CN117813327A - 抗gitr抗体及其用途 - Google Patents

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CN117813327A CN202280047210.9A CN202280047210A CN117813327A CN 117813327 A CN117813327 A CN 117813327A CN 202280047210 A CN202280047210 A CN 202280047210A CN 117813327 A CN117813327 A CN 117813327A
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Abstract

本发明涉及新型抗GITR抗体及其用于免疫增强、癌症预防和免疫疾病的预防和/或治疗的用途。

Description

抗GITR抗体及其用途
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年5月10日向韩国知识产权局提交的KR 10-2021-0060012的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
公开了新的抗GITR抗体及其用于免疫增强和用于预防和/或治疗癌症和免疫相关疾病的用途。
背景技术
癌症免疫疗法是利用机体免疫应答治疗癌症的方法，被称为继化学疗法、手术治疗和放射疗法之后的第四种癌症治疗方法。癌症免疫疗法需要激活免疫系统的机制，以增加对肿瘤细胞的识别和应答。免疫系统的激活涉及复杂的机制，包括各种细胞的功能，如抗原呈递细胞，其对于启动抗原特异性应答至关重要，以及效应细胞，其负责破坏肿瘤细胞。
糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员，其功能是激活T细胞以促进免疫应答。
因此，需要开发通过激活GITR而表现出免疫增强作用的药物。
发明内容
技术问题
提供了与GITR结合的抗GITR抗体及其药物用途。
本文提供的抗GITR抗体或其抗原结合片段可作为GITR的激动剂。
抗GITR抗体或其抗原结合片段可以包含：
重链互补决定区(CDR)，其由包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)组成，或包含该重链互补决定区的重链可变区；和
轻链互补决定区(CDR)，其由包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)、包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)组成，或包含该轻链互补决定区的轻链可变区。
在实施方案中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)可以包含SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)可以包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
在实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合片段可以包含：
包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区；和
包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区。
另一方面提供了免疫增强剂或免疫增强药物组合物，其各自包含抗GITR抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了用于预防和/或治疗免疫相关疾病的药物组合物，其包含抗GITR抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了用于预防和/或治疗癌症的抗癌剂或药物组合物，其各自包含抗GITR抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了免疫增强方法，该方法包括向需要免疫增强的对象施用药学有效量的抗GITR抗体或其抗原结合片段的步骤。
另一方面提供了用于预防和/或治疗免疫相关疾病的方法，该方法包括向需要免疫相关疾病预防或治疗的对象施用药学有效量的抗GITR抗体或其抗原结合片段的步骤。
另一方面提供了用于预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括向需要癌症预防和/或治疗的对象施用药学有效量的抗GITR抗体或其抗原结合片段的步骤。
另一方面提供了抗GITR抗体或其抗原结合片段用于免疫增强或用于制备免疫增强剂的用途。
另一方面提供了抗GITR抗体或其抗原结合片段用于预防和/或治疗免疫相关疾病或用于制备预防和/或治疗免疫相关疾病的药物的用途。
另一方面提供了抗GITR抗体或其抗原结合片段用于预防和/或治疗癌症或用于制备预防和/或治疗癌症的药物的用途。
另一方面提供了编码抗GITR抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子。
另一方面提供了编码抗GITR抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子。
另一方面提供了重组载体，其携带编码抗GITR抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子和编码抗GITR抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子的组合，或者分离的重组载体，其分别携带编码抗GITR抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子和编码抗GITR抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子。重组载体可以是用于表达核酸分子的表达载体。
另一方面提供了锚定重组载体的重组细胞。
另一方面提供了生产抗GITR抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在宿主细胞中表达核酸分子的步骤。表达核酸分子的步骤可以是培养锚定核酸分子的宿主细胞或携带核酸分子的重组载体的步骤。该方法还可以包括在表达步骤之后从培养基中分离和/或纯化抗体的步骤。
技术方案
本文提供了与GITR结合的抗GITR抗体或其抗原结合片段及其医学用途。抗GITR抗体或其抗原结合片段充当GITR的激动剂以激活免疫(例如，增强效应T细胞功能、调节Treg活性、增加细胞因子分泌等)，因此发现了作为各种免疫活化剂和/或免疫治疗剂的应用。
如本文所用，术语“糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白”(GITR)指结合GITR配体(GITR-1)的TNF-受体超家族成员。GITR也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员18(TNFRSF18)、AITR或CD357。GITR不仅包括细胞天然表达的GITR，还包括其任何变体或同源异构体。在实施方案中，GITR可以是人GITR，或由UniProt检索号Q9Y5U5-1(NCBI检索号NP_004186.1；由NM_004195.3编码)、NCBI检索号NP_683699.1(由NM_148901.2编码)和NCBI检索号NP_683700.1(由NM_148902.1编码)，但不限于此。
下面，将给出本公开的详细描述。
抗体或抗原结合片段
一方面提供了与GITR结合的抗GITR抗体或其抗原结合片段。
抗GITR抗体或其抗原结合片段可以包含：
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)，
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)，
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)，
包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)，
包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)，和
包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。
在实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合片段可以包含：
包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)，
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)，
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)，
包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)，
包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)，和
包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。
在实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合片段可以包含：
(1)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3；
(2)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3；或
(3)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
本文中，互补决定区(CDR)通常是根据kabat系统定义的。
在实施方案中，本文提供的抗GITR抗体或其抗原结合片段中可能包含的六个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)总结于下表1中。
表1
(在表1中，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3各自代表重链互补决定区，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3各自代表轻链互补决定区)
在实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合片段可以包含：
