CN115073584B

CN115073584B - 一种特异性识别prame抗原肽的tcr及其应用

Info

Publication number: CN115073584B
Application number: CN202210495457.9A
Authority: CN
Inventors: 吴显辉; 王晓娟; 陈亮; 汤小欣; 黄金燕; 李嘉; 林子圣; 栗红建
Original assignee: Liyang Masai Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Liyang Masai Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-05-07
Filing date: 2022-05-07
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2042-05-07
Also published as: CN115073584A; WO2023216440A1

Abstract

本发明公开了一种特异性识别PRAME抗原肽的TCR及其应用。所述的TCR的α链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列，所述的TCR的β链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，本发明的TCR与pMHC(HLA‑A*02:01/VLDGLDVLL)的亲和力高，K_D值可达1.3E‑05M，对HLA‑A*02:01⁺/PRAME⁺靶细胞(K562‑A0201‑3G5)在体外和体内均有特异性的杀伤作用，而对其他非双阳性肿瘤细胞或健康人PBMC无明显作用。

Description

一种特异性识别PRAME抗原肽的TCR及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种特异性识别PRAME抗原肽的TCR及其应用，具体为一种识别HLA-A*02:01/PRAME_100-108的TCR及其应用。

背景技术

黑色素瘤特异性抗原(Preferentially Expressed Antigen of Melanoma，PRAME)是肿瘤癌睾抗原家族的一员，最初在黑色素瘤中发现，具有免疫原性，能被细胞毒性T淋巴细胞(简称T细胞)特异性识别并引发肿瘤溶解的表面抗原(Immunity,1997,6,199；BrJHaematol,1998,102,1376；J Exp Med,2001,193,73；Clin Cancer Res,2006,12,3130；Blood,2008,112,1876；Clin Cancer Res,2011,17,5615；Oncol Rep,2014,31,384；CancerRes,2018,78,3337)。PRAME属于肿瘤相关抗原，在许多不同的癌症中高度表达，例如急慢性白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、肉瘤、头颈癌、肾细胞癌、乳腺癌等(Cancer Res,1998,58,4090；Cell,2005,122,835；Blood,2009,114,15；Oral Oncol,2013,49,144；Clin Cancer Res,2013,19,2562；Oncol Rep,2014,31,384；Immunol Invest,2016,45,619；Mol Ther Methods Clin Dev,2021,21,492)，而在正常组织中几乎不表达或表达量极低(例如睾丸、肾上腺、卵巢和子宫内膜)，因此PRAME是肿瘤免疫治疗中重要的潜在靶点(Biomark Med,2012,6,629；Cancers(Basel),2019,11,984)。VLDGLDVLL肽段(SEQID NO:1)在PRAME上位于100-108，可通过HLA-A*02:01分子进行递呈并被细胞毒性T淋巴细胞识别而产生效应，该肽段与HLA-A*02:01分子的结合亲和力是5.2μM，其复合物在37℃半衰减期为2.5h(J.Exp.Med.,2001,193,73)。

T细胞受体基因工程改造的T细胞(T cell receptor gene engineered T cells，TCR-T)疗法是将肿瘤抗原特异性的TCR基因转导到正常T细胞中，能够增强或重新赋予该T细胞识别肿瘤抗原的能力，特异地靶向和杀伤肿瘤细胞，是当前过继性细胞治疗中重要的治疗方法(Immunol Rev,2014,257,56)。许多临床试验已经证明了TCR-T细胞疗法在治疗黑色素瘤、滑膜细胞肉瘤、骨髓瘤等恶性肿瘤中的有效性和安全性(Science,2006,314,126；JClin Oncol,2011,29,917；Nat Med,2015,21,914；Blood,2017,130,1985；Cancer Discov,2018,8,944)。截至2022年2月，clinicaltrials.gov网站上显示，针对PRAME靶点目前全球已开展10项临床试验，其中与TCR相关的疗法有5项(NCT02743611、NCT03503968、NCT03318900、NCT04262466、NCT03686124)。Immatics N.V.公司开发的PRAME TCR-T疗法的Ia期临床数据验证了该疗法的有效性和安全性(NCT03686124,J Immunother Cancer,2021,9(Suppl 2),A1009)，为PRAME相关癌症的治疗提供一条新的途径。随着相关技术的发展和研究的不断深入，TCR-T疗法将逐渐向高效、低毒及可操控的方向发展，在提高疗效和安全性的同时也能带来临床应用的便捷性，从而为更多肿瘤患者带来治愈的希望。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中识别并结合PRAME抗原肽的TCR数量有限的缺陷，从而本发明提供一种特异性识别PRAME抗原肽的TCR，采用该TCR改造的T细胞通过高效识别HLA-A*02:01/PRAME_100-108靶点对肿瘤细胞进行特异性杀伤。

主要组织相容性复合体(MHC)分子属于免疫球蛋白超家族成员，可以是I类或II类MHC分子。其对于抗原的呈递具有特异性，不同的个体有不同的MHC，能呈递一种蛋白抗原中不同的短肽到各自的抗原呈递细胞(APC)表面。人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体。

T细胞受体(TCR)，是呈递在MHC上的特异性抗原的唯一受体。在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与APC直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子发生相互作用，引起一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。

TCR是T淋巴细胞识别抗原的功能单位，属免疫球蛋白超级家族，其编码链包括α、β、γ和δ四条链，TCR是由α链/β链或者γ链/δ链以异质二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。外周血95％的TCR是由α和β两条多肽链构成的异源二聚体。但重组TCR还可以由一条单独的TCRβ链或者TCRα链组成，其已被证明能够结合抗原肽-MHC分子(WO 2005/113595)。

