TWI821881B - 腫瘤壞死因子α重組抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示了一種重組抗體，其包括輕鏈變異區及重鏈變異區，其中該輕鏈變異區包含至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體輕鏈變異區之胺基酸序列；該重組抗體可以低劑量投藥於犬隻骨關節炎治療，不引發副作用。
Description
本發明關於一種抗體及其應用，尤其關於一種重組抗體，且該重組抗體用於之免疫療法。
腫瘤壞死因子α為一種強效且多功之細胞激素，在保護細胞避免受於微生物病原體感染或內因性壓力破壞時扮演著要角，其係一種第二型同三聚體膜蛋白(homotrimeric type-II membrane protein)，為腫瘤壞死因子超家族(superfamily)一員；在與受器結合後，腫瘤壞死因子α會透過啟動NK-kB、JNK(JUN N-terminal kinase)、p42/p44促細胞增殖原(mitogen-activated kinase，MAPK)及p38 MAPK調控路徑以調節細胞凋亡、細胞分化或細胞增生；腫瘤壞死因子α主要由巨噬細胞(Macrophage)所製造及釋放，並對其有相當高的反應性；一般而言，腫瘤壞死因子α的功能在於免疫反應、造血功能及型態發育，同時也涉及了腫瘤生成、移植排斥、感染性休克、病毒複製、骨吸收、類風濕性關節炎和糖尿病。
異常的腫瘤壞死因子α及腫瘤壞死因子受器信號傳遞與數種疾病的病理機制有所關聯，其中包括了類風溼性關節炎、克隆氏症、動脈粥樣硬化、牛皮癬、敗血症、糖尿病和肥胖症；在具有輕微退化性關節炎徵兆的軟骨中，腫瘤壞死因子α及其受器的異常增量均暗示著其於早期退化性關節炎中所扮演的
角色；是以，調節腫瘤壞死因子α在治療犬類退化性關節炎方面可能會是個重要的部分。
骨關節炎(osteoarthritis)是犬類相當常見的健康問題，尤其發生在年長的犬隻身上；事實上，每五隻犬隻當中就有一隻會經歷骨關節炎的侵擾；骨關節炎係肇因於關節的發炎反應，導致疼痛、不適以及緊蹦感；在犬隻的關節內部，骨頭表面通常由一層薄而光滑的軟骨所覆蓋，並且為少量的關節液所潤滑，以令關節兩側的骨頭能自由地相對滑動；在具有骨關節炎的犬隻身上，關節內的軟骨受損導致犬隻的不適且會進一步的破壞軟骨，最終演變為退化性關節症(degenerative arthritis)；在排除外科手術介入的前提下進行關節炎關節重建在當前仍有相當難以突破的困境，因此降低關節發炎以及疼痛感會是值得嘗試的方向；主流針對罹患關節炎犬隻的方式一般採用止痛方式，其中NASIDs(Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs)例如Etogesic、Rimadyl、Metacam以及Deramaxx專為犬隻所設計；然而，NSAIDS可能導致腸胃道不適，並在一些案例中更造成肝臟或腎臟的失能；其他鎮痛劑例如曲馬多(tramadol)、金剛烷胺(amantadine)、潑尼松(prednisone)、地塞米松(dexamethasone)或其他皮質類固醇(corticosteroids)均能有效減少犬隻關節炎所造成的腫脹並達到消炎止痛的效果，但長期使用固醇類藥物仍存在著缺點，也間接導致獸醫不如以往那樣頻繁地開立皮質類固醇作為犬隻關節炎的治療處方；因此，新型犬類專用藥物的開發更顯得必要，且不僅能針對目標疾病達到良好的治療效果，更要減少發生在犬隻身上的不良副作用。
在現有市售的單株抗體中，已有數種抗體臨床用於對抗腫瘤壞死因子；在這些單株抗體中，阿達木單株抗體(Adalimumab)是目前最暢銷的產品，
並在2019年擁有達到100億美金的年銷售規模，其係一種重組人類IgG1單株抗體，為通過皮下投藥的生物疾病調節劑。
第二種藥物Humira為原先由Abbvie於美國起用並於2002年為美國食藥署所核准上市；該種藥物係以預先填充好的針劑，並以便於自行皮下投藥的筆型針劑在市面上銷售；然而，由於腫瘤壞死因子在宿主防禦系統中至關重要，所有的腫瘤壞死因子抑制劑包括阿達木單株抗體，其所引發的感染及惡性腫瘤風險為當前最受關注的議題之一。
骨關節炎(Osteoarthritis)是一種慢性病，而目前並沒有針對犬隻的治療方法；如今預防骨關節炎發生的最佳方式為保持犬隻關節健康，包括通過飲食、運動以及使用保護關節的補充食品；然而，補充劑通常並沒有顯著減緩症狀的效果，且同時會造成飼主鉅額的負擔；除了使用關節保護補充劑之外，鎮痛消炎也是治療犬隻骨關節炎的主流辦法；最常用的嚴重骨關節炎鎮痛藥物為非固醇類消炎藥物(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs，NSAIDs)，其不僅可以減緩疼痛，更可以降低關節內的發炎反應，但近幾年的研究指出，長期使用NSAIDS會導致相當多的副作用，例如腸胃道出血、腎臟或肝臟的功能性喪失；另一方面，抗發炎藥物例如阿斯匹靈(aspirin)或布洛芬(ibuprofen)係屬於非專一性的環氧合酶(Cyclooxygenase，COX)抑制劑，它們不僅僅會抑制炎症型前列腺素(inflammatory prostaglandins)的製造，更抑制了固有型前列腺素(constitutive prostaglandins)的生產，從而導致副作用，例如腸胃道出血；是以，需要安全性更高的治療方案來治療罹患關節炎的犬隻。
