、より好ましくは約７から２４週の胎児組織である。ある場合では、成人ヒト骨を管状薄片またはチップとして移植することもできる。異なる器官の場合、異なる年齢の組織が好ましいこともある。胎児組織では、ヒトリンパが約２０妊娠週(g.w.)、好ましくは２０−２４g.w.に等しいかまたはそれ以上、ヒト胸腺および肝臓の場合、約１６−２４g.w.、好ましくは１８g.w. 以上であることが望ましい。胎児骨および脾臓の場合、胎児は、一般に、約１６から２４g.w.である。移植に適し、かつ所望の免疫無能性を有する免疫無防備状態哺乳動物宿主は、存在するか、または創製できる。重要な要因は、免疫無防備状態宿主が、本来的にまたは導入した器官と関連して、異種個体組織または細胞に対する免疫応答を開始する能力がないということである。それ故に、宿主が免疫無防備状態であることが重要なのではなく、宿主が、移植後に機能性同系宿主Ｂ−細胞、特に、形質細胞、および／またはＴ−細胞、特に、ＣＤ４⁺および／またはＣＤ８⁺Ｔ−細胞を産生する能力がないことによって証明されるような、移植後免疫応答を開始することができないことが重要である。特に、対象となるのは、小動物、例えば、ウサギ、アレチネズミ、ハムスター、モルモット等、特に、ネズミ類、例えば、マウスおよびラットであり、これらは、免疫グロブリンおよびＴ細胞抗原受容体をコードする遺伝子座での生殖系列ＤＮＡ再編成を受ける能力を無くす、遺伝子欠損により、免疫無防備状態にされる。目下のところ利用可能な宿主には、トランスジェニック破壊（disruption）によりＲＡＧ−１および／またはＲＡＧ−２に関連する組換え酵素機能（例えば、市販されているＴＩＭ^TMＲＡＧ−２トランスジェニック）を欠く、Ｉ型および／またはII型ＭＨＣ抗原（例えば、市販されているＣＩＤおよびＣ２Ｄトランスジェニック）を欠く、またはＢcl−２癌原遺伝子の発現を欠くように遺伝子的に操作したマウスがある。特に対象となるのは、scid遺伝子座でホモ接合性変異（ho mozygous mutation）を有するマウスであり、機能的に再結合した免疫グロブリンとＴ−細胞受容体遺伝子を欠くことにより明示される深刻な複合免疫不全を生じる。scid/scid変異は、入手可能であるか、または多くの様々な遺伝子的バックグラウンド、例えばＣＢ.１７、ＩＣＲ（異系交配）、Ｃ３Ｈ、ＢＡＬＢ/c、Ｃ５７Ｂ１/６、ＡＫＲ、ＢＡ、Ｂ１０、１２９等、の中にある。受容個体として有用なその他のマウスは、ＮＯＤ scid/scid；ＳＧＢ scid/scid，bh/bh；ＣＢ.１７ scid/hr；ＮＩＨ−３ bg/nu/xidおよびＭＥＴＡ nu/nuである。ＣＤ３e 遺伝子におけるホモ接合性破壊により機能性Ｔ細胞を欠くトランスジェニックマウス、ラット、およびブタが入手可能である。免疫無防備状態ラットには、Ｈsd Ｈan：ＲＮＵ-rnu；ＨsdＨan：ＲＮＵ-rnu/＋；ＨsdＨan：ＮＺＮＵ-rnu;ＨsdＨ an：ＮＺＮＵ-rnu/＋；ＬＥＷ/ＨanＨsd-rnu；ＬＥＷ/ＨanＨsd-rnu/＋;ＷＡＧ/ ＨanＨsd-rnuおよびＷＡＧ/ＨanＨsd-rnu/＋がある。ＮＯＤ（非肥満性糖尿病）バックグラウンドを有するscid/scidマウスの有用性は、インシュリン依存性糖尿病の発症におけるヒトＴ細胞の影響を研究する機会を与えることである。宿主動物における免疫機能の更なる損失は、異種個体組織の移植前、移植中、または移植後に内生マクロファージの数を低減することにより、達成することもできる。特に対象となるのは、同時継続出願番号第０８/１６９,２９３号に記載のように、リポソーム中に封入したジクロロメチレンジホスホネート（Ｃl₂ＭＤＰ）の投与によるマクロファージの縮小である。宿主マクロファージの除去により、非自己造血細胞の宿主動物循環における生存能力が向上する。宿主は、普通、免疫適格宿主の正常寿命の約２５％以下、普通は正常寿命の約１ないし２０％の年齢のものである。一般に、宿主は、少なくとも約６週齢であり、所望の部位でドナー組織の導入操作を行うのに十分に大きい。例えば、マウスは、普通、約６ないし１０週齢で使用する。宿主内での組織の生育は、器官によって変わる。哺乳動物宿主は、適宜生育させる。哺乳動物宿主の免疫無防備状態の程度によって変わるが、様々な程度で感染から保護され得る。無菌環境が必要である。肺炎感染から保護するための予防的抗生作用は、scid/scidマウスの場合、トリメトプリム２５−７５mgおよびサルファメトキサゾール１００−３００mgを、５ml の懸濁状態で各週３日与えるか、または含浸食ペレット状態で用いて達成できる。あるいは、帝王誘導（cesarean derivation）後、ノトバイオティック環境において他の動物から強力な宿主を単離しても十分であり得る。キメラ宿主の摂食および維持管理は、大部分ノトバイオティック技術に従うものである。免疫無防備状態宿主における外来組織の存在は、生存宿主中のヒト細胞の生育、生存能、分化、成熟、形質転換、またはその他に対する様々な化合物の影響を研究するのに使用され得る。キメラ宿主を用いて、疾病の兆候または適応に対する条件変化の影響を研究することもできる。条件により、物理的、化学的、または生物学的特性、例えば、温度、電位、イオン強度、薬剤類、形質転換等を定める。特に対象となるのは、疾病の誘導または進行に対する様々な感染要因の病原性および／または様々な薬剤または処置の影響の研究である。対象の感染要因には、ニューモコッカス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、メニンゴコッカス、ゴノコッカス、エシェリヒア、クレブシエラ、プロテウス、シュードモナス、サルモネラ、シゲラ、ヘモフィラス、イェルシニア、リステリア、コリネバクテリウム、ビブリオ、クロストリジア、クラミジア、マイコバクテリア、ヘリコバクター、およびトレポネマなどの細菌、原生動物病原体、およびウイルスがある。対象となるウイルスには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）；腸管系ウイルス、例えば、コクサッキー、エコウイルス、レオウィルス；呼吸器系ウイルス、例えば、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザウイルス；ラブドウイルス；ルベオラ；ポックスウイルス；ヘルペスウイルス；ＥＢＶ；パラミクソウイルス（麻疹）、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型肝炎ウイルス、水痘帯状ヘルペスウイルス（水痘）およびサイトメガロウイルスがある。