广义上讲，α和β各链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常被视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(framework regions)中的3个CDR(互补决定区)，CDR1、CDR2和CDR3。CDR区决定了TCR与pMHC复合物的结合，其中CDR3由可变区和连接区重组而成，被称为超变区。TCR的α和β链一般看作各有两个"结构域"即可变域和恒定域，可变域由连接的可变区和连接区构成。TCR恒定域的序列可以在国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的公开数据库中找到，如TCR分子α链的恒定域序列为TRAC(也可称为TRAC*01)，TCR分子β链的恒定域序列为TRBC1(也可称为TRBC1*01)或TRBC2(也可称为TRBC2*01)。此外，TCR的α和β链还包含跨膜区和胞质区，胞质区很短。

另外，α链由胚系基因中TRAV、TRAJ、TRAC重排组成；β链由胚系基因中的TRBV、TRBD、TRBJ、TRBC重排组成，不同V(D)J重排后，由V-J(或V-D和D-J)连接时随机插入不同数量的核苷酸形成一个可变化的区域(N)成为互补决定区3(CDR3)，这种随机插入使TCRα链和β链序列呈现高度多样性；不同克隆T淋巴细胞的TCR重排时CDR3长度和碱基序列不同，这是TCR特异地识别抗原的区域，它决定了TCR的特异性。

需注意的是，本发明中CDR1～CDR3以及FR1～FR4在TCR全长序列中位置的确定是根据IMGT命名法定义，该定义是众所周知的，可在IMGT公共数据中找到，“T cell ReceptorFactsbook,(2001)LeFranc和LeFanc，Acdamic出版社，ISBN 0-12-441352-8”也公开了由IMGT命名法定义的序列。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义TCR的CDR，因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定TCR时，所述TCR的范围还涵盖了这样的TCR，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。

本发明的技术方案之一为：一种TCR，所述TCR包含α链和β链，所述α链包含α链可变区，所述β链包含β链可变区，所述α链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述β链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在本发明一具体实施方案中，所述α链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，且所述β链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

本发明中所述TCR的α链和/或β链优选还包含框架区(FR)；其中：

所述α链的框架区来源于TRAV和TRAJ，其中所述TRAV优选种系TRAV20，所述TRAJ优选种系TRAJ36。

所述β链的框架区来源于TRBV、TRBD和TRBJ，所述TRBV优选种系TRBV7-8，所述TRBD优选种系TRBD1，所述TRBJ优选种系TRBJ2-3。

在本发明一较佳实施方案中，所述TCR的α链可变区含有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

在本发明另一较佳实施方案中，所述TCR的β链可变区含有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

在本发明一具体实施方案中，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，且所述β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

本发明中所述TCR的α链较佳地还包含恒定区，所述α链的恒定区优选来源于人种系。

在本发明一较佳实施方案中，所述α链的恒定区来源于TRAC。

本发明中所述TCR的β链较佳地还包含恒定区，所述β链的恒定区优选来源于人种系。

在本发明一较佳实施方案中，所述β链的恒定区来源于TRBC。

在本发明一更佳实施方案中，所述TRBC为种系TRBC2。

在本发明一具体实施方案中，来源于人种系的α链的恒定区的氨基酸序列如SEQID NO:11所示。

在本发明一具体实施方案中，来源于人种系的β链的恒定区的氨基酸序列如SEQID NO:13所示。

此外，本发明中所述的α链还可包括膜外区和跨膜区；较佳地，所述的α链还包括胞内序列。

所述β链也还可包括膜外区和跨膜区；较佳地，所述的β链还包括胞内序列。

在本发明一具体实施方案中，含有信号肽的所述TCR的α链的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，其中信号肽位于具体序列的第1～21位；和/或，含有信号肽的所述TCR的β链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中信号肽位于具体序列的第1～19位。

如本领域技术人员所知，信号肽位于翻译后蛋白的N端，引导蛋白质到指定的表达地点，故本发明上述α链、β链发挥功能的全长序列中并不包含信号肽，因此上述信号肽序列并不限定本发明上述α链、β链的全长氨基酸序列；而且具体应用时，信号肽可以进行调整，本发明并不仅限于上述具体实施方案中的信号肽序列。

本发明的技术方案之二为：一种分离的核酸，其编码如本发明技术方案之一所述的TCR。

本发明的技术方案之三为：一种包含如技术方案之二所述核酸的载体，所述的载体优选慢病毒载体；所述的核酸在单个开放阅读框中，或者在两个不同的开放阅读框中分别编码TCRα链和TCRβ链。

如本发明所用，“载体”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。用于预防或治疗时所述载体通常选用病毒载体，可包括但不限于，慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯殖痊病毒载体。更具体而言，如实施例中所述，可以使用慢病毒载体在体外、离体或体内递送所述构建体。

本发明还涉及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主细胞中含有本发明的载体或染色体中整合有本发明的核酸分子。宿主细胞选自:原核细胞和真核细胞,例如大肠杆菌、酵母细胞、CHO细胞、293T细胞等。用于预防或治疗时，所述宿主细胞可为本领域常规使用的T淋巴细胞、造血干细胞等。

本发明还包括表达本发明的TCR的分离的细胞，特别是T细胞。该T细胞可衍生自从受试者分离的T细胞，或者可以是从受试者中分离的混合细胞群，诸如外周血淋巴细胞(PBL)群的一部分。如该细胞可以分离自外周血单核细胞(PBMC)，可以是CD4⁺辅助T细胞或CD8⁺细胞毒性T细胞。该细胞可在CD4⁺辅助T细胞/CD8⁺细胞毒性T细胞的混合群中。一般地，该细胞可以用抗体(如抗-CD3或抗-CD28的抗体)活化，以便使它们能够更容易接受转染，例如用包含编码本发明TCR分子的核苷酸序列的载体进行转染。