對於犬隻而言，骨關節炎是相當普遍的疾病，抗腫瘤壞死因子α的單株抗體是相當有潛力的候選藥物；於本發明中，Humira的互補決定區(Complementarity-determining regions，CDRs)被移植到了犬類抗體架構中以製備一種用於犬隻的新型抗腫瘤壞死因子α抗體。
本發明之一目的在於提供一種重組抗體，其包括：一輕鏈變異區及一重鏈變異區，其中，該輕鏈變異區包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)輕鏈變異區之胺基酸序列。
在一個或多個實施例中，該重鏈變異區包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)重鏈變異區之胺基酸序列。
在多個實施例中，該輕鏈包括：一第一序列，位於由N端起算第1至12之殘基；一第二序列，位於由N端起算第18至54之殘基；一第三序列，位於由N端起算第56至84之殘基；及一第四序列，位於由N端起算第86至108之殘基；其中，該第一序列包含一相同於SEQ ID NO：21之胺基酸序列，該第二序列包含一相同於SEQ ID NO：22之胺基酸序列，該第三序列包含一相同於SEQ ID NO：23之序列，該第四序列包含一相同於SEQ ID NO：24之胺基酸序列，該第五序列包含一相同於SEQ ID NO：25之胺基酸序列。
在一些實施例中，該輕鏈進一步包括一第五序列，位於由N端起算第110至217之殘基，其包括一相同於SEQ ID NO：25之胺基酸序列。
在一些較佳實施例中，該輕鏈包括一輕鏈序列，該輕鏈序列係選自由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所組成群組；更佳者，該輕鏈包括一相同於SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
在一個或多個實施例中，該重鏈包括：一第六序列，位於由N端起算第1至15之殘基；一第七序列，位於由N端起算第24至48之殘基；一第八序列，位於由N端起算第51至62之殘基；一第九序列，位於由N端起算第67至77之殘基；一第十序列，位於由N端起算第89至115之殘基，其中，該第六序列包含一相同於SEQ ID NO：26之胺基酸序列，該第七序列包含一相同於SEQ ID NO：27之胺基酸序列，該第八序列包含一相同於SEQ ID NO：28之胺基酸序列，該第九序列包含一相同於SEQ ID NO：29之胺基酸序列，該第十序列包含一相同於SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
在一些實施例中，該重鏈進一步包括一第十一序列，位於由N端起算第117至452之殘基，其中該第十一序列包含一相同於SEQ ID NO：31之胺基酸序列。
在一些較佳實施例中，該重鏈包括一重鏈序列，該重鏈序列係選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9所組成之群組；更佳者，該重鏈包括一相同於SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
在另一些較佳實施例中，該重鏈包括一重鏈序列，該重鏈序列係選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9所組成之群組，及該輕鏈包括一輕鏈序列，該輕鏈序列係選自由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所組成之群組；更佳者，該重鏈包括一相同於SEQ ID NO：6之胺基酸序列，該輕鏈包括一相同於SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
本發明之另一目的在於提供一種中和腫瘤壞死因子α的方法，該方法包括給予所需個體一有效濃度之重組抗體，其中，該重組抗體包含如前所述之重組抗體。
在一些較佳實施例中，該有效濃度介於0.04至1.0nM；更佳者，該有效濃度介於0.5至0.8nM。
本發明所提供的重組抗體的建構，可透過電腦模型以模擬目標抗體中的結合方位後加以建構，該重組抗體展現了對於犬類腫瘤壞死因子α的高度專一性並在低劑量展現了高效度。
本發明所提供的重組抗體，與現有市售的單株抗體相比，展現了更高的結合親和力以及更強的中和能力。
本發明所提供的重組抗體能夠以相對低的劑量治療骨關節炎，提高了治療的安全性並減少了不可預期的副作用。
圖1呈現了本發明所有設計之重組抗體之重鏈序列比對。
圖2呈現了本發明所有設計之重組抗體之輕鏈序列比對。
圖3呈現了實驗例中所有Humivet系列抗體之重鏈序列比對。
圖4呈現了實驗例中所有Humivet系列抗體之輕鏈序列比對。
圖5說明了重組犬類抗腫瘤壞死因子α於HEK-DualTM TNFα細胞中生物活性之效價驗證。
圖6說明了IgG變異體的結合親和力，其中酵素連結免疫吸附分析法實施以比較不同IgG變異體的結合親和力；該些IgG由117nM稀釋至0.0nM並於塗佈了腫瘤壞死因子α之96孔盤反應60分鐘。
圖7說明了犬化抗體Humivet-3.0系列於HEK-DualTM TNFα細胞中的抑制效果。