特に対象となるのは、ヒト細胞に感染するかまたは疾病を引き起こすヒト熱帯性ウイルスであり、これらの多くは、在来の動物モデルでは容易に研究できない。一般に、ヒト熱帯性ウイルスは、主に、ヒト細胞において、増殖性感染、即ち、ウイルス複製および新たな感染粒子の放出を生じる感染を引き起こす。このウイルスは、近親霊長類種の細胞に感染できるが、普通は、例えば麻疹ウイルスのようなヒトに見られる疾病兆候を引き起こさない。このようなヒト細胞に対するウイルス親和性の理由は、ウイルスが細胞内に入り込むのに必要な特定細胞表面抗原に対するウイルスの特異的結合によるものであり得る。この特異性の例には、ＨＩＶ−１のヒトＣＤ４への結合、単純ヘルペス１のヒト繊維芽細胞増殖因子受容体への結合、麻疹ウイルスのヒトＣＤ４６への結合がある。その他のウイルスは、複製サイクルを完了するためにヒト細胞の細胞質成分を必要とする場合がある。ヒト熱帯性ウイルスには、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２；ヒトヘルペスウイルス：ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状ヘルペスウイルス、エプスタイン− バーウイルス、ヒトＢ−細胞リンパ熱帯性（lymphotropic）ウイルス、およびヒトサイトメガロウイルス；痘瘡ウイルス；麻疹ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスがある。ウイルスは野性型、例えば、臨床単離物、在来株等；弱毒株であってもよく、または、感染性、病原性等を増大または低減するために遺伝子的に操作してもよい。このようなウイルスゲノムの修飾には、毒性遺伝子の欠失、宿主範囲を変化させるウイルス外皮タンパク質の変異、ウイルス核酸ポリメラーゼの変化、ウイルスゲノムの宿主ゲノムへの組み込みに影響するタンパク質の変化、等がある。ウイルスゲノムに導入される変異は、ウイルスタンパク質の機能を位置付け（ma p）し、どのドメインが様々な感染態様、即ち、潜伏期の確立、細胞の形質転換、ウイルス複製、等を担うかを測定するために有用である。ヒト細胞に対する感染の影響を研究するために、“ＢＴＳ”移植組織に感染レベルのウイルスを接種する。ウイルスの影響は、普通、時間の関数として測定する。ヒト細胞のウイルスに対する免疫応答；感染に対する応答の際に感染細胞または関連細胞により分泌される生産物、例えば、サイトカイン、インターフェロン、抗体等；“ＢＴＳ”移植組織または宿主循環のいずれかに存在するヒトリンパ球、骨髄性細胞、および間質細胞の生存能および生育；およびウイルス複製、例えば、新たな感染粒子の放出に関するデータを得ることができる。感染は、ウイルスの直接感染により達成できる。普通、感染は、ウイルスの少なくとも約１０²感染単位、好ましくは約１０³から１０⁵感染単位を必要とする。ウイルスは、臨床単離物、クローン化臨床単離物、遺伝子的に修飾した単離物、または同等物であってもよい。あるいは、ウイルスを感染細胞の注射により投与することもでき、この場合、注射された細胞は、感染性ウイルスを経時的に生産する。この細胞は、少なくとも約１０²感染単位、好ましくは約１０³から１０⁵ 感染単位のウイルス用量を輸送できる。様々な薬剤を宿主に投与して、特定組織に対する影響を侵襲性または非侵襲性技術により測定することもできる。非侵襲性技術には、ＮＭＲ、ＣＡＴスキャン、蛍光透視法、Ｘ線撮影法、放射性核種スキャニング、超音波検査法、心電図記録法、脳波記録法、誘発電位等がある。侵襲性技術には、生検、解剖、腹壁切開、間欠性静脈内血液サンプリング、または静脈内カテーテル法等がある。様々な装置、例えば、カテーテル、電極等を適宜配置して、連続監視を実施することもできる。こうして、宿主を用いて、異なるヒト組織に対する様々な化合物の発癌性、様々なヒト組織の生育および生存能に対する影響、化合物、例えば、薬剤その他の組み合わせ、の影響を測定することができる。更に、異種個体組織の病原性感染を与えることにより、宿主組織を病原体から保護すると同様、細胞環境において病原体に対して細胞毒性である、または病原体を抑制する、様々な薬剤の影響を測定できる。このキメラ宿主は、またヒト組織向けの様々な薬剤の細胞毒性を評価する、例えば、研究中の新規薬剤施用についてスクリーンするのに使用できる。更に、キメラ宿主は、薬剤をその効力、安全性、およびバイオアベイラビリティーに関して評価するのにも使用できる。感染に対する薬剤効果を研究する際のキメラ動物の使用は、感染用量のウイルスの投与前、実質的に投与と同時、または投与に続いて、薬剤を投与することから始めればよい。薬剤の投与は、普通、感染前早くても７日、より普通には、感染前多くて１日に始める。ほとんどの場合、薬剤の投与は、感染後遅くても約７日、より普通には、感染後遅くても約１日に始める。しかしながら、慢性感染の研究の場合、薬剤処置は、感染後１年ほど後、普通は６カ月後、より普通には１カ月後に開始するほうがよい。初期スクリーニング後に、異なる期間が、薬剤の有効性を確認する際の対象となることもある。投与方法は、薬剤の性質に依存して大きく変わる。それは、経口、無制限、腹膜内、血管内、皮下、胸腺内、その他であることができる。普通、その薬剤による過去の実験、ヒト処置での予想レベル、毒性または副作用、特定キメラ宿主での実験、その他に基づいて、様々な投与量レベルを採用する。薬剤の作用は、適宜期間、普通は薬剤投与開始から少なくとも１週間、より普通には少なくとも２週間、および６週間以上の長い期間で監視できる。好ましくは、約２−６週間の期間で測定を行う。ＨＩＶ−誘導Ｔ−細胞または胸腺細胞の涸渇を抑制する薬剤の有効性について、様々な測定を行うことができる。フローサイトメトリー（蛍光活性化細胞走査フローサイトメトリー）を採用することにより、末梢血液のＣＤ４およびＣＤ８プロフィール、胸腺、リンパ節移植組織、または適切に存在する他のヒト胎児組織から調製される細胞分散中の細胞集団を分析できる。末梢血液または移植組織中のｐ２４のレベルを監視することにより、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ＨＩＶ、ＨＩＶＲＮＡまたはそれらの部分、またはＨＩＶＤＮＡの存在についても監視できる。