CN116867803A

CN116867803A - 用于兽用的TNFα和NGF抗体

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Publication number: CN116867803A
Application number: CN202180093961.XA
Authority: CN
Inventors: S·A·皮尔斯; L·普雷斯塔; S·J·李; L·阮; R·真; H·詹
Original assignee: Jindered Biosciences Co ltd
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-10-10

Abstract

提供了与犬源化TNFα抗体和犬源化NGF抗体相关的各种实施方案。此类抗体可以用于治疗患有炎性病症如炎性肠病的犬类的方法中，和/或用于治疗患有疼痛如骨关节炎疼痛、背部疼痛、癌性疼痛和/或神经性疼痛的犬类的方法中。

Description

用于兽用的TNFα和NGF抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年12月18日提交的美国临时申请号63/127,994和2020年12月21日提交的美国临时申请号63/128,804的优先权权益，将每个文献的内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开文本涉及犬源化TNFα抗体和/或犬源化NGF抗体，所述犬源化TNFα抗体和/或犬源化NGF抗体例如用于治疗犬类的炎性病症(如炎性肠病)和/或用于治疗犬类的疼痛。

背景技术

TNF是一种参与全身性炎症的细胞因子，并且刺激急性期反应。TNF促进炎性应答，这继而引起或促成许多与自身免疫性障碍相关的临床问题，如强直性脊柱炎、哮喘、癌症、克罗恩病、炎性肠病(IBD)、幼年型特发性关节炎、包括斑块状银屑病的银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎和其他慢性炎性障碍。

本公开文本提供了用于用TNFα抗体治疗伴生动物的诸如IBD的疾病的方法和组合物，并且因此涉及生物学、分子生物学和兽医学领域。

伴生动物(如猫、狗和马)患有许多与人疾病相似的疾病，包括自身免疫性疾病、癌症和慢性炎性障碍。然而，迄今为止尚未证明阿达木单抗或英夫利昔单抗可以用于治疗伴生动物的此类疾病。此外，具有显著的源自人的氨基酸序列含量的蛋白质(特别是如果那些序列源自抗体)可能在非人动物中具有免疫原性。并且结合人TNF的人药物可能不会以在伴生动物中提供与在人中提供的治疗效果同样有益的治疗效果的方式结合伴生动物TNF，特别是如果伴生动物TNF在序列上与人TNF不同。相似地，如果人药物在伴生动物中引发免疫应答，那么所述免疫应答可能无效。参见Mauldin等人,Aug.2010,21(4):373-382。

IBD是一个统称，其用于描述具有相关炎症组织学证据的狗的胃肠道障碍。参见Ettinger SJ和Feldman EC.Diseases of the Small Intestine.Textbook ofVeterinary Internal Medicine:Diseases of the Dog and the Cat,ElsevierSaunders,2010。虽然犬类IBD的确切病因仍然未知，但免疫系统对饮食抗原和肠道细菌的耐受性的改变被认为与遗传易感性一样起着主要作用。犬类IBD可能与发生在人中的障碍(也称为克罗恩病和溃疡性结肠炎)具有相似的病因，但是与狗和人相关的临床综合征和组织学变化是不同的。参见Ettinger和Feldman；Suchodolski JS等人“The fecalmicrobiome in dogs with acute diarrhea and idiopathic inflammatory boweldisease.”PLoS ONE.2012；7(12):e51907.doi:10.1371/journal.pone.0051907；Suchodolski JS.“Companion-animals symposium:Microbes and gastrointestinalhealth of dogs and cats.”J Anim Sci.2010；89(5):1520-1530。临床上，犬类IBD的特征在于持续性或反复性体征，如呕吐、腹泻、腹痛、体重减轻或食欲改变。

犬类IBD的准确诊断可能具有挑战性，并且当无法鉴定确切的致病因子时，通常使用术语“特发性”。通常建议进行完整的病史和体格检查，然后进行实验室检查、诊断成像和肠活检(以证明存在炎症)。此外，与人IBD相反，患有淋巴细胞性-浆细胞性结肠炎(LPC)(IBD的常见形式)的狗未能在发炎的结肠粘膜中表达主要的细胞因子谱(包括TNFα)。参见Tamura Y等人“Evaluation of Selected Cytokine Gene Expression in ColonicMucosa from Dogs with Idiopathic Lymphocytic-plasmacytic Colitis.”J Vet MedSci.2014；76(10):1407-10。用于管理这些患者的治疗策略包括以缓解临床体征为目标的抗寄生虫药(驱虫药)、抗生素、饮食调整以及免疫抑制药物的施用。参见Ettinger和Feldman。在人中，抑制TNF的抗炎性单克隆抗体被广泛用于治疗这种疾病。在我们的犬类患者中，传统疗法的预后和对传统疗法的反应不同，并且可以从极好到差变化。因此，狗的治疗结局不能基于人治疗来预测。

因此，仍然需要可以用于结合伴生动物中的伴生动物TNF以治疗伴生动物的TNF相关病症的方法和化合物。理想地，所述化合物将与伴生动物TNF特异性地结合，并且在血浆中具有足够长的半衰期以适用于疗法，但在伴生动物中不会具有高免疫原性。本发明满足这种需要。

本公开文本还提供了用于伴生动物的疼痛如慢性疼痛或炎性疼痛的使用NGF抗体的方法和组合物，并且因此涉及生物学、分子生物学和兽医学领域。

神经生长因子(NGF)是一种神经营养因子，其对调节某些神经元的生长、维持、增殖和存活具有广泛作用。NGF还与慢性疼痛和炎性疼痛相关联。NGF与以下两类受体结合：原肌球蛋白(tropomyosine)受体激酶A(TrkA)和低亲和力NGF受体。当NGF(一种二聚体)与TrkA细胞外结构域结合时，NGF引起受体二聚化，从而激活下游激酶活性。NGF抗体可以用于拮抗NGF活性、减少游离NGF和/或减弱与NGF相关疼痛相关的临床体征和症状。

伴生物种动物(如猫、狗和马)可能遭受慢性和炎性疼痛。仍然需要可以用于特异性地结合伴生动物NGF以治疗NGF诱导的病症和降低NGF信号传导活性的方法和物种特异性化合物。

本公开文本还提供了能够结合TNF和NGF二者的双特异性抗体，以及用于使用此类分子进行治疗的方法。例如，本公开文本的双特异性分子可以用于治疗炎症和与炎症相关的疼痛二者，如用于治疗骨关节炎、慢性疼痛、下背部疼痛、癌性疼痛和神经性疼痛。

发明内容

实施方案1.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含可变轻链的犬源化抗体，所述可变轻链包含(i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQID NO:2的氨基酸序列的CDR-L2；(iii)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR L3；和(iv)含有在位置3处的谷氨酰胺和在位置8处的赖氨酸的LC-FR2。

实施方案2.根据实施方案1所述的分离的抗体，其中所述抗体包含可变重链，所述可变重链包含(i)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2；和(iii)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR H3。

实施方案3.根据前述实施方案中任一项所述的分离的抗体，其中所述LC-FR2包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

实施方案4.根据前述实施方案中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列或其变体，在所述变体中所述可变轻链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其变体，在所述变体中所述可变重链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

实施方案5.根据前述实施方案中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

实施方案6.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含：(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

实施方案7.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列，所述可变重链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

实施方案8.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的可变轻链和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变重链。

实施方案9.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:46的氨基酸序列的可变轻链和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变重链。

实施方案10.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含以下的犬源化抗体：

(a)轻链，所述轻链包含(i)含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2；(iii)含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR L3；和(iv)含有SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其变体的可变轻链，在所述变体中所述可变轻链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；

(b)重链，所述重链包含(i)含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-H2；(iii)含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR H3；和(iv)含有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其变体的可变重链，在所述变体中所述可变重链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；或

(c)如在(a)中的轻链和如在(b)中的重链。

实施方案11.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含以下的犬源化抗体：

(a)轻链，所述轻链包含(i)含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2；(iii)含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR L3；和(iv)含有SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其变体的可变轻链，所述变体与SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；

(b)重链，所述重链包含(i)含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-H2；(iii)含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR H3；和(iv)含有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其变体的可变重链，所述变体与SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或

(c)如在(a)中的轻链和如在(b)中的重链。

实施方案12.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含：(i)含有SEQID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列的可变轻链；(ii)含有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的可变重链；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

实施方案13.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含犬类恒定重链区和/或犬类恒定轻链区。

实施方案14.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含选自IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D恒定区的犬类重链恒定区。

实施方案15.根据实施方案1至9、13或14中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：(i)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:44的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)重链，所述重链包含SEQID NO:23或SEQ ID NO:64的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的轻链和如在(ii)中的重链。

实施方案16.根据实施方案1至9或实施方案13至15中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：(i)含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；(ii)含有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链；或(iii)如在(i)中的轻链和如在(ii)中的重链。

实施方案17.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:44的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链。

实施方案18.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链。

实施方案19.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含以下的犬源化抗体：

(a)轻链，所述轻链包含(i)含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2；(iii)含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR L3；和(iv)含有SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60的氨基酸序列或其变体的轻链，所述变体与SEQ IDNO:59或SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；

(b)重链，所述重链包含(i)含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-H2；(iii)含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR H3；和(iv)含有SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的氨基酸序列或其变体的重链，所述变体与SEQ IDNO:61或SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或

(c)如在(a)中的轻链和如在(b)中的重链。

实施方案20.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:59或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链。

实施方案21.一种与犬类NGF结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含以下的犬源化抗体：(i)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-H2；和(iii)含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-H3。

实施方案22.根据实施方案21所述的分离的抗体，其中所述抗体进一步包含(iv)含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR-L1；(v)含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR-L2；和(vi)含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR L3。

实施方案23.根据实施方案21或实施方案22所述的分离的抗体，其中所述抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列、其变体，所述变体与SEQID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

实施方案24.一种与犬类NGF结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含以下的犬源化抗体：(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列、其变体，所述变体与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

实施方案25.根据实施方案21至24中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含(i)SEQ ID NO:73的可变轻链序列或其变体，在所述变体中所述可变轻链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代，(ii)SEQ ID NO:74的可变重链序列或其变体，在所述变体中所述可变重链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代，或(iii)如在(i)中的可变轻链序列和如在(ii)中的可变重链序列。

实施方案26.根据实施方案21至25中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含犬类恒定重链区和/或犬类恒定轻链区。

实施方案27.根据实施方案21至26中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含选自IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D恒定区的犬类重链恒定区。

实施方案28.根据实施方案21至27中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：(i)SEQ ID NO:77的轻链序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)SEQ ID NO:79的重链序列或其变体，所述变体与SEQ IDNO:79的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的轻链序列和如在(ii)中的重链序列。

实施方案29.根据实施方案21至28中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链。

实施方案30.一种与犬类NGF结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:77的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链。

实施方案31.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体是选自Fv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和Fab'-SH的抗体片段。

实施方案32.一种与犬类TNFα和犬类NGF结合的分离的抗体，其中所述抗体包含：

(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸或其变体，所述变体与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；

(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；

(iii)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；

(iv)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或

(v)如在(i)中的可变轻链序列、如在(ii)中的可变重链序列、如在(iii)中的可变轻链序列、以及如在(iv)中的可变重链序列。

实施方案33.根据实施方案32所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：

(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:43的氨基酸或其变体，所述变体与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；

(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；

实施方案34.一种与犬类TNFα和犬类NGF结合的分离的抗体，其中所述抗体包含：(i)含有SEQ ID NO:43的氨基酸的可变轻链；(ii)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变重链；(iii)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的可变轻链；和(iv)含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的可变重链。

实施方案35.根据实施方案33所述的分离的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列和SEQ ID NO:81的氨基酸序列。

实施方案36.一种或多种编码根据实施方案1至35中任一项所述的抗体的分离的核酸。

实施方案37.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案36所述的一种或多种核酸。

实施方案38.一种产生抗体的方法，所述方法包括培养根据实施方案37所述的宿主细胞以及分离所述抗体。

实施方案39.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1至35中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

实施方案40.一种治疗患有与TNFα相关的病症的犬类的方法，所述方法包括向所述犬类施用治疗有效量的根据实施方案1至20和实施方案31至35中任一项所述的抗体或根据实施方案39所述的药物组合物。