一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的TCR分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。

本发明的技术方案之四为：一种含有如技术方案之二所述的核酸或者如技术方案之三所述的载体的细胞；较佳地，所述的细胞为T细胞或者干细胞，所述的T细胞优选CD8⁺T细胞。

本发明的技术方案之五为：一种提呈如技术方案之一所述的TCR的分离的或非天然存在的细胞，所述的细胞优选T细胞。

在本发明中术语“细胞”可包括已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本发明包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。

本发明的技术方案之六为：一种药物组合物，其含有如技术方案之一所述的TCR或者技术方案之四所述的细胞；较佳地，所述的药物组合物还包含药物上可接受的载体。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含合适的药学上可接受的载体例如药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。如本发明所用，“药学上可接受的载体”或“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。可以通过将具有所需纯度的本发明的TCR与一种或多种任选的药用辅料(Remington’s PharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本发明所述的药物制剂或药物组合物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗肿瘤活性成分，例如其它TCR、抗体、抗肿瘤活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的TCR或其抗原结合片段的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

本发明的技术方案之七为：一种如技术方案之一所述TCR、如技术方案四所述的细胞或者技术方案之六所述的药物组合物在制备防治PRAME表达相关的肿瘤的药物中的应用；较佳地，所述的肿瘤包括黑色素瘤、急慢性白血病、淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、肉瘤、头颈癌、肾细胞癌和乳腺癌。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的TCR与pMHC(HLA-A*02:01/VLDGLDVLL)的亲和力K_D值达1.3E-05M，对HLA-A*02:01⁺/PRAME⁺靶细胞(K562-A0201-3G5)在体外和体内均有特异性的杀伤作用，而对其他非双阳性肿瘤细胞或健康人PBMC无明显作用。

附图说明

图1为PRAME_100-108抗原特异性双阳单克隆CD8⁺ T细胞的分选过程。

图2A和图2B为PVL7 TCR复性后的阴离子交换层析和SDS-PAGE电泳图。

图3A和图3B为PVL7 TCR复性后的凝胶过滤层析和SDS-PAGE电泳图。

图4A和图4B为HLA-A*02:01/β2M/VLDGLDVLL复性后的阴离子交换层析和SDS-PAGE电泳图；其中，分子量大的条带为HLA-A*02:01，分子量小的条带为β2M，VLDGLDVLL多肽因分子量太小，SDS-PAGE上无法看到条带。

图5为HLA-A*02:01/β2M/VLDGLDVLL复性后的凝胶过滤层析图。

图6为PRAME-pMHC生物素化后的Gel Shift图。

图7为PVL7 TCR亲和力测试结果图。

图8为PVL7 TCR慢病毒感染CD8⁺ T细胞的阳性率结果图；其中，PVLcon为阳性TCR对照组，GFP为阴性对照组。

图9A、图9B和图9C为PVL7 TCR对负载PRAME_100-108、NY-ESO-1_157-165或HPV16-E6_29-38多肽的T₂细胞的INF-γ释放图。

图10为构建K562-A0201单克隆细胞流式检测图。

图11为PVL7 TCR对不同肿瘤细胞系的INF-γ释放图。

图12为PVL7 TCR对不同肿瘤细胞系LDH特异性杀伤实验结果图。

图13A和图13B为PVL7 TCR对28例不同HLA-A分型健康人PBMC的INF-γ释放图。

图14为PVL7 TCR-T动物实验的肿瘤生长曲线。

图15为PVL7 TCR-T细胞给药18天后小鼠的瘤体情况。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

另：以下实施例中，若没有特殊说明，所用细胞系均购自ATCC。

实施例1抗原特异性αβ-TCR克隆和基因序列鉴定

PRAME_100-108(VLDGLDVLL)抗原特异性CD8⁺ T细胞TCR基因克隆采用的方法、试剂和耗材，主要参考Curr.Protoc.Immunol.2002,7,1；PLoS One.2011,6,e27930；OncoImmunology.2016,5,e1175795；J Vis Exp.2011,8,3321；J Immunol Methods.2006,310,40；PLoS One.2014,9,e110741及其引用文献。通过免疫磁珠负筛选法从HLA-A*02:01基因型健康志愿者的PBMC中分离得到CD8⁺ T细胞后，用负载PRAME_100-108肽段的EBV-B细胞(J VisExp.2011，8,3321)(EBV病毒：ATCC产品号VR-1492)刺激CD8⁺ T细胞，然后采用PE标记的HLA-A*02:01/PRAME_100-108四聚体(制备方法见实施例3)及APC标记的抗CD8抗体(Biolegend，产品号301014)对T细胞进行双染色，流式分选得到双阳性T细胞，并将该T细胞扩增培养至一定数量后再次进行分选(图1)。如此经过2轮的刺激培养和分选后，采用有限稀释法对双阳T细胞进行单克隆培养。增殖后的单克隆T细胞通过HLA-A*02:01/PRAME_100-108四聚体和抗CD8抗体双染色进行流式检测并分选得到PRAME_100-108抗原特异性单克隆T细胞。

采用Quick-RNA^TM MiniPrep试剂盒(ZYMO research,产品号R1050)对获得单克隆T细胞的总RNA进行提取，并通过SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech,产品号634923)对RNA进行逆转录获得cDNA。然后以cDNA为模板，通过PCR扩增目标基因后连接至pUC19载体，热激法转化E.coli-DH5α，涂板培养过夜后，挑取单克隆菌落进行鉴定和测序，测序获得的基因序列在IMGT数据库进行比对分析，最后获得1个HLA-A*02:01/PRAME_100-108抗原特异性TCR，命名为PVL7 TCR，其TCRα和β链基因型见表1。

