BRPI0411132B1 - protéina de fusão heteróloga e seus usos - Google Patents

Abstract

"proteína de fusão heteróloga, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, processo papa produzir uma proteína de fusão heteróloga, métodos para tratar um paciente com diabete melito independente de insulina e para induzir perda de peso em um paciente acima do peso, e 9 uso de proteína de fusão heteróloga". a invenção proporciona análogos de glp-1 específicos fundidos em derivados de igg4-fc específicos. estas proteinas de fusão possuem uma meia-vida aumentada, uma imunogenicidade diminuída, e uma atividade efetuadora reduzida. as proteinas de fusão são úteis no tratamento de diabetes, de obesidade, de síndrome de intestino irritável e de outras condições que seriam beneficiadas pelo abaixamento de glucose plásmica, pela inibição de motilidade intestinal e/ou gástrica e pela inibição do esvaziamento intestinal e/ou gástrico, ou pela inibição da ingestão de alimentos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "PROTÉEVA DE FUSÃO HETERÓLOGA E SEUS USOS".

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se aos análogos de peptídeo semelhantes a glucagon fundidos em proteínas que possuem o efeito de estender a meia-vida in vivo de peptídeos. Estas proteínas de fusão podem ser usadas para tratar diabetes bem como uma variedade de outras condições ou de outros distúrbios.

Os derivados e análogos de peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1) mostram-se promissores em testes clínicos para o tratamento de diabetes de tipo 2. O GLP-1 induz numerosos efeitos biológicos tais como estimulação de secreção de insulina, inibição de secreção de glucagon, inibição de esvaziamento gástrico, inibição de mo-tilidade gástrica ou de motilidade intestinal, e indução de perda de peso. Uma característica significativa de GLP-1 é sua capacidade para estimular a secreção de insulina sem o risco associado de hipoglicemia que é visto quando se usa terapia de insulina ou se utilizam alguns outros tipos de terapias orais que atuam pelo aumento da expressão de insulina. A utilidade da terapia envolvendo peptídeos GLP-1 tem sido limitada pelo fato de que GLP-1 (1-37) é fracamente ativo, e os dois peptídeos truncados de ocorrência natural, GLP-1 (7-37)OH e GLP-1 (7-36)NH2, são rapidamente eliminados in vivo e possuem meias-vidas in vivo extremamente curtas. É sabido que a dipeptidil-peptidase IV (DPP-IV) endogenamente produzida inativa os peptídeos GLP-1 circulantes pela remoção de resíduos de alani-na e de histidina N-terminais e é uma razão maior pela meia-vida in vivo curta. Várias abordagens têm sido consideradas para estender a meia-vida de eliminação de um peptídeo GLP-1 ou para reduzir a eliminação do peptídeo do corpo ao mesmo tempo mantendo a atividade biológica. Uma abordagem envolve a fusão de um peptídeo GLP-1 em uma porção Fc de uma imunoglobulina. Imunoglobulinas tipicamente possuem meias-vidas de circulação longas in vivo. Por exemplo, moléculas de IgG podem possuir uma meia-vida em humanos de até 23 dias. A porção Fc da imunoglobulina é responsável, em parte, por esta estabilidade in vivo. Proteínas de fusão de GLP-1-Fc se aproveitam da vantagem da estabilidade proporcionada pela porção Fc de uma imunoglobulina ao mesmo tempo preservando a atividade biológica da molécula de GLP-1.

Embora esta abordagem seja factível para terapias com GLP-1 (veja WO 02/46227), há em geral uma preocupação com relação à antigenicidade de várias proteínas de fusão quando administradas repetidamente durante períodos de tempo prolongados. Isto é especialmente uma preocupação pelos agentes terapêuticos de fusão de GLP-1-Fc visto que um paciente com diabetes tem que ser tratado durante toda a sua vida uma vez diagnosticado com a doença. Em adição, agentes terapêuticos de proteína de fusão Fc podem ser uma preocupação se a porção Fc retiver suas funções efetuadoras indesejadas. A presente invenção almeja suplantar os problemas associados com a imunogenicidade potencial e a atividade efetuadora associadas com a administração de fusões de GLP-l-Fc pela identificação de proteínas de fusão de GLP-l-Fc específicas que possuem um risco reduzido de indução de uma resposta imune após administração prolongada e repetida e não têm mais função efetuadora. Estas proteínas de fusão específicas possuem substituições em várias posições na porção GLP-1 bem como na porção Fc da molécula. As substituições aqui descritas proporcionam potência aumentada, estabilidade in vivo aumentada, eliminação de função efetuadora e possibilidade diminuída de que a molécula será reconhecida pelos elementos adaptáveis do sistema imune.

Os compostos da presente invenção incluem proteínas de fusão heterólogas compreendendo um análogo de GLP-1 compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo de: His-XaEs-Olii-Gly-Tk-Phe-Thr-Ser-Asp-Vai-Ser-Seí-Tw-Leu-Glu-Glu- Gl]^·Ala’-A!a-Lys·Glu-Phe-De-Alâ‘Trp-Let!■Vd-Lys-Gly-Gly-Gly na qual Xaa8 é selecionado de Gly e Vai; b) (SEQID NO: 2) His-Xaaí-Glw-GJy-ltr-Phe-Ttir-Ser-Asp-Val-Set-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gki- Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-De-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-GlyOly na qual Xaa§ é selecionado de Gly e Vai; c) (SEQ IDNO: 3) His-Xaas-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser^Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Gíu-Glu- Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trç-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro na qual Xaa8 é selecionado de Gly e Vai; d) (SEQ IDNO: 4) Ηί5"Χ388^]«^-ΉΐΓ-^Τ1]τ^βΓ-Α8|^νβ1·56χ-§«-Τ3τ^“Θϊα-ΟΙϋ-Gin-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ue-Ala-Trp-Leu-Lys-AsD-Gly-Gly-Pfo na qual Xaa8 é selecionado de Gly e Vai; e) (SEQ IDNO: 5) His-XaarGlu-Gly-Ihr-Plie-TJir-Ser-Asp-Val-Sér-Ser-TjT-Leu-Glw-Glu- Gln-Ala-AIa-Lyj-Glu-Hie-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly na qual Xaa8 é selecionado de Gly e Vai; f) (SEQIDNO: 6) Η^-Χ888-ΟΙη-Ο^.1ΐΓ-Ρ^0-ΤΗΐ"8«“Αίρ-νίΙ>5«^-Τ^1^ι»-ΟΙυ·Ο1α“ Gln-AIa-Ala-Lys-Glu-fíie41e-Ala-Trp-Leu-Ly8-Asn-Gly--Gly na qual Xaa8 é selecionado de Gly e Vai; fundida na porção Fc de uma imunoglobulina compreendendo a sequência de SEQ IDNO: 7 Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gíy-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro^ys-Pro-Ala Pro- Xaai6-Xaar7*Xaaií-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Pbe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro- Lys-Asp-Tbr-Leu-Met-De-Ser-Arg-Tbr-Pio-Glu-Val-Thr-Cys-Va]- Val-Val-Asp-Val'Ser-GIn-GiU'Asp-Pro-<jlu-Val-Gln-Phe-Asii-Trp- Tyr-Val-Asp-GJy-VaJ-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg- Glu-Glu-Gln-Phe-Xaa*rSer-Tht-Tyr-Arg'Val-Val-Ser~Vá-Leu-Thr- Vd-I^u-His-ían-Asp-Típ-Leu-Aja-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys- Val-Ser-Asu-Lys-Gly-Leu-Piro-Ser-Ser-Ile-Gla-Lys-Thr-Iie-Ser- Lys-AlíhL^-GIy-Gk-Pro-Arg-GIu-Pio-Gln-Val-Tyr-Thr-Uu-Pro- Pr^Ser-Glü-Glu-Glu-Mét-Thr-Lys-Asn-Gb-Val-Ser-Lea-Thr-Cys- Leu-Val-Lys-Gly-Hie-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu- Ser-Asti-Gly-GIn^Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Tk-Thr-Pro-Pro-Va]- Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Plie-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-nir-Val- Asp-Lys-Ser-Arg-T^p-GIa-GJu-Gly-Asn-Val-Pbe-Ser-Cys-^er-Va]- Met-His^lu-Ak-L|j-Hls-Asn-His-Tyr-Ttr-Glii-Lys-Sfflr-Leu-S«- Leu-Ser-Leu-Gly-Xaai» (SEQ Π) NO:7) na qual: Xaa na posição 16 é Pro ou Glu;

Xaa na posição 17 é Phe, Vai, ou Ala;

Xaa na posição 18 é Leu, Glu, ou Ala;

Xaa na posição 80 é Asn ou Ala; e Xaa na posição 230 é Lys ou está ausente. A terminação C da porção de análogo de GLP-1 e a terminação N da porção Fc das proteínas de fusão heterólogas da presente invenção estão preferivelmente fundidas juntas via 1, 1,5 ou 2 repetições de um ligante de peptídeo rico em G possuindo a seqüência Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 8). A presente invenção também inclui polinucleotídeos codificadores de proteínas de fusão heterólogas da presente invenção, bem como vetores e células hospedeiras compreendendo tais polinucleotídeos. Métodos de tratamento de pacientes sofrendo de diabete melito independente de insulina bem como de diabete melito dependente de insulina, de obesidade, e de vários outros distúrbios e de várias outras condições compreendendo administrar as proteínas de fusão heterólogas aqui discutidas também são incluídos pela presente invenção.