重链可变区，其包含SEQ ID NO:1(例如，SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9)的CDR-H1，SEQ ID NO:2的CDR-H2和SEQ ID NO:3的CDR-H3，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4(例如，SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12)的CDR-L1，SEQ ID NO:5的CDR-L2和SEQ ID NO:6的CDR-L3。
在实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合片段可以包含：
(1)由包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3组成的重链可变区，和
由包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3组成的轻链可变区；
(2)由包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3组成的重链可变区，和
由包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3组成的轻链可变区；或者
(3)由包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3组成的重链可变区，和
由包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3组成的轻链可变区。
在实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合片段可以包含：
重链可变区，其包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合片段可以包含：
SEQ ID NO:13的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区；
SEQ ID NO:14的重链可变区和SEQ ID NO:20的轻链可变区；
SEQ ID NO:15的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区；
SEQ ID NO:16的重链可变区和SEQ ID NO:22的轻链可变区；
SEQ ID NO:17的重链可变区和SEQ ID NO:23的轻链可变区；或者
SEQ ID NO:18的重链可变区和SEQ ID NO:24的轻链可变区。
根据情况(例如，当重组产生时)，重链可变区和/或轻链可变区还可以在N-末端包含适当的信号序列。
本文提供的抗GITR抗体或其抗原结合片段中可能包含的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列在下表2中给出：
表2
(在表2中，下划线区域依次表示重链和轻链中的CDR1、CDR2和CDR3)
在实施方案中，本文提供的抗GITR抗体或其抗原结合片段可结合GITR蛋白内的一个或多于一个氨基酸，例如，人GITR蛋白内的一个或多于一个氨基酸(SEQ ID NO:33中的氨基酸残基26至241；其中氨基酸残基1至25是信号序列)，特别是序列上的氨基酸残基92至132中的一个或多于一个。例如，抗GITR抗体或其抗原结合片段可结合选自氨基酸残基92至96(SGTFS，SEQ ID NO:34)、107至116(TDCTQFGFLT，SEQ ID NO:35)和122至132(KTHNAVCVPGS，SEQ ID NO:36)的区域中的至少一个或这些区域内的至少一个氨基酸残基，例如选自92S(第92位氨基酸残基，Ser(S)，下文适用相同的解释)、96S、107T、110T、116T、122K和132S的至少一个氨基酸残基，但不限于此(人GITR的氨基酸残基位置从第26位氨基酸残基开始计数，排除信号序列(1至25))。
[人GITR(UniProt Q9Y5U5-1，SEQ ID NO:33，氨基酸残基1至25的区域(斜体)是信号序列)]
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV
如本文所述，术语“抗体”可以指特异性结合特定抗原的蛋白质，并且可以是通过刺激免疫系统中的抗原产生的蛋白质，或者是通过化学合成或重组产生的蛋白质，没有具体限制。抗体可以是非天然存在的，例如，通过重组或合成产生。抗体可以是动物抗体(例如，小鼠抗体等)、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
在本文提供的抗GITR抗体或其抗原结合片段中，除了上述定义的重链CDR和轻链CDR部分或重链可变区和轻链可变区之外的部分可以来源于免疫球蛋白的任何亚型(例如，IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM等)，以及例如来源于框架部分、和/或轻链恒定区和/或重链恒定区。在实施方案中，本文提供的抗GITR抗体可以是人IgG形式的抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，但不限于此。
完整的抗体(例如IgG型)具有两个全长轻链和两个全长重链的结构，其中每个轻链通过二硫键与相应的重链相连。抗体的恒定区分为重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区为gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)型，并具有gamma1(γ1)、gamma2(γ2)、gamma3(γ3)、gamma4(γ4)、alpha1(α1)或alpha2(α2)作为其亚类。轻链恒定区是kappa(κ)或kappa(λ)型。
在实施方案中，本文提供的抗GITR抗体可以包含作为重链恒定区的IgG恒定区和作为轻链恒定区的κ恒定区，但不限于此。
在实施方案中，IgG(例如，人IgG1)的恒定区可以是野生型。在另一个实施方案中，IgG的恒定区可以是在人IgG1上具有突变N298A(第298位氨基酸N被A取代)的变体，但不限于此。
如本文所用，术语“重链”可包括全长重链及其片段，其中全长重链包含包括足以提供抗原特异性的氨基酸序列的可变区VH、三个恒定区CH1、CH2和CH3以及铰链。术语“轻链”旨在包括全长轻链及其片段，其中全长轻链包含包括足以提供抗原特异性的氨基酸序列的可变区VL和恒定区CL。
术语“互补决定区”(CDR)指抗体可变区中赋予抗原结合特异性的部分，指免疫球蛋白重链或轻链高变区中发现的氨基酸序列。重链和轻链可以各自包含三个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3；以及CDRL1、CDRL2和CDRL3)。所述CDR可以提供在抗体与其抗原或抗原表位的结合中起重要作用的接触残基。如本文所用，术语“特异性结合”和“特异性识别”可具有与本领域普通技术人员已知的相同的一般含义，并表示抗体和抗原彼此特异性相互作用导致免疫应答。
本文所述的互补决定区(CDR)是根据kabat系统确定的。
在本公开中，除非特别说明，术语“抗体”可以理解为包括具有抗原结合能力的抗体的抗原结合片段。
本文使用的术语“抗原结合片段”可以指任何类型的多肽，其包括能够结合抗原的部分(例如，本文定义的6个CDR)，并且例如可以是scFv、scFv-Fc、(scFv)2、Fab、Fab'或F(ab')2，但不限于此。
在抗原结合片段中，Fab具有由轻链和重链可变区、轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)组成的结构，保留一个抗原结合位点。
Fab'不同于Fab之处在于Fab'在重链CH1结构域的C-末端包括具有至少一个半胱氨酸残基的铰链区。
F(ab')2抗体是通过Fab'铰链区半胱氨酸残基的二硫键桥接形成的。Fv是仅由重链可变区和轻链可变区组成的最小抗体片段。产生Fv片段的重组技术是本领域众所周知的。
双链Fv包括通过非共价键相互连接的重链可变区和轻链可变区。单链Fv通常包括重链可变区和轻链可变区，它们通过肽接头以共价键相互连接，或者直接在C-末端连接，以具有类似双链Fv的二聚体结构。
抗原结合片段可以使用蛋白酶获得(例如，Fab可以通过用木瓜蛋白酶限制性切割整个抗体获得，F(ab')2片段可以通过用胃蛋白酶切割获得)，或者可以通过使用基因重组技术制备。
术语“铰链区”指抗体重链中CH1和CH2结构域之间的区域，其功能是为抗体中的抗原结合位点提供柔性。
本文提供的抗体可以是单克隆抗体。可以使用本领域公知的方法制备单克隆抗体，例如使用噬菌体展示技术。或者，可以通过常规方法以动物(例如小鼠)来源的单克隆抗体的形式构建抗体。
同时，基于针对GITR受体结合结构域的结合潜力，可以使用典型的ELISA(酶联免疫吸附测定)方式筛选单个单克隆抗体。抑制活性可以通过功能分析来验证，例如用于验证结合组件的分子相互作用的竞争性ELISA，或者功能分析，例如基于细胞的分析。然后，关于根据其强抑制活性选择的单克隆抗体成员，可以分别验证它们与GITR受体结合结构域的亲和力(Kd值)。
最终选择的抗体可以被制备并用作人源化抗体以及人免疫球蛋白抗体，其中除了抗原结合部分之外的其余部分是人源化的。生产人源化抗体的方法是本领域众所周知的。
本文提供的抗GITR抗体的抗原结合片段可以指源自抗GITR抗体并保留抗GITR抗体的抗原(GITR)结合亲和力的片段。在实施方案中，抗原结合片段可以是包括如上所述的抗GITR抗体的6个CDR的多肽，并且例如可以是scFv、scFv-Fc、scFv-Ck(κ恒定区)、scFv-Cλ(λ恒定区)、(scFv)2、Fab、Fab'或F(ab')2，但不限于此。在实施方案中，抗原结合片段可以是融合多肽，其中scFv或scFv融合到免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等)的Fc区(scFv-Fc)或轻链恒定区(例如κ或λ)(scFv-Ck或scFv-Cλ)，但不限于此。
在本公开中，抗体(例如，CDR、可变区、或重链/轻链、抗原结合片段等)“包括(包含)特定的氨基酸序列”或“由特定的氨基酸序列组成或表达特定的氨基酸序列”是指基本上包括该氨基酸序列，和/或在该氨基酸序列中引入不影响抗体活性(例如抗原结合亲和力、药理学活性)的不显著突变(例如氨基酸残基的取代、缺失和/或添加)。