圖8說明了犬化抗體Humivet-3.0於HEK-DualTM TNFα細胞中的抑制效果。
本發明之一實施方式係提供一種重組抗體，其專一地與犬類腫瘤壞死因子α結合；該重組抗體包括一輕鏈變異區及一重鏈變異區，其中，該輕鏈變異區包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)輕鏈變異區之胺基酸序列；較佳地，該輕鏈變異區包含一50、60、70、80、90或95%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)輕鏈變異區之胺基酸序列。
在多個實施例中，該輕鏈包括：一第一序列，位於由N端起算第1至12之殘基；一第二序列，位於由N端起算第18至54之殘基；一第三序列，位於由N端起算第56至84之殘基；及一第四序列，位於由N端起算第86至108之殘基；其中，該第一序列包含一相同於SEQ ID NO：21之胺基酸序列，該第二序列包含一相同於SEQ ID NO：22之胺基酸序列，該第三序列包含一相同於SEQ ID NO：23之序列，該第四序列包含一相同於SEQ ID NO：24之胺基酸序列。
在一些實施例中，該輕鏈進一步包括一第五序列，位於由N端起算第110至217之殘基，其包括一相同於SEQ ID NO：25之胺基酸序列。
在一些實施例中，該輕鏈包括一輕鏈序列，該輕鏈序列係選自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、
SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20所組成群組；請參閱圖1，其說明了本發明所有設計之重組抗體之輕鏈序列比對。
在一些較佳實施例中，該輕鏈包括一輕鏈序列，該輕鏈序列係選自由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所組成群組。
在一較佳實施例中，該輕鏈包括一相同於SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
本發明之另一實施方式係一種重組抗體，其專一地與犬類腫瘤壞死因子α結合；該重組抗體包括一輕鏈變異區及一重鏈變異區，其中，該重鏈變異區包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)重鏈變異區之胺基酸序列；較佳地，該重鏈變異區包含一50、60、70、80、90或95%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)重鏈變異區之胺基酸序列。
在一個或多個實施例中，該重鏈包括：一第六序列，位於由N端起算第1至15之殘基；一第七序列，位於由N端起算第24至48之殘基；一第八序列，位於由N端起算第51至62之殘基；一第九序列，位於由N端起算第67至77之殘基；一第十序列，位於由N端起算第89至115之殘基，其中，該第六序列包含一相同於SEQ ID NO：26之胺基酸序列，該第七序列包含一相同於SEQ ID NO：27之胺基酸序列，該第八序列包含一相同於SEQ ID NO：28之胺基酸序列，該第九序列包含一相同於SEQ ID NO：29之胺基酸序列，該第十序列包含一相同於SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
在一些實施例中，該重鏈進一步包括一第十一序列，位於由N端起算第117至452之殘基，其中該第十一序列包含一相同於SEQ ID NO：31之胺基酸序列。
在一些實施例中，該重鏈包括一重鏈序列，該重鏈序列係選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10所組成之群組；請參閱圖2，其說明了本發明所有設計之重組抗體之重鏈序列比對。
在一些較佳實施例中，該重鏈包括一重鏈序列，該重鏈序列係選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9所組成之群組。
在一較佳實施例中，該重鏈包括一相同於SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
本發明之再一實施方式係提供一種重組抗體，其專一地與犬類腫瘤壞死因子α結合；該重組抗體包括一輕鏈變異區及一重鏈變異區，其中，該輕鏈變異區包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)輕鏈變異區之胺基酸序列，且該重鏈變異區包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)重鏈變異區之胺基酸序列；較佳地，該輕鏈變異區包含一50、60、70、80、90或95%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)輕鏈變異區之胺基酸序列；該重鏈變異區包含一50、60、70、80、90或95%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)重鏈變異區之胺基酸序列。
在多個實施例中，該輕鏈包括：一第一序列，位於由N端起算第1至12之殘基；一第二序列，位於由N端起算第18至54之殘基；一第三序列，位於由N端起算第56至84之殘基；及一第四序列，位於由N端起算第86至