表1.TCRα和β链的基因型

PVL7 TCR的α链全长序列(SEQ ID NO:2)：

PVL7 TCR的β链全长序列(SEQ ID NO:3)：

上述序列中：下划线标记序列为信号肽区，黑色加粗标记序列为Vα(α链的可变区)或者Vβ(β链的可变区)、加粗斜体标记序列为Cα(α链的恒定区，SEQ ID NO:11)或者Cβ(β链的恒定区，SEQ ID NO:13)、斜体下划线标记序列为跨膜胞内区，加粗且下划线标记的序列为CDR序列。

依据IMGT数据库规则，PVL7 TCR V区的特有关键序列CDR区氨基酸序列见表2：

表2.PVL7 TCR V区α和β链CDR区氨基酸序列

PRAME全长序列(SEQ ID NO:14)：

上述序列中：下划线标记序列为PRAME_100-108肽段。

实施例2PVL7 TCR基因的表达和纯化

PVL7 TCR的α链和β链基因采用Nco I/Not I酶切位点分别连接到pET28a载体，热激法转化E.coli-BL21(DE3)，涂板培养过夜后，挑取单克隆菌落至LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG诱导目的蛋白表达，37℃继续培养3h后，6000rpm离心10min收集菌体。

用裂解液(含0.5％Triton X-100的1×PBS)重悬菌体，进行超声破碎后，12000rpm离心20min。弃上清，用裂解液重悬沉淀直至无肉眼可见的颗粒，12000rpm离心10min，重复以上操作2-3次后，用6M盐酸胍溶液溶解沉淀，12000rpm离心10min后收集上清，上清即为纯化后的包涵体。采用BCA法对包涵体进行定量。

将20mg PVL7 TCRα链包涵体和15mgβ链包涵体分别稀释于5mL的6M盐酸胍溶液中，然后将TCRα链、TCRβ链依次缓慢加入到预冷的复性缓冲液中(Science 1996,274,209；J.Mol.Biol.1999,285,1831；Protein Eng.2003,16,707)，4℃下持续搅拌30min。将溶液加入透析袋中，置于10倍体积预冷的去离子水中，搅拌透析8-12h后，置于预冷的透析液(pH8.1,20mM Tris-HCl)于4℃透析8-12h，重复2-3次。

将透析袋中的溶液取出，高速离心10min去除沉淀和气泡后，通过HiTrap Q HP(5mL)进行阴离子交换层析，用洗脱液(0-2M NaCl,20mM Tris pH 8.1)线性洗脱(图2A)。分段收集含有目标蛋白组分的洗脱峰，浓缩后取样进行非还原性SDS-PAGE电泳(图2B)，结果显示目标蛋白纯度尚需进一步纯化。采用superdex 75 10/300对浓缩后的蛋白样品进行凝胶过滤层析(图3A)，取样进行非还原性和还原性SDS-PAGE电泳检测(图3B)，结果显示非还原性电泳泳道在45kDa附近有一条主带；还原性电泳泳道有两条带，分别是PVL7 TCR的α链和β链，其纯度满足后续实验需求。

实施例3生物素化抗原肽-MHC(pMHC)制备

pMHC的复性和纯化，按照NIH Tetramer Core Facility的方法进行制备。按照在线protocols所述，将PRAME_100-108多肽溶液、β2M和HLA-A*02:01包涵体溶液依次加入复性缓冲液(0.1M Tris-HCl,0.4M L-arginine,2mM EDTA,0.5mM氧化性谷胱甘肽和5mM还原性谷胱甘肽,0.2mM PMSF)，4℃搅拌过夜，第二天早上和晚上分别再加入同量的HLA-A*02:01包涵体溶液，4℃搅拌1-3天后，在10倍体积透析液(pH 8.1,20mM Tris-HCl)中透析3次。将透析后的蛋白样品用HiTrap Q HP(5mL)进行阴离子交换层析，用洗脱液(0-2M NaCl,20mMTris pH 8.1)线性洗脱，收集和合并洗脱峰(图4A)，将从图4A中的洗脱峰分段(A1-A5)收集的样品用还原性SDS-PAGE电泳分析，清晰可见HLA-A*02:01和β2M两条带(图4B，图中A3-A5对应图4A中在不同洗脱峰节点收集的样品)，纯度已满足后续需求，而PRAME_100-108多肽分子量太小，胶图看不到条带。对含有pMHC组分的洗脱峰进行浓缩，经凝胶过滤层析(Superdex75 10/300)纯化后(图5)，用重组酶BirA对pMHC复合体进行生物素化(ProteinExpr.Purif.2012,82,162；J.Bacteriol.2012,194,1113.)，然后加入链霉亲和素(SA)进行反应验证，反应体系按照NIH Tetramer Core Facility的方法进行制备和Gel Shift纯度鉴定。从Gel Shift电泳图来看(图6)，PRAME-pMHC复合体的生物素化制备成功。

实施例4亲和力测试

Biacore是一种基于表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术检测亲和力的仪器。在本实验中，使用Biacore T200，首先将生物素化的pMHC偶联在CM5芯片上，然后检测其与不同TCR的结合解离常数，计算出K_D值。据此测试PVL7 TCR与pMHC(HLA-A*02:01/VLDGLDVLL)的亲和力，详见表3和图7。

表3.PRAME TCR亲和力K_D值

需说明的是：如本领域人员所知，SPR技术是当前测定亲和力最常用、可靠的方法之一，但是涉及到蛋白定量、芯片新旧程度、仪器状态等，不同批次间的实验，会有一定的误差，误差值甚至可达3～5倍；而本发明为使用了同一蛋白定量、同一芯片以及同一仪器所进行的同批次实验，因此各数据之间可用于进行亲和力大小的比较，但具体数值并不构成对本发明保护范围的限制。