更に、移植組織中に存在する、ＣＤ４またはＣＤ８、ＨＩＶのタンパク質、例えばｐ２４の存在を検出するための免疫化学を採用する組織学的分析も使用できる。また、組織学的方法または電子顕微鏡により観察されるような、またはアポプトシスに一致するＤＮＡ分解プロフィールを識別できる方法により測定されるような濃縮核物質を伴う細胞の多病巣により示される感染組織におけるアポプトシスの兆候について分析できる。異種個体細胞の起源および発生過程段階を証明するためのそれらの表現型決定は、標準的な組織学的方法、免疫組織化学、抗体染色、またはＲＮＡおよび／またはＤＮＡプローブでのin situハイブリダイゼーションにより実施できる。精確な方法は、本発明にとって重大ではなく、研究対象の正確な細胞型に依存するものである。ＨＬＡマーカーを用いて、定着した異種個体器官組織体を識別することもできる。ＨＬＡ型は、Ｉ型およびII型抗原を含む、ヒトＨＬＡ遺伝子座の対立遺伝子のいずれかを指向する適切な抗体で染色することにより容易に決定できる。動物モデルに成熟ヒトＴ−細胞、Ｂ−細胞および骨髄性細胞が存在すると、特定の抗原に対するヒト抗体の発生が可能になる。ヒト細胞は、Ｔ−非依存性およびＴ−依存性抗体応答、例えば、ＩgＭからＩgＧおよびＩgＡサブクラスへのクラス交換、および抗体結合の親和性成熟を与えるために相互作用できる。所望の抗原は、一般に、アジュバントと共に処方される。動物を全身的、例えば、静脈内または筋肉内、または移植片内的に免疫感作させる。必要ならば、動物を抗原で追加免疫させる。免疫感作動物から採血し、免疫感作抗原に対する血清抗体の力価を試験する。ハイブリドーマ抗体の生産が望まれるならば、その場合は移植片を取り出し、細胞懸濁液を作成する。次いで、ＢＴＳ細胞を骨髄腫細胞相手と融合する。得られたハイブリドーマ細胞を、免疫感作抗原に対する反応性についてスクリーンし、抗体産生の陽性細胞を選択する。このようにして、本発明は：Ａ．適切な条件下、例えば、免疫無防備状態宿主において、例えば、少なくとも組織がハイブリダイズするまで、例えば、少なくとも２０週間の期間、並置状態で生育させた生存能力のある正常ヒト骨、脾臓、および所望により胸腺組織により形成させた、ヒトリンパ性および骨髄性細胞の長期間生産を与える新規ハイブリッド組織;例えば、例えば、少なくとも２０週間の期間、並置状態で生育させた生存能力のある正常ヒト骨組織および正常ヒト胎児脾臓により形成させたヒト骨髄性細胞、Ｂ−細胞、およびリンパ性前駆細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織；または、例えば、少なくとも２０週間の期間、並置状態で生育させた生存能力のある正常ヒト骨組織、正常ヒト胎児脾臓、および正常ヒト胎児胸腺組織により形成させたヒト骨髄性細胞、Ｂ−細胞、およびＴ−細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織。Ｂ．機能性同系Ｂ−細胞およびＴ−細胞を欠く哺乳動物以外の宿主、例えば、免疫不全マウス、例えば、scid遺伝子座でホモ接合性変異を有し、および／または機能性ＲＡＧ−１および／またはＲＡＧ−２の少なくとも１つの発現を欠くマウスで、上記Ａのハイブリッド組織を含み、例えば、そのハイブリッド組織は、宿主に移植、例えば、皮下移植されている、哺乳動物以外の宿主。Ｃ．ヒト骨髄性およびリンパ性細胞を長期間生産する能力があるヒト以外のキメラ哺乳動物、例えば、上記Ｂの宿主の製法であって：生存能力のある正常ヒト胎児脾臓および正常ヒト骨組織（および所望により、正常ヒト胎児脾臓組織）を、機能性同系Ｂ−およびＴ−細胞を欠くヒト以外の免疫無防備状態哺乳動物宿主（例えば、免疫不全マウス、例えば、scid遺伝子座でホモ接合性変異を有し、および／または機能性ＲＡＧ−１および／またはＲＡＧ−２の少なくとも１つの発現を欠くマウス）において皮下部位で並置状態で移植し；さらに、該宿主を、該組織がヒト骨髄性およびリンパ性細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織（例えば、上記Ａの組織）を形成できるのに充分な期間維持する、例えば、該宿主を少なくとも２０週間維持することを含んでなる方法；例えば、ヒト骨髄性細胞、Ｂ−細胞、およびリンパ性前駆細胞を長期間生産する能力があるキメラ哺乳動物の製法であって：生存能力のある正常ヒト胎児脾臓および正常ヒト骨組織を、機能性同系Ｂ−およびＴ−細胞を欠くヒト以外の免疫無防備状態哺乳動物宿主において皮下部位で並置状態で移植し；さらに、該宿主を少なくとも２０週間の期間維持し、それによって、該組織にヒト骨髄性細胞、Ｂ−系列細胞、およびリンパ性前駆細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織を形成させることを含んでなる方法、または、ヒト骨髄性細胞、Ｂ−細胞およびＴ−細胞を長期間生産する能力があるキメラ哺乳動物の製法であって：生存能力のある正常ヒト胎児脾臓、正常ヒト骨、および正常ヒト胎児胸腺組織を、機能性同系Ｂ−およびＴ−細胞を欠くヒト以外の免疫無防備状態哺乳動物宿主において皮下部位で並置状態で移植し；さらに、該宿主を維持し、それによって、該組織にヒト骨髄性細胞、Ｂ−系列細胞、およびＴ −細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織を形成させることを含んでなる方法。Ｄ．例えば、病原体に対する有効性について薬剤候補を評価する際に使用するための、病原体、例えば、ヒト熱帯性ウイルスで感染させた上記Ｂの宿主を含んでなる、疾病モデル。Ｅ．ヒト造血前駆細胞の能力範囲を測定する方法であって：生存能力のある正常ヒト胎児脾臓、正常ヒト骨、および正常ヒト胎児胸腺組織を、機能性同系Ｂ− およびＴ−細胞を欠くヒト以外の免疫無防備状態哺乳動物宿主において皮下部位で並置状態で移植し；該ハイブリッド組織に放射線照射し；ＨＬＡ不適合ヒト造血前駆細胞を該ヒト骨腔に注射し；該宿主を維持し、それによって、該組織にヒト骨髄性細胞、Ｂ−細胞、およびＴ−細胞を長期間生産できるハイブリッド組織を形成させ；さらに、該前駆細胞のＨＬＡ型を持って生産される造血細胞の能力範囲を測定することを含んでなる方法。下記実施例は、限定ではなく例示のために与える。実施例１−ＢＴＳ移植組織の構築および分析材料および方法ＢＴＳマウス。