108之殘基；其中，該第一序列包含一相同於SEQ ID NO：21之胺基酸序列，該第二序列包含一相同於SEQ ID NO：22之胺基酸序列，該第三序列包含一相同於SEQ ID NO：23之序列，該第四序列包含一相同於SEQ ID NO：24之胺基酸序列；該重鏈包括：一第六序列，位於由N端起算第1至15之殘基；一第七序列，位於由N端起算第24至48之殘基；一第八序列，位於由N端起算第51至62之殘基；一第九序列，位於由N端起算第67至77之殘基；一第十序列，位於由N端起算第89至115之殘基，其中，該第六序列包含一相同於SEQ ID NO：26之胺基酸序列，該第七序列包含一相同於SEQ ID NO：27之胺基酸序列，該第八序列包含一相同於SEQ ID NO：28之胺基酸序列，該第九序列包含一相同於SEQ ID NO：29之胺基酸序列，該第十序列包含一相同於SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
在一些實施例中，該輕鏈進一步包括一第五序列，位於由N端起算第110至217之殘基，其包括一相同於SEQ ID NO：25之胺基酸序列；該重鏈進一步包括一第十一序列，位於由N端起算第117至452之殘基，其中該第十一序列包含一相同於SEQ ID NO：31之胺基酸序列。
在一些較佳實施例中，該輕鏈包括一輕鏈序列，該輕鏈序列係選自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20所組成群組；該重鏈包括一重鏈序列，該重鏈序列係選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10所組成之群組。
在另一些較佳實施例中，該輕鏈包括一輕鏈序列，該輕鏈序列係選自由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所組成群組；該重鏈包括一重鏈序列，該重鏈序列係選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9所組成之群組。
在一較佳實施例中，該輕鏈包括一相同於SEQ ID NO：12之胺基酸序列；該重鏈包括一相同於SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
在一些實施例中，該輕鏈變異區進一步包括一犬類k鏈或其變異體與輕鏈架構區(framework region，FR region)；更佳者，該重組抗體更包含犬類IgG或其變異體與輕鏈保守區(constant region)。
在一些實施例中，該重鏈變異區進一步包括一犬類IgG或其變異體與輕鏈架構區(framework region，FR region)；更佳者，該重組抗體更包含犬類IgG或其變異體與重鏈保守區(constant region)。
本發明之又一實施方式係提供一種嵌合抗體(chimeric antibody)，其包含一輕鏈及一重鏈，其中，該輕鏈變異區包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)輕鏈變異區之胺基酸序列，且該重鏈變異區包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)重鏈變異區之胺基酸序列；較佳地，該輕鏈變異區包含一50、60、70、80、90或95%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)輕鏈變異區之胺基酸序列；該重鏈變異區包含一50、60、70、80、90或95%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)重鏈變異區之胺基酸序列。
在多個實施例中，該輕鏈包括：一第一序列，位於由N端起算第1至12之殘基；一第二序列，位於由N端起算第18至54之殘基；一第三序列，
位於由N端起算第56至84之殘基；及一第四序列，位於由N端起算第86至108之殘基；其中，該第一序列包含一相同於SEQ ID NO：21之胺基酸序列，該第二序列包含一相同於SEQ ID NO：22之胺基酸序列，該第三序列包含一相同於SEQ ID NO：23之序列，該第四序列包含一相同於SEQ ID NO：24之胺基酸序列。
在一些實施例中，該輕鏈進一步包括一第五序列，位於由N端起算第110至217之殘基，其包括一相同於SEQ ID NO：25之胺基酸序列。
在一些實施例中，該輕鏈包括一輕鏈序列，該輕鏈序列係選自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20所組成群組。
在一些較佳實施例中，該輕鏈包括一輕鏈序列，該輕鏈序列係選自由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所組成群組。
在一較佳實施例中，該輕鏈包括一相同於SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