实施例5TCR慢病毒制备和转导CD8⁺ T细胞

1)TCR慢病毒包装

采用第三代慢病毒包装系统(Invitrogen,pLenti6/V5 Directional TOPO^TMCloning Kit,产品号K495510)包装含有编码目的TCR基因的慢病毒。参照该试剂盒说明书提供的方法，将包装质粒pMDLg/pRRE(addgene,产品号k12251)、pRSV-REV(addgene,产品号12253)、pMD2.G(addgene,产品号12259)分别与含目的基因的穿梭质粒如pLenti-PVL7、pLenti-PVLcon(该TCR基因序列来源于专利号US2019169261A1中的TCR T4.8-1-29)、pLenti-GFP(阴性对照)等按质量比4:2:1:1进行混匀，通过转染试剂PEI-MAX(Polyscience，产品号23966-1)瞬时转染处于对数生长期的293T细胞。转染48-50h后收集含有慢病毒的培养基上清液，经离心和0.45μm滤器去除细胞碎片后，用配有Ultracel-50滤膜的Amicon Ultra-15离心过滤器(Merck Millipore，产品号UFC905096)将上清液进行浓缩。对浓缩后的样品进行慢病毒滴度测定，步骤参照p24 ELISA(Clontech,产品号632200)试剂盒说明书。

2)TCR慢病毒转导CD8⁺ T细胞

从健康志愿者的PBMC中分离得到CD8⁺ T细胞，用含有10％FBS和100IU/mL IL-2的RPMI 1640完全培养基接种于48孔板中，每孔1×10⁶个细胞，并加入抗CD3/CD28抗体偶联磁珠用于刺激活化CD8⁺ T细胞，置于细胞培养箱培养过夜。刺激过夜后，按MOI＝5的比例加入PVL7、PVLcon或GFP慢病毒，32℃，900g离心感染1h。感染完毕后去除慢病毒感染液，继续培养细胞3天，用磁铁去除抗CD3/CD28抗体偶联磁珠。此后每两天细胞计数一次，更换或加入新鲜完全培养基，将细胞密度维持在1-2×10⁶cells/mL。在细胞培养第9天，通过HLA-A*02:01/PRAME_100-108四聚体染色，对T细胞进行流式检测和阳性率分析。结果如图8所示，PVL7TCR-T细胞的阳性率为44.8％，PVLcon TCR-T细胞阳性率为47.1％，GFP TCR-T细胞阳性率为79.3％。

实施例6PVL7 TCR体外功能特异性分析—ELISPOT法检测负载多肽T₂细胞的INF-γ释放

本实施例通过ELISPOT试验分析PVL7 TCR在负载特异性或非特异性多肽的T₂细胞刺激下INF-γ因子的释放情况。本实施例的效应细胞是实施例5中的经PVL7、PVLcon和GFP慢病毒转导的CD8⁺ T细胞。本实施例的靶细胞是负载不同浓度多肽的T₂细胞，将T₂细胞分别与7个梯度浓度(10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5M)PRAME_100-108多肽，或10^-6M的NY-ESO-1_157-165多肽或HPV16-E6_29-38多肽混匀，置于37℃培养箱孵育4h后，离心，1×PBS洗涤1次，用含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，用于下一步铺板。根据Human INF-γELISPOT Set试剂盒说明书(BD biosciences,产品号551849)，执行后续的实验操作。将4×10³个阳性效应细胞/孔和4×10⁴个靶细胞/孔加入ELISPOT孔板，每孔培养体系200μL，将孔板置于细胞培养箱孵育过夜。孵育结束后按照试剂盒说明书进行洗涤，然后加入BCIP/NBT溶液显影5-15min后，用去离子水洗涤孔板，最终倒扣孔板，使板在室温下自然干燥。用酶联免疫斑点分析仪(6000Pro-Fβ,Bio-Sys)对孔板进行分析。

结果如图9A所示，负载PRAME_100-108多肽的T₂细胞强烈刺激PVL7 TCR-T细胞释放INF-γ因子，并且呈多肽浓度依赖性，其趋势与阳性对照PVLcon一致。当负载多肽浓度大于10^-7M，PVL7和PVLcon TCR-T细胞释放INF-γ均达到峰值，且两者之间无显著差异。特异性识别NY-ESO-1_157-165的1G4 TCR-T细胞(制备方法参考专利CN112442118A)和特异性识别HPV16-E6_29-38的E6con TCR-T细胞(制备方法参考专利CN113754756A)具有显著活性(图9B&图9C)，而PVL7和PVLcon TCR-T细胞对负载非特异性NY-ESO-1_157-165或HPV16-E6_29-38多肽的T₂细胞均无显著活性。负载PRAME/NY-ESO-1/HPV16-E6肽段的T₂细胞都无法刺激GFP TCR-T细胞释放INF-γ因子。综上所述，PVL7 TCR功能与阳性对照PVLcon接近，且对HLA-A*02:01/PRAME_100-108的识别具有特异性。

实施例7构建PRAME转基因K562单克隆细胞

为了构建HLA-A*02:01⁺/PRAME⁺双阳靶细胞以用于PVL7 TCR功能验证，将HLA-A*02:01基因通过实施例5的方法连接到相应的穿梭质粒，并进行慢病毒包装，然后转导到K562肿瘤细胞(HLA-A*02:01^-/PRAME⁺)，初步得到染色体整合有HLA-A*02:01基因的K562多克隆细胞。为了得到能稳定表达HLA-A*02:01基因的K562单克隆细胞，通过有限稀释法对K562-A0201多克隆细胞在96孔板中进行分离培养，每孔含有0.5–1个候选细胞。待候选细胞扩增完毕，采用鼠抗人HLA-A2流式抗体(BD Pharmingen,产品号558570)检测K562-A0201单克隆细胞膜表面HLA-A*02:01表达情况。如图10所示，编号为3G5的K562-A0201单克隆细胞HLA-A*02:01表达阳性率为99.7％，该细胞将用于PVL7 TCR的体外功能验证和动物实验。