CB.17 scid/scidマウスは、メイン、バーハーバー、ジャクソン・ラボラトリーから得られた。このマウスを定形動物保有施設内の標準隔離ケージで飼育した。感染を防止するために、抗生作用予防のトリメトプリム／スルファメトキサゾール（懸濁液５ml当たり４０mg／２００mg；１日当たりマウス１匹につき飲料水４ml当たり懸濁液０.１２５ml）を投与した。小さい（２mm）ヒト胎児脾臓および胸腺フラグメントと随意選択の流産児の１９ないし２３週妊娠胎児の大腿骨および脛骨由来のおよそ５×３×１０mm胎児骨フラグメントを用いて、ＢＴＳマウスを構築した。胎児組織は、連邦および州の規定に従い、インホームド・コンセント（Informed consent）を得て、機関から入手した。この組織は、胎児部分として手術室で直接得られた。厳密な滅菌性を維持することなく、この胎児部分は、直ちに肉眼的解剖室へと運ばれた。同定した組織を切り取り、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に置いた。胎児脾臓および胸腺フラグメントを６ないし８週齢の麻酔をかけたC.B-17 scid/scidマウスの哺乳動物脂肪パッドにおいて胎児骨フラグメントに近接して皮下的に置いた。受容個体マウスをマイクロ隔離器から取り出し、垂直空気層流フードに置き、ケタミンで麻酔し、滅菌手術ボード上にテープで補綴した。感染予防技術により、４分の１の哺乳動物脂肪パッドを中線腹部切開により露出させた。時計メーカーの鋭利な鉗子を用いて哺乳動物脂肪パッドにキズを作り、そのキズから胎児組織を導入した。次いで、腹部皮膚切開部を７.５mm傷クリップで閉じた。胎児胸腺または胎児肝臓由来の細胞懸濁液を用いて、個々のドナーについてＨＬＡ型を測定した。抗体。ヒト白血球マーカーに対するマウス抗体をフィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、またはトリコロール（ＴＣ）と直接コンジュゲートさせた。これらは、ヒトＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３３およびＣＤ８（カリフォルニア、マウンテン・ビュー、ベクトン・ディッキンソン）およびＣＤ４、ＣＤ１９およびＣＤ４５（カリフォルニア、サウスサンフランシスコ、カルタグ）に対する抗体を含んでいた。ＨＬＡ免疫表現型は、ＡＴＣＣ（メリーランド、ロックビル）から入手したハイブリドーマ由来のＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＨＬＡＩ型ＭＡｂＭＡ２.１、ＢＢ７.１、ＢＢ７.２、ＭＢ４０.２、およびＧＡＰ−Ａ３、およびSyStemixでコンジュゲートさせた蛍光色素を用いて測定した。無関係なアイソタイプ対照は、直接ＦＩＴＣまたはＰＥコンジュゲート化ＩgＧ１（カリフォルニア、マウンテン・ビュー、ベクトン・ディッキンソン）およびＴＣ−コンジュゲート化ＩgＧ２Ａ（カリフォルニア、サウスサンフランシスコ、カルタグ）であった。フローサイトメトリー。ＢＴＳマウスを移植後２８−３６週で屠殺し、ヒト組織移植片を取り出した。移植片を０.２％ＢＳＡを含有する冷ホスフェート緩衝化塩水中でこすり刻むことにより、単一細胞懸濁液を作成した。その細胞を洗浄し、１mg／mlヒトガンマグロブリン（Gamimune、インディアナ、エルクハート、マイルズ・インコーポレイテッド）でブロックした。生存能力のある細胞の総含量をトリパン・ブルー色素排除により測定し、細胞を直接コンジュゲート化抗体と共に氷上で３０分間インキュベーションした。細胞を洗浄し、ＦＡＣスキャン蛍光分析機（ベクトン・ディッキンソン）で分析した。結果共通の前駆細胞プールは、ＢＴＳマウスにおける長期間多系列ヒト造血に貢献する。CB.17 scid/scidマウスに胎児骨および脾臓、およびＨＬＡ−不適合胸腺フラグメントを皮下移植し、２８−３６週後に屠殺し、移植片をＦＡＣＳにより胎児骨−脾臓由来のヒト造血細胞について分析した。計３２移植片を分析し、そのうち２２移植片(６８.８％) が５％以上のヒト細胞を有することが分かった。細胞懸濁液を、抗ドナーＩ型（骨−脾臓フラグメントに特異的であるが、胸腺フラグメントには特異的でない）、ＣＤ４およびＣＤ８、または抗−ドナーＩ型、ＣＤ３３およびＣＤ１９の組み合わせで染色した。骨および脾臓移植片（ドナー）由来の細胞に特異的な抗−ＨＬＡに対して、高割合のＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ−細胞は染まる。更に、同一移植片において、ドナー由来ＣＤ１９陽性細胞（Ｂ−細胞）およびＣＤ３３陽性細胞（骨髄性細胞）もまた容易に検出できる。４組の異なる骨−脾臓、胸腺（Ａ／Ｂ、Ｃ／Ｄ、Ｅ／ＦおよびＧ／Ｈ）由来の２２移植片のデータは、表１に示している。ドナー由来ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ−細胞の割合、同じくＣ１９およびＣＤ３３陽性細胞の割合は、上記アイソタイプ対照ドナーＩ型に対して陽性である細胞の数によって決めた。表１に示した２４移植片のうち、１５移植片（６２.５％）は、ＦＡＣＳ表現型決定により測定した検出可能レベルのＴ、Ｂおよび骨髄性細胞を伴う多系列造血を有した。残りの移植片は、異なる二系列または単一系列ドナー由来細胞を有し、検出可能レベルのＢおよび骨髄性細胞を有する２移植片、ドナーＴ−細胞のみの２移植片、Ｔ−細胞およびＢ−細胞を有する１移植片、Ｔ−細胞および骨髄性細胞を有する１移植片であった。胎児骨フラグメントが移植片において長期間Ｂ−細胞生産および骨髄赤血球生産を維持でき、またＣＤ３４⁺細胞を維持できることは、以前に示されている（ヨーロッパ特許出願第９１９１１２２４.３号）。しかしながら、骨移植片単独の場合、移植後２０週までに動物内の造血は顕著に低減する。２０週よりも有意に長い期間になると、被験骨／脾臓およびＢＴＳマウスは、活発な造血を示す。表１に示したデータは、骨または脾臓の初期前駆細胞もまた、同一移植片において少なくとも３６週間、骨髄性細胞およびＢ−細胞生産と同時にＴ−細胞生産できる胎児胸腺フラグメントを再構築する能力を有することを示している。ＢＴＳ移植片における骨髄性細胞の維持。ＣＤ３３は未熟骨髄球細胞および単球において発現される。しかしながら、最近、ＣＤ３３は、活性化正常ヒト末梢血ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ−細胞においても発現されることが示された。