在一些實施例中，該重鏈包括：一第六序列，位於由N端起算第1至15之殘基；一第七序列，位於由N端起算第24至48之殘基；一第八序列，位於由N端起算第51至62之殘基；一第九序列，位於由N端起算第67至77之殘基；一第十序列，位於由N端起算第89至115之殘基，其中，該第六序列包含一相同於SEQ ID NO：26之胺基酸序列，該第七序列包含一相同於SEQ ID NO：27之胺基酸序列，該第八序列包含一相同於SEQ ID NO：28之胺基酸序列，
該第九序列包含一相同於SEQ ID NO：29之胺基酸序列，該第十序列包含一相同於SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
在一個或多個實施例中，該重鏈進一步包括一第十一序列，位於由N端起算第117至452之殘基，其中該第十一序列包含一相同於SEQ ID NO：31之胺基酸序列。
在一些實施例中，該重鏈包括一重鏈序列，該重鏈序列係選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10所組成之群組。
在一些較佳實施例中，該重鏈包括一重鏈序列，該重鏈序列係選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9所組成之群組。
在一較佳實施例中，該重鏈包括一相同於SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
在一些實施例中，該輕鏈變異區進一步包括一犬類k鏈或其變異體與輕鏈架構區(framework region，FR region)；更佳者，該重組抗體更包含犬類IgG或其變異體與輕鏈保守區(constant region)。
在一些實施例中，該嵌合抗體進一步包括一犬類IgG或其變異體與輕鏈架構區(framework region，FR region)；更佳者，該重組抗體更包含犬類IgG或其變異體與重鏈保守區(constant region)。
在該嵌合抗體一個示例性的實施例中，移植技術(grafting technique)被應用於一腫瘤壞死因子α專一犬類抗體創造互補決定區(complementarity-determining regions)；具體而言，Humira的互補決定區被移植到
一犬類抗體的架構區以製備一新型腫瘤壞死因子α抗體；舉例來說，可以依據後續治療的需求將互補決定區移植到一輕鏈或一重鏈之變異區。
在另一示例性的實施例中，該IgG基因序列被轉殖入一表現載體，接著轉染入宿主細胞，例如大腸桿菌(E.coli)、酵母菌或哺乳動物細胞(例如人類HEK293細胞或CHO細胞)，以製備本發明所揭示之重組抗體；以較佳實施例來說，該重組抗體係由哺乳類動物細胞所製造；在一個特定案例中，該重組抗體係由人類HEK293細胞所製備而得。
又一個示例性的實施例進一步地描述了移植Humira互補決定區至犬類抗體架構以建構該嵌合抗體序列，其實施以一酵母菌表現載體文庫之建構；具體來說，該嵌合抗體序列文庫係藉由移植具有Humira互補決定區編碼之序列至一犬類抗體文庫之架構區序列中；透過上述移植方式，建構了一嵌合抗體文庫，而該些序列編碼有一同時具有犬類及非犬類抗體序列之嵌合抗體文庫；接著，該嵌合抗體序列文庫轉殖入一酵母菌表現載體以建構一具有犬化(caninized)抗體序列之酵母菌表現載體文庫；上述犬化手段涉及了兩個選殖步驟以相繼犬化輕鏈及重鏈保守區；通過選殖後，僅存的變異區序列係輕鏈及/或重鏈變異區上的Humira互補決定區。
該嵌合抗體也可以是由任一種先前技術中習知的方法所製造而得，而上述本發明之示例性實施例僅在於說明該嵌合抗體之建構，而非用於限制本發明實施的範疇。
本發明又再一實施方式係提供一種犬類腫瘤壞死因子α專一性結合之犬化抗體(caninized antibody)，其包含一輕鏈及一重鏈，其中，該輕鏈變異區包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)輕鏈變異
區之胺基酸序列，且該重鏈變異區包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)重鏈變異區之胺基酸序列；較佳地，該輕鏈變異區包含一50、60、70、80、90或95%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)輕鏈變異區之胺基酸序列；該重鏈變異區包含一50、60、70、80、90或95%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)重鏈變異區之胺基酸序列。
在多個實施例中，該輕鏈包括：一第一序列，位於由N端起算第1至12之殘基；一第二序列，位於由N端起算第18至54之殘基；一第三序列，位於由N端起算第56至84之殘基；及一第四序列，位於由N端起算第86至108之殘基；其中，該第一序列包含一相同於SEQ ID NO：21之胺基酸序列，該第二序列包含一相同於SEQ ID NO：22之胺基酸序列，該第三序列包含一相同於SEQ ID NO：23之序列，該第四序列包含一相同於SEQ ID NO：24之胺基酸序列。
在一些實施例中，該輕鏈進一步包括一第五序列，位於由N端起算第110至217之殘基，其包括一相同於SEQ ID NO：25之胺基酸序列。
在另一些實施例中，該輕鏈包括一輕鏈序列，該輕鏈序列係選自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20所組成群組。