HLA-A*02:01基因全长序列(SEQ ID NO:15)：

atggccgtcatggcgccccgaaccctcgtcctgctactctcgggggctctggccctgacccagacctgggcgggctctcactccatgaggtatttcttcacatccgtgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatcgcagtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgacgccgcgagccagaggatggagccgcgggcgccgtggatagagcaggagggtccggagtattgggacggggagacacggaaagtgaaggcccactcacagactcaccgagtggacctggggaccctgcgcggctactacaaccagagcgaggccggttctcacaccgtccagaggatgtatggctgcgacgtggggtcggactggcgcttcctccgcgggtaccaccagtacgcctacgacggcaaggattacatcgccctgaaagaggacctgcgctcttggaccgcggcggacatggcagctcagaccaccaagcacaagtgggaggcggcccatgtggcggagcagttgagagcctacctggagggcacgtgcgtggagtggctccgcagatacctggagaacgggaaggagacgctgcagcgcacggacgcccccaaaacgcatatgactcaccacgctgtctctgaccatgaagccaccctgaggtgctgggccctgagcttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcgggatggggaggaccagacccaggacacggagctcgtggagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcggctgtggtggtgccttctggacaggagcagagatacacctgccatgtgcagcatgagggtttgcccaagcccctcaccctgagatgggagccgtcttcccagcccaccatccccatcgtgggcatcattgctggcctggttctctttggagctgtgatcactggagctgtggtcgctgctgtgatgtggaggaggaagagctcagatagaaaaggagggagctactctcaggctgcaagcagtgacagtgcccagggctctgatgtgtctctcacagcttgtaaagtgtaa

实施例8PVL7 TCR体外功能验证—ELISPOT法检测肿瘤细胞系的INF-γ释放

本实施例通过ELISPOT试验分析PVL7 TCR在不同肿瘤细胞系刺激下INF-γ因子的释放情况。本实施例的效应细胞是实施例5中的经PVL7、PVLcon和GFP慢病毒转导的CD8⁺ T细胞。本实施例的肿瘤靶细胞分别是K562、K562-A0201-3G5、Hela(北京协和细胞资源中心)、SiHa(北京协和细胞资源中心)、Raji(北京协和细胞资源中心)和HT-1080(北京协和细胞资源中心)细胞。按实施例6所述，依次将4×10³个阳性效应细胞/孔和4×10⁴个肿瘤靶细胞/孔加入ELISPOT孔板，每孔培养体系200μL，将孔板置于细胞培养箱孵育过夜。孵育结束后，参照实施例6的方法对ELISPOT孔板进行洗涤和显影，最终用酶联免疫斑点分析仪对孔板进行分析。

结果如图11所示，PVL7和PVLcon TCR-T细胞对双阳肿瘤靶细胞K562-A0201-3G5展现出强烈刺激活性，PVL7释放INF-γ因子的活性略高于PVLcon，但两者之间并无显著差异。其它肿瘤细胞均无法刺激PVL7与PVLcon TCR-T细胞释放INF-γ。GFP TCR-T细胞对所有肿瘤靶细胞均无明显活性。

实施例9PVL7 TCR体外功能验证—肿瘤细胞系LDH特异性杀伤

采用定量测定靶细胞裂解后释放的LDH来评估效应细胞杀伤靶细胞的功能，具体实验方案参考文献Eur.J Immunol.1993,23,3217。本实施例的效应细胞是实施例5中的经PVL7、PVLcon和GFP慢病毒转导的CD8⁺ T细胞。本实施例的肿瘤靶细胞是K562和K562-A0201-3G5细胞。依次将3×10⁴个阳性效应细胞/孔和1×10⁴个肿瘤靶细胞/孔加入96孔圆底板，每孔培养体系200μL，细胞在铺板时均置换成仅含5％FBS的RPMI 1640培养基，将孔板置于细胞培养箱中培养24h。根据CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒说明书(Promega,产品号G1780)，在培养基空白孔与肿瘤靶细胞最大自释放孔中加入裂解液，置于细胞培养箱孵育45min后，每孔取50μL上清与50μL LDH检测液混匀，在室温避光孵育30min。孵育结束后，加入终止液，并于490nm波长下读板。按照计算公式对数据进行处理分析：细胞毒性百分比％，即LDH释放百分比％＝(实验组释放量–肿瘤细胞自释放量–TCR-T细胞自释放量)/(肿瘤细胞最大释放量-肿瘤细胞自释放量)*100％。计算时，各组LDH释放量数值均减去培养基本底光吸收值。

结果如图12所示，PVL7和PVLcon TCR-T细胞对双阳肿瘤靶细胞K562-A0201-3G5展现出明显的杀伤作用，两者细胞毒性百分比接近，分别是65.16±17.39％和66.22±9.67％。PVL7和PVLcon TCR-T细胞对K562无明显杀伤作用，与阴性对照GFP TCR-T细胞接近。

实施例10PVL7 TCR体外功能验证—健康人PBMC特异性INF-γ释放

为排查PVL7 TCR的安全性，采用实施例6的ELISPOT法，对28例健康人的PBMC进行安全性排查。28例健康人PBMC包含7例HLA-A*02:01分型，21例非HLA-A*02:01分型(图13A)。结果如图13B所示，INF-γ释放结果显示PVL7和PVLcon TCR-T细胞与健康人的PBMC无明显反应。