ＣＤ３３染色が骨髄系列分化に影響したことを確実にするために、各移植片由来の細胞をＣＤ４５に単球／顆粒球マーカーＣＤ１４を加えたものと顆粒球マーカーＣＤ１５とを組み合わせたもので染色した。この移植片由来の細胞の総合非ゲート化集団（total ungated populations）を分析すると、大部分の細胞は、リンパ性細胞の実質数が存在することを示す、低い前方および側方散乱特性を有し、これはＢ−細胞およびＴ−細胞系列マーカーに対して染色することにより確認した。ドナーＩ型およびＣＤ３３⁺に対してゲートした細胞の前方および側方散乱特性は、これらの細胞の殆どがリンパ芽球範囲内ではないことを示す。ＣＤ１４およびＣＤ１５で染色したＣＤ４５⁺細胞は、ＣＤ１４／ＣＤ１５二重陽性細胞の、またＣＤ１５単一陽性顆粒球とは別個の集団を表す。これらの染色プロフィールとＣＤ３３陽性細胞の散乱特性を合わせると、胎児骨／脾臓由来骨髄性集団はＢＴＳ移植片中に長期間存在することが分かる。ＢＴＳ移植片はＣＤ４⁺／ＣＤ８⁺二重陽性、並びに成熟単一陽性ドナー由来ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ−細胞を含有する。ＢＴＳ移植片におけるドナー由来Ｔ− 細胞の成熟段階を測定するために、ドナーＩ型にＣＤ４およびＣＤ８を加えた場合の移植片の３色染色を行った。胎児骨／脾臓内の初期Ｔ−細胞または多系列前駆細胞が、正常胎児胸腺またはＴhy／Ｌiv移植片で見られるのと同様に、胸腺微環境におけるＴ−細胞生産に長期間持続貢献する能力があるならば、未熟ＣＤ４⁺ ＣＤ８⁺二重陽性（ＤＰ）並びに成熟単一ＣＤ４⁺またはＣＤ⁺陽性細胞（ＳＰ）が観察されるべきである。表現型について分析した２２移植片のうち、１５移植片（６８.２％）は、検出可能レベルのＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺双方の単一陽性成熟Ｔ−細胞を有した。未熟ＤＰＴ−細胞は、２２移植片のうち１２移植片（５５％）で観察された。ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺ＤＰ細胞と比較したＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺ ＳＰ細胞の割合についての値を、ＣＤ４およびＣＤ８発現に基づく総Ｔ−細胞生産に対して正規化し、表２に示す。総ＤＰＴ−細胞の割合は、総Ｔ−細胞集団の１７.６％から８２.６％の範囲であった。この分析は、初期ＣＤ４およびＣＤ８陰性Ｔ−細胞前駆細胞を除外しているが、高割合の移植片が実質数の中間ＤＰ細胞を含有すること、および活発なＴ−細胞生産が続いていることを示す。未熟ＤＰＴ−細胞は、Ｉ型発現が低く、成熟の最終段階でより高いＩ型発現を獲得する。ＤＰ並びにＳＰＴ−細胞を含有する移植片における全細胞集団のヒストグラムは、２並数ドナーＩ型分布を示す。これらの集団は、高発現性ドナーＩ型集団およびＩ型が低い集団を含むが、アイソタイプ対照レベル以下で染色される細胞もまた含んでいる。ドナーＩ型発現についてのＳＰＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺細胞のヒストグラム分析は、ＢＴＳ移植片において成熟Ｔ−細胞が高レベルのドナーＩ型を発現することを表している。しかしながら、未熟ＤＰＴ−細胞では、陰性レベルよりも低く発現する。胎児胸腺由来ドナーＨＬＡ−陰性Ｔ−細胞は、キメラのドナー（骨／脾臓）および宿主（胸腺）Ｔ−細胞集団を産生する、Ｉ型低集団に属することもある。検出不可能レベルのドナーＨＬＡ−陰性細胞が成熟Ｔ−細胞に見いだされるという珍しい観察は、宿主胸腺に由来する全Ｔ−細胞集団の割合が低いことを示している。脾臓／骨移植片は、胸腺微環境がなくてもＣＤ４⁺細胞を含有する。我々は、脾臓および骨フラグメントが皮下にあり、ＨＬＡ不適合胸腺フラグメントが腎臓嚢下にある一連のＳＣＩＤ−hu移植片を分析した。ドナー（脾臓／骨）由来Ｔ− 細胞再集団（repopulation）は分析した１１の胸腺移植片では決して観察されないのに対し、１０の脾臓／骨移植片は検出可能レベルの、ドナーＨＬＡおよびＣＤ４双方に対して陽性の細胞を含有し、これは表３に示している。高レベルのドナー由来Ｂ−細胞、並びに骨髄性細胞が観察される。ＣＤ８に対して陽性の細胞は、アイソタイプ対照以上に検出可能ではないのに対し、ＣＤ４陽性細胞は、容易に見られる。１１移植片のデータは表３にまとめている。全ての移植片は、Ｂ −細胞および骨髄性細胞の両方を移植後少なくとも３２週間維持した。更に、これらの移植片のうち１０移植片は、１.０から５.３％の範囲のＣＤ４⁺細胞レベルを有した。ＣＤ８⁺細胞が観察されたケースはなかった。実施例２ＢＴＳ移植組織のヒト熱帯性ウイルスでの感染Ａ．ＢＴＳ移植組織のＨＩＶの一次単離物での感染。ＨＩＶ１の一次単離物および分子クローン化単離物を用いて、ＢＴＳキメラ中のヒトＴ細胞に感染させる。キメラＢＴＳマウスは、実施例１に記載のようにして作成する。横腹を切開して麻酔をかけたマウスの生育ヒトＢＴＳ移植組織を露出させる。１０³−１０⁴感染単位用量（ＰＨＡ芽球におけるＴ.Ｃ.Ｉ.Ｄ.５０に基づく）を直接胸腺内接種により導入する。次いで、マウスをグローブボックス内側のマイクロ隔離ケージ内に保持した。様々な時点で、様々な測定を行う。一般には、試験動物を屠殺した後、胸腺移植組織を外科的に取り出す。ある場合では、組織の一部を組織学的試験用によけておく。移植組織の全体または部分を顕微鏡スライドすりガラスの間に挟んで砕き、胸腺細胞の懸濁液を得る。５０ μlＰＢＳ／２％ＦＣＳ中〜１０⁶の胸腺細胞をフローサイトメトリー分析用に抗 −ＣＤ４−ＦＩＴＣおよび抗−ＣＤ８−ＰＥコンジュゲート化モノクローナル抗体で染色する。〜１０⁶の胸腺細胞を水中０.１％トリトン／１％クエン酸塩／ヨウ化プロピジウム１ml当たり５０μgの溶液に１時間懸濁させ、洗浄し、フローサイトメトリー分析用にＰＢＳ／２％ＦＣＳに再懸濁させる。ヨウ化プロピジウムは、ＤＮＡに対しインターカレーションを生じるので、これを単一細胞内のＤＮＡ含量を評定するのに使用できる。胸腺移植組織は、組織薄片の光学顕微鏡および電子顕微鏡分析を用いて分析する；非感染対照ではアポプトシス形状がめったに生じないのに比べて、アポプトシス形状の劇的な増大が観察される。