As proteínas de fusão heterólogas da presente invenção compreendem uma porção de análogo de GLP-1 e uma porção Fc. A porção de análogo de GLP-1 e a porção Fc compreendem substituições na seqüência de GLP-1 nativo e a seqüência de IgG4 humana respectivamente que proporcionam a proteína com potência aumentada e estabilidade in vivo aumentada em comparação com o GLP-1 nativo ou os análogos de GLP-1 não fundidos em uma seqüência Fc ao mesmo tempo diminuindo o potencial para indução de formação de anticorpo após administração prolongada e repetida em humanos. GLP-1 nativo é processado in vivo de tal modo que os primeiros 6 aminoácidos são clivados da molécula. Assim, pelo costume na técnica, a terminação amino de GLP-1 tem sido designada com o número 7 e a terminação carboxila, com o número 37. Os outros aminoácidos no polipeptídeo não numerados consecutivamente como mostrado na SEQ ID

NO: 9. Por exemplo, a posição 8 é alanina e a posição 22 é glicina. O peptídeo processado pode ser adicionalmente modificado in vivo de tal maneira que o resíduo de glicina C-terminal é removido e substituído por um grupo amino. Assim, GLP-1 (7-37)OH e GLP-1 (7-36)amida representam as duas formas nativas da molécula. GLP-l(7-37)OH possui a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9: ?His-Ala-Glu-i0G!y-Thr-Phe-Thr-Ser-líAsp-Val-Ser-Ser-Tyr-:i0Leu-Glu-Gly-Gltí-AJa-25Ala-Lys-Gk-Phe-ÍI&-30Ala-Tjp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg-37Gly (SEQ ID NO:9) A porção de análogo de GLP-1 da proteína de fusão heteróloga compreende três substituições primárias nas posições 8, 22, e 36 em relação ao GLP-l(7-37) nativo. A substituição na posição 8 reduz a velocidade na qual a enzima endógena dipeptidil-peptidase IV (DPP-IV) inativa o análogo. DPP-IV cliva GLP-1 nativo entre os 2o e 3o aminoácidos (entre as posições 8 e 9) e a molécula resultante é menos ativa. Assim, as proteínas de fusão heterólogas da presente invenção são resistentes à DPP-IV. A substituição na posição 22 reduz o potencial de a molécula se agregar e aumenta a potência da molécula. A substituição na posição 36 no contexto do análogo com mudanças em 8 e 22 também no contexto do proteína de fusão inteira reduz o risco de que a proteína de fusão induza uma resposta imune neutralizadora após administração prolongada e repetida a humanos. O evento central na geração de ambas as respostas imunes humoral e mediada por célula é a ativação e a expansão clonal de células Τ'-auxiliares (TH). A ativação de células TH é iniciada pela interação do complexo de CD3-receptor de célula T (TCR) com um peptídeo antigênico processado ligado em uma molécula de histocompatibilidade maior (MHC) de classe II na presença de uma célula apresentadora de antígeno (APC). Interação de uma célula TH com antígeno inicia uma cascata de eventos bioquímicos que induz a célula TH restante a entrar no ciclo celular (transição G0 para Gi). A célula T ativada progride através do ciclo celular, proliferando e diferenciando em células de memória ou células efetuadoras. A seguinte seqüência foi analisada para identificar os epítopos potenciais: His-Gly-G!u-Gly-Thr-Phe'Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-QlU'Gin‘Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly-GIy-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Sei^iy-GÍ^Gly-Gly-SefrGly-Gly-GIy-GljHSer- Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glii-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro (SEQ tt> NGilO) Esta seqüência é uma seqüência de análogo de GLP-1 nativo com mudanças nas posições 8 e 22 relativas à seqüência nativa seguida por 2 cópias de um ligante rico em G seguido pelos primeiros 10 aminoácidos de uma região Fc derivada de IgG4 humana. Epítopo como aqui usado refere-se a uma região de uma molécula de proteína no qual um anticorpo pode se ligar. Um epítopo imunogênico é definido como a parte da proteína que gera uma resposta de anticorpo quando a proteína inteira é o imunógeno. Mapeamento de epítopo envolveu a varredura das seqüências usando uma janela deslizante de nove aminoácidos acoplada a técnicas de análise estatística avançada para extrair a informação contida nestes padrões. Um pacote de programa de computador patenteado conhecido como EpiMatrix™ foi utilizado para analisar a seqüência e identificar os peptídeos que apresentam a probabilidade elevada para provocar uma resposta imune quando apresentados às células-T. Oito alelos elevadamente comuns foram usados na análise para a interação de receptor de MHC de Classe II. Estes alelos incluíram DRB 1*0101, DRB 1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*0801, DRB1*1101, DRBl*1301,eDRBl*1501.

Um epítopo forte foi predito para estar localizado na junção da terminação-C da porção de análogo de GLP-1 e o início do ligante. A seqüência deste epítopo é Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 11) que interage com DRB 1*0801. A presente invenção inclui a verificação de que este epítopo pode ser eliminado pela mudança da terminação-C do análogo de GLP-1 para a seguinte seqüência: Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 12); Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 13); Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 14); Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 15); Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO: 16); e Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly (SEQ ID NO: 17).

As proteínas de fusão heterólogas da presente invenção contêm uma porção Fc que é derivada de uma IgG4 humana, mas compreende uma ou mais substituições comparada com a seqüência humana de tipo selvagem. Como aqui usada, a porção Fc de uma imunoglobulina possui o significado comumente dado ao termo no campo de imunologia. Especificamente, este termo refere-se a um fragmento de anticorpo que não contém as duas regiões de ligação de antígeno (os fragmentos Fab) do anticorpo. A porção Fc consiste da região constante de um anticorpo de ambas as cadeias pesadas, que associam-se através de interações não- covalentes e ligações de dissulfeto. A porção Fc pode incluir as regiões de dobradiça e se estender através dos domínios CH2 e CH3 até a terminação-C do anticorpo. A porção Fc pode incluir adicionalmente um ou mais sítios de glicosilação. Há cinco tipos de imunoglobulinas humanas com diferentes funções efetuadoras e propriedades farmacocinéticas. IgG é o mais estável dos cinco tipos possuindo uma meia-vida sérica em humanos de cerca de 23 dias. Há outras quatro subclasses de IgG (Gl, G2, G3 e G4) cada uma das quais possuindo funções biológicas diferentes conhecidas como funções efetuadoras. Estas funções efetuadoras são em geral mediadas através de interação com o receptor de Fc (FcyR) ou pela ligação de Clq e complexo fixador. Ligação de FcyR pode acarretar a citólise mediada por célula dependente de anticorpo, enquanto que a ligação em fatores de complemento pode ocasionar lise celular mediada por complemento. No projeto de proteínas de fusão Fc heterólogas nas quais a porção Fc está sendo utilizada apenas por sua capacidade de estender a meia-vida, é importante minimizar qualquer função efetuadora. Assim, as proteínas de fusão heterólogas da presente invenção são derivadas da região IgG4 Fc humana por causa de sua capacidade reduzida para ligar FcyR e fatores de complemento comparadas com os outros subtipos de IgG. Tem sido mostrado, contudo, que IgG4 ocasiona depleção de células alvo em humanos [Issacs et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 106:427-433]. Devido ao fato de as proteínas de fusão heterólogas da presente invenção selecionarem células beta no pâncreas para induzir expressão de insulina, o uso de região derivada de IgG4 em uma proteína de fusão de Fc podería iniciar uma resposta imune contra a célula beta de pâncreas através de interação da proteína de fiisão com o receptor de GLP-1 presente sobre as células beta de pâncreas. Assim, a região IgG4 Fc que é parte das proteínas de fusão heterólogas da presente invenção contém substituições que eliminam a função efetuadora. A porção IgG4 Fc das proteínas de fusão da presente invenção podem conter uma ou mais das seguintes substituições: substituição de glutamato por prolina no resíduo 233, de fenilalanina por alanina ou valina no resíduo 234 e de leucina por alanina ou glutamato no resíduo 235 (Numeração EU, Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publication no. 91-3242). Estes resíduos correspondem às posições 16, 17 e 18 na SEQ ID NO: 7. Ainda mais, remoção do sítio de glicosilação N-ligado na região IgG4 Fe pela substituição de Asn por Ala no resíduo 297 (numeração EU) que corresponde à posição 80 de SEQ ID NO: 7 é outro modo de garantir que a atividade efetuadora residual é eliminada no contexto de uma proteína de fusão heteróloga.