在一些較佳實施例中，該輕鏈包括一輕鏈序列，該輕鏈序列係選自由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所組成群組。
在一較佳實施例中，該輕鏈包括一相同於SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
在一個或多個實施例中，該重鏈包括：一第六序列，位於由N端起算第1至15之殘基；一第七序列，位於由N端起算第24至48之殘基；一第八序列，位於由N端起算第51至62之殘基；一第九序列，位於由N端起算第67至77之殘基；一第十序列，位於由N端起算第89至115之殘基，其中，該第六序列包含一相同於SEQ ID NO：26之胺基酸序列，該第七序列包含一相同於SEQ ID NO：27之胺基酸序列，該第八序列包含一相同於SEQ ID NO：28之胺基酸序列，該第九序列包含一相同於SEQ ID NO：29之胺基酸序列，該第十序列包含一相同於SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
在一些實施例中，該重鏈進一步包括一第十一序列，位於由N端起算第117至452之殘基，其中該第十一序列包含一相同於SEQ ID NO：31之胺基酸序列。
在一些實施例中，該重鏈包括一重鏈序列，該重鏈序列係選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10所組成之群組。
在一些較佳實施例中，該重鏈包括一重鏈序列，該重鏈序列係選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9所組成之群組。
在一較佳實施例中，該重鏈包括一相同於SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
在一些實施例中，該犬化抗體進一步包括一犬類IgG或其變異體與輕鏈保守區。
在一些實施例中，該犬化抗體進一步包括一犬類IgG或其變異體與重鏈架構區。
在另一些實施例中，該犬化抗體進一步包括一犬類IgG或其變異體及重鏈保守區。
在另一些實施例中，該犬化抗體包括一犬類IgG及一犬類k鏈或其變異體與輕鏈架構區。
在一個或多個實施例中，該犬化抗體進一步包含犬類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及/或一重鏈架構區變異體。
在一個或多個實施例中，該犬化抗體包含一輕鏈變異區，該輕鏈變異區進一步具有犬類k、λ鏈或一輕鏈架構區變異體。
在一些實施例中，該犬化抗體係由Fab、Fv、單鏈變異片段(single chain variable fragment，scFv)、F(ab’)2片段和雙體(diabody)所組成。
在一些較佳實施例中，該犬化抗體進一步包括犬類IgG1,、IgG2、IgG3、IgG4及/或一重鏈恆定區；較佳者，該犬化抗體包括犬類IgG1或IgG4。
一個示例性的犬化抗體係建構一全犬類抗體序列文庫；首先，由全犬類抗體輕鏈及重鏈二文庫中執行一定向選殖(directed selection)；前述定向選殖係針對一嵌合抗體重鏈，其包括一非犬類核心抗原辨識片段(例如重鏈變異區或互補決定區)及一犬類架構區序列(例如犬類IgG1)；舉例而言，一犬類抗體恆定區作為一架構區序列以攜帶下述Humira之互補決定區。
其次，個別基因池在in vivo的表現中形成一嵌合抗原結合段(fragment antigen-binding，Fab)文庫以使源自犬類抗體之輕鏈與嵌合重鏈進行組裝；針對引發非犬類抗體的原始抗原選擇含有嵌合輕鏈的雙鏈Fab文庫；由前述
方法挑選之全犬類嵌合Fab之輕鏈藉由與一全犬類抗體重鏈序列配對以形成一全犬類抗體序列文庫。
其三，上述全犬類抗體序列文庫再一次針對原始抗原(original antigen)進行篩選，以選殖出對於原始抗原具高度親和性之全犬類抗體；該些較原始非犬類抗體具有較高原始抗原親和性之全犬類抗體得以被篩選出來；此外，相較於具有部分犬類及部分非犬類序列之嵌合抗體，該些犬類抗體所導致的免疫抗性也較低，在投藥於所需個體時，可以預期產生較少的副作用。
除了以上述技術接合抗體以外，更進一步需要一蛋白質載體表現系統以促成大規模生產；較佳地，該重組抗體之序列、嵌合抗體或該犬化抗體轉殖入蛋白質表現載體中並轉染該些載體至宿主細胞，例如大腸桿菌(E.coli)、酵母菌細胞或哺乳動物細胞(例如HEK293細胞或CHO細胞)；更佳者，哺乳動物細胞做為生產抗體之宿主細胞；在一個特定的實施例中，該抗體由HEK293細胞所製造。
該重組抗體、該嵌合抗體或該犬化抗體可以是以任何習知技術所製造，而該示例性實施例所陳述之製造方法旨在於解釋本發明所提供之抗體構築，但並非用於限制本發明所保護之範疇。
本發明之再一實施方式係提供一種中和腫瘤壞死因子α的方法，該方法包括投予所需抗體一有效濃度之抗體，其中該抗體係如前所述之重組抗體、嵌合抗體或犬化抗體。
較佳者，該有效濃度介於0.04至1.0nM之間；更佳者，該有效濃度介於0.5至0.8nM之間。
實驗例
下述實驗例係用於進一步說明或展示一些較佳實施例，但並非用於限制本發明之範疇。
材料與方法
1. IgG選殖、表現與純化