实施方案41.一种维持犬类的与TNFα相关的病症的缓解的方法，所述方法包括向所述犬类施用治疗有效量的根据实施方案1至20和实施方案31至35中任一项所述的抗体或根据实施方案37所述的药物组合物。

实施方案42.根据实施方案40或实施方案41所述的方法，其中所述与TNFα相关的病症是炎性疾病。

实施方案43.根据实施方案40至42中任一项所述的方法，其中所述与TNFα相关的病症是胃肠道炎性疾病。

实施方案44.根据实施方案40至43中任一项所述的方法，其中所述与TNFα相关的病症是炎性肠病。

实施方案45.根据实施方案40至44中任一项所述的方法，其中所述与TNFα相关的病症是强直性脊柱炎、哮喘、癌症、克罗恩病、特发性关节炎、银屑病、斑块状银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎或溃疡性结肠炎。

实施方案46.一种治疗患有与NGF相关的病症的犬类的方法，所述方法包括向所述犬类施用治疗有效量的根据实施方案21至35中任一项所述的抗体或根据实施方案39所述的药物组合物。

实施方案47.一种维持犬类的与NGF相关的病症的缓解的方法，所述方法包括向所述犬类施用治疗有效量的根据实施方案21至35中任一项所述的抗体或根据实施方案39所述的药物组合物。

实施方案48.一种治疗犬类的疼痛的方法，所述方法包括向所述犬类施用治疗有效量的根据实施方案21至35中任一项所述的抗体或根据实施方案39所述的药物组合物。

实施方案49.根据实施方案46至48中任一项所述的方法，其中所述与NGF相关的病症或所述疼痛是慢性疼痛、急性疼痛和/或炎性疼痛。

实施方案50.根据实施方案46至49中任一项所述的方法，其中所述与NGF相关的病症或所述疼痛是骨关节炎疼痛、背部疼痛、癌性疼痛和/或神经性疼痛。

实施方案51.根据实施方案46至50中任一项所述的方法，其中所述与NGF相关的病症或所述疼痛是与手术、断骨或骨折、牙科治疗、烧伤、割伤和/或分娩相关的疼痛。

实施方案52.根据实施方案40至51中任一项所述的方法，其中肠胃外施用所述抗体或所述药物组合物。

实施方案53.根据实施方案40至52中任一项所述的方法，其中所述抗体或所述药物组合物是通过肌肉内途径、腹膜内途径、脑脊髓内途径、皮下途径、动脉内途径、滑膜内途径、鞘内途径或吸入途径施用的。

实施方案54.根据实施方案40至53中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用IL17抗体、IL-5抗体、IL-31抗体、IL4抗体、IL13抗体、IL23抗体、IgE抗体、CD11α抗体、IL6R抗体、α4-整合素抗体、IL12抗体、IL1β抗体或抗BlyS抗体。

实施方案55.根据实施方案40至54中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用NGF激酶抑制剂、PI3K抑制剂、ras抑制剂、CGRP抑制剂、TNF抑制剂、IL17抑制剂、EGFR抑制剂和/或磷脂酶C途径抑制剂。

实施方案56.根据实施方案40至55中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用一种或多种疼痛治疗药物，如皮质类固醇、非甾体抗炎药(NSAID)、环氧合酶抑制剂、阿片类物质和/或大麻素。

实施方案57.根据实施方案40至56中任一项所述的方法，其中以每剂0.01mg/kg体重至100mg/kg体重范围内的量施用所述抗体。

实施方案58.根据实施方案40至57中任一项所述的方法，其中以2mg/kg体重的剂量施用所述抗体。

实施方案59.一种降低细胞中TNFα和/或NGF信号传导功能的方法，所述方法包括在允许所述抗体与TNFα和/或NGF结合的条件下向所述细胞暴露根据实施方案1至35中任一项所述的抗体或根据实施方案39所述的药物组合物，从而降低结合通过所述细胞的TNFα和/或NGF信号传导功能。

实施方案60.根据实施方案59所述的方法，其中将所述细胞离体暴露于所述抗体或所述药物组合物。

实施方案61.根据实施方案59所述的方法，其中将所述细胞在体内暴露于所述抗体或所述药物组合物。

实施方案62.根据实施方案59至61中任一项所述的方法，其中所述细胞是犬类细胞、猫类细胞或马类细胞。

实施方案63.一种用于检测来自伴生动物物种的样品中的TNFα和/或NGF的方法，所述方法包括在允许所述抗体与TNFα和/或NGF结合的条件下使所述样品与根据实施方案1至35中任一项所述的抗体或根据实施方案39所述的药物组合物接触，并且在所述样品中检测是否在所述抗体与TNFα和/或NGF之间形成复合物。

实施方案64.根据实施方案63所述的方法，其中所述样品是从犬类、猫类或马类获得的生物样品。

附图说明

图1是D2E7、KBA VL v1、KBA VL v2、KBA VL v3、KBA VL v4、KBA VL v5、KBA VL v6和KBA VL v7的可变轻链序列的比对以及D2E7和KBA的可变重链序列的比对。

序列说明

表1提供了本文中提及的某些序列的列表。

表1

具体实施方式

提供了结合犬类TNFα和/或犬类NGF的抗体。还提供了能够形成结合犬类TNFα和/或犬类NGF的抗体的抗体重链和轻链。另外，提供了包含一个或多个特定互补决定区(CDR)的抗体、重链和轻链。提供了编码针对犬类TNFα和/或犬类NGF的抗体的多核苷酸。还提供了产生或纯化针对犬类TNFα和/或犬类NGF的抗体的方法。提供了使用针对犬类TNFα和/或犬类NGF的抗体的治疗方法。此类方法包括但不限于与犬类中的TNFα和/或NGF相关的病症的方法。提供了检测来自伴生动物物种的样品中的TNFα和/或NGF的方法。

为方便读者，提供了本文所用的术语的以下定义。

如本文所用，如Kd的数字术语是基于科学测量计算的，因此受到适当的测量误差的影响。在一些情况下，数字术语可以包括化整到最接近的有效数字的数值。

如本文所用，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”，除非另外说明。如本文所用，术语“或”意指“和/或”，除非另外说明。在多个从属权利要求的上下文中，当引用其他权利要求时，“或”的使用仅指替代方案中的那些权利要求。

示例性TNFα和/或NGF抗体

提供了针对TNFα和/或NGF的新型抗体，例如与犬类TNFα和/或犬类NGF结合的抗体。本文提供的TNFα和/或NGF抗体包括但不限于单克隆抗体、嵌合抗体和犬源化抗体。在一些实施方案中，TNFα抗体是KIND-509。

本文还提供了单克隆抗体的氨基酸序列。例如，提供了本文所述的用于单克隆抗体的可变重链CDR、可变轻链CDR、可变区重链框架序列和可变区轻链框架序列。例如，提供了单克隆抗体KIND-509的可变轻链和可变重链的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:14和22)。此外，图1中提供了不同犬源化轻链和重链的CDR的氨基酸序列、框架序列、可变轻链序列和可变重链序列。

本文还提供了源自单克隆抗体D2E7的嵌合抗体。在一些实施方案中，提供了犬源化单克隆抗体D2E7的氨基酸序列，如SEQ ID NO:13-46、55-64和80-83。在一些实施方案中，提供了源自单克隆抗体D2E7的嵌合抗体的氨基酸序列，如SEQ ID NO:9-12。

本文还提供了源自单克隆抗体αD11的嵌合抗体。在一些实施方案中，提供了犬源化单克隆抗体αD11的氨基酸序列，如SEQ ID NO:73-83。

本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体(如双特异性T细胞衔接器)和三特异性抗体)和抗体片段(如Fab、F(ab')₂、ScFv、微型抗体、双抗体、三抗体和四抗体)，只要它们展现出所需的抗原结合活性即可。犬类、猫类和马类物种具有不同种类(类别)的被许多哺乳动物共有的抗体。

术语抗体包括但不限于能够与抗原结合的片段，如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、di-scFv、sdAb(单结构域抗体)和F(ab')2(包括化学连接的F(ab')2)。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点；和残留的“Fc”片段，这一名称反映了容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原组合位点并且仍然能够交联抗原。术语抗体还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体和各种物种的抗体，如小鼠、人、食蟹猴、犬类、猫类、马类等。此外，对于本文提供的所有抗体构建体，还考虑了具有来自其他生物的序列的变体。抗体片段还包括单链scFv、串联二-scFv、双链抗体、串联三-sdcFv、微抗体等的取向。抗体片段还包括纳米抗体(sdAb，具有单个单体结构域的抗体，如一对重链可变结构域，没有轻链)。在一些实施方案中，抗体片段可以被称为特定物种(例如，小鼠scFv或犬类scFv)。这表示至少部分非CDR区的序列，而不是构建体的来源。在一些实施方案中，所述抗体包含标记或与第二部分缀合。

术语“标记”和“可检测标记”意指与抗体或其分析物附接以使特异性结合对的成员之间的反应(例如，结合)可检测的部分。特异性结合对的经标记的成员被称为“被可检测地标记”。因此，术语“经标记的结合蛋白”是指掺入了标记的蛋白质，所述标记提供结合蛋白的鉴定。在一些实施方案中，标记是可以产生可通过视觉或仪器手段检测的信号的可检测标记物，例如，掺入放射性标记的氨基酸或将生物素基部分附接到多肽，所述生物素基部分可以通过加标记的抗生物素蛋白(例如，含有可以通过光学方法或比色法检测的荧光标记物或酶活性的链霉亲和素)检测。用于多肽的标记的例子包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho或¹⁵³Sm)；色原、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记物；生物素基团；由第二报吿分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；和如钆螯合物等磁性剂。通常用于免疫测定的标记的代表性例子包括产生光的部分，例如吖啶鎓化合物；和产生荧光的部分，例如荧光素。在这方面，所述部分本身可以未被可检测地标记，但在与又另一种部分反应时可能变得可检测。

术语“单克隆抗体”是指基本上同质的抗体群体中的抗体，即构成群体的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变之外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。而且，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体是针对该抗原上的单一决定簇。因此，单克隆抗体样品可以与抗原上的相同表位结合。修饰语“单克隆”指示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，所述单克隆抗体可以通过Kohler和Milstein,1975,Nature 256:495首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(如美国专利号4,816,567中所述)制备。例如，还可以从使用McCafferty等人,1990,Nature348:552-554中所述的技术产生的噬菌体文库中分离所述单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述单克隆抗体是KIND-509。

“氨基酸序列”意指肽或蛋白质中的氨基酸残基序列。术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖了全长蛋白质及其片段两者。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本公开文本的目的，“多肽”是指包括对天然序列的修饰(如缺失、添加和取代，在本质上通常是保守的)的蛋白质，只要蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。

如本文所用的“TNFα”是指由细胞中TNFα的表达和加工产生的任何天然TNFα。除非另有指示，否则所述术语包括来自任何脊椎动物来源的TNFα，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)和伴生动物(例如狗、猫和马类)。所述术语还包括天然存在的TNFα变体，例如剪接变体或等位基因变体。

如本文所用，“NGF”或“神经生长因子”是指由细胞中NGF的表达和加工产生的任何NGF。除非另外指明，否则所述术语包括来自任何脊椎动物来源的NGF，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如，人和食蟹猴)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)和伴生动物(例如，狗、猫和马类)。所述术语还包括天然存在的NGF变体，例如剪接变体或等位基因变体。