Em adição, a porção IgG4 Fc das proteínas de fusão heterólogas da presente invenção contém uma substituição que estabiliza a formação de dímero de cadeia pesada e previne a formação de cadeias de meia-IgG4 Fc. As proteínas de fusão heterólogas da presente invenção preferivelmente existem como dímeros unidos juntos por ligações de dissulfeto e várias outras interações não-covalentes. IgG4 de tipo selvagem contém um motivo Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys (SEQ ID NO: 18) começando no resíduo 224 (numeração EU). Este motivo em uma cadeia Fc - análogo de GLP-1 simples forma ligações de dissulfeto com o motivo correspondente em outra cadeia Fc - análogo de GLP-1. Contudo, a presença de serina no motivo causa a formação de proteínas de fusão de cadeia simples. A presente invenção inclui proteínas de fusão de Fc heterólogas nas quais a seqüência de IgG4 está adicionalmente modificada de tal modo que serina na posição 228 (numeração EU) está substituída por prolina (resíduo de aminoácido 11 na SEQ ID NO: 7). O resíduo de lisina C-terminal presente na molécula nativa pode ser deletado na porção Fc derivada de IgG4 das proteínas de fusão heterólogas discutidas aqui (posição 230 de SEQ ID NO: 7; lisina deletada referida como des-K). Proteínas de fusão expressadas em alguns tipos de célula (tais como células NSO) nas quais lisina é codificada pelo códon C-terminal são heterólogas pelo fato de que uma porção das moléculas possui lisina como o aminoácido C-terminal e uma porção possui lisina deletada. A deleção é devido à ação de protease durante a expressão em alguns tipos de células de mamífero. Assim, para evitar esta heterogeneidade, é preferido que os construtos de expressão de fusão de Fc sejam faltantes de um códon C-terminal para lisina. É preferido que o aminoácido C-terminal da porção de análogo de GLP-1 aqui discutido esteja fundido na terminação-N da porção de análogo IgG4 Fc via um ligante rico em glicina. A estabilidade e a função in vivo das proteínas de fusão heterólogas da presente invenção podem ser otimizadas pela adição de ligantes de peptídeo pequenos para prevenir interações de domínio potencialmente indesejadas. Ainda mais, um ligante rico em glicina proporciona alguma flexibilidade estrutural de tal modo que a porção de análogo de GLP-1 pode interagir produtivamente com o receptor de GLP-1 sobre células alvo tais como as células beta do pâncreas. Estes ligantes, contudo, podem aumentar significativamente o risco de que a proteína de fusão seja imunogênica in vivo. Assim, é preferido que o comprimento não seja mais longo do que o necessário para prevenir as interações de domínio indesejadas e/ou otimizar a atividade biológica e/ou a estabilidade. O ligante rico em glicina preferido compreende a seqüência Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 8). Embora mais cópias deste ligante possam ser usadas nas proteínas de fusão heterólogas da presente invenção, é preferido que uma única cópia deste ligante seja utilizada para minimizar o risco de imunogenicidade associada com administração repetida e prolongada.

Proteínas de fusão heterólogas de GLP-1-Fc preferidas da presente invenção incluem as seguintes: GI^-Glu^-Gly^-GLP-1(7-37)- lL-IgG4 (S22SP), Gl/Glm22- Gly3í"GIJP-l(7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A), Gl/-Glu22-Gl/Ô-GLP-1(7-37)-lL-IgG4 (S22SP, N297A), Gl/'Glu22-G]y35TGLP4(7-37>lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A), 01/-0^-01^-01^-1(7-37)-13HgG4 (S228P), Gí/WLGI/-GLP-l(7-37>l.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), Οΐ/-01^-βΐ/-ΟΙΜ(7-37>1.5υ IgG4 (S228P, N297A), Gl/-Glu22-Gl/s-GLP-l(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A), Gly8.Glu22-Gly36-GLP-l(7-37>2L-IgG4 (S228P), GlZ-Glu^Gl/-GLP-l(7-37}-2L-IgG4 (S228P, F234A. L23SA), Gl/-Glu2,-Gl/-GLP-l{7-37)-2L-lgG4 (S228P, N297Á), and Gl/-Glu22-Gl/-GLP-l(7-37)-2L-IgG4 (S22SP, F234A, L235A, N297A), fonnas Valse des-K de todes acima. A nomenclatura aqui utilizada para se referir às proteínas de fusão heterólogas específicas é definida como segue: substituições específicas na porção GLP-1 da proteína de fusão são indicadas usando o aminoácido específico sendo substituído seguido pelo número de resíduo. GLP-1 (7-37) indica que a porção GLP-1 da proteína de fusão madura começa com His na posição 7 e termina com Gly na posição 37. L refere-se a um ligante com a seqüência Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQID NO: 8). 0 número imediatamente precedendo L refere-se ao número de ligantes separando a porção GLP-1 da porção Fc. Um ligante especificado como 1,5L refere-se à seqüência Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser- Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 19). IgG4 refere-se a um análogo de seqüência IgG4 Fc humana especificada como SEQ ID NO: 7. Substituições na porção IgG4 Fc da proteína de fusão heteróloga são indicadas entre parênteses. 0 aminoácido de tipo selvagem é especificado por sua abreviação comum seguida pelo número de posição no contexto da seqüência de IgG4 inteira usando o sistema de numeração EU seguido pelo aminoácido sendo substituído naquela posição especificado por sua abreviação comum.