实施例11PVL7 TCR动物实验验证—PRAME转基因K562细胞异源移植

本实施例的实验动物种系是B-NDG小鼠(百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，SPF级)，雌性，4～6周龄。试验期间，实验动物安置在SPF级动物中心，所有技术指标均符合GB14925-2010屏障环境技术要求。本研究中的动物将食用质量符合国家标准并在有效期内的饲料，其饮用水经动物饮用纯水系统过滤除菌处理或高温高压灭菌处理，由动物饮水瓶自由摄取。实验动物均适应性饲养1周后再进行后续实验。

选择适应性观察合格的B-NDG小鼠皮下接种K562-A0201-3G5肿瘤细胞，调整细胞密度为2×10⁷个/mL，每只接种0.2mL。接种后每天进行观察，在平均瘤体积为100mm³左右时分为3个组，即Model Control组、PVL7 TCR-T组和GFP TCR-T组，每组7只动物。PVL7 TCR-T组按照剂量4×10⁸个阳性细胞/kg给药，GFP TCR-T组给予相同剂量的T细胞，模型对照组动物给予等体积的溶媒。各组小鼠给药均为尾静脉注射。各组给药后腹腔注射IL-2，5万IU/只，连续给药5天。分组当天测量瘤径，之后每3天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)及短径(b)，按公式1/2×a×b²计算肿瘤体积(Tumor Volume)，绘制肿瘤生长曲线。给药18天后安乐死动物，取瘤体进行拍照。

各组小鼠的肿瘤生长曲线和瘤体详见图14和图15，PVL7 TCR-T细胞能有效杀伤肿瘤细胞K562-A0201-3G5、抑制肿瘤的生长。GFP TCR-T组的肿瘤生长曲线和Model Control组相比无明显变化。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳普瑞金生物药业股份有限公司

<120> 一种特异性识别PRAME抗原肽的TCR及其应用

<130> P22011408CN

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRAME上100-108位肽段

<400> 1

Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu

1 5

<210> 2

<211> 274

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 含信号肽的PVL7 TCR的α链全长序列

<400> 2

Met Glu Lys Met Leu Glu Cys Ala Phe Ile Val Leu Trp Leu Gln Leu

1 5 10 15

Gly Trp Leu Ser Gly Glu Asp Gln Val Thr Gln Ser Pro Glu Ala Leu

20 25 30

Arg Leu Gln Glu Gly Glu Ser Ser Ser Leu Asn Cys Ser Tyr Thr Val

35 40 45

Ser Gly Leu Arg Gly Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Pro Glu Phe Leu Phe Thr Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu Lys Glu Lys

65 70 75 80

Glu Arg Leu Lys Ala Thr Leu Thr Lys Lys Glu Ser Phe Leu His Ile

85 90 95

Thr Ala Pro Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg

100 105 110

Ala Asp Gln Thr Gly Ala Asn Asn Leu Phe Phe Gly Thr Gly Thr Arg

115 120 125

Leu Thr Val Ile Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln

130 135 140

Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp

145 150 155 160

Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr

165 170 175

Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser

180 185 190

Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn

195 200 205

Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro

210 215 220

Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp

225 230 235 240

Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu

245 250 255

Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp

260 265 270

Ser Ser

<210> 3

<211> 310

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 含信号肽的PVL7 TCR的β链全长序列

<400> 3

Met Gly Thr Arg Leu Leu Cys Trp Val Val Leu Gly Phe Leu Gly Thr

1 5 10 15

Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Ala

20 25 30

Lys Arg Gly Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His

35 40 45

Val Ser Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe

50 55 60

Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro

65 70 75 80

Ser Asp Arg Phe Phe Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu

85 90 95

Lys Ile Gln Arg Thr Gln Gln Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala

100 105 110

Ser Ser Arg Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val

130 135 140

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu

145 150 155 160

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp

165 170 175

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln

180 185 190

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser

195 200 205

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His

210 215 220

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp

225 230 235 240

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala

245 250 255

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly

260 265 270

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr

275 280 285

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys

290 295 300

Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PVL7 TCR的α链CDR1

<400> 4

Val Ser Gly Leu Arg Gly

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PVL7 TCR的α链CDR2

<400> 5

Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu

1 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PVL7 TCR的α链CDR3

<400> 6

Ala Val Arg Ala Asp Gln Thr Gly Ala Asn Asn Leu Phe

1 5 10

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PVL7 TCR的β链CDR1

<400> 7

Ser Gly His Val Ser

1 5

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PVL7 TCR的β链CDR2

<400> 8

Phe Gln Asn Glu Ala Gln

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PVL7 TCR的β链CDR3

<400> 9

Ala Ser Ser Arg Gly Ala Asp Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Vα(α链的可变区)

<400> 10

Glu Asp Gln Val Thr Gln Ser Pro Glu Ala Leu Arg Leu Gln Glu Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ser Ser Leu Asn Cys Ser Tyr Thr Val Ser Gly Leu Arg Gly

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Pro Glu Phe Leu Phe

35 40 45

Thr Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu Lys Glu Lys Glu Arg Leu Lys Ala

50 55 60

Thr Leu Thr Lys Lys Glu Ser Phe Leu His Ile Thr Ala Pro Lys Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Ala Asp Gln Thr Gly

85 90 95

Ala Asn Asn Leu Phe Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Val Ile Pro

100 105 110

<210> 11

<211> 91

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cα(α链的恒定区)

<400> 11

Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

1 5 10 15

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

20 25 30

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

35 40 45

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro

85 90

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Vβ(β链的可变区)