如本文所用，术语“表位”是指抗原结合分子(例如，抗体、抗体片段或含有抗体结合区的支架蛋白)结合到靶分子(例如，如蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质等抗原)上的位点。表位通常包括如氨基酸、多肽或糖侧链等分子的化学活性表面分组，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以由所述靶分子的连续或并置的非连续残基(例如，氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成。由连续残基(例如，氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位可包括但不限于至少3个、至少5个或8-10个残基(例如，氨基酸或核苷酸)。在一些例子中，表位长度为少于20个残基(例如，氨基酸或核苷酸)、少于15个残基或少于12个残基。如果两种抗体展现出对一种抗原的竞争性结合，则它们可以结合所述抗原内的相同表位。在一些实施方案中，表位可以通过与抗原结合分子上的CDR残基的一定最小距离来鉴定。在一些实施方案中，表位可以通过上述距离鉴定，并且进一步限于参与抗体残基与抗原残基之间的键(例如，氢键)的那些残基。表位也可以通过各种扫描来鉴定，例如丙氨酸或精氨酸扫描可以指示抗原结合分子可以与之相互作用的一个或多个残基。除非明确指出，否则作为表位的一组残基不排除其他残基为特定抗体的表位的一部分。相反，这样一组的存在表示表位的最小系列(或物种组)。因此，在一些实施方案中，鉴定为表位的一组残基表示与抗原相关的最小表位，而不是抗原上表位的残基的排他列表。

术语“CDR”意指如通过本领域技术人员的至少一种鉴定方式定义的互补决定区。在一些实施方案中，CDR可以根据以下中的任一种来定义：Chothia编号方案，Kabat编号方案，Kabat和Chothia的组合，AbM定义，contact定义，或者Kabat、Chothia、AbM或contact定义的组合。抗体内的各种CDR可以通过其适当的编号和链类型来表示，包括而不限于CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。本文使用的术语“CDR”还涵盖“高变区”或HVR，包括高变环。

在一些实施方案中，犬源化TNFα抗体包含可变轻链，所述可变轻链包含(a)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；(b)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L2；和/或(c)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，所述犬源化TNFα抗体包含可变轻链，所述可变轻链包含含有在位置3(对应于KABAT位置37)处的谷氨酰胺和在位置8(对应于KABAT位置42)处的赖氨酸的LC-FR2。在一些实施方案中，所述犬源化TNFα抗体包含可变重链，所述可变重链包含(a)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2；和/或(c)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3。

在一些实施方案中，犬源化TNFα抗体包含可变轻链，所述可变轻链包含(a)含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1；(b)含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2；和/或(c)含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，犬源化TNFα抗体包含可变重链，所述可变重链包含(a)含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含有SEQID NO:53的氨基酸序列的CDR-H2；和/或(c)含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-H3。

在一些实施方案中，犬源化NGF抗体包含(i)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-H2；和/或(iii)含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，犬源化NGF抗体包含(i)含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR-L2；和/或(iii)含有SEQID NO:67的氨基酸序列的CDR L3。

如本文所用的术语“可变区”是指包含至少三个CDR的区域。在一些实施方案中，可变区包括三个CDR和至少一个框架区(“FR”)。术语“重链可变区”或“可变重链”可互换地用于指代包含至少三个重链CDR的区域。术语“轻链可变区”或“可变轻链”可互换地用于指代包含至少三个轻链CDR的区域。在一些实施方案中，可变重链或可变轻链包含至少一个框架区。在一些实施方案中，抗体包含选自LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3和LC-FR4的至少一个轻链框架区。在一些实施方案中，抗体包含选自HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3和HC-FR4的至少一个重链框架区。所述框架区可以并置在轻链CDR之间或重链CDR之间。例如，抗体可以包含具有以下结构的可变轻链：(LC-FR1)-(CDR-L1)-(LC-FR2)-(CDR-L2)-(LC-FR3)-(CDR-L3)-(LC-FR4)。抗体还可以包含具有以下结构的可变轻链：(CDR-L1)-(LC-FR2)-(CDR-L2)-(LC-FR3)-(CDR-L3)。抗体还可以包含具有以下结构的可变重链：(HC-FR1)-(CDR-H1)-(HC-FR2)-(CDR-H2)-(HC-FR3)-(CDR-H3)-(HC-FR4)。抗体可包含具有以下结构的可变重链：(CDR-H1)-(HC-FR2)-(CDR-H2)-(HC-FR3)-(CDR-H3)。

在一些实施方案中，TNFα抗体包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:45的LC-FR2序列。

在一些实施方案中，所述TNFα抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ IDNO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列或其变体，在所述变体中所述可变轻链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其变体，在所述变体中所述可变重链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

在一些实施方案中，所述TNFα抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ IDNO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQID NO:22的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

在一些实施方案中，所述TNFα抗体包含：(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

在一些实施方案中，TNFα抗体包含可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列。

在一些实施方案中，TNFα抗体包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变重链。

在一些实施方案中，所述TNFα抗体包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的可变轻链和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变重链。

在一些实施方案中，所述TNFα抗体包含含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的可变轻链和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变重链。

在一些实施方案中，所述TNFα抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ IDNO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其变体，在所述变体中所述可变轻链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:57或SEQ IDNO:58的氨基酸序列或其变体，在所述变体中所述可变重链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

在一些实施方案中，所述TNFα抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ IDNO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

在一些实施方案中，所述TNFα抗体包含：(i)含有SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列的可变轻链；(ii)含有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的可变重链；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

在一些实施方案中，TNFα抗体包含含有SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列的可变轻链。

在一些实施方案中，TNFα抗体包含含有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的可变重链。

在一些实施方案中，犬源化NGF抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ IDNO:73的氨基酸序列、其变体，所述变体与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

在一些实施方案中，犬源化NGF抗体包含(i)SEQ ID NO:73的可变轻链序列或其变体，在所述变体中所述可变轻链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；(ii)SEQID NO:74的可变重链序列或其变体，在所述变体中所述可变重链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；或(iii)如在(i)中的可变轻链序列和如在(ii)中的可变重链序列。

如本文所用的术语“恒定区”是指包含至少三个恒定结构域的区域。

术语“重链恒定区”或“恒定重链”可互换地用于指代包含至少三个重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的区域。非限制性示例性重链恒定区包括γ、δ、α、ε和μ。每个重链恒定区对应于抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，包含α恒定区的抗体是IgA抗体，包含μ恒定区的抗体是IgM抗体，包含ε恒定区的抗体是IgE抗体。某些同种型可以进一步细分为子类。例如，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ₁恒定区)、IgG2(包含γ₂恒定区)、IgG3(包含γ₃恒定区)和IgG4(包含γ₄恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α₁恒定区)和IgA2(包含α₂恒定区)抗体；并且IgM抗体包括但不限于IgM1和IgM2。

术语“轻链恒定区”或“恒定轻链”可互换地用于指代包含轻链恒定结构域CL的区域。非限制性示例性轻链恒定区包括λ和κ。除非另外表示，否则结构域内的非功能改变性缺失和改变涵盖在术语“恒定区”的范围内。犬类、猫类和马类具有诸如IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的抗体类别。在犬类IgG抗体类别内有IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D。

术语“嵌合抗体”或“嵌合”是指这样的抗体，其中重链或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链或轻链的其余部分的至少一部分源自不同的来源或物种。在一些实施方案中，嵌合抗体是指包含来自第一物种(如小鼠、大鼠、食蟹猴等)的至少一个可变区和来自第二物种(如人、狗、猫、马类等)的至少一个恒定区的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个犬类恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的所有可变区均来自第一物种，并且所述嵌合抗体的所有恒定区均来自第二物种。在一些实施方案中，嵌合抗体包含来自伴生动物的恒定重链区或恒定轻链区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含小鼠可变重链和可变轻链以及伴生动物恒定重链和恒定轻链。例如，嵌合抗体可以包含小鼠可变重链和可变轻链以及犬类恒定重链和恒定轻链。

在一些实施方案中，TNFα抗体包含嵌合抗体，所述嵌合抗体包含：(a)(i)SEQ IDNO:10的轻链氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列；或(iii)如在(i)中的轻链氨基酸序列和如在(ii)中的重链序列；或(b)(i)SEQ ID NO:40的轻链氨基酸序列；(ii)SEQID NO:12的重链氨基酸序列；或(iii)如在(i)中的轻链氨基酸序列和如在(ii)中的重链序列。

“犬类嵌合”、“嵌合犬类”或“犬类嵌合抗体”是指具有源自狗的至少一部分重链或一部分轻链的嵌合抗体。在一些实施方案中，犬类嵌合抗体包含小鼠可变重链和可变轻链以及犬类恒定重链和恒定轻链。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体，其包含鼠类可变重链框架区或鼠类可变轻链框架区。

在一些实施方案中，TNFα和/或NGF抗体包含选自IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D恒定区的犬类重链恒定区。

“犬源化抗体”意指这样的抗体，其中非犬类可变区的一部分中的至少一个氨基酸已经被来自犬类可变区的相应氨基酸替代。在一些实施方案中，犬源化抗体包含至少一个犬类恒定区(例如，γ恒定区、α恒定区、δ恒定区、ε恒定区、μ恒定区等)或其片段。在一些实施方案中，犬源化抗体是如Fab、scFv、(Fab')₂等抗体片段。术语“犬源化”还表示作为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其含有非犬类免疫球蛋白的最小序列的片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其他抗原结合序列)的非犬类(例如鼠类)抗体的形式。犬源化抗体可以包括这样的犬类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的CDR的残基被来自具有所需的特异性、亲和力和能力的如小鼠、大鼠或兔等非犬类物种(供体抗体)的CDR的残基取代。在一些情况下，犬类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非犬类残基替代。此外，所述犬源化抗体可以包含这样的残基，它们既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中被发现，但是被包括在内以进一步改善和优化抗体性能。

在一些实施方案中，小鼠可变重链或小鼠可变轻链的一部分中的至少一个氨基酸残基已被来自犬类可变区的相应氨基酸替代。在一些实施方案中，经修饰的链与犬类恒定重链或犬类恒定轻链融合。

在一些实施方案中，TNFα抗体是犬源化抗体，所述犬源化抗体包含：(i)SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38或SEQID NO:44的轻链序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:64的重链序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的轻链序列和如在(ii)中的重链序列。

在一些实施方案中，TNFα抗体是犬源化抗体，所述犬源化抗体包含(i)SEQ ID NO:44的轻链序列，(ii)SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:64的重链序列，或(iii)如在(i)中的轻链序列和如在(ii)中的重链序列。

在一些实施方案中，TNFα抗体是犬源化抗体，所述犬源化抗体包含(i)SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60的轻链序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的重链序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的轻链序列和如在(ii)中的重链序列。

在一些实施方案中，TNFα抗体是犬源化抗体，所述犬源化抗体包含：(i)SEQ IDNO:59或SEQ ID NO:60的轻链序列；(ii)SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的重链序列；或(iii)如在(i)中的轻链序列和如在(ii)中的重链序列。

在一些实施方案中，所述犬源化NGF抗体包含：(i)SEQ ID NO:77的轻链序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)SEQID NO:79的重链序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的轻链序列和如在(ii)中的重链序列。

在一些实施方案中，所述犬源化NGF抗体包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链。

在一些实施方案中，所述抗体与犬类TNFα和犬类NGF结合并且包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸或其变体，所述变体与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:22、SEQID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(iii)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(iv)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(v)如在(i)中的可变轻链序列、如在(ii)中的可变重链序列、如在(iii)中的可变轻链序列、以及如在(iv)中的可变重链序列。

在一些实施方案中，所述抗体与犬类TNFα和犬类NGF结合并且包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:43的氨基酸或其变体，所述变体与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(iii)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(iv)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(v)如在(i)中的可变轻链序列、如在(ii)中的可变重链序列、如在(iii)中的可变轻链序列、以及如在(iv)中的可变重链序列。

在一些实施方案中，所述抗体与犬类TNFα和犬类NGF结合并且包含(i)含有SEQ IDNO:43的氨基酸的可变轻链；(ii)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变重链；(iii)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的可变轻链；和(iv)含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的可变重链。

在一些实施方案中，所述抗体与犬类TNFα和犬类NGF结合并且包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列和SEQ ID NO:81的氨基酸序列。

“可结晶片段多肽”或“Fc多肽”是抗体分子中与效应分子和细胞相互作用的部分。其包含免疫球蛋白重链的C末端部分。如本文所用，Fc多肽包括具有完整Fc多肽的一种或多种生物活性的Fc结构域的片段。Fc多肽的“效应子功能”是任何抗体响应于刺激而全部或部分执行的作用或活性，并且可以包括补体结合和/或ADCC(抗体依赖性细胞毒性)诱导和/或ADCP(抗体依赖性细胞吞噬)。