Embora as proteínas de fusão heterólogas da presente invenção possam ser preparadas por uma variedade de métodos diferentes, por causa do tamanho da proteína de fusão, métodos recombinantes são preferidos. Para os propósitos da presente invenção, como aqui descritos e reivindicados, os seguintes termos e abreviações de biologia molecular geral são definidos abaixo. “Par de bases” ou “pb” como aqui usado refere-se a DNA ou RNA. As abreviações A, C, G, e T correspondem às formas de 5’-monofosfato dos desoxirribonucleotídeos (desoxi)adenosina, (desoxi)citidina, (desoxi)guanosina, e timidina, respectivamente, quando ocorrem em moléculas de DNA. As abreviações U, C, G, e A correspondem às formas de 5’-monofosfato dos ribonucleotídeos uridina, citidina, guanosina, e adenosina, respectivamente quando ocorrem em moléculas de RNA. Em DNA de fita dupla par de bases pode ser referir a uma associação de A com T ou de C com G. Em um DNA/RNA, par de bases heteroduplex pode ser referir a uma associação de A com U ou de C com G. (Veja a definição de “complementar”, infra). “Digestão” ou “Restrição” de DNA refere-se à divagem catalítica do DNA com uma enzima de restrição que atua apenas em certas seqüências no DNA (“endonucleases seqüência-específicas”). As várias enzimas de restrição aqui usadas estão comercialmente disponíveis e suas condições de reação, seus co-fatores, e seus outros requerimentos foram utilizados como seria conhecido por uma pessoa ordinariamente experiente na técnica. Quantidades de substrato e de tampões apropriados para enzimas de restrição particulares são especificadas pelo fabricante ou podem ser prontamente encontradas na literatura. “Ligação” refere-se ao processo de formação de ligações de fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico de fita dupla. A não ser que seja proporcionada, ligação pode ser realizada usando tampões e condições conhecidos com uma DNA ligase, tal como T4 DNA ligase. “Plasmídeo” refere-se a um elemento genético extracromossômico (normalmente) auto-replicante. “Vetor de clonagem de DNArecombinante” como aqui usado refere-se a qualquer agente autonomamente replicante, incluindo, mas não limitado a, plasmídeos fagos, compreendendo uma molécula de DNA na qual um ou mais segmentos de DNA adicionais podem ser ou têm sido adicionados. “Vetor de expressão de DNA recombinante” como aqui usado refere-se a qualquer vetor de clonagem de DNA recombinante no qual um promotor tem sido incorporado para controlar a transcrição do DNA inserido. “Transcrição” refere-se ao processo por meio do qual informação contida na seqüência de nucleotídeos de DNA é transferida para uma seqüência de RNA complementar. “Transfecção” refere-se à captação de um vetor de expressão por uma célula hospedeira sejam ou não, de fato, quásquer seqüências codificadoras expressadas. Numerosos métodos de transfecção são conhecidos pela pessoa ordinariamente experiente na técnica, por exemplo, co-precipitação com fosfato de cálcio, transfecção de lipossoma, e eletroporação. Transfecção bem sucedida é em geral reconhecida quando qualquer indicação da operação deste vetor ocorre dentro da célula hospedeira. “Transformação” refere-se à introdução de DNA em um microorganismo de modo que o DNA seja replicável, quer como um elemento extracromossômico quer por integração cromossômica. Métodos de transformação de hospedeiros eucarióticos e bacterianos são bem conhecidos na técnica, muitos de tais métodos, tais como injeção nuclear, fusão de protoplasto ou por tratamento por cálcio usando cloreto de cálcio estão resumidos em J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989). Em geral, quando se introduz DNA em Levedura o termo transformação é utilizado em oposição ao termo transfecção. “Tradução” como aqui usado refere-se ao processo por meio do qual a informação genética do RNA mensageiro (mRNA) é utilizada para especificar e direcionar a síntese de uma cadeia de polipeptídeo. “Vetor” refere-se a um composto de ácido nucleico usado para a transfecção e/ou a transformação de células em manipulação genética possuindo seqüências de polinucleotídeo correspondendo às moléculas de proteína apropriadas que, quando combinadas com as seqüências de controle adequadas, confere propriedades específicas à célula hospedeira a ser transfectada e/ou transformadas. Plasmídeos, vírus, e bacteriófago são vetores apropriados. Vetores artificiais são construídos pelo corte e pela junção de moléculas de DNA de fontes diferentes usando enzimas de restrição e ligases. O termo “vetor” como aqui usado inclui vetores de clonagem de DNA recombinante e vetores de expressão de DNA recombinante. “Complementar” ou “complementaridade”, como aqui utilizados, referem-se aos pares de bases (purinas e pirimidinas) que se associam através de ligação de hidrogênio em um ácido nucleico de fita dupla. Os seguintes pares de bases são complementares: guanina e citosina; adenina e timina; e adenina e uracila. “Iniciador” refere-se a um fragmento de ácido nucleico que funciona como um substrato de iniciação de alongamento enzimático ou sintético. “Promotor” refere-se a uma seqüência de DNA que direciona a transcrição de DNA em RNA. “Sonda” refere-se a um composto de ácido nucleico ou um fragmento do mesmo que hibridiza com outro composto de ácido nucleico. “Seqüência líder” refere-se a uma seqüência de aminoácidos que pode ser enzimática ou quimicamente removida para produzir o polipeptídeo desejado de interesse. “Seqüência de sinal de secreção” refere-se a uma seqüência de aminoácidos geralmente presente na região N-terminal de um polipeptídeo maior funcionando para iniciar a associação daquele polipeptídeo com os compartimentos de membrana celular como retículo endoplasmático e a secreção daquele polipeptídeo através de membrana plasmática.

Proteínas IgG4 humanas de tipo selvagem podem ser obtidas de uma variedade de fontes. Por exemplo, estas proteínas podem ser obtidas de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de células que expressam o mRNA de interesse em um nível detectável. Bibliotecas podem ser selecionadas com sondas projetadas usando a seqüência de proteína ou de DNA publicada para a proteína particular de interesse,. Por exemplo as regiões constantes de cadeia pesada ou leve de imunoglobulina são descritas em Adams, et al (1980) Biochemistry 19:2711-2719; Goughet, et al (1980) Biochemistry 19:2702-2710; Dolby, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:60276031; Rice et al (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:7862-7862; Falkner, et al. (1982) Nature 298:286-288; e Morrison, et al (1984) Ann. Rev. Immunol. 2:239-256.

Triagem de uma biblioteca genômica ou de cDNA com a sonda selecionada pode ser conduzida usando procedimentos padrão, tais como os descritos em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). Um meio alternativo para isolar um gene codificador de uma proteína imunoglobulina é o uso de metodologia de PCR [Sambrook et al, supra; Dieffenbach et al, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1995)]. Iniciadores de PCR podem ser projetados baseados em seqüências publicadas.

Em geral as seqüências de tipo selvagem de comprimento total clonadas de uma biblioteca particular podem servir como um modelo para formar os fragmentos de análogo de IgG4 Fc da presente invenção que retêm a capacidade de conferir uma meia-vida plásmica mais longa ao análogo de GLP-1 que é parte da proteína de fusão. Os fragmentos de análogo de IgG4 Fc podem ser gerados usando técnicas de PCR com iniciadores projetados para hibridizar em seqüências correspondendo às extremidades desejadas do fragmento. Iniciadores de PCR também podem ser projetados para formar sítios de enzima de restrição para facilitar a clonagem em vetores de expressão. DNA codificador de análogos de GLP-1 da presente invenção pode ser preparado por métodos diferentes incluindo métodos de clonagem como aqueles descritos acima bem como por DNA quimicamente sintetizado. Síntese química pode ser atrativa dado o comprimento curto do peptídeo codificado. A seqüência de aminoácidos para GLP-1 tem sido publicada bem como a seqüência do gene de preproglucagon. [Lopez, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei., USA 80:5485-5489; Bell, et al. (1983) Nature, 302:716-718; Heinrich, G., et al. (1984) Endocrinol, 115:2176-2181; Ghiglione, M., et al. 91984) Diabetologia 27:599600]. Assim, iniciadores podem ser projetados baseando-se na seqüência nativa para gerar o DNA codificador dos análogos de GLP-1 aqui descritos. O gene codificador de uma proteína de fusão pode ser então construído pela ligação de DNA codificador de um análogo de GLP-1 em-matriz no DNA codificador de proteínas IgG4 Fc aqui descritas. O DNA codificador de fragmentos de IgG4 Fc e de GLP-1 de tipo selvagem pode ser mutado quer antes da ligação quer no contexto de um cDNA codificador de uma proteína de fusão inteira. Uma variedade de técnicas de mutagênese é bem conhecida na técnica. O gene codificador do análogo de GLP-1 e o gene codificador de proteína análoga de IgG4 Fc também podem ser unidos em-matriz via DNA codificador de um peptídeo ligante rico em G. Uma seqüência de DNA preferida codificadora de uma das proteínas de fusão heterólogas da presente invenção, Gly8-Glu22-Gly36-Glp-l(7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A, des K), é proporcionada como a SEQID NO: 20: GLP-l(7-37)-lHgG4 (S228P, F234A, L235A, des K), is provided asSEQID NOi20: CACGGCGAGGGCACCTTCAÓCTCXX3ACGTGTCCTCCTAICTCGAG<3AGCAGG ccgccaaggaattcatcgcctggctggtgaagggcgggggcggtggtggtgg CTCCGGAGGCGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGCTGAGTCCAAATATGGT

CCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGÁGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTT

CTTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGCiACCCCTGAGG tcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaa CrGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAG

GAGCAGTTCMCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA

GGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGOCTC

CCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGC

CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGAIGACCAAGAACCAGGT

CAGCCrGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCr GGACTCCXjACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCrAACCGTGGACAAGAGC

AGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGC ACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT (SEQID NO:20) Células hospedeiras são transfectadas ou transformadas coir vetores de clonagem ou de expressão aqui descritos para produção de proteím de fusão heteróloga e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados apropriados para induzir promotores, selecionar transformantes. ou amplificar os genes codificadores das seqüências desejadas. As condições de cultura, tais como meios, temperatura, pH e semelhantes, podem sei selecionadas pelo técnico experiente sem experimentação indevida. Em geral, princípios, protocolos, e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas celulares podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology. A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook, et aL supra. Métodos de transfecção são conhecidos pelo técnico ordinariamente experiente, por exemplo, CaP04 e eletroporação. Aspectos gerais de transformações de sistema de hospedeiro celular de mamífero têm sidc descritos em Patente U.S. 4.399.216. Transformações em levedura sãc tipicamente realizadas de acordo com o método de van Solingen et al, J Bact 130(2): 946-7 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76(8): 3829- 33 (1979). Contudo, outros métodos para introduzir DNA em células, tais como por microinjeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplasto bacteriano com células intactas, ou policátions, por exemplo, polibreno ou poliomitina, também podem ser usados. Para várias técnicas de transformação de células de mamífero, veja Keown, et al, Methods in Enzymology 185: 527-37 (1990) e Mansour, et al, Nature 336(6 197): 348-52 (1988). Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de ácido nucleico (por exemplo, DNA) nos vetores incluem aqui levedura e células eucarióticas superiores.

Micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou levedura são hospedeiros de expressão ou de clonagem adequados para vetores de proteína de fusão. Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucariótico inferior comumente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe [Beach e Nurse, Nature 290: 140-3 (1981); EP 139.383 publicada aos 2 de maio de 1.995]; hospedeiros Muyveromyces [Patente U.S. 4.943.529; Fleer, et al, Bio/Technology 9(10): 968-75 (1991)] tais como, por exemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574) [de Louvencourt et al, J. Bacteriol. 154(2): 737-42 (1983)]; K. fiagilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K wickeramii (ATCC 24,178), K waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36.906) [Van den Berg et al, Bio/Technology 8(2): 135-9 (1990)); K. thermotoierans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070) [Sreekrishna et al, J. Basic Microbiol. 28(4): 265-78 (1988)1; Candid; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa [Case, et al, Proc. Natl. Acad Sei. USA 76(10): 5259-63 (1979)]; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentulis (EP 394.538 publicada aos 31 de outubro de 1990); e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada aos 10 de janeiro de 1991), e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans [Ballance et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 112(1): 284-9 (1983)]; Tilbum, et al, Gene 26(2-3): 205-21 (1983); Melton, et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81(5): 1470-4 (1984)] e A. niger [Kelly e Hynes, EMBO J. 4(2): 475-9 (1985)]. Leveduras metilotróficas são selecionadas dos gêneros consistindo de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, e Rhodotoruia. Uma lista de espécies específicas que são exemplares desta classe de levedura pode ser encontrada em C. Antony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982). Células hospedeiras adequadas para a expressão das proteínas de fusão da presente invenção são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrado incluem células de inseto tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sp, Spodoptera high5 bem como células de planta. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero incluem células de mieloma NSO, células de ovário de hamster chinês (CHO), células SP2, e células COS. Exemplos mais específicos incluem a linhagem celular CV1 de rim de macaco transformada por S V40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem celular de rim embriônico humano [células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham, et al, J. Gen Virol., 36(1): 59-74 (1977)]; células de ovário de hamster chinês /-DHFR [CHO, Urlaub e Chasm, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]; células de sertoli de camundongo [TM4, Mather, Biol. Reprod. 23(1):243-52 (1980)]; células de pulmão humano (W138. ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); e tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51). Uma linhagem celular preferida para a produção das proteínas de fusão de Fc da presente invenção é a linhagem celular de mieloma de NSO disponível na European Collection of Cell Cultures (ECACC, no. de catálogo 85110503) e descrita em Galffe, G. e Milstein, C. ((1981) Methods in Enzymology 73(13):3-46; e Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures, Academic Press, N.Y., N.Y.).

As proteínas de fusão da presente invenção podem ser recombinantemente produzidas diretamente, ou como uma proteína possuindo uma seqüência de sinal ou outras seqüências adicionais que formam um sítio de divagem específico na terminação-N da proteína de fusão madura. Em geral, a seqüência de sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA codificador de proteína de fusão que é inserida no vetor. Para a secreção em levedura, a seqüência de sinal pode ser, por exemplo, a líder de invertase de levedura, a líder de fator alfa (incluindo as líderes de co-fator de Saccharomyces e de Kluyveromyces a última descrita em Patente U.S. 5.010.182), ou a líder de ácido-fosfatase, a líder de glicoamilase de C. albicans (EP 362.179), ou o sinal descrito em WO 90/13646. Em expressão em célula de mamífero, as seqüências de sinal de mamífero podem ser usadas para dirigir a secreção da proteína, tais como as seqüências de sinal de polipeptídeos secretados de mesma espécie ou de espécie relacionada bem como líderes secretórias virais.

Vetores tanto de expressão quanto de clonagem contêm uma seqüência de ácido nucleico que permite que o vetor se replique em uma ou mais células hospedeiras relacionadas. Os vetores de clonagem e de expressão tipicamente conterão um gene de seleção, também chamado de um marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou a outras toxinas, por exemplo, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) deficiências autotróficas de complemento, ou (c) fornecimento de nutrientes críticos não disponíveis dos meios complexos, por exemplo o gene codificador de D-alanina-racemase para Bacilli.

Um exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero é aquele que permite a identificação de células competentes para capturar o ácido nucleico codificador de proteína de fusão, tal como DHFR ou timidina cinase. Uma célula hospedeira apropriada quando DHFR de tipo selvagem for empregado é a linhagem celular CHO deficiente em atividade de DHFR, preparada e propagada como descrito [Urlaub e Chasm, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]. Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo TRp7 de levedura [Stinchcomb, et al, Nature 282(5734): 39-43 (1979); Kingsman, et al, Gene 7(2): 141-52 (1979); Tschumper, et al, Gene 10(2): 157-66 (1980)]. O gene trpl proporciona um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura faltante da capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEPC1 [Jones, Genetics 85:23-33 (1977)].

Vetores de clonagem e de expressão normalmente contêm um promotor operacionalmente ligado na seqüência de ácido nucleico codificadora de proteína de fusão para dirigir a síntese de mRNA. Promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. Exemplos de seqüências promotoras apropriadas para uso com hospedeiros levedura incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato cinase [Hitzeman, et al, J. Biol. Chem. 255(24): 12073-80 (1980)) ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); Holland, Biochemistry 17(23): 4900-7 (1978)], tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfoffutocinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase, e glicocinase. Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis possuindo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, ácido fosfatase, enzimas degradadoras associadas com metabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e de galactose. Vetores e promotores apropriados para uso em expressão em levedura são adicionalmente descritos em EP 73.657. Transcrição de mRNA codificador de proteína de fusão dos vetores em células hospedeiras de mamífero pode ser controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus tais como vírus do polioma, vírus de epitelioma contagioso, adenovíras (tal como adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovíms, vírus de hepatite B, e Vírus Simiano 40 (SV40), dos promotores heterólogos de mamífero, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e dos promotores de choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de célula hospedeira. A transcrição de um polinucleotídeo codificador de uma proteína de fusão por eucariotos superiores pode ser aumentada pela inserção de uma seqüência intensificadora no vetor. Intensificadores são elementos cis-atuantes de DNA, normalmente de cerca de 10 a 300 pb, que atuam sobre um promotor para aumentar sua transcrição. Muitas sequências intensifícadoras são agora conhecidas de genes de mamífero (globina elastase, albumina, a-cetoproteína, e insulina). Tipicamente, contudo, usar-se-á um intensificador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o intensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-720), o intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma sobre o lado tardio da origem de replicação, e intensificadores de adenovírus. O intensificador pode ser editorado no vetor em uma posição 5’ ou 3’ à seqüência codificadora de proteína de fusão mas está preferivelmente localizado em um sítio 5’ do promotor.

Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (levedura, fungos, inseto, planta, animal, humano, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também contêm seqüências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do mRNA. Tais seqüências estão comumente disponíveis das regiões não traduzidas 5’ e ocasionalmente 3’ de cDNAs ou de DNAs virais ou eucarióticos. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA codificador da proteína de fusão. Várias formas de uma proteína de fusão podem ser recuperadas do meio de cultura ou de lisados de célula hospedeira. Se ligada em membrana, pode se liberada da membrana usando uma solução detergente adequada (por exemplo, Triton X-100) ou por divagem enzimática. Células empregadas na expressão de uma proteína de fusão podem ser rompidas por vários meios físicos ou químicos, tais como congelamento-descongelamento cíclico, sonificação, disrupção mecânica, ou agentes de lise celular.