本文提供的抗GITR抗体或其抗原结合片段对GITR(例如，人GITR)的结合亲和力(KD)可为10mM或少于10mM、5mM或少于5mM、1mM或少于1mM、0.5mM或少于0.5mM、0.2mM或少于0.2mM、0.1mM或少于0.1mM、0.05mM或少于0.05mM、0.01mM或少于0.01mM、0.005mM或少于0.005mM、或0.001mM或少于0.001mM，例如0.0001nM至10mM、0.0005nM至10mM、0.001nM至10mM、0.005nM至10mM、0.01nM至10mM、0.05nM至10mM、0.1nM至10mM、0.5nM至10mM、1nM至10mM、0.0001nM至5mM、0.0005nM至5mM、0.001nM至5mM、0.005nM至5mM、0.01nM至5mM、0.05nM至5mM、0.1nM至5mM、0.5nM至5mM、1nM至5mM、0.0001nM至1mM、0.0005nM至1mM、0.001nM至1mM、0.005nM至1mM、0.01nM至1mM、0.05nM至1mM、0.1nM至1mM、0.5nM至1mM、1nM至1mM、0.0001nM至0.5mM、0.0005nM至0.5mM、0.001nM至0.5mM、0.005nM至0.5mM、0.01nM至0.5mM、0.05nM至0.5mM、0.1nM至0.5mM、0.5nM至0.5mM、1nM至0.5mM、0.0001nM至0.2mM、0.0005nM至0.2mM、0.001nM至0.2mM、0.005nM至0.2mM、0.01nM至0.2mM、0.05nM至0.2mM、0.1nM至0.2mM、0.5nM至0.2mM、1nM至0.2mM、0.0001nM至0.1mM、0.0005nM至0.1mM、0.001nM至0.1mM、0.005nM至0.1mM、0.01nM至0.1mM、0.05nM至0.1mM、0.1nM至0.1mM、0.5nM至0.1mM、1nM至0.1mM、0.0001nM至0.05mM、0.0005nM至0.05mM、0.001nM至0.05mM、0.005nM至0.05mM、0.01nM至0.05mM、0.05nM至0.05mM、0.1nM至0.05mM、0.5nM至0.05mM、1nM至0.05mM、0.0001nM至0.01mM、0.0005nM至0.01mM、0.001nM至0.01mM、0.005nM至0.01mM、0.01nM至0.01mM、0.05nM至0.01mM、0.1nM至0.01mM、0.5nM至0.01mM或1nM至0.01mM，通过表面等离子体共振测量(SPR例如，Biacore)，但不限于此。
另一方面提供了多肽分子，其包括重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3或其组合)、轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3或其组合)、其组合；或前述抗GITR抗体中的重链可变区、轻链可变区或其组合。
多肽分子可作为抗体前体用于制备抗体，或包含在具有抗体样结构的蛋白质支架(例如，肽抗体、纳米抗体)、双特异性抗体或多特异性抗体中作为其组分(例如，CDR或可变区)。
如本文所用，术语“肽抗体”(肽+抗体)指具有与抗体相似的框架和功能的融合蛋白，其中肽与抗体的整个或部分恒定区如Fc区融合，并充当抗原结合位点(重链和/或轻链CDR或可变区)。
如本文所用，术语“纳米抗体”被称为单结构域抗体，是指包含单体形式抗体的单个可变结构域的抗体片段，其表现出以与具有完整结构的抗体相似的方式选择性结合特定抗原的特征。纳米抗体的分子量通常为约12kDa至约15kDa，这与完整抗体(包括两条重链和两条轻链)的正常分子量(约150kDa或约160kDa)相比非常小，并且在某些情况下小于Fab片段或scFv片段。
本文所用术语“多特异性抗体”(包括双特异性抗体)是指识别和/或结合两种或多于两种不同抗原，或识别和/或结合同一抗原不同位点的抗体，多特异性抗体的一个抗原结合位点可包括上述多肽、抗体或抗原结合片段，以结合GITR。
本文提供的与GITR结合的多肽、抗体或抗原结合片段可以与选自有用的聚合物、标记等的至少一种的缀合物的形式使用。
有用的聚合物可以是例如增加多肽、抗体和/或抗原结合片段的体内半衰期的非蛋白质聚合物，并且可以是选自聚乙二醇(PEG)(例如，2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa PEG)、葡聚糖、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)等的至少一种亲水聚合物，但不限于此。
标记可以是至少一种放射性核苷酸或荧光或化学发光的小化学物质，其选自稀土螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、152Eu、丹磺酰、伞形酮、虫荧光素、鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳族吖锭酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、水母发光蛋白标记、2,3-二氢酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记和稳定自由基，但不限于此。
医药用途
本文提供的抗GITR抗体或其抗原结合片段充当GITR(GITR激活)的激动剂，并起到激活免疫(例如，增强效应T细胞功能、调节Treg活性、增加细胞因子分泌等)的作用。因此，抗GITR抗体或其抗原结合片段可用于免疫增强，并可在免疫相关疾病，特别是癌症的预防和/或治疗中找到有利的应用。
另一方面提供了免疫增强剂或免疫增强药物组合物，各自包含抗GITR抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了用于预防和/或治疗免疫相关疾病的药物组合物，其包含抗GITR抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了用于预防和/或治疗癌症的抗癌剂或药物组合物，各自包含抗GITR抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
另一方面提供了免疫增强方法，该方法包括向需要免疫增强的对象施用药学有效量的抗GITR抗体或其抗原结合片段的步骤。免疫增强方法还可以包括在施用步骤之前识别需要免疫增强的对象的步骤。
另一方面提供了用于预防和/或治疗免疫相关疾病的方法，该方法包括向需要免疫相关疾病预防和/或治疗的对象施用药学有效量的抗GITR抗体或其抗原结合片段的步骤。预防和/或治疗免疫相关疾病的方法还可以包括在施用步骤之前识别需要免疫相关疾病预防和/或治疗的对象的步骤。
另一方面提供了用于预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括向需要癌症预防和/或治疗的对象施用药学有效量的抗GITR抗体或其抗原结合片段的步骤。用于预防和/或治疗癌症的方法还可以包括在施用步骤之前识别需要癌症预防和/或治疗的对象的步骤。
另一方面提供了抗GITR抗体或其抗原结合片段用于免疫增强或用于制备免疫增强剂的用途。
另一方面提供了抗GITR抗体或其抗原结合片段用于预防和/或治疗免疫相关疾病或用于制备预防和/或治疗免疫相关疾病的药物的用途。
另一方面提供了抗GITR抗体或其抗原结合片段用于预防和/或治疗癌症或用于制备预防和/或治疗癌症的药物的用途。
如本文所用，术语“免疫增强”(或增强免疫力)是指诱导对抗原的初始免疫应答或增强现有的免疫应答，并且可以与术语免疫刺激、免疫增加、免疫活化等互换使用。在实施方案中，免疫增强可以通过选自免疫细胞(效应T细胞，如细胞毒性T细胞；CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞等)、调节性T(Treg)细胞的失活和/或耗竭、免疫蛋白(例如，细胞因子等)的产生和/或分泌增加来实现，但不限于此。
如本文所用，术语“免疫相关疾病”包括由免疫系统的损伤和/或活性不足引起的所有疾病。免疫相关疾病的实例包括癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病等，但不限于此。
癌症可以是实体癌或血液癌，但不限于此，并且可以是选自鳞状细胞癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌等)、腹膜癌、皮肤癌、黑色素瘤(如皮肤或眼内黑色素瘤等)、直肠癌、食道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肝癌、胃癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌(例如结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌等)、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、头颈癌、脑癌和骨肉瘤中的至少一种。
对癌症的预防和/或治疗效果包括抑制癌细胞的产生和/或生长以及抑制由于迁移、侵袭、转移等导致的癌症恶化的所有效果。
传染性疾病、自身免疫性疾病和炎症性疾病可选自可以通过前述免疫增强(例如，免疫细胞(效应T细胞，如细胞毒性T细胞；CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞等)、调节性T(Treg)细胞的活性抑制和/或耗竭、免疫蛋白(例如，细胞因子(IL-2、IFN-γ等)等)的产生和/或分泌增加来治疗、缓解和/或预防的所有传染性疾病、自身免疫性疾病和炎症性疾病。例如，传染性疾病是当病原体，例如病毒、细菌、真菌和寄生虫，扩散并侵入活体(例如包括人类在内的动物)时产生的疾病的通称。它们可以是由选自病毒、细菌、真菌、寄生虫等的一种或多于一种病原体引起的感染或疾病。自身免疫性疾病可选自类风湿性关节炎、1型糖尿病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、白塞氏病综合征、狼疮、干燥综合征、重症肌无力、硬皮病、甲状腺功能减退、甲状腺机能亢进、银屑病、白癜风、多发性硬化症、自身免疫性肝炎、自身免疫性肾炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性脑炎、细胞因子风暴等，但不限于此。术语“炎症性疾病”指炎症(例如，慢性炎症或急性炎症)或由炎症引起的疾病。炎症性疾病的实例包括心脏炎症(例如，冠状动脉疾病、心绞痛、心肌梗塞、心包炎、心肌炎等)、血管炎症(如动脉粥样硬化、血管炎、弥散性血管内凝血(DIC)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、贫血等)、上呼吸道炎症(如急性鼻咽炎、过敏性鼻炎、鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎、喉炎等)、下呼吸道和/或肺部炎症(例如支气管炎、支气管扩张症、哮喘、慢性活动性肺疾病(COPD)、肺炎、间质性肺病、结核病等)、上胃肠道炎症(如胃炎、食管炎等)、下胃肠道炎症(如肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、乳糜泻、憩室炎、肠易激综合征、阑尾炎、肛周瘘等)、肝脏、胆道和/或胰腺的炎症(例如，肝炎、脂肪肝、胆管炎、胆囊炎、胰腺炎、1型糖尿病等)、肾脏(上尿路)炎症(如肾盂肾炎、肾小球肾炎、尿路感染等)、下尿路炎症(例如，尿路感染、输尿管炎、尿道炎、膀胱炎、前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征等)、甲状腺和/或甲状旁腺炎症(如甲状腺炎、甲状旁腺炎等)、肾上腺炎症(如肾上腺炎等)、生殖器炎症(如盆腔炎、卵巢炎、睾丸炎、附睾炎等)、骨和/或关节炎症(例如，骨关节炎、类风湿性关节炎、骨髓炎、滑膜炎等)、皮肤炎症(如皮肤:蜂窝组织炎、丹毒、花斑癣、足癣、痤疮等)、肌肉炎症(如肌炎等)、脑部炎症(如脑炎、重度抑郁症等)、神经炎症(如眼、耳等各部位的神经炎、复杂区域性疼痛综合征、格林-巴利综合征等)、眼部炎症(例如，麦粒肿、葡萄膜炎、结膜炎等)、耳部炎症(如中耳炎、乳突炎等)、口腔炎症(例如，口腔炎、牙周炎、牙龈炎等)、全身炎症(如全身炎症反应综合征(脓毒症)、代谢综合征相关疾病等)、腹膜炎、再灌注损伤、移植排斥反应和超敏反应，但不限于此。