在一些实施方案中，Fc多肽的生物活性是结合FcRn的能力。在一些实施方案中，Fc多肽的生物活性是结合C1q的能力。在一些实施方案中，Fc多肽的生物活性是结合CD16的能力。在一些实施方案中，Fc多肽的生物活性是结合蛋白A的能力。

术语“IgX Fc”意指Fc区源自特定抗体同种型(例如，IgG、IgA、IgD、IgE、IgM等)，其中“X”表示抗体同种型。因此，“IgG Fc”表示γ链的Fc区，“IgA Fc”表示α链的Fc区，“IgDFc”表示δ链的Fc区，“IgE Fc”表示ε链的Fc区，“IgM Fc”表示μ链的Fc区等。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含CH1、铰链、CH2、CH3和CL1。“IgX-N-Fc”表示Fc区源自抗体同种型的特定子类(如犬类IgG子类A、B、C或D；或猫类IgG子类1、2a或2b)，其中“N”表示子类。在一些实施方案中，IgX Fc或IgX-N-Fc区源自伴生动物，如狗。在一些实施方案中，IgG Fc区分离自犬类γ重链(如IgG-A、IgG-B、IgG-C或IgG-D)。包含IgG-A、IgG-B、IgG-C或IgG-D的Fc区的抗体可以在重组生产系统中提供更高的表达水平。

除非另外说明，否则术语“IgX Fc”和“IgX Fc多肽”包括野生型IgX Fc多肽和变体IgX Fc多肽。

在一些实施方案中，变体IgG Fc多肽包含伴生动物物种的变体IgG Fc多肽。在一些实施方案中，变体IgG Fc多肽包含变体犬类IgG Fc多肽。在一些实施方案中，变体IgG Fc多肽(例如，变体犬类IgG-A Fc多肽、变体犬类IgG-C Fc多肽或变体犬类IgG-D Fc多肽、变体猫类IgG1a Fc多肽)具有参考(例如，野生型)多肽基本上缺乏的活性。

可以修饰抗体以延长或缩短其半衰期。在涉及较高剂量抗体的一些实施方案中，对于急性治疗可能需要较短的半衰期。在涉及较低剂量抗体的一些实施方案中，对于延长治疗可能需要较长的半衰期。例如，如下所讨论，可以在IgG Fc中引入影响FcRn相互作用的突变。

在一些实施方案中，TNFα和/或NGF抗体包含具有补体结合活性(或补体依赖性细胞毒性(CDC))的野生型或变体IgG Fc。在一些实施方案中，TNFα和/或NGF抗体包含具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性的野生型或变体IgG Fc。在一些实施方案中，TNFα和/或NGF抗体包含具有抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)活性的野生型或变体IgG Fc。在一些实施方案中，TNFα和/或NGF抗体包含具有补体结合活性和/或ADCC活性和/或ADCP活性的野生型或变体IgG Fc。可以修饰IgG Fc多肽以具有效应子功能或具有增强的效应子功能。

在一些实施方案中，TNFα和/或NGF抗体包含在低pH下与犬类FcRn结合的野生型或变体IgG Fc。

在一些实施方案中，变体IgG Fc(例如，变体犬类IgG Fc多肽)与参考多肽相比具有经修饰的FcRn结合亲和力。在一些实施方案中，变体IgG Fc与参考多肽相比在酸性pH(例如，在约5.0至约6.5范围内的pH，如在约5.0的pH、约5.5的pH、约6.0的pH或约6.5的pH)下具有增加的FcRn结合亲和力。具有增加的FcRn结合亲和力的示例性变体IgG Fc多肽公开于WO2020/082048中，将其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，变体IgG Fc(例如，变体犬类IgG Fc多肽)与参考多肽相比具有经修饰的蛋白A结合亲和力。在一些实施方案中，变体IgG Fc与参考多肽相比具有增加的蛋白A结合亲和力。具有增加的蛋白A结合亲和力的示例性变体IgG Fc多肽公开于WO 2020/139984(例如，实施例2)中，将其通过引用整体并入本文。

术语“亲和力”意指在分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(K_D)表示。亲和力可以通过本领域中已知的常用方法来测量，所述常用方法例如免疫印迹、ELISA KD、KinEx A、生物膜层干涉法(BLI)或表面等离子体共振装置。

术语“K_D”、“K_d”、“Kd”或“Kd值”可互换使用，指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。在一些实施方案中，根据供应商说明书，使用如系统(Pall ForteBio LLC,Fremont,CA)等的生物传感器，通过使用生物层干涉测定来测量抗体的K_d。

例如，将生物素化的抗原与传感器尖端结合，并且监测抗体缔合90秒，并且监测解离600秒。用于稀释和结合步骤的缓冲液是20mM磷酸盐、150mM NaCl，pH 7.2。减去仅缓冲液的空白曲线以校正任何漂移。使用ForteBio数据分析软件将数据拟合至2:1结合模型以确定缔合速率常数(k_on)、解离速率常数(k_off)和K_d。平衡解离常数(K_d)计算为k_off/k_on的比率。术语“kon”是指抗体与抗原缔合的速率常数，并且术语“koff”是指抗体与抗体/抗原复合物解离的速率常数。

术语与抗原或表位“结合”是本领域熟知的术语，并且确定这种结合的方法也是本领域熟知的。如果分子与特定细胞或物质反应，与特定细胞或物质缔合或者具有对特定细胞或物质的亲和力，并且所述反应、缔合或亲和力可通过本领域中已知的一种或多种方法(如免疫印迹、ELISA KD、KinEx A、生物膜层干涉法(BLI)、表面等离子体共振装置等)来检测，则称所述分子展现“结合”。

“表面等离子体共振”表示光学现象，其允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用，例如使用BIAcore^TM系统(BIAcoreInternational AB,a GE Healthcare公司,乌普萨拉,瑞典以及皮斯卡塔韦,新泽西州)。有关进一步说明，请参见Jonsson等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26。

“生物膜层干涉法”是指光学分析技术，其分析在生物传感器尖端和内部参考层上从固定化蛋白质层反射的光的干涉图案。与生物传感器尖端结合的分子数量的变化引起可以实时测量的干涉图案的偏移。用于生物膜层干涉法的非限制性示例性装置是系统(Pall ForteBio LLC)。参见例如Abdiche等人,2008,Anal.Biochem.377:209-277。

在一些实施方案中，TNFα抗体以如通过生物膜层干涉法测量的小于5x 10^-6M、小于1x 10^-6M、小于5x 10^-7M、小于1x 10^-7M、小于5x 10^-8M、小于1x 10^-8M、小于5x 10^-9M、小于1x10^-9M、小于5x 10^-10M、小于1x 10^-10M、小于5x 10^-11M、小于1x 10^-11M、小于5x 10^-12M、或小于1x 10^-12M的解离常数(Kd)与犬类TNFα、人TNFα、猫类TNFα或马类TNFα结合。

在一些实施方案中，TNFα抗体以如通过生物膜层干涉法测量的以下Kd与犬类TNFα、人TNFα、猫类TNFα或马类TNFα结合：5x 10^-6M与1x 10^-6M之间、5x 10^-6M与5x 10^-7M之间、5x10^-6M与1x 10^-7M之间、5x 10^-6M与5x 10^-8M之间、5x 10^-6M与1x 10^-8M之间、5x 10^-6M与5x 10^-9M之间、5x 10^-6M与1x 10^-9M之间、5x 10^-6M与5x 10^-10M之间、5x 10^-6M与1x 10^-10M之间、5x10^-6M与5x 10^-11M之间、5x 10^-6M与1x 10^-11M之间、5x 10^-6M与5x 10^-12M之间、5x 10^-6M与1x10^-12M之间、1x 10^-6M与5x 10^-7M之间、1x 10^-6M与1x 10^-7M之间、1x 10^-6M与5x 10^-8M之间、1x10^-6M与1x 10^-8M之间、1x 10^-6M与5x 10^-9M之间、1x 10^-6M与1x 10^-9M之间、1x 10^-6M与5x 10^-10M之间、1x 10^-6M与1x 10^-10M之间、1x 10^-6M与5x 10^-11M之间、1x 10^-6M与1x 10^-11M之间、1x10^-6M与5x 10^-12M之间、1x 10^-6M与1x 10^-12M之间、5x 10^-7M与1x 10^-7M之间、5x10^-7M与5x 10^-8M之间、5x 10^-7M与1x 10^-8M之间、5x 10^-7M与5x 10^-9M之间、5x 10^-7M与1x 10^-9M之间、5x10^-7M与5x 10^-10M之间、5x 10^-7M与1x 10^-10M之间、5x 10^-7M与5x 10^-11M之间、5x 10^-7M与1x10^-11M之间、5x 10^-7M与5x 10^-12M之间、5x 10^-7M与1x 10^-12M之间、1x 10^-7M与5x 10^-8M之间、1x 10^-7M与1x 10^-8M之间、1x 10^-7M与5x 10^-9M之间、1x 10^-7M与1x 10^-9M之间、1x 10^-7M与5x10^-10M之间、1x 10^-7M与1x10^-10M之间、1x 10^-7M与5x 10^-11M之间、1x 10^-7M与1x 10^-11M之间、1x 10^-7M与5x10^-12M之间、1x 10^-7M与1x 10^-12M之间、5x 10^-8M与1x 10^-8M之间、5x 10^-8M与5x10^-9M之间、5x 10^-8M与1x 10^-9M之间、5x 10^-8M与5x 10^-10M之间、5x 10^-8M与1x 10^-10M之间、5x 10^-8M与5x 10^-11M之间、5x 10^-8M与1x 10^-11M之间、5x 10^-8M与5x 10^-12M之间、5x 10^-8M与1x 10^-12M之间、1x 10^-8M与5x 10^-9M之间、1x 10^-8M与1x 10^-9M之间、1x 10^-8M与5x 10^-10M之间、1x 10^-8M与1x 10^-10M之间、1x 10^-8M与5x 10^-11M之间、1x 10^-8M与1x 10^-11M之间、1x 10^-8M与5x 10^-12M之间、1x 10^-8M与1x 10^-12M之间、5x 10^-9M与1x 10^-9M之间、5x 10^-9M与5x 10^-10M之间、5x 10^-9M与1x 10^-10M之间、5x 10^-9M与5x 10^-11M之间、5x 10^-9M与1x 10^-11M之间、5x10^-9M与5x 10^-12M之间、5x 10^-9M与1x 10^-12M之间、1x 10^-9M与5x 10^-10M之间、1x 10^-9M与1x10^-10M之间、1x 10^-9M与5x 10^-11M之间、1x 10^-9M与1x 10^-11M之间、1x 10^-9M与5x 10^-12M之间、1x 10^-9M与1x 10^-12M之间、5x 10^-10M与1x 10^-10M之间、5x 10^-10M与5x 10^-11M之间、1x 10^-10M与5x 10^-11M之间、1x 10^-10M与1x 10^-11M之间、1x 10^-10M与5x 10^-12M之间、1x 10^-10M与1x 10^-12M之间、5x 10^-11M与1x 10^-12M之间、5x 10^-11M与5x 10^-12M之间、5x 10^-11M与1x 10^-12M之间、1x 10^-11M与5x 10^-12M之间或1x 10^-11M与1x 10^-12M之间。

在一些实施方案中，如通过免疫印迹分析所测定的，TNFα抗体与犬类TNFα、人TNFα、猫类TNFα或马类TNFα结合。

在一些实施方案中，NGF抗体以如通过生物膜层干涉法测量的小于5x 10^-6M、小于1x 10^-6M、小于5x 10^-7M、小于1x 10^-7M、小于5x 10^-8M、小于1x 10^-8M、小于5x 10^-9M、小于1x10^-9M、小于5x 10^-10M、小于1x 10^-10M、小于5x 10^-11M、小于1x 10^-11M、小于5x 10^-12M、或小于1x 10^-12M的解离常数(Kd)与犬类NGF、人NGF、猫类NGF或马类NGF结合。