Uma vez expressadas as proteínas de fusão heterólogas da presente invenção na célula hospedeira apropriada, os análogos podem ser isolados e purificados. Os seguintes procedimentos são exemplares de procedimentos de purificação adequados: ffacionamento sobre carbóxi-metil-celulose; fíltração em gel tal como Sephadex G-75; resina de troca iônica tal como DEAE ou Mono-Q; troca catiônica tal como CM ou Mono-S; colunas quelantes de metal para ligar formas epítopo-marcadas do polipeptídeo; HPLC em fase reversa; cromatofocalização; gel de sílica; precipitação por etanol; e precipitação por sulfato de amônio. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) e Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada(s) dependerá(ão) da natura do processo de produção usado e da proteína de fusão particular produzida. Por exemplo, as proteínas de fusão compreendendo um fragmento de Fc podem ser efetivamente purificadas usando uma matriz de afinidade por Proteína A ou Proteína G. Tampões de pH baixo ou alto podem ser utilizados para eluir a proteína de fusão da matriz de afinidade. Condições de eluição brandas ajudarão a prevenir desnaturação irreversível da proteína de fusão.

As proteínas de fusão heterólogas da presente invenção podem ser formuladas com um ou mais excipientes. As proteínas de fusão da presente invenção podem ser combinadas com um tampão farmaceuticamente aceitável, e o pH ajustado para proporcionar estabilidade aceitável, e um pH aceitável para administração tal como administração parenteral. Opcionalmente, um ou mais agentes antimicrobianos farmaceuticamente . aceitáveis preferidos podem ser adicionados. Meta-cresol e fenol são agentes antimicrobianos farmaceuticamente aceitáveis preferidos. Um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser adicionados para ajustar a tonicidade ou força iônica. Um ou mais excipientes podem ser adicionados para adicionalmente ajustar a isotonicidade da formulação. Glicerina é um exemplo de um excipiente ajustador de isotonicidade. Farmaceuticamente aceitável significa adequado para a administração a um humano ou a outro animal e portanto, não contém elementos tóxicos ou contaminantes indesejáveis e não interfere com a atividade dos compostos ativos no mesmo.

As proteínas de fusão heterólogas da presente invenção podem ser formuladas como uma formulação de solução ou como um pó liofilizado que pode ser reconstituído com um diluente apropriado. Uma forma de dosagem liofilizada é uma na qual a proteína de fusão é estável, com ou sem atividade de tamponamento para manter o pH da solução durante a vida de armazenagem em uso intencionada do produto reconstituído. É preferível que a solução compreendendo as proteínas de fusão heterólogas aqui discutidas antes da liofilização sejam substancialmente isotônicas para permitir a formação de soluções isotônicas após a reconstituição.

Uma forma de sal farmaceuticamente aceitável das proteínas de fusão heterólogas da presente invenção está dentro do escopo da invenção. Ácidos comumente empregados para formar sais de adição de ácido são ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodídrico, ácido sulfürico, ácido fosfórico, e semelhantes, e ácidos orgânicos tais como ácido p-tolueno-sulfônico, ácido metano-sulfonico, ácido oxálico, ácido p-bromo-fenil-sulfônico, ácido carbônico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido acético, e semelhantes. Sais de adição de ácido preferidos são aqueles formados com ácidos minerais tais como ácido clorídrico e ácido bromídrico.

Sais de adição de base incluem aqueles derivados de bases inorgânicas, tais como bicarbonatos, carbonatos, hidróxidos de metal alcalino ou de metal alcalino-terroso ou de amônio, e semelhantes. Tais bases úteis na preparação dos sais desta invenção incluem portanto hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, carbonato de potássio, e semelhantes.

As proteínas de fusão heterólogas da presente invenção possuem atividade biológica. A atividade biológica refere-se à capacidade da proteína de fusão de se ligar em ou de ativar o receptor de GLP-1 in vivo e gerar uma resposta. Respostas incluem, mas não são limitadas a, secreção de insulina, supressão de glucagon, inibição de apetite, perda de peso, indução de saciedade, inibição de apoptose, indução de proliferação de célula beta pancreática, e diferenciação de células beta pancreáticas. Um número representativo de proteínas de fusão de GLP-1 foi testado para a atividade in vitro e in vivo. Exemplos 1 e 2 proporcionam a atividade in vitro baseada na capacidade da proteína de fusão de interagir com e de ativar o receptor de GLP-1 humano. Em ambos os conjuntos de experimentos, células HEK293 superexpressando o receptor de GLP-1 humano foram usadas. Ativação do receptor de GLP-1 nestas células causa ativação de adenilil-ciclase que por sua vez induz a expressão de um gene repórter conduzida por um elemento de resposta de AMP cíclico (CRE). Exemplo 1 (tabela 1) proporciona dados nos quais o gene repórter é beta lactamase, e o exemplo 2 (tabela 2) proporciona dados nos quais o gene repórter é luciferase. Exemplo 3 proporciona dados gerados após a administração de uma das proteínas de fusão heterólogas da presente invenção a ratos. Juntos os dados mostram que as proteínas de fusão são capazes de se ligar em e de ativar o receptor de GLP-1 e parecem mais potentes in vitro do que Val8-GLP-l(7-37)OH. Em adição, os dados gerados em ratos indicam que as proteínas de fusão são ativas in vivo e possuem uma meia-vida mais longa do que o GLP-1 nativo. A administração das proteínas de fusão heterólogas pode ser via qualquer rota conhecida como efetiva pelo médico de capacidade ordinária. Parenteral periférico é um tal método. Administração parenteral é comumente entendida na literatura médica como a injeção de uma forma de dosagem para dentro do corpo por uma seringa estéril ou algum outro dispositivo mecânico tal como uma bomba de infusão. Rotas parenterais periféricas podem incluir rotas de administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, e intraperitoneal.

As proteínas de fusão heterólogas da presente invenção também podem ser tratáveis para administração por rotas oral, retal, nasal ou respiratória inferior, que são rotas não parenterais. Destas rotas não parenterais, a rota respiratória inferior e a rota oral são preferidas.

As proteínas de fusão da presente invenção podem ser usadas para tratar uma ampla variedade de doenças e condições. As proteínas de fusão da presente invenção principalmente exercem seus efeitos biológicos pela ação em um receptor referido como o “receptor de GLP-1”. Indivíduos com doenças e/ou condições que respondem favoravelmente à estimulação de receptor de GLP-1 ou à administração de compostos de GLP-1 podem portanto ser tratados com as proteínas de fusão de GLP-1 da presente invenção. Estes indivíduos são citados como “estando em necessidade de tratamento com compostos de GLP-1” ou “em necessidade de estimulação de receptor de GLP-1”. Estão incluídos os indivíduos com diabetes independente de insulina, diabetes dependente de insulina, derrame cerebral (veja WO 00/16797), infarto do miocárdio (veja WO 98/08531), obesidade (veja WO 98/19698), mudanças catabólicas após cirurgia (veja Patente U.S. 6.006.753), dispepsia funcional e síndrome do intestino irritável (veja WO 99/64060).

Também estão incluídos os indivíduos requerendo tratamento profilático com um composto de GLP-1, por exemplo, os indivíduos sob risco de desenvolvimento de diabetes independente de insulina (veja WO 00/07617). Indivíduos com tolerância à glucose diminuída, indivíduos cujo peso corporal está cerca de 25% acima do peso corporal normal para a constituição corporal e a altura do indivíduo, indivíduos com uma pancreatectomia parcial, indivíduos possuindo um ou mais parentes com diabetes independente de insulina, indivíduos que tiveram diabetes gestacional e indivíduos que tiveram pancreatite aguda ou crônica estão sob risco de desenvolvimento de diabetes independente de insulina.