<400> 12

Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Val Ala Lys Arg Gly

1 5 10 15

Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Leu

20 25 30

Phe Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr

35 40 45

Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ser Gly Leu Pro Ser Asp Arg

50 55 60

Phe Phe Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Lys Ile Gln

65 70 75 80

Arg Thr Gln Gln Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Arg

85 90 95

Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 13

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cβ(β链的恒定区)

<400> 13

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala

<210> 14

<211> 509

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRAME全长序列

<400> 14

Met Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser

1 5 10 15

Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln

20 25 30

Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu

35 40 45

Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg

50 55 60

His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys

65 70 75 80

Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr

85 90 95

Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val

100 105 110

Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser

115 120 125

His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr

130 135 140

Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys

145 150 155 160

Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu

165 170 175

Val Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe

180 185 190

Ser Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu

195 200 205

Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys

210 215 220

Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val

225 230 235 240

Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu

245 250 255

Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala

260 265 270

Ser Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe

275 280 285

Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp

290 295 300

Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val

305 310 315 320

Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu

325 330 335

Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser

340 345 350

Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro

355 360 365

Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val

370 375 380

Phe Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro

385 390 395 400

Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn

405 410 415

Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly

420 425 430

Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr

435 440 445

Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His

450 455 460

Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val

465 470 475 480

Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr

485 490 495

Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn

500 505

<210> 15

<211> 1098

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HLA-A*02:01基因全长序列

<400> 15

atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggctct ggccctgacc 60

cagacctggg cgggctctca ctccatgagg tatttcttca catccgtgtc ccggcccggc 120

cgcggggagc cccgcttcat cgcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180

gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggt 240

ccggagtatt gggacgggga gacacggaaa gtgaaggccc actcacagac tcaccgagtg 300

gacctgggga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccgtccag 360

aggatgtatg gctgcgacgt ggggtcggac tggcgcttcc tccgcgggta ccaccagtac 420

gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480

gacatggcag ctcagaccac caagcacaag tgggaggcgg cccatgtggc ggagcagttg 540

agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600

gagacgctgc agcgcacgga cgcccccaaa acgcatatga ctcaccacgc tgtctctgac 660

catgaagcca ccctgaggtg ctgggccctg agcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720

tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc tcgtggagac caggcctgca 780

ggggatggaa ccttccagaa gtgggcggct gtggtggtgc cttctggaca ggagcagaga 840

tacacctgcc atgtgcagca tgagggtttg cccaagcccc tcaccctgag atgggagccg 900

tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ctttggagct 960

gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa 1020

ggagggagct actctcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080

acagcttgta aagtgtaa 1098

Claims

1.一种TCR，所述TCR包含α链和β链，所述α链包含α链可变区，所述β链包含β链可变区，其特征在于，所述α链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为如SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列，且所述β链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为如SEQ IDNO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR的α链和β链还包含框架区；

所述α链的框架区来源于TRAV和TRAJ；和/或，

所述β链的框架区来源于TRBV、TRBD和TRBJ。

3.如权利要求2所述的TCR，其特征在于，所述TRAV为种系TRAV20。

4.如权利要求2所述的TCR，其特征在于，所述TRAJ为种系TRAJ36。

5.如权利要求2所述的TCR，其特征在于，所述TRBV为种系TRBV7-8。

6.如权利要求2所述的TCR，其特征在于，所述TRBD为种系TRBD1。

7.如权利要求2所述的TCR，其特征在于，所述TRBJ为种系TRBJ2-3。

8. 如权利要求2所述的TCR，其特征在于，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，和所述β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。

9.如权利要求1~8任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR的α链和β链还包括恒定区。

10.如权利要求9所述的TCR，其特征在于，所述α链和/或所述β链的恒定区来源于人种系。

11.如权利要求9所述的TCR，其特征在于，所述α链的恒定区来源于TRAC，和/或，所述β链的恒定区来源于TRBC。

12.如权利要求11所述的TCR，其特征在于，所述TRBC为种系TRBC2。

13. 如权利要求10所述的TCR，其特征在于，来源于人种系的α链的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示，和/或，来源于人种系的β链的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

14.如权利要求9所述的TCR，其特征在于，所述TCR的α链和β链还包括跨膜区。

15.如权利要求14所述的TCR，其特征在于，所述TCR的α链和β链还包括胞内序列。

16. 如权利要求15所述的TCR，其特征在于，包含信号肽的所述TCR的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，和包含信号肽的所述TCR的β链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。

17.一种分离的核酸，其编码如权利要求1~16任一项所述的TCR。

18. 一种包含如权利要求17所述的核酸的载体；所述的核酸在单个开放阅读框中，或者在两个不同的开放阅读框中分别编码TCR α链和TCR β链。

19.如权利要求18所述的载体，其特征在于，所述的载体为慢病毒载体。

20.一种含有如权利要求17所述的核酸或者如权利要求18或19所述的载体的细胞。

21.如权利要求20所述的细胞，其特征在于，所述的细胞为T细胞或者干细胞。

22. 如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述的T细胞为CD8⁺ T细胞。

23.一种提呈如权利要求1~16任一项所述的TCR的分离的或非天然存在的细胞。

24.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述的细胞为T细胞。

25.一种药物组合物，其特征在于，其含有如权利要求1~16任一项所述的TCR或者如权利要求20~24任一项所述的细胞。

26.如权利要求25所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包含药物上可接受的载体。

27.一种如权利要求1~16任一项所述TCR、如权利要求20~24任一项所述的细胞或者如权利要求25或26所述的药物组合物在制备防治PRAME表达相关的肿瘤的药物中的应用。

28.如权利要求27所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为黑色素瘤、急慢性白血病、淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、肉瘤、头颈癌、肾细胞癌或乳腺癌。