本文提供的抗GITR抗体、其抗原结合片段和/或包含其的药物组合物可施用于任何动物或细胞，例如选自哺乳动物的动物，包括灵长类如人和猴、啮齿类如大鼠、小鼠等、或来源于(分离自)动物的细胞、组织、体液(例如血清)、或其培养物，例如分离自人类的细胞、组织、体液(血清)。
除了作为活性成分的抗GITR抗体或其抗原结合片段之外，药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于蛋白质药物的制剂中，并且可以是选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油中的至少一种，但不限于此。该药物组合物还可以包括选自稀释剂、赋形剂、润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等中的至少一种，它们通常用于药物组合物的制备。
抗GITR抗体、其抗原结合片段和/或药物组合物可以通过口服或胃肠外途径施用。对于肠胃外施用，可能会采取静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮内施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠内施用等。由于口服施用时蛋白质或肽被消化，所以用于口服施用的组合物中的活性成分可以被包衣或配制以防止在胃中消化。
此外，抗GITR抗体、其抗原结合片段和/或药物组合物可以是在油或水介质中的溶液、混悬剂、糖浆剂或乳剂的形式，或者可以配制成提取物、粉剂、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊、注射剂等。该组合物还可以包含分散剂或制剂稳定剂。
药物组合物中抗GITR抗体或其抗原结合片段的含量或其剂量可以根据各种因素来确定，例如配制方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别、病理、膳食和施用时间、施用间隔、施用途径、排泄率、应答敏感性等。基于活性成分(抗GITR抗体或抗原结合片段)，药物组合物可以以0.00001mg/kg至1000mg/kg、0.00001mg/kg至500mg/kg、0.00001mg/kg至100mg/kg、0.00001mg/kg至50mg/kg、0.0001mg/kg至1000mg/kg、0.0001mg/kg至500mg/kg、0.0001mg/kg至100mg/kg、0.0001mg/kg至50mg/kg、0.001mg/kg至1000mg/kg、0.001mg/kg至500mg/kg、0.001mg/kg至100mg/kg、0.001mg/kg至50mg/kg、0.01mg/kg至1000mg/kg、0.01mg/kg至500mg/kg、0.01mg/kg至100mg/kg、0.01mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至1000mg/kg、0.1mg/kg至500mg/kg、0.1mg/kg至100mg/kg、或0.1mg/kg至50mg/kg的日剂量施用，但不限于此。
日剂量可以配制成单位剂量形式的一种制剂，配制成适当的部分，或通过将其置于多剂量容器中来制备。此外，在本说明书中，药物有效量是指能够显示活性成分的期望药理活性的活性成分的量，并且可以在上述剂量范围内。
多核苷酸和表达载体的构建、及抗体的制备
另一方面提供了编码抗GITR抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子。在实施方案中，核酸可以包括SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12的核酸序列。
另一方面提供了编码抗GITR抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸。在实施方案中，核酸可以包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14的核酸序列。
另一方面提供了重组载体，其携带编码抗GITR抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子和编码抗GITR抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子的组合，或者分离的重组载体，其分别携带编码抗GITR抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子和编码抗GITR抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子。重组载体可以是用于表达核酸分子的表达载体。
另一方面提供了锚定重组载体的重组细胞。
如本文所用，术语“载体”指用于在宿主细胞中表达靶基因的手段，例如质粒载体、粘粒载体和病毒载体，如噬菌体载体、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。重组载体可以通过操作质粒(例如，pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pUC19等)、噬菌体(例如λgt4λB、λ-Charon、λδZ1、M13等)或者病毒载体(例如，SV40等)来构建，这是本领域中常用的。
在重组载体中，核酸分子可以与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”指感兴趣的核苷酸序列和表达调控序列(例如，启动子序列)之间的功能性连接。当被“可操作地连接”时，调节元件可以控制感兴趣的多核苷酸的转录和/或翻译。
重组载体通常可以构建为克隆载体或表达载体。对于重组表达载体，可以使用相关领域中通常可获得的用于在植物、动物或微生物细胞中表达外源蛋白的载体。本领域众所周知的各种方法可用于构建重组载体。
为了在宿主如原核或真核细胞中使用，可以相应地构建重组载体。例如，当载体被构建为用于原核宿主的表达载体时，该载体通常包括用于转录的强启动子(例如，pLλ启动子、CMV启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、T7启动子等)、用于起始翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。另一方面，用于真核宿主的表达载体包括在真核细胞中可操作的复制起点，例如f1复制起点、SV40复制起点、pMB1复制起点、腺病毒复制起点、AAV复制起点和BBV复制起点，但不限于此。此外，表达载体通常包括来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子、HSV的tk启动子等)，和作为转录终止序列的聚腺苷酸化序列。
可以通过将重组载体导入合适的宿主细胞来制备重组细胞。只要它允许重组载体以稳定的方式顺序克隆和表达，本领域已知的任何宿主细胞都可以用于本公开。可用于本发明的原核宿主细胞的实例可选自大肠杆菌，例如大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776、大肠杆菌W3110、芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，以及肠杆菌科菌株如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和各种假单胞菌。可用于转化的真核宿主细胞可选自但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞，例如Sp2/0、CHO(中国仓鼠卵巢)K1、CHO DG44、CHO S、CHO DXB11、CHO GS-KO、PER.C6、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、Huh7、3T3、RIN、MDCK等。
可以使用相关领域公知的方法将核酸分子或携带该核酸分子的重组载体递送(导入)到宿主细胞中。例如，当宿主细胞是原核细胞时，可以使用CaCl2或电穿孔方法进行这种递送。对于真核宿主细胞，可以使用但不限于显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染或粒子轰击来实现基因导入。
根据本领域众所周知的方法，为了选择转化的宿主细胞，可以利用与选择标记相关的表型。例如，当选择标记是赋予对某种抗生素抗性的基因时，宿主细胞可以在抗生素存在的培养基中生长，以选择感兴趣的转化体。
另一方面提供了生产抗GITR抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在宿主细胞中表达核酸分子的步骤。在宿主细胞中表达核酸分子的步骤可以是培养锚定核酸分子的细胞或携带核酸分子的重组载体的步骤。该方法还可以包括在培养步骤后从培养基中分离和/或纯化抗体或抗原结合片段的步骤。
有益效果
作为GITR的激动剂，本文提供的抗GITR抗体或其抗原结合片段具有激活免疫(例如，增强效应T细胞功能、调节Treg活性、增加细胞因子分泌等)的功能，并因此可作为各种免疫激活剂和/或免疫治疗剂得到有利的应用。
附图说明
图1a和图1b显示了根据实施方案的嵌合和人源化抗体的重链(1a)和轻链(1b)的序列比对。
图2显示了根据实施方案的抗GITR抗体的表位作图结果。
图3a是显示根据实施方案的抗GITR抗体与其抗原(人GITR)的结合亲和力的图表。
图3b显示了根据实施方案的抗GITR抗体对人类原代免疫细胞中GITR的结合亲和力。
图4显示了根据实施方案的抗GITR抗体的GITR激动效力。
图5a至图5d是显示在用根据实施方案的抗GITR抗体处理后，人原代T细胞中细胞因子产生水平的图表，分析了CD4+T细胞中的IL-2水平(5a)、CD4+T细胞中的IFN-γ水平(5b)、CD8+T细胞中的IL-2水平(5c)和CD8+T细胞中的IFN-γ水平(5d)。
图6显示了说明根据实施方案的抗GITR抗体对人T细胞中细胞因子产生的增强作用的图表。
图7a和图7b显示了根据实施方案的抗GITR抗体对NK细胞的增殖作用，分析了分离的NK细胞的增殖水平(7a)和含NK细胞的PBMC的增殖水平(7b)。
图8是显示根据实施方案的抗GITR抗体的T细胞增殖作用的图表。
图9a是显示用根据实施方案的抗GITR抗体处理后NK细胞表面上CD107a的表达水平。
图9b是显示用根据实施方案的抗GITR抗体处理后Treg细胞数量的图表。