接種後＞４週のフローサイトメトリーから判断すると、ＣＤ４／ＣＤ８比率が実質的に逆転しており、ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞の絶対数および相対割合が実質的に減少している。１０⁶細胞当たりのｐ２４の量に基づくウイルスの存在は、観察期間中の連続増加を示すものである。更に、ＤＮＡの正常（２Ｎ）の補体を有する細胞の数を、感染後２および４週の対照およびＨＩＶ単離物について測定する。感染後数週間で、対照と比較すると、正常胸腺は、ＤＮＡの正常以下（＜２Ｎ）の補体を含有する細胞を少量有するのに対し、感染させた胸腺は、ＤＮＡの正常以下（＜２Ｎ）の補体を含有する細胞を多く有する。ＨＩＶ−感染移植組織のシクロスポリンＡでの処理。上記方法に従い、ＢＴＳマウスをＨＩＶ単離物で感染させる。シクロスポリンＡを数週間にわたって浸透性ミニポンプにより皮下投与する。投与速度は、〜２４mg／kg／日であり、接種後様々な期間で開始する。投与は、接種後１週間で始め、実験動物の限界まで続ける。高いレベルのｐ２４が胸腺中の細胞に存在するにもかかわらず、ＣＤ４を発現する胸腺細胞の涸渇は、非処理のＨＩＶ−感染対照マウスと比較して実質的に減少している。ＨＩＶ−感染移植組織のｄｄＩおよびＡＺＴでの処理。感染前処理の２０週間以上前に移植組織を受けた、実施例１に記載のＢＴＳ移植マウスをこれらの実験に用いる。ＢＴＳ移植組織にＨＩＶの一次患者単離物または分子ＨＩＶクローン（ＪＲ−ＣＳＦ）を接種する。全ての場合で、胸腺ｐ２４レベルは経時的に増大し、これは幾つかの胸腺成分の増殖性感染を示すものである。ｐ２４の増大に付随して、胸腺細胞質は大きく低減し、これはＣＤ４⁺８^-およびＣＤ４⁺８^-表現型の胸腺細胞の除去（ablation）を反映している。ウイルス抗原の発現は、胸腺細胞および胸腺間質成分を含む幾つかの細胞型に集中させることができる。治療を施さないと、胸腺のＨＩＶ感染は、発生する胸腺細胞の大多数を排除することとなる。感染後１週間で開始して、ｄｄＩを毎日１００μl、腹膜内注射で１２.５mg／ mlで与え、一方、ＡＺＴを飲料水中１mg／mlで無制限に与える。数週間後、動物を分析する。ＣＤ４／ＣＤ８比率を、薬剤を投与しない対照と、ｄｄＩおよびＡＺＴ摂生の場合とで測定する。ＦＡＣＳ測定用の試料は、胸腺移植組織をスライドすりガラスで砕いて、胸腺細胞を放出させることにより調製する。胸腺細胞を洗浄して、計数し、次いで、約５０μlＰＢＳ、２％ＦＣＳ中１０⁶細胞を抗−ＣＤ４−ＦＩＴＣおよび抗−ＣＤ８−ＰＥコンジュゲート化抗体で染色する。ウイルスを投与しない場合、ＣＤ４／ＣＤ８比率は１：１以上である。ＡＺＴを受けた動物は、薬剤なしよりは良いが、ｄｄＩを受けたものほど顕著な改善はみられないという中間の応答を示す。Ｂ．ＢＴＳ移植組織のサイトメガロウイルスでの感染。ヒトＣＭＶの一次単離物を用いて、ＢＴＳキメラ中のヒト細胞に感染させる。キメラＢＴＳマウスは、実施例１に記載のようにして作成する。少なくとも移植後１カ月で、移植組織を切開露出させ、露出させた移植組織表面下に３０ゲージの針を用いて、ヒトＣＭＶの臨床単離物を接種した。ウイルスは、移植組織内で生育できる。接種後７および１５日で、動物を屠殺し、組織を取り出して切り刻み、超音波処理して、ヒト繊維芽細胞におけるプラークアッセイによりヒトＣＭＶの存在について力価を求める。一般に、ウイルス力価ピークは、１週間後に観察される。更なる研究では、ＢＴＳ移植組織をＣＭＶ感染用に採用するが、ガンシクロビルを様々な濃度で飲料水中に与える。感染後すぐに始めて、マウスを２週間薬剤付けの状態にし、ＣＭＶ感染のレベルを２週間の期間の最後に測定する。この操作後、ウイルス力価は、ガンシクロビル濃度が増大するにつれて低減する。飲料水中１.５mg／mlのガンシクロビルを無制限に投与すると、２週間でウイルス力価は、薬剤を受けない対照動物におけるよりも大きく下回る。次の研究では、マウスを２週間薬剤付け、次いで２週間薬剤なしの状態にし、ウイルス血症のレベルを４週間の期間の最後に測定した。ガンシクロビル処理動物におけるウイルス力価は、薬剤を与えなかった場合よりも低いが、２週目から力価は増大する。Ｃ．ＢＴＳ移植組織の水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）での感染。キメラＢＴＳマウスは、実施例１に記載のようにして作成する。移植組織に水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）を感染させる。ＢＴＳ移植組織は、ＶＺＶの増殖を支え、ウイルス抗原と共に同時集中化する組織破壊領域を示す。ＶＺＶで感染させたＭＲＣ−５胎児肺繊維芽細胞を接種原として用いる。およそ１.５×１０³ＶＺＶ−感染細胞を移植組織に注射し、次いで移植組織を感染後１および２週間で外科的に取り出す。ウイルス力価を、両時点で観察する。両方の時点で、ホルマリン固定してパラフィン包埋し、次いでヘマトキシリンおよびエオシン染色した、３ミクロンの移植組織断片は、繊維症、核破片、および壊死を特徴とする損傷領域を示す。これらの領域は、一次抗体としてポリクローナルヒトＶＺＶ免疫血清を用いる免疫組織学的染色により検出したところ、ＶＺＶ抗原の存在に対応していた。ウイルスは、依然として細胞変性作用を有するようには見えなかった移植組織の皮質領域にも検出され、これは、ＶＺＶが移植組織中に広がり、複製していることを示すものである。Ｄ．ＢＴＳ移植組織の麻疹ウイルスでの感染。麻疹ウイルスの２つの野性型株を実施例１に記載のようにして作成したＢＴＳ移植組織に注射する。接種後１および２週間で、シンシチウム形成用のＢ９５−８細胞による終点希釈アッセイにより、またはベロ細胞のプラーク形成によりウイルス複製を測定する。麻疹感染により誘導された胸腺細胞の細胞変性効果は、抗−ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ３抗体を用いるＦＡＣＳ分析により評価する。麻疹ウイルスは複製し、ＢＴＳ移植組織において細胞変性効果を示す。実施例３宿主マクロファージレベルを低減するためのＢＴＳマウスのリポソーム封入ジクロロメチレンジホスホネート（ＣＬ₂ＭＤＰ）での処理Ｃl₂ＭＤＰでの処理による内生マウスマクロファージの除去は、ＢＴＳ移植組織に由来する循環ヒト血液細胞の数に影響する。