在一些实施方案中，NGF抗体以如通过生物膜层干涉法测量的以下Kd与犬类NGF、人NGF、猫类NGF或马类NGF结合：5x 10^-6M与1x 10^-6M之间、5x 10^-6M与5x 10^-7M之间、5x 10^- ⁶M与1x 10^-7M之间、5x 10^-6M与5x 10^-8M之间、5x 10^-6M与1x 10^-8M之间、5x 10^-6M与5x 10^-9M之间、5x 10^-6M与1x 10^-9M之间、5x 10^-6M与5x 10^-10M之间、5x 10^-6M与1x 10^-10M之间、5x 10^-6M与5x 10^-11M之间、5x 10^-6M与1x 10^-11M之间、5x 10^-6M与5x 10^-12M之间、5x 10^-6M与1x 10^-12M之间、1x 10^-6M与5x 10^-7M之间、1x 10^-6M与1x 10^-7M之间、1x 10^-6M与5x 10^-8M之间、1x10^-6M与1x 10^-8M之间、1x 10^-6M与5x 10^-9M之间、1x 10^-6M与1x 10^-9M之间、1x 10^-6M与5x 10^-10M之间、1x10^-6M与1x 10^-10M之间、1x 10^-6M与5x 10^-11M之间、1x 10^-6M与1x 10^-11M之间、1x10^-6M与5x 10^-12M之间、1x 10^-6M与1x 10^-12M之间、5x 10^-7M与1x 10^-7M之间、5x 10^-7M与5x10^-8M之间、5x 10^-7M与1x 10^-8M之间、5x 10^-7M与5x 10^-9M之间、5x 10^-7M与1x 10^-9M之间、5x10^-7M与5x 10^-10M之间、5x 10^-7M与1x 10^-10M之间、5x 10^-7M与5x10^-11M之间、5x 10^-7M与1x10^-11M之间、5x 10^-7M与5x 10^-12M之间、5x 10^-7M与1x10^-12M之间、1x 10^-7M与5x 10^-8M之间、1x10^-7M与1x 10^-8M之间、1x 10^-7M与5x 10^-9M之间、1x 10^-7M与1x 10^-9M之间、1x 10^-7M与5x 10^-10M之间、1x 10^-7M与1x 10^-10M之间、1x 10^-7M与5x 10^-11M之间、1x 10^-7M与1x 10^-11M之间、1x10^-7M与5x 10^-12M之间、1x10^-7M与1x10^-12M之间、5x10^-8M与1x10^-8M之间、5x10^-8M与5x10^-9M之间、5x10^-8M与1x10^-9M之间、5x10^-8M与5x10^-10M之间、5x10^-8M与1x10^-10M之间、5x10^-8M与5x10^-11M之间、5x10^-8M与1x10^-11M之间、5x10^-8M与5x10^-12M之间、5x10^-8M与1x10^-12M之间、1x10^-8M与5x10^-9M之间、1x10^-8M与1x10^-9M之间、1x10^-8M与5x10^-10M之间、1x10^-8M与1x10^-10M之间、1x10^- ⁸M与5x10^-11M之间、1x10^-8M与1x10^-11M之间、1x10^-8M与5x10^-12M之间、1x10^-8M与1x10^-12M之间、5x10^-9M与1x10^-9M之间、5x10^-9M与5x10^-10M之间、5x10^-9M与1x10^-10M之间、5x10^-9M与5x10^-11M之间、5x10^-9M与1x10^-11M之间、5x10^-9M与5x10^-12M之间、5x10^-9M与1x10^-12M之间、1x10^-9M与5x10^-10M之间、1x10^-9M与1x10^-10M之间、1x10^-9M与5x10^-11M之间、1x10^-9M与1x10^-11M之间、1x10^-9M与5x10^-12M之间、1x10^-9M与1x10^-12M之间、5x10^-10M与1x10^-10M之间、5x10^-10M与5x10^- ¹¹M之间、1x10^-10M与5x10^-11M之间、1x10^-10M与1x10^-11M之间、1x10^-10M与5x10^-12M之间、1x10^-10M与1x10^-12M之间、5x10^-11M与1x10^-12M之间、5x10^-11M与5x10^-12M之间、5x10^-11M与1x10^-12M之间、1x10^-11M与5x10^-12M或1x10^-11M与1x10^-12M。

在一些实施方案中，如通过免疫印迹分析所测定的，NGF抗体与犬类NGF、人NGF、猫类NGF或马类NGF结合。

“野生型”是指天然存在的多肽或其片段的未突变形式。可以重组产生野生型多肽。

“变体”意指在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，与天然序列多肽具有至少约50％的氨基酸序列同一性的生物活性多肽。此类变体包括，例如，其中在多肽的N末端或C末端添加、缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。

在一些实施方案中，变体具有至少1、2、3、4、5或6个被不同氨基酸取代的氨基酸。

在一些实施方案中，在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，变体与参考核酸分子或多肽具有至少约50％序列同一性。此类变体包括，例如，其中在多肽的N末端或C末端添加、缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变体与参考核酸或多肽的序列具有至少约50％序列同一性、至少约60％序列同一性、至少约65％序列同一性、至少约70％序列同一性、至少约75％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％序列同一性、至少约97％序列同一性、至少约98％序列同一性或至少约99％序列同一性。

如本文所用，关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在用以实现最大百分比序列同一性并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分而比对序列和引入缺口(如果需要)后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALINE^TM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。

“氨基酸取代”是指用另一种氨基酸替代多肽中的一种氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是保守取代。非限制性示例性保守氨基酸取代示于表2中。可以将氨基酸取代引入目的分子中，并且筛选产物的所需活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC或增强的药代动力学。

表2

可根据常见的侧链特性将氨基酸分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。

术语“载体”用于描述可以被工程化为含有一种或多种克隆的多核苷酸的可以在宿主细胞中繁殖的多核苷酸。载体可以包括一种或多种以下元件：复制起点、调节目的多肽表达的一种或多种调节序列(例如，启动子或增强子)、或一种或多种选择性标记基因(例如，抗生素抗性基因和可以用于比色测定的基因，例如β-半乳糖苷酶)。术语“表达载体”是指用于在宿主细胞中表达目的多肽的载体。

“宿主细胞”是指可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的受体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于NS0细胞、细胞(Crucell)、293细胞和CHO细胞，及其衍生物，如293-6E、DG44、CHO-S和CHO-K细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或故意的突变，所述后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态方面或基因组DNA互补序列方面)。宿主细胞包括在体内用编码本文提供的一个或多个氨基酸序列的一个或多个多核苷酸转染的细胞。

如本文所用，术语“分离的”是指已经与通常在自然界中发现或产生的至少一些组分分离的分子。例如，当多肽与产生它的细胞的至少一些组分分离时，称其为“分离的”。当多肽在表达后由细胞分泌时，将含有所述多肽的上清液与产生它的细胞物理分离，认为是“分离”所述多肽。类似地，当多核苷酸不是通常在自然界中发现的较大的多核苷酸(如在DNA多核苷酸的情况下的基因组DNA或线粒体DNA)的一部分时，或例如在RNA多核苷酸的情况下与产生它的细胞的至少一些组分分离时，称多核苷酸为“分离的”。因此，包含在宿主细胞内的载体中的DNA多核苷酸可称为“分离的”。在一些实施方案中，使用色谱法(如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、蛋白A柱色谱法、疏水相互作用色谱法和CHT色谱法)纯化TNFα和/或NGF抗体。

术语“伴生动物物种”是指适合作为人同伴的动物。在一些实施方案中，伴生动物物种是如犬类、猫类、狗、猫、马、兔、雪貂、豚鼠、啮齿动物等小型哺乳动物。在一些实施方案中，伴生动物物种是如马、牛、猪等农场动物。

“降低”或“抑制”意指与参考相比使活性、功能或量减少、降低或停滞。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指引起总体减少20％或更多的能力。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指引起总体减少50％或更多的能力。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指引起总体减少75％、85％、90％、95％或更多的能力。在一些实施方案中，在相同的时间段内，相对于对照剂量(如安慰剂)，上述量在一段时间内被抑制或减少。如本文所用，“参考”是指用于比较目的的任何样品、标准或水平。可以从健康或非患病样品中获得参考。在一些例子中，从伴生动物的未患病或未处理样品中获得参考。在一些例子中，从特定物种的一种或多种健康动物而不是被测试或治疗的动物获得参考。

如本文所用，术语“显著降低”表示在数值与参考数值之间的足够高的降低程度，使得本领域技术人员将认为在由所述值测量的生物学特征的背景下这两个值之间的差异具有统计学显著性。在一些实施方案中，与参考值相比，显著降低的数值降低大于约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任何一个。

在一些实施方案中，与不存在TNFα抗体时的TNFα信号传导功能相比，所述抗体可以将伴生动物物种中的TNFα信号传导功能降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些实施方案中，TNFα信号传导功能的降低在10％与15％之间、10％与20％之间、10％与25％之间、10％与30％之间、10％与35％之间、10％与40％之间、10％与45％之间、10％与50％之间、10％与60％之间、10％与70％之间、10％与80％之间、10％与90％之间、10％与100％之间、15％与20％之间、15％与25％之间、15％与30％之间、15％与35％之间、15％与40％之间、15％与45％之间、15％与50％之间、15％与60％之间、15％与70％之间、15％与80％之间、15％与90％之间、15％与100％之间、20％与25％之间、20％与30％之间、20％与35％之间、20％与40％之间、20％与45％之间、20％与50％之间、20％与60％之间、20％与70％之间、20％与80％之间、20％与90％之间、20％与100％之间、25％与30％之间、25％与35％之间、25％与40％之间、25％与45％之间、25％与50％之间、25％与60％之间、25％与70％之间、25％与80％之间、25％与90％之间、25％与100％之间、30％与35％之间、30％与40％之间、30％与45％之间、30％与50％之间、30％与60％之间、30％与70％之间、30％与80％之间、30％与90％之间、30％与100％之间、35％与40％之间、35％与45％之间、35％与50％之间、35％与60％之间、35％与70％之间、35％与80％之间、35％与90％之间、35％与100％之间、40％与45％之间、40％与50％之间、40％与60％之间、40％与70％之间、40％与80％之间、40％与90％之间、40％与100％之间、45％与50％之间、45％与60％之间、45％与70％之间、45％与80％之间、45％与90％之间、45％与100％之间、50％与60％之间、50％与70％之间、50％与80％之间、50％与90％之间、50％与100％之间、60％与70％之间、60％与80％之间、60％与90％之间、60％与100％之间、70％与80％之间、70％与90％之间、70％与100％之间、80％与90％之间、80％与100％之间或90％与100％之间。

在一些实施方案中，与不存在NGF抗体时的NGF信号传导功能相比，所述抗体可以将伴生动物物种中的NGF信号传导功能降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些实施方案中，NGF信号传导功能的降低在10％与15％之间、10％与20％之间、10％与25％之间、10％与30％之间、10％与35％之间、10％与40％之间、10％与45％之间、10％与50％之间、10％与60％之间、10％与70％之间、10％与80％之间、10％与90％之间、10％与100％之间、15％与20％之间、15％与25％之间、15％与30％之间、15％与35％之间、15％与40％之间、15％与45％之间、15％与50％之间、15％与60％之间、15％与70％之间、15％与80％之间、15％与90％之间、15％与100％之间、20％与25％之间、20％与30％之间、20％与35％之间、20％与40％之间、20％与45％之间、20％与50％之间、20％与60％之间、20％与70％之间、20％与80％之间、20％与90％之间、20％与100％之间、25％与30％之间、25％与35％之间、25％与40％之间、25％与45％之间、25％与50％之间、25％与60％之间、25％与70％之间、25％与80％之间、25％与90％之间、25％与100％之间、30％与35％之间、30％与40％之间、30％与45％之间、30％与50％之间、30％与60％之间、30％与70％之间、30％与80％之间、30％与90％之间、30％与100％之间、35％与40％之间、35％与45％之间、35％与50％之间、35％与60％之间、35％与70％之间、35％与80％之间、35％与90％之间、35％与100％之间、40％与45％之间、40％与50％之间、40％与60％之间、40％与70％之间、40％与80％之间、40％与90％之间、40％与100％之间、45％与50％之间、45％与60％之间、45％与70％之间、45％与80％之间、45％与90％之间、45％与100％之间、50％与60％之间、50％与70％之间、50％与80％之间、50％与90％之间、50％与100％之间、60％与70％之间、60％与80％之间、60％与90％之间、60％与100％之间、70％与80％之间、70％与90％之间、70％与100％之间、80％与90％之间、80％与100％之间或90％与100％之间。