Uma quantidade efetiva de proteínas de fusão de GLP-1 aqui descritas é a quantidade que resulta em um efeito profilático e/ou terapêutico desejado sem causar efeitos colaterais indesejáveis quando administrada a um indivíduo em necessidade da estimulação de receptor de GLP-1. Um “efeito terapêutico desejado” inclui um ou mais dos seguintes: (1) uma melhoria do(s) sintoma(s) associado(s) com a doença ou a condição; (2) um retardo do início dos sintomas associados com a doença ou a condição; (3) longevidade aumentada comparada com a ausência do tratamento; e (4) qualidade de vida maior comparada com a ausência do tratamento. Por exemplo, uma “quantidade efetiva” de uma proteína de fusão GLP-1-Fc para o tratamento de diabetes é a quantidade que resultará em controle de concentração de glucose sanguínea maior do que na ausência do tratamento, resultando deste modo em um atraso no início das complicações diabéticas tais como retinopatia, neuropatia ou doença renal. Uma “quantidade efetiva” de uma proteína de fusão GLP-1-Fc para a prevenção de diabetes é a quantidade que retardará, comparada com a ausência de tratamento, o início dos níveis de glucose sanguínea elevados que requerem tratamento com drogas anti-hipoglicêmicas tais como sulfonil-uréias, tiazolidinadionas, insulina e/ou bisguanidinas. A dose de proteína de fusão efetiva para normalizar uma glucose sanguínea de paciente dependerá de numerosos fatores, dentre os quais estão incluídos, sem limitação, o sexo, o peso, a idade do indivíduo, a severidade da incapacidade de regular a glucose sanguínea, a rota de administração e a biodisponibilidade, o perfil farmacocinético da proteína de fusão, a potência, e a formulação. Doses podem estar dentro da faixa de 0,01 mg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal, preferivelmente dentro da faixa de 0,05 mg/kg de peso corporal a 0,5 mg/kg de peso corporal. É preferível que as proteínas de fusão da presente invenção sejam administradas uma vez a cada duas semanas ou uma vez por semana. Dependendo da doença sendo tratada, pode ser necessário administrar a proteína de fusão mais ffeqüentemente tal como duas a três vezes por semana. A presente invenção será agora descrita apenas por meio de exemplo não limitante com referência aos seguintes Exemplos.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Ensaio de ativação de receptor de GLP-1 in vitro Células HEK-293 expressando receptor de GLP-1 humano, usando um sistema CRE-BLAM, são semeadas a 20.000 a 40.000 células/cavidade/100 pL de meio DMEM com FBS 10% para dentro de uma placa de fundo limpo, preto de 96 cavidades revestidas de poli-d-lisina. No dia após a semeadura, o meio é removido e 80 pL de meio DMEM livre de plasma são adicionados. No terceiro dia após a semeadura, 20 pL de meio DMEM livre de plasma com BSA 0,5% contendo diferentes concentrações de várias proteínas de fusão heterólogas GLP-1-Fc são adicionados em cada cavidade para gerar uma curva de resposta à dose. Em geral, quatorze diluições contendo de 3 nanomolar a 30 nanomolar de proteína de fusão heteróloga GLP-1-Fc são usadas para gerar uma curva de resposta à dose da qual os valores de EC50 podem ser determinados. Após 5 horas de incubação com a proteína de fusão, 20 pL de substrato de β-lactamase (CCF2/AM, PanVera LLC) são adicionados e a incubação é continuada por 1 hora em cujo momento a fluorescência é determinada em um citoflúor. 0 ensaio é adicionalmente descrito em Zlokamikm et al. (1998), Science, 278:84-88. Várias proteínas de fusão d GLP-l-Fc são testadas e os valores de EC50 são apresentados na Tabela 1. Os valores são relativos aos valores determinados para Val8-GLP-l(7-37)-OH que é usado como um controle interno em cada experimento.

Tabela 1 Exemplo 2 - Ensaio de ativação de receptor de GLP-1 in vitro Células HEK-293 estavelmente expressando receptor de GLP-1 humano, usando um sistema CRE-Luciferase, são semeadas a 30.000 células/cavidade/80 pL de meio DMEM F12 baixo em soro para dentro de placas de 96 cavidades. No dia após a semeadura alíquotas de 20 pL de proteína de teste dissolvidas em BSA 0,5% são misturadas e incubadas com as células por 5 horas. Em geral 12 diluições contendo de 3 pM a 3 nM são preparadas em uma concentração de 5X para cada proteína de teste antes da adição nas células para gera uma curva de resposta à dose da qual os valores de EC50 podem ser determinados. Após a incubação, 100 pL de reagente Luciferase são adicionados diretamente em cada placa e misturados cuidadosamente por 2 minutos. Placas são deixadas em um luminômetro Tri-lux e a produção de luz resultante da expressão de luciferase é calculada. Várias proteínas de fusão de GLP-1-Fc são testadas e os valores de EC50 são apresentados na Tabela 2. Os valores são relativos aos valores determinados Q para Vai -GLP-l(7-37)-OH que é usado como um controle interno em cada experimento. Devido ao fato de as proteínas de fusão testadas abaixo serem dímeros, os valores são corrigidos levando em consideração uma diferença dupla em molaridade Tabela 2 Exemplo 3: Teste de tolerância à glucose intravenosa em ratos A proteína de fusão de Fc, Gly8-Glu22-Gly36-GLP-l(7-37)-L-IgG4 (S228,F234A,L235), é avaliada em um teste de tolerância de glucose intravenosa (IVGTT) em ratos. Pelo menos quatro ratos são incluídos em cerca de um de três grupos. 0 Grupo I recebe veículo (tabela 3), o Grupo II recebe 1,79 mg/kg de Gly8-Glu22-Gly36-GLP-l(7-37)-L-IgG4 (S228,F234A,L235) como uma única injeção subcutânea (tabela 4), e o Grupo III recebe 0,179 mg/kg de Gly8-Glu22-Gly36-GLP-l(7-37)-L-IgG4 (S228,F234A,L235) como uma única injeção subcutânea (tabela 5). Os ratos são subcutaneamente injetados na manhã do Dia 1. Vinte e quatro horas após a primeira injeção, 1 pL de glucose (D50) por grama de peso corporal de rato é infundido como um bolo. Amostras de sangue são retiradas a 2,4,6,10,20 e 30 minutos após a injeção de bolo de glucose.

Tabela 3 Tabela 4 Tabela 5 Exemplo 4 - Estudo de farmacocinética após uma única injeção subcutânea em macacos Cinomolgo Um estudo é realizado para caracterizar a farmacocinética (PK) da proteína de fusão de Fc, Gly8-Glu22-Gly36-GLP-l(7-37)-L-IgG4 (S228,F234A,L235), quando administrada como uma dose de 0,1 mg/kg por injeção subcutânea (SC) em macacos machos cinomolgo. Anticorpo RIA é específico para a porção média de GLP. ELISA usa um anticorpo de captura específica de terminação-N e um anticorpo de detecção específico para Fc. As concentrações plásmicas resultantes da ambos ELISA e RIA são usadas para determinar os valores de parâmetro farmacocinético representados.

Uma representação dos valores de parâmetro PK resultantes é resumida na tabela 6. PK de SC de dose única de RIA está associado com uma Cmax média de 446,7 ng/ml com um Tmax correspondente de 17,3 horas. A meia-vida de eliminação média é aproximadamente 79,3 horas (3,3 dias). A PK de ELISA está associada com uma Cmax média de 292,2 ng/ml com um Tmax correspondente de 16,7 horas. A meia-vida de eliminação média é aproximadamente 51,6 horas (2,2 dias).

Tabela 6 a Concentração plásmica máxima observada. b Tempo de concentração plásmica máxima observada. c Área sob a curva de concentração plásmica - tempo medida de 0 a infinito. d Meia-vida de eliminação. e Eliminação corporal total como uma função de biodisponibilidade. f Volume de distribuição como uma função de biodisponibilidade. SD = Desvio padrão.

Exemplo 5 - Avaliação da formação potencial de anticorpos após iniecões subcutâneas repetidas Amostra de soro designadas de macacos cinomolgo são testadas para a formação de anticorpos contra Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228,F234A,L235) usando formato de ELISA direto. Placas de microtítulo são revestidas com Gly8-Glu22-Gly36-GLP-l(7-37)-L-IgG4 (S228,F234A,L235) em uma concentração de 0,1 pg/ml. Amostras de soro de macaco são diluídas 50, 500,1.000 e 5.000 vezes em solução de bloqueio, e 0,5 ml de amostra/cavidade são incubados aproximadamente uma hora. Anticorpo secundário, Cabra<Humano Fab’2>Peroxidase (com reatividade cruzada de 75% para humano), é diluído 10,000 vezes em bloco e adicionado a 0,05 ml/cavidade e incubado aproximadamente uma hora. Desenvolvimento de cor usando substrato tetrametil-benzidina (TMB) é lido em uma densidade óptica de 450 nm-630 nm. Leituras em duplicata são tomadas na média. Um anticorpo contra GLP-1 foi usado como um controle positivo e conjugado de cabra<coelho>(H+L)-Peroxidase é o secundário suado para detecção.