実質数のヒト細胞は移植片中に存在するが、循環中のヒト細胞の数は低いままである。実施例１に記載したように、２０週間以上ＢＴＳ移植組織を有するマウスを、末梢血ヒト細胞含量について試験する。次いで、このマウスの尾静脈にＰＢＳまたはリポソーム封入Ｃl₂ＭＤＰのいずれかの２００μlを注射する。リポソーム封入Ｃl₂ＭＤＰは、Delemarre等（1990）Immunobiol．180：395−4 04；およびRooijen（1989）J.Immunol Methods 124：1−6に記載の方法に従い、ホスファチジルコリンとコレステロールを用いて調製する。要約すると、ホスファチジルコリン７５mgとコレステロール１１mgを丸底フラスコ中クロロホルムに溶解する。３７℃で低真空回転蒸発濃縮した後、脂質を、ジクロロメチレンジホスホネート１.８９gが溶解しているＰＢＳ１０ml中で穏やかに旋回させることにより、分散させる。生じたリポソームを１００,０００×ｇで３０分間２回洗浄して、遊離の非封入Ｃl₂ＭＤＰを除去する。次いで、リポソームをホスフェート緩衝化塩水（ＰＢＳ）４mlに懸濁し、“１００％”ストックを得る。注射後大多数のマウスは、注射後数日で末梢ヒト細胞の上昇を示し、これを注射後少なくとも２週間維持し、注射後〜３−４週間までに基底レベルへ戻す。ヒト胎児骨および脾臓内の初期造血前駆細胞が、免疫無防備状態宿主動物において胎児胸腺組織と共に移植された場合、Ｂ−細胞および骨髄性細胞、並びに、成熟および中間段階のＴ−細胞を生産できることは上記結果から明らかである。同一部位に皮下移植した胎児骨、胸腺、および脾臓（ＢＴＳ）移植片の高割合が、移植後７−９カ月でヒト造血系列について分析したところ、ＣＤ４および／またはＣＤ８に陽性の細胞、ＣＤ１９に陽性の細胞、並びに、ＣＤ３３を発現する細胞集団を有した。抗−ヒトＨＬＡＩ型マーカーでの分析により、骨／脾臓において前駆細胞から誘導されている細胞を同定したが、これは、共通の幹細胞プールがインビトロモデルにおいて長期間多能性ヒト造血を起こすことができることを示している。この被験キメラ系は、ヒト抗体生産、およびヒト造血およびその疾病状態の分析ための小動物モデルを与えるものである。植え付け後、移植したヒト組織を系統的方法で操作できる。かかる操作の結果は、上記の通り、様々な方法で読み取ることができる。例えば、白血病または遺伝子異常におけるような羅病骨髄由来の造血細胞を、前以て移植した同種胎児骨移植片に導入して、悪性腫瘍、および正常造血または疾病状態を調節し得る成長因子および／または薬剤の影響を研究することもできる。ヒト遺伝子療法治験の場合にも、このモデルは、ヒト造血細胞に導入された外来遺伝子の長期間発現を試験するための価値あるシステムとして役立ち得る。このモデルは、ヒト熱帯性ウイルス感染およびインビボ系の治療効果を観察するための価値あるシステムでもある。本明細書に引用した全ての刊行物および特許出願は、出典明示により本明細書の一部としており、それぞれ個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に参照して組み込まれているものとする。前記発明は、理解の明確さを目的として例示説明および実施例により、ある程度詳細に記載しているが、当業者ならば、本発明の技術から鑑みて、ある種の変化や修飾が添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく為され得ることが容易に明らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年７月１７日【補正内容】確な方法は、本発明にとって重大ではなく、研究対象の正確な細胞型に依存するものである。ＨＬＡマーカーを用いて、定着した異種個体器官組織体を識別することもできる。ＨＬＡ型は、Ｉ型およびII型抗原を含む、ヒトＨＬＡ遺伝子座の対立遺伝子のいずれかを指向する適切な抗体で染色することにより容易に決定できる。動物モデルに成熟ヒトＴ−細胞、Ｂ−細胞および骨髄性細胞が存在すると、特定の抗原に対するヒト抗体の発生が可能になる。ヒト細胞は、Ｔ−非依存性およびＴ−依存性抗体応答、例えば、ＩgＭからＩgＧおよびＩgＡサブクラスへのクラス交換、および抗体結合の親和性成熟を与えるために相互作用できる。所望の抗原は、一般に、アジュバントと共に処方される。動物を全身的、例えば、静脈内または筋肉内、または移植片内的に免疫感作させる。必要ならば、動物を抗原で追加免疫させる。免疫感作動物から採血し、免疫感作抗原に対する血清抗体の力価を試験する。ハイブリドーマ抗体の生産が望まれるならば、その場合は移植片を取り出し、細胞懸濁液を作成する。次いで、ＢＴＳ細胞を骨髄腫細胞相手と融合する。得られたハイブリドーマ細胞を、免疫感作抗原に対する反応性についてスクリーンし、抗体産生の陽性細胞を選択する。このようにして、本発明は：Ａ．適切な条件下、例えば、免疫無防備状態宿主において、例えば、少なくとも組織がハイブリダイズするまで、好ましくは、少なくとも２０週間の期間、並置状態で生育させた生存能力のある正常ヒト骨、脾臓、および所望により胸腺組織により形成させた、ヒトリンパ性および骨髄性細胞の長期間生産を与える新規ハイブリッド組織；例えば、例えば、少なくとも２０週間の期間、並置状態で生育させた生存能力のある正常ヒト骨組織および正常ヒト胎児脾臓により形成させたヒト骨髄性細胞、Ｂ−細胞、およびリンパ性前駆細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織；または、例えば、少なくとも２０週間の期間、並置状態で生育させた生存能力のある正常ヒト骨組織、正常ヒト胎児脾臓、および正常ヒト胎児胸腺組織により形成させたヒト骨髄性細胞、Ｂ−細胞、およびＴ−細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織。Ｂ．機能性同系Ｂ−細胞およびＴ−細胞を欠くヒト以外の哺乳動物宿主、例えば、免疫不全マウス、例えば、scid遺伝子座でホモ接合性変異を有し、および／または機能性ＲＡＧ−１および／またはＲＡＧ−２の少なくとも１つの発現を欠くマウスで、上記Ａのハイブリッド組織を含み、例えば、そのハイブリッド組織は、宿主に移植、例えば、皮下移植されている、哺乳動物以外の宿主。Ｃ．