图10a和图10b是显示根据实施方案的抗GITR抗体对肿瘤细胞(卵巢癌细胞)的杀伤效果的图表。
图11显示了说明根据实施方案的抗GITR抗体在分离自结肠直肠癌患者的T细胞中增加细胞因子产生作用的图表。
图12显示了说明根据实施方案的抗GITR抗体在分离自肺癌患者的T细胞中增加细胞因子产生作用的图表。
图13显示了说明根据实施方案的抗GITR抗体在分离自肝癌患者的T细胞中增加细胞因子产生作用的图表。
图14是显示用根据实施方案的抗GITR抗体处理后肿瘤动物模型中肿瘤大小的图表。
实施例
通过以下实施例可以更好地理解本发明，这些实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明。对于本领域技术人员来说，显然可以在不脱离本发明主旨的情况下修改以下实施例。
实施例1：抗GITR抗体的构建
1.1.抗GITR单克隆抗体的制备
用免疫原(GITR蛋白，纯度>90％，哺乳动物表达；Genscript)免疫10只小鼠(5只Balb/c和5只C57/bl6)。
免疫计划如下：
初次免疫：每只动物皮下注射50μg人GITR蛋白(Q9Y5U5-1)；
第一次增强：T＝14天，每只动物腹腔注射25μg人GITR蛋白；
第二次增强：T＝28天，每只动物皮下注射25μg人GITR蛋白；
最终增强：T＝56±7天，每只动物腹腔注射25μg人GITR蛋白。
细胞融合和筛选
从免疫小鼠的脾脏中收集B淋巴细胞，并与SP2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。这种细胞融合是通过电融合进行的。观察到融合效率约为每3000个B细胞1个杂交瘤。将从每次细胞融合中获得的所有融合细胞铺在96孔板中。每次融合最多使用50块板。
随后进行初级蛋白筛选和FACS确认筛选。使用针对免疫抗原(可溶性GITR蛋白)的ELISA进行初级蛋白筛选。使用稳定表达GITR的细胞系(Genscript)进行FACS，并筛选来自初级筛选结果的阳性上清液。
之后，进行配体结合筛选。通过ELISA筛选先前筛选的阳性克隆，以检查这些克隆是否阻断或增强GITR与GITRL的结合。选择特异性阳性克隆用于随后的一轮亚克隆。
亚克隆和扩增
一轮亚克隆和杂交瘤培养上清液收集：每个单克隆细胞选自先前用于分析目的选择的亲代克隆。从24孔板上收集每个扩增克隆的培养上清液，体积为1mL，测定培养上清液中的抗体浓度。
亚克隆：从每个选择的融合中获得的阳性原代克隆通过限制稀释来亚克隆，以确保这些亚克隆来自单个细胞。这些克隆传至3代。
亚克隆筛选：使用ELISA或HTP FACS筛选这些亚克隆。
使用两轮间接ELISA针对抗原(Genscript)筛选杂交瘤组织培养物的上清液。使用间接ELISA的竞争试验进一步测试阳性克隆上的配体结合抑制。将选择的克隆与GITR过表达的CHO细胞共培养，进行FACS以检测GITR结合。
完全亚克隆：对于每种从细胞融合获得的单克隆，进一步进行两轮亚克隆以获得稳定的亚克隆。
抗体序列测序
根据制造商的说明，使用试剂(Ambion，Cat.15596-026)从杂交瘤细胞中分离总RNA。随后，根据制造商的指南使用PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒(Takara，Cat.6110A)，通过通用引物或同种型特异性反义引物将总RNA逆转录成cDNA。扩增抗体重链和轻链的片段，并将每个片段克隆到标准克隆载体中。进行菌落PCR以选择具有正确插入片段大小的克隆。
分析代表所选克隆的抗GITR单克隆抗体克隆的抗GITR单克隆抗体(51B克隆)的重链和轻链可变区的氨基酸序列，结果在下表3中给出。
表3
(在表3中，带下划线的区域依次表示重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3，斜体表示信号序列)
1.2.小鼠抗GITR克隆的人源化
使用Swiss PDB生成抗体可变区(V区)的结构模型，并进行分析以识别V区中对抗体结合特征潜在必需的关键“限制性(constraining)”氨基酸。包括在CDR内的大多数残基(使用Kabat和Chothia定义)以及许多结构残基被评估为重要的。
基于结构分析，选择可用于创建人源化变体的人序列片段，并采用iTope-AI技术(ABZENAplc)对结合人MHC II类等位基因的肽进行计算机分析。对于CDR之外和一侧的区域，广泛选择的人序列片段被证实可用作新的人源化可变区域的组成部分，而可用序列的选择在CDR区域缩小。只要有可能，就丢弃被识别为人MHC II类的重要的非人类种系结合物的序列片段。这减少了片段集，使用上述方法重新分析这些片段的组合，以确认片段之间的连接不包含潜在的T细胞表位。
为了产生缺乏(当可能时)或具有减少的显著T细胞表位的可变区序列，组装选择的序列片段。为哺乳动物细胞表达基因合成和配对设计了五条重链(VH1至VH5)和五条轻链(VL1至VL5)序列(表4)。
重链和轻链结合产生一个嵌合抗体(VH0/VL0)和25个人源化抗体的实例如下表4所示：
表4
嵌合抗体(VH0xVL0)和人源化抗体的序列，通过将表4的组合应用于表3的51B克隆而获得，在表5和表6以及图1a和图1b中给出。在表5和表6以及图1a(重链可变区)和图1b(轻链可变区)的序列中，根据Kabat定义确定氨基酸编号和CDR区，并且在图1a和图1b中，从上面确定的CDR和亲代序列(VH0或VL0)改变的氨基酸残基用阴影表示。
表5重链(恒定区：人IgG1)
表6轻链(恒定区：kappa)
在以下实施例中，相同的轻链克隆可以表示为VL或Vk。例如，VL0、VL1、VL2、VL3、VL4和VL5分别指代与Vk0、Vk1、Vk2、Vk3、Vk4和Vk5相同的克隆。
在产生的抗体中，通过将N298A点突变引入51B VH0/VL0嵌合抗体重链的Fc区，产生了Fc工程化变体。表7列出了含有Fc-工程化变体的抗体的重链和轻链序列。
表7
(在表7中，可变区域下划线，Fc区域的突变氨基酸残基被保留)
1.3.嵌合和人源化IgG1抗体的瞬时表达
使用PEI转染方法，将VH0/VL0嵌合抗体的编码DNA、两种参考抗体编码DNA和人源化重链和轻链组合的编码DNA(总共25种人源化配对)瞬时转染到6孔板中的HEK293EBNA贴壁细胞(LGC Standards,Teddington,UK)中。转染后，细胞培养7天。收集样品，基于人IgG1抗体标准，使用蛋白A生物传感器(Molecular Devices,Wokingham,Berkshire,UK)在OctetQk384上测量抗体浓度。
获得的结果列于下表8中：
表8
表8显示了在HEK细胞中表达嵌合抗体(VH0/VL0)和25种人源化抗体组合后上清液中的IgG浓度(μg/mL)。
如表8所示，所有测试的抗体通常都是良好表达的。
1.4.嵌合和人源化抗GITR抗体的单循环动力学分析
为了评估所有选择的变体(人源化抗体)与人GITR抗原的结合，并选择亲和力最接近嵌合(VH0/VL0)抗体的先导人源化IgG抗体，对转染细胞培养物的上清液进行单循环动力学分析。在25℃的条件下，使用运行Biacore 8K控制软件V3.0.12.15655和BiacoreInsight评估软件V3.0.12.15655(Cytiva,Uppsala,Sweden)的Biacore 8K进行动力学实验。
补充有1％ BSA w/v(Sigma,Dorset,UK)(以减少与参考表面的非特异性结合)的HBS-P+(Cytiva,Uppsala,Sweden)用作运行缓冲液，也用于配体和分析物的稀释。将含有IgG的上清液在运行缓冲液中稀释至1μg/mL。在每个循环开始时，将稀释液加载到蛋白A传感器芯片(Cytiva,Little Chalfont,UK)的通道1至通道8的Fc2上。以10μL/min的流速捕获IgG抗体，确保固定化水平(RL)达到约130RU。然后，稳定表面。
为了使潜在的传质效应最小化，以40μL/min的流速注射的重组人GITR(CatNo.13643-H08H，Lot No.LC12JA2509，Sino Biological，北京，中国)被用作分析物，以获得单循环动力学数据。通过加倍(5点)将抗原在运行缓冲液中稀释至浓度范围为0.6125nM至10nM，并且在每个浓度之间无需再生即可使用。每次注射5种增加的抗原浓度时，监测结合相200秒，最后一次注射抗原后，测量单解离相600秒。通过单次注射10mM甘氨酸(pH 1.5)来再生传感器芯片表面。
双参考传感图符合Langmuir(1:1)结合模型，使用卡方值评估数据对模型的准确性(接近度)，卡方值解释了实验和拟合(观察和预期)曲线之间的偏差。拟合算法被设计成最小化卡方值。
获得的结果总结在表9中：
表9
表9显示了使用Biacore 8K测量的嵌合(VH0/VL0)和人源化变体与人GITR抗原结合的单循环动力学参数。通过将人源化变体的KD除以在同一实验中分析的VH0/VL0嵌合抗体的KD来计算相对KD。
如表9所示，与VH0/VL0相比，观察到与所有测试的人源化变体(抗体)与人GITR的结合相关的KD值在5.9倍以内。考虑到相对表达水平、人源化百分比、MHC II类结合风险和相对KD值(从对上清液的Biacore单循环动力学分析中获得)，选择六种人源化变体(VH3/VL1、VH3/VL3、VH3/VL4、VH3/VL5、VH4/VL3和VH4/VL4)用于随后的热稳定性分析。
1.5.热稳定性评估
为了从抗体从其天然状态转变为变性状态(解折叠)的温度获得关于抗体热稳定性的信息，进行了热升温稳定性实验(Tm和Tagg)。这种解折叠过程发生在狭窄的温度范围内，这种转变的中点被称为“解链温度”或“Tm”。因为蛋白质在这一点上经历了构象变化，所以测量Sypro Range(其结合到蛋白质的暴露疏水区域)的荧光以确定蛋白质的解链温度。
样品在PBS中稀释至最终测试浓度为0.5mg/mL，Sypro Orange(160×储备溶液；Sigma-Aldrich)加入到最终浓度为20×的溶液中。将每种样品混合物装入UNi微量比色皿两次，每次9μL。对样品进行从15℃到95℃的热升温(升温速率为0.3℃/分钟，激发波长为473nm)。收集从250nm至720nm的完整发射光谱，并且使用510nm至680nm之间的曲线下面积来计算过渡曲线的拐点(Tonse和Tm)。监测473nm处的静态光散射(SLS)以检测蛋白质聚集，并从所得SLS曲线计算Tagg(聚集开始)。使用UNcleTM软件4.0版本(ABZENA)进行数据分析。
表10显示了使用UNcle生物稳定性平台获得的人源化和嵌合抗体的热稳定性值。
表10
如表10所示，大多数人源化抗体表现出相当于或优于嵌合抗体的热稳定性。
1.6.使用多循环动力学分析测量人源化变体的亲和力
为了测量嵌合抗体和六种主要人源化变体(VH3/VL1、VH3/VL3、VH3/VL4、VH3/VL5、VH4/VL3和VH4/VL4)对人GITR抗原的结合亲和力，对纯化的蛋白质(抗体)进行了多循环动力学分析。动力学实验在25℃下使用Biacore 8K控制软件V3.0.12.15655和BiacoreInsight评估软件V3.0.12.15655(Cytiva,Uppsala,Sweden)进行。