示例性药物组合物

术语“药物配制品”和“药物组合物”是指呈使得一种或多种活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对所述配制品所施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。

“药学上可接受的载体”是指本领域常规的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、配制辅助剂或载体，其与共同构成用于施用于受试者的“药物组合物”的治疗剂一起使用。药学上可接受的载体在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与配制品的其他成分相容。药学上可接受的载体适用于所用配制品。药学上可接受的载体的例子包括氧化铝；硬脂酸铝；卵磷脂；诸如人血清白蛋白、犬或其他动物白蛋白等的血清蛋白；诸如磷酸盐、柠檬酸盐、氨丁三醇或HEPES缓冲液等的缓冲液；甘氨酸；山梨酸；山梨酸钾；饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物；水；盐或诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅或三硅酸镁等的电解质；聚乙烯吡咯烷酮，纤维素基物质；聚乙二醇；蔗糖；甘露糖醇；或包括但不限于精氨酸的氨基酸。

所述药物组合物可以以冻干形式储存。因此，在一些实施方案中，所述制备方法包括冻干步骤。然后可以在施用至狗之前，将冻干的组合物重新配制，通常作为适于肠胃外施用的水性组合物。在其他实施方案中，特别是当所述抗体对热变性和氧化变性而言高度稳定时，所述药物组合物可以作为液体储存，即作为水性组合物储存，其可以直接或在适当稀释的情况下施用至狗。可以用无菌注射用水(WFI)重建冻干的组合物。可以包括抑菌试剂，如苯甲醇。因此，本发明提供了固体或液体形式的药物组合物。

当施用时，所述药物组合物的pH可以在约pH 5至约pH 8的范围内。如果本发明的组合物用于治疗目的，则它们是无菌的。无菌可以通过本领域已知的几种方法中的任何一种来实现，包括通过无菌过滤膜(例如0.2微米膜)过滤。可以使用或不使用抗细菌剂来维持无菌。

抗体和药物组合物的示例性用途

所述抗体或包含本发明的抗体的药物组合物可用于治疗与TNFα和/或NGF相关的病症。

如本文所用，“与TNFα相关的病症”意指与TNFα浓度升高的水平或改变的梯度相关或由其引起或以其为特征的疾病。此类病症包括但不限于自身免疫性障碍，如强直性脊柱炎、哮喘、癌症、克罗恩病、炎性肠病(IBD)、幼年型特发性关节炎、包括斑块状银屑病的银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎和其他慢性炎性障碍。

如本文所用，“与NGF相关的病症”意指与NGF浓度升高的水平或改变的梯度相关或由其引起或以其为特征的疾病。此类病症包括但不限于疼痛，如慢性疼痛、急性疼痛和/或炎性疼痛。在一些实施方案中，所述疼痛是骨关节炎疼痛、背部疼痛、癌性疼痛和/或神经性疼痛。在一些实施方案中，所述疼痛与手术、断骨或骨折、牙科治疗、烧伤、割伤和/或分娩相关。

与TNFα和/或NGF相关的病症可以出现在伴生动物(包括但不限于犬类)中。

如本文所用，“治疗”是用于获得有益或所需临床结果的途径。如本文所用，“治疗”包括哺乳动物(包括伴生动物)中疾病治疗剂的任何施用或应用。出于本公开文本的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下中的任何一个或多个：减轻一种或多种症状，降低疾病程度，预防或延迟疾病的传播，预防或延迟疾病的复发，延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态，抑制疾病或疾病进展，抑制或减缓疾病或疾病进展，停滞疾病发展和缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”还涵盖降低增殖性疾病的病理后果。本文提供的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。与上述一致，术语治疗不需要百分之百地去除所述障碍的所有方面。

在一些实施方案中，可以根据本文的方法使用TNFα和/或NGF抗体或包含TNFα和/或NGF抗体的药物组合物来治疗与TNFα和/或NGF相关的病症。在一些实施方案中，向伴生动物如犬类施用TNFα和/或NGF抗体或药物组合物，以治疗与TNFα和/或NGF相关的病症。在一些实施方案中，向伴生动物如犬类施用TNFα和/或NGF抗体或药物组合物，以维持与TNFα和/或NGF相关的病症的缓解。

物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据如以下的因素而变化：待治疗的疾病类型，疾病状态，疾病的严重程度和病程，治疗目的的类型，任何既往疗法，临床病史，对先前治疗的反应，主治兽医的判断，动物的年龄、性别和体重，以及物质/分子、激动剂或拮抗剂在动物中引发期望反应的能力。治疗有效量也是治疗有益效果超过物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用的量。治疗有效量可以按一次或多次施用来递送。“治疗有效量”是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下能有效实现所需治疗或预防结果的量。

在一些实施方案中，将TNFα和/或NGF抗体或包含TNFα和/或NGF抗体的药物组合物通过肠胃外施用，通过皮下施用、静脉输注或肌肉内注射进行。在一些实施方案中，将TNFα和/或NGF抗体或包含TNFα和/或NGF抗体的药物组合物按团注或通过经一段时间的连续输注来施用。在一些实施方案中，将TNFα和/或NGF抗体或包含TNFα和/或NGF抗体的药物组合物通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、动脉内、滑膜内、鞘内或吸入途径施用。

可以以每剂0.01mg/kg体重至100mg/kg体重范围内的量施用本文所述的TNFα和/或NGF抗体。在一些实施方案中，可以以每剂0.5mg/kg体重至50mg/kg体重范围内的量施用TNFα/NGF抗体。在一些实施方案中，可以以每剂0.1mg/kg体重至10mg/kg体重范围内的量施用TNFα/NGF抗体。在一些实施方案中，可以以每剂0.1mg/kg体重至100mg/kg体重范围内的量施用TNFα/NGF抗体。在一些实施方案中，可以以每剂1mg/kg体重至10mg/kg体重范围内的量施用TNFα/NGF抗体。在一些实施方案中，可以以以下范围内的量施用TNFα和/或NGF抗体：0.5mg/kg体重至100mg/kg体重范围内、1mg/kg体重至100mg/kg体重范围内、5mg/kg体重至100mg/kg体重范围内、10mg/kg体重至100mg/kg体重范围内、20mg/kg体重至100mg/kg体重范围内、50mg/kg体重至100mg/kg体重范围内、1mg/kg体重至10mg/kg体重范围内、5mg/kg体重至10mg/kg体重范围内、0.5mg/kg体重至10mg/kg体重范围内、0.01mg/kg体重至0.5mg/kg体重范围内、0.01mg/kg体重至0.1mg/kg体重范围内或在5mg/kg体重至50mg/kg体重范围内。在一些实施方案中，可以以0.5mg/kg体重的量施用TNFα和/或NGF抗体。在一些实施方案中，可以以2mg/kg体重的量施用TNFα和/或NGF抗体。

可以一次或在一系列治疗中将TNFα和/或NGF抗体或包含TNFα和/或NGF抗体的药物组合物施用于伴生动物。例如，可以将TNFα和/或NGF抗体或包含TNFα和/或NGF抗体的药物组合物施用至少一次、多于一次、至少两次、至少三次、至少四次或至少五次。

在一些实施方案中，将该剂量每周施用一次，持续至少连续两周或三周，并且在一些实施方案中，该治疗周期重复两次或更多次，任选地穿插有一周或多周未治疗。在其他实施方案中，将该治疗有效剂量每天施用一次，持续连续二至五天，并且在一些实施方案中，该治疗周期重复两次或更多次，任选地穿插有一天或多天未治疗。

与一种或多种其他治疗剂“组合”施用包括以任何顺序同时(并行)和连续或依序施用。术语“并行”在本文中用于指两种或更多种治疗剂的施用，其中至少部分施用在时间上重叠或者一种治疗剂的施用相对于另一种治疗剂的施用在很短的时间内发生。例如，以不超过约指定分钟数的时间间隔施用所述两种或更多种治疗剂。术语“依序”在本文中用于指两种或更多种治疗剂的施用，其中在中断施用一种或多种药剂后继续施用一种或多种其他药剂，或者其中在施用一种或多种药剂之前施用一种或多种其他药剂。例如，以超过约指定分钟数的时间间隔施用所述两种或更多种治疗剂。如本文所用，术语“与……结合”是指除了一种治疗模式之外还施用另一种治疗模式。因此，“与……结合”是指在向动物施用一种治疗模式之前、期间或之后施用另一种治疗模式。

在一些实施方案中，所述方法包括与TNFα和/或NGF抗体或包含TNFα和/或NGF抗体的药物组合物组合施用IL17抗体、IL-5抗体、IL-31抗体、IL4抗体、IL13抗体、IL23抗体、IgE抗体、CD11α抗体、IL6R抗体、α4-整合素抗体、IL12抗体、IL1β抗体或抗BlyS抗体。

本文提供了在允许所述抗体与TNFα和/或NGF结合的条件下向细胞暴露TNFα和/或NGF抗体或包含抗TNFα和/或NGF抗体的药物组合物的方法。在一些实施方案中，所述细胞离体暴露于所述抗体或药物组合物。在一些实施方案中，将所述细胞在体内暴露于所述抗体或药物组合物。在一些实施方案中，在允许所述抗体与细胞内TNFα和/或NGF结合的条件下，将细胞暴露于所述TNFα和/或NGF抗体或所述药物组合物。在一些实施方案中，在允许所述抗体与细胞外TNFα和/或NGF结合的条件下，将细胞暴露于所述TNFα和/或NGF抗体或所述药物组合物。

在一些实施方案中，细胞可以通过本文所述的任何一种或多种施用方法体内暴露于所述TNFα和/或NGF抗体或所述药物组合物，包括但不限于腹膜内、肌肉内、静脉注射到受试者体内。在一些实施方案中，通过将细胞暴露于包含所述抗体或所述药物组合物的培养基，可以将细胞离体暴露于所述TNFα和/或NGF抗体或所述药物组合物。在一些实施方案中，在将细胞暴露于包含所述抗体或所述药物组合物的培养基之前，可以使用本领域技术人员理解的任何数量的方法(如电穿孔细胞或将细胞暴露于含有氯化钙的溶液)影响细胞膜的渗透性。

在一些实施方案中，所述结合导致通过细胞的TNFα和/或NGF信号传导功能的降低。在一些实施方案中，与不存在所述抗体时的TNFα和/或NGF信号传导功能相比，TNFα和/或NGF抗体可以将细胞中的TNFα和/或NGF信号传导功能降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。在一些实施方案中，TNFα和/或NGF信号传导功能的降低在10％与15％之间、10％与20％之间、10％与25％之间、10％与30％之间、10％与35％之间、10％与40％之间、10％与45％之间、10％与50％之间、10％与60％之间、10％与70％之间、10％与80％之间、10％与90％之间、10％与100％之间、15％与20％之间、15％与25％之间、15％与30％之间、15％与35％之间、15％与40％之间、15％与45％之间、15％与50％之间、15％与60％之间、15％与70％之间、15％与80％之间、15％与90％之间、15％与100％之间、20％与25％之间、20％与30％之间、20％与35％之间、20％与40％之间、20％与45％之间、20％与50％之间、20％与60％之间、20％与70％之间、20％与80％之间、20％与90％之间、20％与100％之间、25％与30％之间、25％与35％之间、25％与40％之间、25％与45％之间、25％与50％之间、25％与60％之间、25％与70％之间、25％与80％之间、25％与90％之间、25％与100％之间、30％与35％之间、30％与40％之间、30％与45％之间、30％与50％之间、30％与60％之间、30％与70％之间、30％与80％之间、30％与90％之间、30％与100％之间、35％与40％之间、35％与45％之间、35％与50％之间、35％与60％之间、35％与70％之间、35％与80％之间、35％与90％之间、35％与100％之间、40％与45％之间、40％与50％之间、40％与60％之间、40％与70％之间、40％与80％之间、40％与90％之间、40％与100％之间、45％与50％之间、45％与60％之间、45％与70％之间、45％与80％之间、45％与90％之间、45％与100％之间、50％与60％之间、50％与70％之间、50％与80％之间、50％与90％之间、50％与100％之间、60％与70％之间、60％与80％之间、60％与90％之间、60％与100％之间、70％与80％之间、70％与90％之间、70％与100％之间、80％与90％之间、80％与100％之间或90％与100％之间。