ヒト骨髄性およびリンパ性細胞を長期間生産する能力があるヒト以外のキメラ哺乳動物、例えば、上記Ｂの宿主の製法であって：生存能力のある正常ヒト胎児脾臓および正常ヒト骨組織（および所望により、正常ヒト胎児脾臓組織）を、機能性同系Ｂ−およびＴ−細胞を欠くヒト以外の免疫無防備状態哺乳動物宿主（例えば、免疫不全マウス、例えば、scid遺伝子座でホモ接合性変異を有し、および／または機能性ＲＡＧ−１および／またはＲＡＧ−２の少なくとも１つの発現を欠くマウス）において皮下部位で並置状態で移植し；さらに、該宿主を、該組織がヒト骨髄性およびリンパ性細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織（例えば、上記Ａの組織）を形成できるのに充分な期間維持する、例えば、該宿主を少なくとも２０週間維持することを含んでなる方法；例えば、ヒト骨髄性細胞、Ｂ−細胞、およびリンパ性前駆細胞を長期間生産する能力があるキメラ哺乳動物の製法であって：生存能力のある正常ヒト胎児脾臓および正常ヒト骨組織を、機能性同系Ｂ−およびＴ−細胞を欠くヒト以外の免疫無防備状態哺乳動物宿主において皮下部位で並置状態で移植し；さらに、該宿主を少なくとも２０週間の期間維持し、それによって、該組織にヒト骨髄性細胞、Ｂ−系列細胞、およびリンパ性前駆細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織を形成させることを含んでなる方法、または、ヒト骨髄性細胞、Ｂ−細胞およびＴ−細胞を長期間生産する能力があるキメラ哺乳動物の製法であって：生存能力のある正常ヒト胎児脾臓、正常ヒト骨、および正常ヒト胎児胸腺組織を、機能性同系Ｂ−およびＴ−細胞を欠くヒト以外の免疫無防備状態哺乳動物宿主において皮下部位で並置状態で移植し；さらに、該宿主を維持し、それによって、該組織にヒト骨髄性細胞、Ｂ−系列細胞、およびＴ請求の範囲１．並置状態で生育させた、生存能力のある正常ヒト骨組織、正常ヒト胎児脾臓、および所望により、正常ヒト胎児胸腺により形成される、ヒト骨髄性細胞およびリンパ性細胞の生産を与えるハイブリッド組織を含んでなる、機能性同系Ｂ− 細胞およびＴ−細胞を欠くヒト以外の哺乳動物宿主。２．該ヒト以外の哺乳動物宿主がマウスである、請求の範囲第１項記載の宿主。３．該マウスがscid遺伝子座でホモ接合性変異を有し、かつ機能性ＲＡＧ−１またはＲＡＧ−２の少なくとも１つの発現を欠く、請求の範囲第２項記載の宿主。４．該ハイブリッド組織がヒト熱帯性ウイルスに感染している、請求の範囲第１ −３項のいずれか１項記載の宿主。５．ヒト骨髄性細胞およびリンパ性細胞を生産する能力のあるキメラ哺乳動物の製法であって、生存能力のある正常ヒト胎児脾臓、生存能力のある正常ヒト骨組織、および所望により、生存能力のある正常ヒト胎児胸腺を機能性同系Ｂ−およびＴ−細胞を欠くヒト以外の免疫無防備状態哺乳動物宿主において皮下部位で並置状態で移植し；さらに、該宿主を少なくとも２０週間の期間維持することによって、該組織に、ヒト骨髄性およびリンパ性細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織を形成させる、ことを含んでなる、方法。６．該ヒト以外の哺乳動物宿主がマウスである、請求の範囲第５項記載の方法。７．該マウスがscid遺伝子座でホモ接合性変異を有し、かつ機能性ＲＡＧ−１またはＲＡＧ−２の少なくとも１つの発現を欠く、請求の範囲第６項記載の方法。８．ヒト造血前駆細胞の能力範囲を測定する方法であって、生存能力のある正常ヒト胎児脾臓、正常ヒト骨組織、および正常ヒト胎児胸腺組織を機能性同系Ｂ−およびＴ−細胞を欠くヒト以外の免疫無防備状態哺乳動物宿主において皮下部位で並置状態で移植し；該ハイブリッド組織に放射線照射し；ＨＬＡ型に関してハイブリッド組織と不適合なヒト造血前駆細胞を該ヒト骨腔に注射し；該宿主を維持することによって、該組織に、ヒト骨髄性細胞、Ｂ−細胞、およびＴ−細胞を長期間生産することができるハイブリッド組織を形成させ；さらに、該前駆細胞のＨＬＡ型を有して生産された造血細胞の能力範囲を測定する、ことを含んでなる、方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フレイザー，クリストファー・シーアメリカ合衆国94204カリフォルニア州ロス・アルトス、ブレントウッド・プレイス720番

Claims

【特許請求の範囲】１．並置状態で生育させた、生存能力のある正常ヒト骨組織、正常ヒト胎児脾臓、および所望により、正常ヒト胎児胸腺により形成される、ヒト骨髄性細胞およびリンパ性細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織を含んでなる、機能性同系Ｂ−細胞およびＴ−細胞を欠くヒト以外の哺乳動物宿主。２．該ヒト以外の哺乳動物宿主がマウスである、請求の範囲第１項記載の宿主。３．該マウスがscid遺伝子座でホモ接合性変異を有し、かつ機能性ＲＡＧ−１またはＲＡＧ−２の少なくとも１つの発現を欠く、請求の範囲第２項記載の宿主。４．該ハイブリッド組織がヒト熱帯性ウイルスに感染している、請求の範囲第１ −３項のいずれか１項記載の宿主。５．ヒト骨髄性細胞およびリンパ性細胞を長期間生産する能力のあるキメラ哺乳動物の製法であって、生存能力のある正常ヒト胎児脾臓、正常ヒト骨組織、および所望により、正常ヒト胎児脾臓を機能性同系Ｂ−およびＴ−細胞を欠くヒト以外の免疫無防備状態哺乳動物宿主において皮下部位で並置状態で移植し；さらに、該宿主を少なくとも２０週間の期間維持することによって、該組織に、ヒト骨髄性およびリンパ性細胞の長期間生産を与えるハイブリッド組織を形成させる、ことを含んでなる、方法。６．該ヒト以外の哺乳動物宿主がマウスである、請求の範囲第５項記載の方法。７．該マウスがscid遺伝子座でホモ接合性変異を有し、かつ機能性ＲＡＧ−１またはＲＡＧ−２の少なくとも１つの発現を欠く、請求の範囲第６項記載の方法。８．ヒト造血前駆細胞の能力範囲を測定する方法であって、生存能力のある正常ヒト胎児脾臓、正常ヒト骨組織、および正常ヒト胎児胸腺組織を機能性同系Ｂ−およびＴ−細胞を欠くヒト以外の免疫無防備状態哺乳動物宿主において皮下部位で並置状態で移植し；該ハイブリッド組織に放射線照射し；ＨＬＡ不適合ヒト造血前駆細胞を該ヒト骨腔に注射し；該宿主を維持することによって、該組織に、ヒト骨髄性細胞、Ｂ−細胞、およびＴ−細胞を長期間生産することができるハイブリッド組織を形成させ；さらに、該前駆細胞のＨＬＡ型を有して生産された造血細胞の能力範囲を測定する、ことを含んでなる、方法。