Amostras de soro pontuais sao coletadas antes da dosagem, a 24 horas apos a segunda dose, e 168 horas após as primeira e segunda dose SC para uma avaliação de imunogenicidade potencial. A presença de títulos de anticorpo para G8E22-CEX-L-hIgG4 é interpretada por comparação com amostras de soro de pré-dose e controle positivo. Uma representação dos resultados é apresentada na Tabela 7 Tabela 7: Exemplo 6 - Estudo farmacodinâmico após uma única injeção subcutânea em macacos cinomolgo no estado de ieium e durante uma infusão de glucose intravenosa gradual Em Fase 1 (Dia 1 de Estudo) uma injeção subcutânea de veículo é administrada. Uma infusão de glucose intravenosa graduada (20% de dextrose) de 5, 10, e 25 mg/kg/min é então administrada imediatamente após a injeção de veículo. Em Fase 2 (Dia 3 de Estudo), uma injeção subcutânea de uma proteína de fusão GLP-1 (0,1 mg/kg) é administrada. Em Fase 3, uma infusão de glucose intravenosa graduada é realizada aproximadamente 96 horas após a injeção de fusão de GLP-1.

Procedimentos de infusão de glucose intravenosa graduada são conduzidos em macacos sedados após 16 h de jejum noturno. Para ambas as infusões de glucose intravenosa, amostras de linha base serão retiradas a cada 10 min por 2o min para definir linha base. Uma infusão de glucose crescente é iniciada a +20 min em uma taxa de 5 mg/kg/min, seguida por infusões de 10 mg/kg/min, e 25 mg/kg/min. Cada taxa de infusão é administrada por um período de 20 minutos. Amostras de sangue são retiradas em intervalos de 10 minutos para medição de glucose, insulina, e glucagon. Aproximadamente 1,0 ml de sangue é coletado a -20, -10 min, 0 antes das infusões de glucose, e a 10,20,30,40,50, e 60 minutos após a infusão de glucose para Fases 1 e 3. Uma apresentação dos dados é mostrada na tabela 8.

Tabela 8 Níveis de glucagon não foram estatisticamente diferentes entre macacos dosados com veiculo e com proteína de fusão de GLP-1.

Exemplo 7 - Estudo farmacodinâmico após injeções subcutâneas únicas de três doses diferentes em ratos no estado de ieium e durante uma infusão de glucose intravenosa. graduada Ratos cronicamente canulados são designados quer para controle com veículo (solução salina) quer para um de 3 grupos de tratamento (proteína de fusão de GLP-1; 0,0179 mg/kg; 0,179 mg/kg; ou 1,79 mg/kg). A proteína de fusão de GLP-1 e o veículo são administrados via injeção subcutânea. Vinte e quatro horas após o tratamento, ratos jejuados durante a noite (16 h) são submetidos a um teste de infusão de glucose intravenosa graduada. O teste de infusão de glucose intravenosa graduada consiste de um período de infusão de solução salina de linha base (20 min), seguido por duas fases de infusão de glucose de 30 min a 5 e 15 mg/kg/min, respectivamente. Amostras de plasma são coletadas a -20, -10 min, 0 antes das infusões de glucose (linha base), e a 10,20,30,40,50, e 60 minutos.

Uma representação dos dados é mostrada na tabela 9.

Tabela 9 REIVINDICAÇÕES

Claims (9)

1. Proteína de fusão heteróloga, caracterizada pelo feto de que compreende um análogo de GLP-1 compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo de: a) (SEQ ID NO: 1) His-Xaag-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly na qual Xaag é Gly; b) (SEQ ID N0:2) His-Xaag-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Gly na qual Xaag é Gly; c) (SEQ ID N0:3) His-Xaag-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro na qual Xaag é Gly; d) (SEQ ID N0:4) His-Xaag-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro na qual Xaag é Gly; e) (SEQ ID N0:5) His-Xaag-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly na qual Xaag é Gly; f) (SEQ ID N0:6) His-Xaag-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly na qual Xaag é Gly; fundida na porção Fc de uma imunoglobulina compreendendo a sequência de SEQID N0:7 Ala-GIu-Ser-Lys-Tyr-GIy-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Xaaió-Xaan-Xaaig-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-lle-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Xaaso-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-LysVal-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ue-Glu-Lys-Thr-lle-SerLys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-lle-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phc-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-GIu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa230 (SEQ ID N0:7) na qual: Xaa na posição 16 é Pro ou Glu; Xaa na posição 17 é Phe, Vai, ou Ala; Xaa na posição 18 é Leu, Glu, ou Ala; Xaa na posição 80 é Asn or Ala; e Xaa na posição 230 é Lys ou está ausente.

2. Proteína de fusão heteróloga, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o resíduo de glicina C-terminal do análogo de GLP-1 está fundido no resíduo de alanina N-terminal da porção Fc via um ligante de pep-tídeo compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo de: a) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:8); b) Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQID NO: 19); e c) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID N0:21).

3. Proteína de fusão heteróloga, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o ligante compreende a sequência de SEQ ID NO: 8.

4. Proteína de fusão heteróloga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o análogo de GLP-1 compreende a sequência de SEQ ID NO: 1.

5. Proteína de fusão heteróloga, caracterizada pelo fato de que é se- lecionada do grupo consistindo de: a) Gly8-Glu22.Gly36-GLP-l (7-37)-lL-lgG4 (S228P); b) Gly^Glu^.Gly^.GLP-l (7-37)-lL-lgG4 (S228P, F234A, L235A); c) Gly8-Glu22.Gly36.GLP-1 (7-37)-lL-lgG4 (S228P, N297A); d) Gly8- Glu^.Gly^.GLP-l (7-37)-lL-lgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e) Gly-Glu^.Gly^.GLP-1 (7-37)-1.5L-lgG4 (S228P); I) Gly8-Glu22.Gly36.GLP-1 (7-37)-1.5L-lgG4 (S228P, F234A, L235A); g) Gly8-Glu22.Gly36.GLP-1 (7-37)-1.5L-lgG4 (S228P, N297A); h) Gly8-Glu22.Gly36-GLP-l (7-37)-1.5L-lgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); i) Gly^Glu^.Gly^-GLP-l (7-37)-2L-lgG4 (S228P); j) Gly-Glu^.Gly^-GLP-l (7-37)-2L-lgG4 (S228P, F234A, L235A); k) Gly^Glu^.Gly36-GLP-1 (7-37)-2L-lgG4 (S228P, N297A); 1) Gly^Glu^-Gly^-Gly36-! (7-37)-2L-lgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e suas formas des-K.

6. . Proteína de fusão heteróloga, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo consistindo de: a) Val^Glu^-Gly^.GLP-l (7-37)-1 L-lgG4 (S228P); b) Val8-Glu22. Gly^-GLP-l (7-37) -lL-lgG4 (S228P, F234A, L235A); c) Va^-Glu^.Gly^.GLP-l (7-37)-lL-lgG4 (S228P, N297A); d) Val8-GLu22-GLy^-GLP-l (7-37)-lL-lgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e) Val8-Glu22- Gly36.GLP-l (7-37)-1.5L-lgG4 (S228P); f) Val^Glu^-Gly^.GLP-l (7-37)-1.5L-lgG4 (S228P, F234A, L235A); g) Val8-Glu22-Gly36-GLP-l(7-37)-1.5L-lgG4 (S228P, N297A); h) Val^Glu^-Gly^-GLP-l (7-37)-1.5L-lgG4 (S22BP, F234A, L235A, N297 A); i) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-2L-lgG4 (S228P); j) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-lgG4 (S228P, F234A, L235A); k) Vaf-Glu^-Gly36-GLP-1 (7-37)-2L-lgG4 (S228P, N297A); 1) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-2L-lgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e suas formas des-K.

7. Proteína de fusão heteróloga, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento.

8. Uso de uma proteína de fusão heteróloga, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para a manufatura de um medicamento para tratar diabetes melito independente de insulina.

9. Uso de uma proteína de fusão heteróloga, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para a manufatura de um medicamento para tratar obesidade ou induzir perda de peso em um indivíduo acima do peso.