本文提供了使用TNFα和/或NGF抗体、多肽和多核苷酸用于检测、诊断和监测与TNFα和/或NGF相关的病症的方法。本文提供了确定伴生动物是否将对TNFα和/或NGF抗体疗法有反应的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用TNFα和/或NGF抗体检测动物是否具有表达TNFα和/或NGF的细胞。在一些实施方案中，所述检测方法包括使样品与抗体、多肽或多核苷酸接触，并且确定结合水平是否不同于参考或对照样品(如对照)的结合水平。在一些实施方案中，所述方法可用于确定本文所述的抗体或多肽是否是对所述受试动物而言合适的治疗。

在一些实施方案中，样品是生物样品。术语“生物样品”意指来自活物或以前的活物的一定量的物质。在一些实施方案中，生物样品是细胞或细胞/组织裂解物。在一些实施方案中，生物样品包括但不限于血液(例如，全血)、血浆、血清、尿液、滑液和上皮细胞。

在一些实施方案中，使细胞或细胞/组织裂解物与TNFα和/或NGF抗体接触，并且确定抗体与细胞之间的结合。当测试细胞与相同组织类型的参考细胞相比显示出结合活性时，它可以指示受试者将受益于用TNFα和/或NGF抗体的治疗。在一些实施方案中，测试细胞来自伴生动物的组织。

可以使用本领域已知的用于检测特异性抗体-抗原结合的各种方法。可以进行的示例性免疫测定包括荧光偏振免疫测定(FPIA)、荧光免疫测定(FIA)、酶免疫测定(EIA)、比浊法抑制免疫测定(NIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。可以将指示剂部分或标记基团与主题抗体附接并且进行选择以便满足所述方法的通常由测定设备的可用性和相容的免疫测定程序决定的各种应用的需要。适当的标记包括而不限于放射性核素(例如，¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、³H或³²P)、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶或p-乳糖苷酶)、荧光部分或蛋白质(例如，荧光素、罗丹明、藻红蛋白、GFP或BFP)或发光部分(例如，由Quantum Dot Corporation，帕洛阿尔托，加利福尼亚州提供的Qdot^TM纳米颗粒)。用于进行上述各种免疫测定的一般技术是本领域普通技术人员已知的。

出于诊断目的，可以用可检测部分标记多肽(包括抗体)，所述可检测部分包括但不限于放射性同位素、荧光标记和本领域已知的各种酶-底物标记。将标记与抗体缀合的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，不需要标记所述TNFα和/或NGF抗体，并且可以使用与第一TNFα和/或NGF抗体结合的第二标记的抗体检测其存在。在一些实施方案中，所述TNFα和/或NGF抗体可以用于任何已知的测定方法，如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定和免疫沉淀测定。Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,第147-158页(CRC Press,Inc.1987)。所述TNFα和/或NGF抗体和多肽也可以用于体内诊断测定，如体内成像。通常，用放射性核素(如¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹⁴C、¹³¹I、¹²⁵I、³H或任何其他放射性核素标记(包括本文概述的那些))标记抗体或多肽，使得可以用免疫闪烁成像术定位目的细胞或组织。使用本领域熟知的技术，抗体还可以用作病理学中的染色试剂。

在一些实施方案中，第一抗体用于诊断，并且第二抗体用作治疗剂。在一些实施方案中，第一抗体与第二抗体是不同的。在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体均可以通过与单独的表位结合而同时与抗原结合。

以下实施例说明了本公开文本的具体方面，并不旨在以任何方式限制本公开文本。

实施例

实施例1

从CHO细胞合成和纯化犬源化TNFαD2E7抗体

化学合成编码犬源化TNFαD2E7抗体的DNA序列并将其插入到表达载体中，该表达载体适合于转染到CHO宿主细胞中并从该细胞分泌轻链或重链蛋白或两者。将一种或多种表达载体转染到CHO细胞中。如本领域已知的，针对TNFα抗体或其组分的高产率和表达稳定性选择CHO细胞，任选地使用表达载体上的DHFR基因和甲氨蝶呤介导的基因扩增。培养CHO细胞直到产生足够量的TNFα抗体。通过包括以下的不同步骤中的一个或多个纯化TNFα抗体：蛋白质A柱色谱法、蛋白G柱色谱法、蛋白L柱色谱法或其他色谱方法(如离子交换柱色谱法、疏水相互作用柱色谱法、混合模式柱色谱法如CHT、和/或多模态模式柱色谱法如CaptoMMC)。可以应用低pH或其他病毒灭活和病毒去除步骤。将所纯化的蛋白质与赋形剂混合，并通过过滤灭菌以制备本发明的药物组合物。以足以结合以抑制TNFα的剂量将药物组合物施用于患有与TNFα相关的病症的狗、猫或马。

更具体地，将TNFα抗体D2E7的可变轻链(SEQ ID NO:7)犬源化为SEQ ID NO:14(KBA VL v1)和SEQ ID NO:18(KBA VL v2)，并且将TNFα抗体D2E7的可变重链(SEQ ID NO:8)犬源化为SEQ ID NO:22(KBA VH)。合成DNA以提供显示为SEQ ID NO:15(KBA VL v1和犬类κ轻链恒定区)、SEQ ID NO:19(KBA VL v2和犬类κ轻链恒定区)和SEQ ID NO:23(犬源化D2E7可变重链和犬类IgG-B恒定区)以及前导序列的翻译的蛋白质序列，并且所述DNA用于为每个序列制备表达载体。轻链表达载体具有与重链不同的选择标记物。轻链载体和重链载体以不同比率共转染，以促进高效鉴定表达相应TNFα抗体的克隆。

然后使用FreestyleMax^TM转染试剂(Life Technologies)，使用载体在CHO-KS细胞中进行中试转染(1L工作体积)。在细胞活力下降至低于80％时，通过澄清条件培养基来收获上清液。用单程蛋白A色谱法步骤纯化蛋白质。从1L中试瞬时生产中，获得12.2mg纯化的KBA v1，而获得更低滴度的6.0mg的KBA v2。与在实验室中获得的典型的约200至500mg/L滴度的其他抗体相比，KBA v1和KBA v2犬源化形式二者均表达低滴度。通过SDS-PAGE和HPLC凝胶过滤分析纯化的KBA v1和KBA v2，并且显现出适合于使用。进一步选择KBA v1以生成稳定的细胞系，并且观察到低生产率。

实施例2.

TNFα结合活性的证明

此实施例证明，以在本文中也称为KIND-509的TNFα抗体KBA v1(SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:23)和KBA v2(SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23)为例说明，本文所述TNFα抗体以治疗活性所必需的动力学与TNFα结合。

进行如下结合分析。简而言之，将犬类和人TNFα生物素化。通过广泛透析从生物素化的TNFα去除游离的未反应的生物素。在链霉亲和素传感器尖端上捕获生物素化的TNFα。监测五种不同浓度(150、50、17、5.6和1.9nM)的TNFα抗体与TNFα(在不同的测试中，人和犬类)的缔合，持续90秒。监测解离持续600秒。减去仅缓冲液空白曲线以校正任何漂移。使用ForteBio^TM数据分析软件将数据拟合为1:1结合模型，以确定kon(缔合速率常数)、koff(解离速率常数)和KD(解离常数)。结合统计在可接受的参数之内(卡方小于或等于3.0；R方大于或等于0.9)。用于稀释和所有结合步骤的缓冲液是：200mM磷酸盐、150mM NaCl、0.02％Tween-20、0.05％叠氮化钠和0.1mg BSA，pH7.4。

犬类TNFα获自Sino Biological，目录号7003-DNAE，批号LC05JU2002；人TNFα来自Sigma，目录号T6674；EZ-Link NHS-LC-生物素来自Thermo Scientific，目录号21336，批号PB194183；并且链霉亲和素生物传感器来自ForteBio，目录号18-509，批号1403251。

结合动力学如下。对于配体犬类TNFα，KBA v1的KD(M)为9.88x 10^-11并且阿达木单抗的KD(M)为1.54x 10^-10；KBA v1的kon(1/Ms)为8.39x 10⁵并且阿达木单抗的kon(1/Ms)为7.22x 10⁵；KBA v1的koff(1/s)为8.28x 10^-5并且阿达木单抗的koff(1/s)为1.12x 10^-4；KBA v1的Rmax(nm)为0.77并且阿达木单抗的Rmax(nm)为0.76；KBA v1和阿达木单抗二者的完全卡方均为0.14；并且KBA v1和阿达木单抗二者的完全R方均为1。对于KBA v2，这些值为：KD为3.03x 10^-10；kon为7.13x 10⁵；koff为2.16x 10^-4；Rmax为0.71；完全卡方为0.38；以及完全R方为1。因此，与KBA v2相比，KBA v1对犬类TNFα具有更高的亲和力。

对于配体人TNFα，KBA v1的KD(M)为2.07x 10^-11并且阿达木单抗的KD(M)为3.06x10^-11；KBA v1的kon(1/Ms)为7.41x 10⁵并且阿达木单抗的kon(1/Ms)为6.74×10⁵；KBA v1的koff(1/s)为1.53x 10^-5并且阿达木单抗的koff(1/s)为2.06x 10^-5；KBA v1的Rmax(nm)为1.05并且阿达木单抗的Rmax(nm)为1.06；KBA v1的完全卡方为0.30并且阿达木单抗的完全卡方为0.27；并且KBA v1和阿达木单抗二者的完全R方均为1。对于KBA v2，这些值为：KD为2.69x 10^-10；kon为5.75x 10⁵；koff为1.50x 10^-4；Rmax为0.98；完全卡方为0.23；以及完全R方为1。

表3.KBA v1和KBA v2与犬类TNFα的相互作用：结合动力学数据汇总

抗体

配体

KD(M)

kon(1/Ms)

koff(1/s)

Rmax(nm)

完全卡²

完全R²

KBA v1

cTNFα

9.88E-11

8.39E+05

8.28E-05

0.77

0.14

1

KBA v2

cTNFα

3.03E-10

7.13E+05

2.16E-04

0.71

0.38

1

实施例3.

影响抗体产生的犬源化问题的鉴定

根据实施例1的方法制备包含嵌合D2E7可变轻链和犬类κ(SEQ ID NO:10)和嵌合D2E7可变重链和犬类IgG-B(SEQ ID NO:12)的嵌合D2E7抗体。从1L中试瞬时生产观察到典型的表达水平。因此，犬类κ和犬类IgG-B显现出并未影响产生。

为了鉴定犬源化可变轻链或犬源化可变重链是否影响抗体产生，根据实施例1的方法制备包含与嵌合重链配对的犬源化轻链和与犬源化重链配对的嵌合轻链的抗体。具体地，犬源化可变重链和犬类IgG-B(SEQ ID NO:23)与嵌合D2E7可变轻链和犬类κ(SEQ IDNO:10)配对。1L中试产生滴度是典型的，表明可变重链的犬源化不影响抗体产生。然而，当KBA VL v1和犬类κ(SEQ ID NO:15)与嵌合D2E7可变重链和犬类IgG-B(SEQ ID NO:12)配对时，所得的1L中试抗体产生滴度低。此外，与嵌合D2E7可变重链和犬类IgG-B(SEQ ID NO:12)配对的KBA VL v2和犬类κ(SEQ ID NO:19)导致不可检测或非常低的1L中试产生滴度。此后两种抗体的低滴度表明可变轻链的犬源化导致观察到抗体产生显著减少。尽管产生滴度低，但这些抗体仍保持TNFα结合活性。

实施例4.