Humira之重鏈及輕鏈變異區轉殖入犬類IgG1κ恆定區並產生十個犬化單株抗體，並命名為Humivet系列；抗犬類腫瘤壞死因子α抗體之構築係依據人類腫瘤壞死因子α之電腦模擬設計，共10種犬類IgG分別依據不同的重鏈及輕鏈之組合而設計，包括Humivet-1、Humivet-2、Humivet-3.0、Humivet-3.1、Humivet-3.1.1、Humivet-3.2、Humivet-3.2.1、Humivet-3.2.2、Humivet-3.2.3、Humivet-3.3；關於前述Humivet系列之具體序列細節，請參閱圖3及圖4，其中列出了Humivet系列的重鏈及輕鏈之胺基酸序列。
2. 自表現重組犬類腫瘤壞死因子α的合成及其生物活性測試
利用DNA構築法合成後續實驗所需之犬類腫瘤壞死因子α，並分別以細菌及哺乳動物系統進行合成；HEK-DualTM TNFα細胞在後續實驗中應用於生物活性測試，並以合成之TNFα對比小鼠TNFα，其中小鼠TNFα係做為陽性對照。
請參閱圖5，重組腫瘤壞死因子α以266.3nM至0.0nM序列稀釋的方式分別於37℃處理細胞達16小時；接著，收集100μl的細胞上清液並進一步分析；相較於細菌系統所表現之TNFα，哺乳動物系統表現之TNFα展現了較高的抗體效價，而這樣的結果也顯示了醣基化(glycosylation)對於TNFα之生理功能具有相當重要的影響；與此同時，哺乳動物系統表現之TNFα具有相似於小鼠TNFα的生理活性；因此，在後續實驗中將採用哺乳動物表現之TNFα。
3. In vitro TNFα抗體中和效力測定
HEK-DualTM TNFα細胞有利於通過監控NK-κB信息傳遞路徑的活化以偵測TNFα之生物活性；將細胞培養於含有10%胎牛血清、100ug/mL吉歐黴素及200ug/mL勻黴素之DMEM中；在用於TNFα中和測試時，細胞先以3x104cells/well的密度種植於96孔盤中，並以200uL之細胞培養液於37℃、5% CO2的條件下培養16小時；接著，以294pM的重組犬類TNFα處理細胞，並搭配不同濃度之測試抗體一同培養16小時；由TNFα所誘發之secreted embryonic alkaline phosphatase(SEAP)可由收集上清液而獲得，並依據生產商所提供之實驗程序加入QUANTI-Blue(InvivoGen)以進行生物活性測試。
4. 抗體-抗原交互作用之半最大效應濃度(EC
50
)
IgG之EC50測定係藉由酵素免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)以IgG抗體滴定於固定化之100ng TNFα進行；簡言之，TNFα以100ng/well的密度藉由磷酸緩衝溶液PBS塗佈於NUNC 96-well Maxisorb免疫測試盤上並靜置於4℃隔夜，接著以含有5%脫脂牛乳(skim milk)之PBST進行阻斷修飾(blocking)；接著，含有IgG及5%脫脂牛奶之PBST以兩倍序列稀釋共準備11組不同濃度之樣本；在完成阻斷修飾之後，100uL稀釋之IgG樣本分別加入每一塗佈有TNFα之培養孔，並在溫和震盪下培養1小時。
該些培養孔接著以300uL之PBST清洗6次後，加入100uL 1：5000稀釋之山葵過氧化酵素(horseradish peroxidase)或犬類抗體IgG(H+L)偶聯物(Jackson ImmunoResearch，貨號：304-035-003)，並於含有5%脫脂牛乳之PBST中培養30分鐘；接著，該些培養孔再經過PBST清洗6次，並以PBS清洗2次；以3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tereamethyl-benzidine peroxidase substrate，
TMB，Kirkegaard & Perry Laboratories)共培養3分鐘，再以1.0M HCl終止反應，接著以450奈米之波長讀取其分光光譜；最後，EC50(ng/mL)數值藉由Stewart and Watson method計算而得。
5. 統計分析
統計分析數據及圖表以GraphPad Prism 6.0版(GraphpPad Software)的形式呈現，數據以平均值±標準差的方式呈現，並至少自三個獨立實驗取得平均值；統計顯著意義藉由多重比較t測試計算而得，當P值小於0.05時則判定具有統計顯著意義。
實驗結果
實驗例1
於該實驗例中，ELISA測定用於比較Humivet-3.0系列中不同版本之IgG結合親和性；IgG由117nM稀釋至0.0nM，並於塗佈有TNFα之96孔盤培養60分鐘；請參閱圖6，個別EC50由ELISA測定而得，而由本實驗例測定可知，相較於其他種類之重組IgG，Humivet-3.0呈現了與犬類TNFα最強的結合親和性。
實驗例2
於該實驗例中，in vitro TNFα抗體中和效力測定於HEK-DualTM TNFα細胞中實施，以測定出具有針對犬類TNFα最強中和能力之抗體株；Humivet-3.0系列之抗體株先與不同濃度的TNFα共培養30分鐘後，未受抗體中和之TNFα會與HEK-DualTM TNFα細胞結合並活化信號傳遞路徑，藉以觀察Humivet-3.0系列抗體株對於TNFα的中和效力。