补充有1％ BSAw/v(Sigma,Dorset,UK)的HBS-EP+(Cytiva,Uppsala,Sweden)用作运行缓冲液，也用于配体和分析物的稀释。将纯化的先导抗体在运行缓冲液中稀释至1μg/mL，并在每个循环开始时，将它们加载到蛋白A传感器芯片(Cytiva,Little Chalfont,UK)的通道1至8的Fc2上。以10μL/min的流速捕获抗体，直到固定化水平(RL)达到约120RU。然后，稳定表面。
为了将潜在的传质效应降至最低，使用重组人GITR(Sino Biological，北京，中国)作为分析物，并以30μL/min的流速注射，以获得多循环动力学数据。将抗原(GITR)在运行缓冲液中稀释，浓度范围为1.25nM至40nM，在六个点稀释两倍。在每个浓度下，监测缔合相210秒，测量解离相1200秒。用10mM甘氨酸(pH1.5)的单次注射在循环之间再生传感器芯片表面。为了确保表面和分析物在动力学循环中的稳定性，将两种分析物浓度的重复空白和重复注射编程到动力学运行中。
嵌合抗体(VH0/VL0)和六种主要抗体的结果如表11所示。
表11
表11显示了使用Biacore 8K测量的纯化的六种人源化抗体和嵌合抗体(VH0/VL0)与人GITR抗原的结合参数。
如表11所示，所有测试的抗体都表现出与人GITR的优异结合，并且人源化抗体都表现出高结合能力，其结合能力是VH0/VL0嵌合抗体的1.5倍。
1.7.表位作图
为了以高分辨率确定GITR/51B复合物的表位，将蛋白质复合物与氘化交联剂一起孵育，然后进行多酶切割。交联肽富集后，使用高分辨率质谱仪(nLC-Q-exact Ms)进行分析。使用XQuest和Stavrox软件分析生成的数据。
使用nLC色谱结合Q-精确质谱进行分析。
hGITR混合物(包括His标签；Cat.GIR-H5228，Acrobiosystems)和51B抗体以下列浓度制备：
表12
将如上制备的20μL GITR/51B混合物与2μL DSS d0/d12(2mg/mL，DMF)混合，并在室温下孵育180分钟。孵育后，加入1μL碳酸氢铵(终浓度20mM)终止反应，然后在室温下再孵育1小时。然后使用真空离心蒸发浓缩器干燥该溶液，随后悬浮在8M尿素水溶液(20μL)中。混合后，加入2μL DTT(500mM)。该混合物在37℃下孵育一小时。随后，加入2μL碘乙酰胺(1M)，混合物在室温下黑暗中再培养1小时。孵育后，加入80μL蛋白质缓冲液。对于蛋白质缓冲液，胰蛋白酶缓冲液含有50mM Ambic pH 8.5和5％乙腈；胰凝乳蛋白酶缓冲液含有100mMTris HCl和10mM CaCl2 pH 7.8；ASP-N缓冲液含有pH 7.8的50mM磷酸盐缓冲液；弹性蛋白酶缓冲液含有50mM Tris HCl pH 8.0；嗜热菌蛋白酶缓冲液含有50mM Tris HCl和0.5mMCaCl2 pH 9.0。
蛋白酶反应如下进行：
-胰蛋白酶水解
将100μL制备的还原/烷基化GITR/51B混合物以1/100的比例与0.7μL胰蛋白酶(Promega)混合。蛋白质消化混合物在37℃孵育过夜。
-胰凝乳蛋白酶水解
将100μL制备的还原/烷基化GITR/51B混合物以1/200的比例与0.5μL胰凝乳蛋白酶(Promega)混合。蛋白质消化混合物在25℃孵育过夜。
-ASP-N蛋白水解
将100μL制备的还原/烷基化GITR/51B混合物以1/200的比例与0.5μL ASP-N(Promega)混合。蛋白质消化混合物在37℃孵育过夜。
-弹性蛋白酶水解
将100μL制备的还原/烷基化GITR/51B混合物以1/100的比例与0.7μL弹性蛋白酶(Promega)混合。蛋白质消化混合物在37℃孵育过夜。
-嗜热菌蛋白酶水解
将100μL制备的还原/烷基化GITR/51B混合物以1/50的比例与1.4μL嗜热菌蛋白酶(Promega)混合。蛋白质消化混合物在70℃孵育过夜。
降解后，加入甲酸至最终浓度为1％(v/v)。
使用Xquest 2.0版分析交联肽。
在GITR/51B蛋白复合物的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、ASP-N、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶水解(用氘化d0d12)后，通过nLC-orbitrap MS/MS分析检测到GITR和51B之间的12个交联肽。
作为分析的结果，在GITR氨基酸序列(SEQ ID NO:33的氨基酸26至241)上，氨基酸92S(从SEQ ID NO:33的第26个氨基酸起的第92个残基Ser，下文以相同方式解释)，96S，107T，110T，116T，122K和132S被证实与51B抗体特异性交联，并且下列氨基酸序列被证实为GITR上的表位：
1)残基92至96(SGTFS，SEQ ID NO:34)
2)残基107至116(TDCTQFGFLT，SEQ ID NO:35)
3)残基122至132(KTHNAVCVPGS，SEQ ID NO:36)
图2描述了GITR上识别的表位区域。图2说明了GITR和51B之间的相互作用位点。GITR PDB结构7KHD中的表位区域以深色阴影表示。GITR蛋白结构中深色阴影的氨基酸对应于GITR序列的序列92至96(SGTPS，SEQ ID NO:34)，107至116(TDCTQFGFLT，SEQ ID NO:35)，和122至132(KTHNAVCVPGS，SEQ ID NO:36)。在图2中，A、B、C、D和E表示带状/表面表示的前视图(A)、后视图(B)、侧视图1(C)、侧视图2(D)和平面视图(E)，而F、G、H、I和J分别表示带状表示的前视图(F)、后视图(G)、侧视图1(H)、侧视图2(I)和平面视图(J)。
1.8.抗GITR抗体对人GITR蛋白的特异性和结合亲和力
1.8.1.抗GITR抗体与人GITR(hGITR)蛋白的结合分析(通过ELISA)
用浓度为1μg/mL的重组人GITR蛋白(在PBS中)包被ELISA板，并在4℃孵育过夜。然后用封闭缓冲液(在PBS中的3％脱脂乳)封闭该板1小时，并连续稀释抗GITR 51BVH0/Vk0(嵌合aGITR 51B mAb)和抗GITR 51B VH3/Vk4(人源化抗GITR 51B mAb)抗体(起始浓度3μg/mL；1:3系列稀释)加入到包被的平板中。孵育后，向每个孔中加入抗小鼠/人IgG-HRP抗体(Abcam)(稀释1:10000)。向平板中加入TMB溶液，用1N HCl终止反应。使用Explorer Full Loaded在450nm读取OD值。
获得的结果描绘在图3a中。如图3a所示，证实了测试的抗GITR 51B VH0/Vk0嵌合抗体和抗GITR 51B VH3/Vk4人源化抗体与hGITR蛋白结合的特异性。嵌合抗体和人源化抗体均以剂量依赖性方式与hGITR蛋白显著结合。
1.8.2.抗GITR抗体对人类原代免疫细胞中hGITR的特异性和结合亲和力
为了测量抗GITR抗体与人类原代淋巴细胞(包括T细胞、NK细胞和NKT细胞)中表达的GITR分子的结合，根据制造商的说明，使用APEXTM抗体标记试剂盒(Invitrogen)将抗GITR51B VH0/Vk0(嵌合mAb)和51BVH3/Vk4(人源化mAb)分别与Alexa488(Af488)缀合。从健康供体分离的人外周血单核细胞(PBMC)购自StemCell technologies，并在5％ CO2和37℃条件下，在存在1μg/mL抗CD3单克隆抗体(BD Biosciences)和1μg/mL抗CD28单克隆抗体(BD Biosciences)的情况下，在含有10％(v/v)FBS和400U/mL人IL-2的PRMI1640培养基中培养2天。在培养期间，每隔2天或3天加入IL-2 400U/mL和IL-15 20ng/mL。培养后，用针对T细胞表面标记(CD3、CD4和CD8)和NK或NKT细胞表面标记(CD56)的荧光团缀合抗体和不同量(50ng/mL、250ng/mL、750ng/mL、1250ng/mL和250ng/mL)的AF488标记的抗GITR抗体对细胞进行染色。用流式细胞仪(CytoFLEX，Beckman Coulter)分析细胞，用FlowJo软件(BD)分析数据。在总T细胞(CD3+)、CD4+T细胞(CD3+CD4+CD8-)、CD8+T细胞(CD3+CD8+CD4-)、CD56+NK细胞(CD3-CD56+)和NKT细胞(CD3+CD56+)中测量了抗GITR抗体与GITR的结合。
获得的结果描绘在图3b中。嵌合和人源化抗GITR 51B抗体均被证实以剂量依赖的方式与原代T细胞、NK细胞和NKT细胞结合。结果证明了抗GITR 51B抗体对免疫细胞中表达的GITR蛋白的特异性。
实施例2：用于抗GITR抗体生物活性(抗GITR激动剂活性)的基于细胞的报道分析
Promega GITR生物测定试剂盒购自Promega公司(Madison,WI,USA)。将一小瓶(0.5mL)GITR效应细胞(Promega)加入9.5mL分析缓冲液(99％ RPMI，1％ FBS)，并将50μL该细胞悬浮液转移至96孔白色平底分析板(Greiner Bio-one,Chonburi,Thailand)。使用检测缓冲液，从5μg/mL的浓度开始制备抗GITR抗体的连续稀释液，然后用检测缓冲液进一步稀释2.5倍至最终抗体浓度为0.0032768μg/mL。将25μL稀释的抗GITR抗体加入到检测板中。在37℃和5％ CO2下孵育6小时后，加入Bio-Glo试剂，然后在环境温度下孵育10分钟。使用PromegaTM 板读数器测量发光。绘制了RLU对Log10[抗体]和倍增率对Log10[抗体]的图。使用曲线拟合软件(如GraphPad软件)测量拟合曲线和抗体应答的EC50值。通过上述测定，在加入活性GITR抗体(测试抗体)后，测量GITR介导的发光，并确认测试抗体的激动剂活性。为了比较，使用了抗GITR 28F3抗体(BMS；参见WO 2015/187835)、抗GITR110416(R&D Systems；参考"Heine等人，Oncoimmunology 2017和Schmiedel等人，Molecular Therapy 2013")和阳性对照抗GITR抗体(Promega Cat.#K1171)。
获得的结果如图4所示。证实了通过抗GITR抗体的激动剂活性和抗GITR 51BVH3/Vk5抗体(表示为抗GITR 51B)的交联，T细胞活化的信号转导增加。与参考抗体相比，该效力明显更好。
实施例3：抗GITR抗体对细胞因子产生的影响
3.1.在人原代T细胞中通过抗GITR抗体对抗肿瘤细胞因子产生的剂量依赖性诱导
为了产生细胞因子，将人PBMC(参见实施例1.8.2)在96孔圆底板中用RPMI 1640培养基培养，所述培养基补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，浓度为0.5×106细胞/孔。在存在抗GITR抗体(嵌合抗体和六种先导人源化抗体，各为10μg/mL和20μg/mL)的情况下，用0.2μg/mL的抗CD3单克隆抗体和1μg/mL的抗CD28单克隆抗体在37℃和5％ CO2下活化细胞19小时。抗GITR抗体110416(R&D Systems)用作参照，单独的培养基(未添加抗体)用作阴性对照组。向共刺激的细胞(抗CD3和抗CD28抗体)中加入Brefeldin A以阻断细胞因子分泌。收获细胞，用Zombie Aqua可固定死细胞染料(Invitrogen)染色，并在室温下孵育20分钟以测量细胞存活力。然后在冰上用针对表面标记CD3、CD4和CD8的荧光团缀合的抗体将细胞染色30分钟，这些标记都来自Biolegend。用eBioscienceTM Foxp3/转录因子固定/渗透浓缩和稀释试剂盒(Thermofisher)固定和渗透细胞后，进行细胞内细胞因子染色。随后，在室温下，使用荧光团缀合的IL-2和IFN-γ抗体(均来自Biolegend)在透化缓冲液中将细胞染色30分钟。然后使用流式细胞仪(CytoFLEX,Beckman Coulter)测量细胞，并使用FlowJo软件(BD)分析数据。抗GITR 110416(R&DSystems)被用作参考抗体。
获得的结果描绘在图5a(CD4+T细胞中的IL-2水平)、图5b(CD4+T细胞中的IFN-γ水平)、图5c(CD8+T细胞中的IL-2水平)和图5d(CD8+T细胞中的IFN-γ水平)中。在图5a至图5d中，每种抗体的成对条的左边显示抗体浓度为10μg/mL时的结果，右边显示抗体浓度为20μg/mL时的结果。
如图5a至图5d所示，所有测试的抗GITR 51B抗体(嵌合和人源化)通过与免疫细胞表面的GITR交联，上调CD4+和CD8+T细胞中Th1/Tc1细胞因子的产生，从而增强免疫应答。在用抗GITR 51B抗体处理期间，细胞因子(IL-2和IFN-γ)的水平显著高于参考抗体(克隆110416，R&D Systems)。这些结果表明，所有测试的抗GITR 51B抗体都以剂量依赖的方式强烈增强T细胞功能。
3.2.抗GITR抗体增加人T细胞中的细胞因子产生
测量人PBMC中的细胞因子产生(参见实施例1.8.2)。将细胞(500000个细胞/反应)与抗CD3单克隆抗体(BD Biosciences，Cat.No:555336；0.2μg/mL)和抗CD28单克隆抗体(BDBiosciences，Cat.No:555725)在人源化抗GITR 51B VH3/Vk4-IgG1抗体(测试抗体，10μg/mL)的存在下孵育。以相同的浓度(10μg/mL)使用前面引入的抗GITR抗体28F3(BMS)作为参考抗体。孵育后，细胞在4℃下以400xg离心10分钟，测量CD4+T细胞内的细胞因子水平。为此，细胞内细胞因子如下染色：细胞用Zombie Aqua可固定死细胞染料(Invitrogen)染色，并用针对CD4+和CD8+T细胞表面标记物的荧光团缀合抗体在冰上标记30分钟(使用抗CD3抗体(Biolegend)、抗CD4抗体(Biolegend)和抗CD8抗体(Biolegend)来染色CD4+和CD8+T细胞的表面)。根据制造商的说明，使用eBioscienceTFoxp3/转录因子固定/透化浓缩和稀释试剂盒(ThermoFisher)固定和透化细胞。然后用针对细胞内IL-2和IFNγ的荧光团缀合抗体对这些细胞进行染色。使用流式细胞仪(CytoFLEX,Beckman Coulter)分析细胞，并使用FlowJo软件(BD)分析数据。
获得的结果如图6所示。如图6所示，抗GITR 51BVH3/Vk4-IgG1抗体上调CD4+T细胞中Th1/Tc1细胞因子的产生，这可以增强免疫应答。此外，抗GITR 51BVH3/Vk4-IgG1抗体的细胞因子产生水平比参考抗体28F3高。这些结果表明，抗GITR 51BVH3/Vk5-IgG1抗体比参考抗体28F3更强有力地显著增强了效应T细胞的功能。
实施例4：抗GITR抗体对免疫细胞的增殖作用
4.1.响应于IL-15的GITR交联增强NK细胞增殖
ELISA板用10μg/mL人源化抗GITR 51B抗体(VH3/Vk1、VH3/Vk3、VH3/Vk4)包被。根据制造商的说明，使用NK分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从人PBMC(参见实施例1.8.2)中分离NK细胞，并用cell tracker violet(BioLegend)在37℃下染色20分钟。将分离的NK细胞(参见图7a)或含有NK细胞的PBMC(参见图7b，500000个细胞/反应)加入到用抗GITR抗体包被的平板中，并用IL-15(5ng/mL)培养6天。培养后，用活/死试剂(ThermoFisher LIVE/DEADTM可固定近红外死细胞染色试剂盒)、CD3(Biolegend)和CD56(Biolegend)抗体对细胞进行染色，然后使用流式细胞仪(CytoFlex,Beckman Coulter)进行分析。随后，用FlowJo软件(BD)对数据进行分析。
获得的结果描绘在图7a(对于分离的NK细胞)和图7b(对于含有NK细胞的PBMC)中。当GITR交联时，IL-15诱导的增殖在分离的NK细胞(A)和PBMC内的NK细胞(B)中都增加。所有测试的抗GITR抗体均增强了人原代T细胞中的NK细胞增殖。这些结果表明，抗GITR抗体通过与GITR交联增强了免疫功能，表明了潜在的抗肿瘤活性。
4.2.通过抗GITR抗体增强CD8+T细胞增殖
使用Miltenyi试剂盒(Miltenyi试剂盒(Miltenyi Biotec))从人外周血单核细胞(参见实施例1.8.2)中分离CD8+T细胞、Treg细胞和NK细胞：CD8+T细胞分离试剂盒，人(130-096-495)、CD4+CD25+CD127-dim Treg细胞分离试剂盒II(130-094-775)和NK细胞分离试剂盒，人(130-092-657)。借助LUNA-II自动细胞计数器，通过台盼蓝排斥对分离的Treg细胞进行计数。细胞以NK细胞:CD8细胞:Treg细胞＝4:4:1和抗GITR抗体51B VH0/Vk0、VH3/Vk5、VH4/Vk3和VG4/Vk4各自以10μg/mL的浓度加入孔中。在IL-2(50ng/mL)的存在下，将制备的细胞和抗GITR抗体的混合物与CD3/CD28 Dynabeads(ThermoFisher)孵育96小时。培养后，对细胞进行CD3、CD8、CD4和活/死标记染色，然后使用CytoFix/CytoPerm(BD n.554722)固定并在4℃透化20分钟。随后，使用Ki67抗体进行细胞内染色以检测Ki67，并使用流式细胞仪(CytoFlex，Beckman Coulter)分析细胞。
获得的结果如图8所示。如图8所示，抗GITR抗体增加了人原代PBMC中CD8+T细胞的增殖，表明抗GITR抗体可以增强人免疫细胞的功能。
4.3.抗GITR抗体对T调节细胞(Treg)和NK细胞的免疫调节
在将PBMC(参见实施例1.8.2)与抗GITR 51BVH3/Vk4抗体孵育后，通过评估NK细胞中的CD107a来测量NK细胞的活化(参见图9a)，并评估抗GITR抗体对Treg耗竭的作用(参见图9b)。更具体地，在CD3和CD28抗体存在下，将抗GITR 51B VH3/Vk4抗体(浓度为5μg/mL和10μg/mL)与人PBMC共培养，并通过流式细胞术评估Treg细胞的频率。将Treg细胞的数量与未进行抗GITR处理的对照组进行比较。
获得的结果(抗体浓度为10μg/mL)在图9a(CD 107a的水平)和图9b(Treg耗竭)中描述。GITR通过抗GITR 51BVH3/Vk4抗体的交联诱导了NK细胞上CD107a的表面表达。因此，抗GITR 51B VH3/Vk4抗体显著激活NK细胞(参见图9a)。此外，将抗GITR抗体(抗GITR 51BVH3/Vk4)与人PBMC共培养导致Treg细胞数量减少(参见图9b)，表明GITR与抗GITR抗体的交联诱导了NK细胞对Treg的去除。因此，抗GITR抗体既诱导NK细胞活化，又促进NK细胞对Treg细胞的细胞毒性。考虑到在肿瘤微环境中，Treg细胞的数量和功能的增加抑制免疫功能，从而抑制抗肿瘤效果，测试的抗GITR抗体可以通过减少Treg细胞的数量来潜在地增强抗肿瘤效果。
实施例5：抗GITR抗体的抗肿瘤作用
分析了抗GITR抗体的人源化变体(抗GITR 51B VH3/Vk4和51B VH3/Vk3抗体)对SKOV-3卵巢癌细胞的细胞毒性。在这点上，将SKOV-3细胞(ATCC，2.5×104细胞/孔)和PBMC(参考实施例1.8.2)与抗GITR 51B抗体(各自为10μg/mL)共培养，使得效应细胞与靶细胞的比例(E:T)为10:1。为了激活T细胞，在每个孔中加入Cytostim(Miltenyi)。为了比较，使用抗GITR抗体110416(R&D Systems)作为参考抗体以相同的方式进行测试。使用IncuCyte原生软件对靶细胞进行计数。
获得的结果(抗GITR 51B VH3/Vk4抗体)描绘在图10a和图10b中。所有测试的抗GITR 51B抗体的杀肿瘤效果显著高于对照组、Cytostim处理组和参考抗体处理组。由于用抗GITR 51BVH3/Vk4和抗GITR 51BVH3/Vk3的测试抗体处理，卵巢癌细胞死亡的程度增加，这意味着抗GITR 51B抗体(测试抗体)显示出强的抗肿瘤活性。与参考抗体相比，由抗GITR51B抗体(测试抗体)诱导的GITR交联导致针对SKOV3细胞系(卵巢癌)的更高的细胞毒性。
实施例6：抗GITR抗体对肿瘤患者T细胞抗肿瘤细胞因子诱导作用的研究
6.1.结肠直肠癌(CRC)患者T细胞中的细胞因子产生增强
由于表达GITR的免疫细胞在癌症患者中引起功能损伤，因此进行了检测以确定抗GITR抗体治疗是否可以通过增强癌症(CRC)患者的免疫应答来诱导抗肿瘤效果。
为了评估抗GITR抗体对癌症患者中细胞因子产生的影响，将来自结肠直肠癌(CRC)患者的人PBMC(500000个细胞/反应)与抗GITR 51BVH3/Vk4抗体(10μg/mL)或等量的参考抗体(抗GITR 28F3；BMS)在抗CD3抗体(0.2μg/mL，BD Biosciences)和抗CD28抗体(1μg/mL，BD Biosciences)的存在下一起培养。来自CRC患者的PBMC来自Cureline，Inc.，参照实施例3测量细胞内细胞因子的产生。
获得的结果显示在图11中(背景：仅细胞(未用CD3/CD28抗体和抗GITR抗体处理)，刺激：用CD3/CD28抗体处理但未用抗GITR抗体处理)。如图11所示，测试的抗GITR 51BVH3/Vk4抗体(称为51B VH3/Vk4)以比参考抗体28F3(ref-28F3)更高的水平增加了来自CRC患者PBMC的CD4+和CD8+T细胞中细胞因子的产生。IL-2和IFN-γ是在免疫系统中具有核心功能的细胞因子，增强NK和T细胞的增殖和杀肿瘤活性。因此，这些结果表明测试的抗GITR抗体在癌症(CRC)患者中表现出优异的抗癌效力。
6.2.非小细胞肺癌(NSCLC)患者T细胞中的细胞因子产生增强
由于表达GITR的免疫细胞在癌症患者中引起功能损伤，因此进行了检测以确定抗GITR抗体治疗是否可以通过增强癌症(NSCLC)患者的免疫应答来诱导抗肿瘤效果。
为了评估抗GITR抗体对癌症患者中细胞因子产生的影响，将来自非小细胞肺癌(非小细胞肺癌)患者的人PBMC(500000个细胞/反应)与抗GITR 51BVH3/Vk4抗体(10μg/mL)或等量的参考抗体(抗GITR 28F3；BMS)在抗CD3抗体(0.2μg/mL，BD Biosciences)和抗CD28抗体(1μg/mL，BD Biosciences)的存在下一起培养。来自NSCLC患者的PBMC来自Cureline，Inc.，参照实施例3测量细胞内细胞因子的产生。