如圖7及圖8所示，以Humira作為陽性對照，並以294.0至0.0pM序列稀釋之犬類TNFα誘導HEK-DualTM TNFα細胞之NF-kB訊息傳遞；在圖7及圖8中，y軸呈現了對應IgG之抑制率而x軸呈現了IgG稀釋濃度之對數值；Humivet-3.0、Humivet-3.1、Humivet-3.2及Humivet-3.3均展現了較Humira更高的抑制能力；在這些抗體株中，相較於其他Humivet系列抗體株以及Humira(IC50=0.21nM)，Humivet-3.0展現了最高的抑制效果(IC50=0.04973nM)；因此，可以更加確定Humivet-3.0是犬隻體內過多TNFα最具中和效力的藥物。
在本發明中，蛋白質結構與計算模型均用於模擬設計之抗體於犬類TNFα上的結合方位，一共10種不同的IgG分別被設計以進行in vitro抗原結合親和性與抗體中和效力測試；在這些被測試的抗體中，Humivet-3.0展現了最高的結合親和性與最強的中和效力，然而這並非犬化抗體(caninized antibody)首度被用於治療犬隻疾病。
同樣作為單株抗體，Lokivetmab由Zoetis所開發並用於犬隻異位性皮膚炎(atopic dermatitis，AD)，其作用於細胞激素介白素-31(interleukin-3，IL-31)，更涉及了搔癢機制的成因；通過皮下注射，每一劑Lokivetmab可維持4到8週的療效；然而，由於Lokivetmab的解離常數K D 低於10nM且IC50達到15.2nM，而本發明所提供的Humivet-3.0抗體之IC50僅0.04973nM，顯示其有效濃度遠低於Lokivetmab；本發明所提供的Humivet-3.0抗體展現了用於骨關節炎治療方面相當巨大的潛力，其擁有較為優異的TNFα中和效力，且與當前市售產品相比，可在較低劑量的條件下達到治療效果，可降低非預期性副作用發生的風險，並進一步提升用藥安全性。
Claims (8)
- 一種重組抗體，其包含：一輕鏈變異區，其包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)輕鏈變異區之胺基酸序列，其中，該輕鏈變異區包括：一第一序列，位於由N端起算第1至12之殘基，其包含一相同於SEQ ID NO：21之胺基酸序列；一第二序列，位於由N端起算第18至54之殘基，其包含一相同於SEQ ID NO：22；一第三序列，位於由N端起算第56至84之殘基，其包含一相同於SEQ ID NO：23之序列；一第四序列，位於由N端起算第86至108之殘基，其包含一相同於SEQ ID NO：24之胺基酸序列；及一第五序列，位於由N端起算第110至217之殘基，其包含一相同於SEQ ID NO：25之胺基酸序列；及一重鏈變異區，其包含一至少50%但未達100%相同於阿達木單株抗體(adalimumab)重鏈變異區之胺基酸序列，其中，該重鏈變異區包括：一第六序列，位於由N端起算第1至15之殘基，其包含一相同於(SEQ ID NO：26之胺基酸序列；一第七序列，位於由N端起算第24至48之殘基，其包含一相同於SEQ ID NO：27之胺基酸序列；一第八序列，位於由N端起算第51至62之殘基，其包含一相同於SEQ ID NO：28之胺基酸序列；一第九序列，位於由N端起算第67至77之殘基，其包含一相同於SEQ ID NO：29之胺基酸序列；一第十序列，位於由N端起算第89至115之殘基，其包含一相同於SEQ ID NO：30之胺基酸序列；及一第十一序列，位於由N端起算第117至452之殘基，其包含一相同於SEQ ID NO：31之胺基酸序列。
- 如請求項1所述之重組抗體，其中，該輕鏈變異區包括一選自由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18所組成群組之輕鏈序列，且該重鏈變異區包括一選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9所組成群組之重鏈序列。
- 如請求項2所述之重組抗體，其中，該輕鏈變異區包括一相同於SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且該重鏈變異區包括一相同於SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
- 如請求項2所述之重組抗體，其中，該輕鏈變異區包括一相同於SEQ ID NO：12之胺基酸序列，且該重鏈變異區包括一相同於SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
- 如請求項2所述之重組抗體，其中，該輕鏈變異區包括一相同於SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且該重鏈變異區包括一相同於SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
- 一種重組抗體用於製備中和腫瘤壞死因子α之組合物的用途，其包括：給予所需個體一有效濃度之重組抗體，其中，該組合物包含如請求項1至5任一項所述之重組抗體。
- 如請求項6所述之方法，其中，該有效濃度介於0.04至1.0nM。
- 如請求項6所述之方法，其中，該有效濃度介於0.5至0.8nM。
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