获得的结果显示在图12中(背景：仅细胞(未用CD3/CD28抗体和抗GITR抗体处理)，刺激：用CD3/CD28抗体处理但未用抗GITR抗体处理)。如图12所示，测试的抗GITR 51BVH3/Vk4抗体(称为51B VH3/Vk4)以比参考抗体28F3(ref-28F3)更高的水平增加了来自NSCLC患者PBMC的CD4+和CD8+T细胞中细胞因子的产生。IL-2和IFN-γ是在免疫系统中具有核心功能的细胞因子，增强NK和T细胞的增殖和杀肿瘤活性。因此，这些结果表明测试的抗GITR抗体在癌症(NSCLC)患者中表现出优异的抗癌效力。
6.3.肝细胞癌(HCC)患者T细胞中的细胞因子产生增强
由于表达GITR的免疫细胞在癌症患者中引起功能损伤，因此进行了检测以确定抗GITR抗体治疗是否可以通过增强癌症(HCC)患者的免疫应答来诱导抗肿瘤效果。
为了评估抗GITR抗体对癌症患者中细胞因子产生的影响，将来自肝细胞癌(HCC)患者的人PBMC(500000个细胞/反应)与抗GITR 51BVH3/Vk4抗体(10μg/mL)或等量的参考抗体(抗GITR 28F3；BMS)在抗CD3抗体(0.2μg/mL，BD Biosciences)和抗CD28抗体(1μg/mL，BDBiosciences)的存在下一起培养。来自HCC患者的PBMC来自Cureline，Inc.，参照实施例3测量细胞内细胞因子的产生。
获得的结果显示在图13中(背景：仅细胞(未用CD3/CD28抗体和抗GITR抗体处理)，刺激：用CD3/CD28抗体处理但未用抗GITR抗体处理)。如图13所示，测试的抗GITR 51BVH3/Vk4抗体(称为51B VH3/Vk4)以比参考抗体28F3(ref-28F3)更高的水平增加了来自HCC患者PBMC的CD4+和CD8+T细胞中细胞因子的产生。IL-2和IFN-γ是在免疫系统中具有核心功能的细胞因子，增强NK和T细胞的增殖和杀肿瘤活性。因此，这些结果表明测试的抗GITR抗体在癌症(HCC)患者中表现出优异的抗癌效力。
结果证明，抗GITR抗体可诱导来自多于一种癌症患者的人类T细胞产生有效的抗肿瘤细胞因子。
实施例7：抗GITR抗体在MC38结肠癌模型(体内)中的抗癌效力
在5％ CO2和37℃的条件下，在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和4μg/mL嘌呤霉素的DMEM中体外维持MC38肿瘤细胞(来自Biocytogen)。收获处于指数生长期的细胞，并在肿瘤接种前用细胞计数器计数。
对于肿瘤发生，将5×105肿瘤细胞(在0.1mL PBS溶液中)皮下接种到C57BL6hGITR敲入小鼠(来自江苏Biocytogen Co.,Ltd.)的右侧区域。当平均肿瘤大小达到100mm3至150mm3时进行随机化。每组由八只小鼠组成。随机分组的日期记录为第0天。
接种肿瘤细胞后，每天监测动物的发病率、死亡率和体重增加/减少(随机化后，每周测量三次体重)。仔细记录每只动物的死亡率和任何观察到的临床症状。随机化后每周三次使用测径器二维测量肿瘤体积，并使用以下公式计算体积(mm3)：
V＝(L×W×W)/2
[V为肿瘤体积(mm3)，L为肿瘤长度(肿瘤的最长轴)，W为肿瘤宽度(垂直于L的最长维度)]。
剂量和肿瘤和重量的测量在层流柜中进行，而重量和肿瘤体积使用StudyDirectorTM软件(3.1.399.19版本)测量。
分组后立即开始处理。对照组(组1)用载体(PBS溶液)处理，而组2和组3分别用CHO细胞中产生的抗GITR 51B VH3/Vk4抗体和INCAGN1876(来自Biocytogen)处理，剂量为20mg/kg(参见表13)。
表13
BIW：Bi-每周(每周两次)
i.v.：静脉注射
肿瘤大小(体积)的测量结果如图14所示。如图14所示，与组1(用PBS处理的对照组)相比，抗GITR 51B VH3/Vk4抗体(组2)表现出显著的肿瘤生长抑制作用。例如，在第24天，与对照组(组1)相比，用抗GITR 51B VH3/Vk4抗体处理的试验组(组2)中的肿瘤大小显著减小。此外，当与用参考抗体(INCAGN1876)处理的组(组3)相比时，在用抗GITR 51BVH3/Vk4抗体处理的试验组(组2)中观察到显著更高的肿瘤减少效力。
此外，使用以下方程计算肿瘤生长抑制(ΔTGI)：
ΔTGI(平均％Δ抑制)＝((平均(C)-平均(C0))-(平均(T)-平均(T0)))/(平均(C)-平均(C0))*100％
[T-当前组值/T0-当前组初始值/C-对照组值/C0-对照组初始值]
[T：测量时试验组的肿瘤大小，
T0：试验组的初始肿瘤大小，
C：测量时对照组的肿瘤大小，
C0：对照组的初始肿瘤大小]。
抗GITR 51B VH3/Vk4抗体的肿瘤生长抑制(ΔTGI)为64.8％，显示出与INCAGN1876类似物相比增强的抑制作用(ΔTGI＝44.7％)。
本实施例中使用的试验动物耐受20mg/kg剂量(静脉注射)的抗体，并且在研究期间没有观察到体重减轻(BWL)。
统计分析
使用普通的单向ANOVA(使用GraphPad Prism 9软件的配对和非配对t检验)评估统计显著性。数据以平均值±SEM表示。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，ns＝不显著。

Claims (13)

1.一种抗GITR抗体或其抗原结合片段，其中抗GITR抗体包含：
包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)，
包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)，
包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)，
包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)，
包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)，和
包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。
2.根据权利要求1所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段，其中抗GITR抗体包含：
包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)，
包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)，
包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)，
包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)，
包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)，和
包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。
3.根据权利要求1所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段，其中抗GITR抗体包含：
(1)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2，包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-L2，和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3；
(2)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2，包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-L2，和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3；或
(3)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2，包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-L2，和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-L3。
4.根据权利要求1所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段，其中抗GITR抗体包含：
包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQID NO：18的氨基酸序列的重链可变区；和
包含SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区。
5.根据权利要求1所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段，其中抗GITR抗体或其抗原结合片段与选自GITR蛋白氨基酸序列中92位至132位氨基酸的至少一个氨基酸结合。
6.根据权利要求1所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段，其中抗GITR抗体是动物抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
7.根据权利要求1所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段，其中抗原结合片段是抗GITR抗体的scFv、scFv-Fc、(scFv)2、Fab、Fab′或F(ab′)2。
8.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，该组合物包含根据权利要求1至7中任一项所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中癌症为实体癌或血液癌。
10.一种用于免疫增强的药物组合物，该组合物包含根据权利要求1至7中任一项所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中组合物具有选自激活免疫细胞、抑制调节性T细胞和增加免疫蛋白的活性。
12.一种用于预防或治疗免疫相关疾病的药物组合物，该组合物包含根据权利要求1至7中任一项所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中免疫相关疾病是传染性疾病、炎症性疾病或自身免疫性疾病。
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