将可变轻链犬源化以恢复抗体产生并保持TNFα结合活性

通过制备一系列具有不同犬源化可变轻链的抗体，研究影响抗体产生的可变轻链的一种或多种氨基酸和一个或多个位置。具体地，设计以下另外的D2E7犬源化可变轻链：KBA VL v3(SEQ ID NO:25)；KBA VL v4(SEQ ID NO:29)；KBA VL v5(SEQ ID NO:33)；KBAVL v6(SEQ ID NO:37)；和KBA VL v7(SEQ ID NO:43)。KBA VL v3-v7和犬类κ(分别为SEQID NO:26、30、34、38和44)中的每一个与嵌合D2E7可变重链和犬类IgG-B(SEQ ID NO:12)或犬源化可变重链和犬类IgG-B(SEQ ID NO:23)配对并且评估所得的在CHO细胞中的1L中试瞬时抗体产生。包含KBA VL v7(SEQ ID NO:43)的抗体展现出恢复的生产率并保持与犬类TNFα和人TNFα的结合活性。

此外，当嵌合D2E7可变轻链和犬类λ(SEQ ID NO:41)与嵌合D2E7可变重链和犬类IgG-B(SEQ ID NO:12)或犬源化可变重链和犬类IgG-B(SEQ ID NO:23)配对时，所得的1L中试抗体产生滴度显示出没有改善。

生成表达TNFα抗体的稳定CHO细胞系，所述TNFα抗体包含KBA VL v7和犬类κ(SEQID NO:44)以及犬源化可变重链和犬类IgG-B(SEQ ID NO:23)。在摇床烧瓶(shaker flask)中的抗体产生滴度大于4g/L。

轻链的框架区2显现出影响抗体产生。特别地，两个残基(在轻链框架区2(LC-FR2)的位置3处的谷氨酰胺(Q)和在LC-FR2的位置8处的赖氨酸(K))对犬源化D2E7轻链在抗TNFα抗体产生中的表达很重要。

实施例5.

另外的示例性犬源化TNFα抗体

可以将另外的D2E7犬源化可变轻链设计为具有在LC-FR2(SEQ ID NO:45)的位置3处的谷氨酰胺(Q)和位置8处的赖氨酸(K)。例如，另一个示例性的D2E7犬源化可变轻链可以由SEQ ID NO:46(KBA VL v8)表示。

实施例6.

用TNFα抗体治疗犬类IBD的研究

进行多地点、随机、单盲、安慰剂对照、试点临床现场研究，以评价KIND-509对于管理客户拥有的狗的炎性肠病(IBD)的有效性和安全性。

该研究涉及被诊断患有IBD并且符合以下所示的入选和排除标准的任何年龄、品种、体重或性别的狗。基于在访视1(第0天)测定并四舍五入至最接近的十分位的体重(BW)，施用的犬源化TNFα抗体(例如，KIND-509或本文所述的任何其他犬源化TNFα抗体)的初始剂量为2mg/kg。基于在访视2、3和4测定并四舍五入至最接近的十分位的BW，犬源化TNFα抗体的所有随后的剂量均为1mg/kg。对照产物(CP，例如，PBS或配制品缓冲液)剂量体积与治疗组的剂量体积匹配。所有狗均接受四剂犬源化TNFα抗体或CP，其中在访视1(第0天)施用第一剂。每7(±2)天在访视2、3和4施用随后的剂量。

内镜胃肠道活检物的组织病理学用于测定犬源化TNFα抗体在管理IBD方面的有效性。

住宿和一般管理

入组的狗与其所有者住在一起，并在家中度过至少60％的时间。一次只有一只来自多狗家庭的狗参加这项研究。研究期间应避免寄宿，并且如果有必要寄宿，则理想的情况是在研究地点寄宿。

水：水是由所有者根据时间表和他们的狗的惯用量酌情提供的。不需要对水采样和分析。

饮食：在筛选访视前90天内完成持续时间为至少连续14天的采用指定饮食的食物试验，以排除食物反应性肠病。在食物试验期间，处方饮食是喂养的唯一饮食。研究者确定食物试验是否足以排除食物反应性肠病。在筛选访视时记录食物试验的详细信息。如果狗的犬类炎性肠病活动指数(CIBDAI)得分≥6并且研究者认为狗患有不稳定疾病(例如，发热、严重体重减轻、厌食等)，则不需要食物试验。

理想情况下，当对狗进行筛选以用于研究时，狗接受作为唯一饮食的指定饮食，但这不是入选研究的要求。

在筛选访视时记录饮食品牌和配方。在筛选访视前14天内或在整个研究持续时间期间，饮食品牌或配方不应发生显著变化。研究者确定是否发生显著的饮食变化。在随后的每次访视中，研究地点人员记录饮食是否发生显著变化。根据具体情况与赞助者协商确定是否使在访视5之前饮食有显著变化的狗退出研究。

入选标准：狗：

·可管理并且配合研究程序

·符合上述水规范

·在筛选访视前至少三周有至少一种IBD体征史(体重减轻、食欲不振/厌食、呕吐或腹泻)，并且在筛选访视时同时具有至少一种IBD体征史(体重减轻、食欲不振/厌食、呕吐或腹泻)。

·在筛选访视时CIBDAI得分≥4(轻度至重度疾病)

·已基于在筛选访视时获得的内镜胃肠道活检物的组织病理学评价被诊断患有IBD

·在筛选访视前60天内已连续三天接受口服(PO)芬苯达唑(50mg/kg)治疗

·在筛选访视前90天内已完成至少两周(连续14天)的采用被研究者认为足够的指定饮食的食物试验。如果狗的CIBDAI得分≥6并且研究者认为狗患有不稳定疾病(例如，发热、严重体重减轻、厌食等)，则要求此入选标准。

·在筛选访视前90天内已至少连续14天接受了抗腹泻抗生素(如甲硝唑或泰乐菌素)的治疗；在筛选访视时接受抗腹泻抗生素的狗必须停用抗生素，并且在入组/随机分组(访视1)前等待七天。如果狗的CIBDAI得分≥6并且研究者认为狗患有不稳定疾病(例如，发热、严重体重减轻、厌食等)，则要求此入选标准。

·在研究者看来预计将活至少六个月

排除标准：狗：

·有显著低白蛋白血症史(白蛋白<2.0mg/dL)或在筛查访视时患有显著低白蛋白血症(白蛋白<2.0mg/dL)

·在筛选访视前六个月内有超声诊断胰腺炎史

·有胰腺外分泌功能不全史、疑似患有或诊断为胰腺外分泌功能不全

·在筛选访视前六个月内有腹部手术史

·患有可能阻止完成研究/干扰研究结果的临床上显著的肝或肾疾病、瘤形成、糖尿病或其他并行疾病

·在筛选访视前30天内有感染(除了牙龈炎或牙周疾病)的临床体征，或已被诊断患有感染(除了牙龈炎或牙周疾病)和/或用针对感染的抗生素(除了抗腹泻抗生素)治疗

·疑似患有或被诊断患有肾上腺皮质功能亢进、肾上腺皮质功能减退或甲状腺功能减退

·在筛选访视前14天内有显著的饮食变化(饮食变化的显著性将由研究者确定)

·已接受以下任何产品的治疗：

o在筛选访视前14天内的全身性非甾体抗炎药

o在筛选访视前30天内的胰酶补充剂

o在筛选访视前30天内全身性、局部、眼部或吸入性糖皮质激素或盐皮质激素

o在筛选访视前90天内的长效糖皮质激素

o在筛选访视前90天内的环孢菌素、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯或其他免疫抑制剂o在筛选访视前90天内的苯丁酸氮芥

·是怀孕或哺乳的雌性或是打算繁殖的狗

·在筛选访视前30天内已入组另一项临床试验

移出标准：研究者完成对于所有经筛选的狗的研究终止eCRF，并记录终止日期。每只入组的完成研究的狗的研究终止定义为计划评估和程序以及从狗或所有者收集数据的最后日期的结束。直到终止日期之后才收到实验室结果。对于完成研究的所有随机化案例，访视5为研究终止访视。如果狗被随机分组并且在访视5之前被移出，则在任何可能的时间进行所有预计在访视5进行的程序。移出的原因在研究终止eCRF上注明。

入选后移出标准：由于以下原因，一只入组的狗可能会被提前移出，不再参与研究：

·饮食显著变化

·狗需要用禁用药物治疗

·狗经历了阻止它继续参与研究的不良事件

·狗基于以下救援条款符合移出标准

·狗变得不依从研究程序

·狗被发现入组错误

·所有者不依从研究程序

·狗错过了一次或多次计划研究访视或超过了治疗之间的所需时间间隔，或需要监测程序，使得无法评价对治疗的反应

·所有者选择性地使狗退出研究

·赞助者决定停止研究

·如与所有者失去联系、更改住所等其他原因。

在可能的情况下，研究者和赞助者在将狗提前移出研究之前协商。

救援条款：如果在访视3(第14±2天)的CIBDAI得分与筛选访视时的CIBDAI得分相同或比后者更高，并且研究者认为IBD整体情况恶化，则将狗移出研究，并按照研究者的指示进行适当的标准护理治疗。这些狗被认为是治疗失败。

动物处置和退出：终止研究的狗仍由其所有者保管。安乐死或自发性死亡(以及验尸检查，如果适用)后的狗的遗体将根据要求退还给所有者，或者按照所有者授权根据研究地点政策进行处置。

研究时间表：研究的筛选阶段长达10天，并且研究的治疗阶段为28±2天，因此总研究持续时间为38±2天。事件时间表列于下表4中。当狗入组研究中以进行进一步评价或由于不良事件而需要时，可以随时进行计划外访视。

研究程序/评估

病史：为了区分不良事件与正在存在或先前存在的病症，在每只狗的病史eCRF上记录所有在筛选访视前12个月内发生的显著医学病症(包括慢性或复发性病症)以及在此之前发生的任何显著事件。此记录包括每种病症的简要描述，以及发作和消退日期(如果这些日期可获取)。对于筛选访视时正在存在的病症，可以在研究期间记录消退日期，或将其列为正在存在(如适用)。

作为病史的一部分，研究者评估狗的与IBD相关的临床体征史，包括但不限于嗜睡、脱水、食欲不振/厌食、体重减轻、呕吐、腹泻、里急后重、便血和/或黏液样便。研究者还将狗的腹泻分类为小肠、大肠或混合肠腹泻。

体格检查：在特征描述eCRF上记录每只筛选入组的狗的特征描述，以包括出生日期、品种和性别(包括完好的或绝育的)。

如有必要，在所有计划的研究访视(筛选访视和访视1-5)和任何计划外访视时进行体格检查(PE)。检查包括对一般外观和姿势、水合状态、以及耳、眼、口、黏膜、呼吸、心血管、胃肠、神经、肌肉骨骼、淋巴、皮肤和泌尿生殖系统的主观评估。体格检查结果记录在体格检查eCRF上。审查访视1(第0天)后记录的异常(不包括先前存在的病症)和异常恶化情况，并将其记录为如下所述的不良事件。

生命体征：每次PE评估体温(°F)、心率(HR)(心跳/分钟)和呼吸频率(RR)(呼吸/分钟)，并记录在体格检查eCRF上。

体重和尺度：在每次PE期间，体重以千克(kg)为单位记录在体格检查eCRF上。对于所有狗，应在禁食状态下测量体重，定义为饭后至少两小时获得的BW。

身体状况得分：身体状况得分(BCS)作为PE的一部分来测量。用NestléPURINA身体状况系统(LaFlamme，DP，1997)评估BCS。BCS使用可视化和触诊来评估狗的总体形状以及肋骨、脊柱和臀部上的脂肪覆盖量。此BCS分为1-9的等级；9分是极度超重的狗，并且1分是极度体重不足的狗。在每次访视时，每只狗最好由同一研究者评估。

肌肉状况得分：肌肉状况得分(MCS)作为PE的一部分来测量。用世界小动物兽医协会(WSAVA)肌肉状况得分系统(WSAVA，2014)来评估MCS。MCS使用脊柱、肩胛骨、头骨和回肠侧翼的可视化和触诊来将肌肉质量分级为正常、轻度损失、中度损失或重度损失。在每次访视时，每只狗最好由同一研究者评估。

犬类炎性肠病活动指数(CIBDAI)得分：犬类炎性肠病活动指数(CIBDAI)是为评价犬类IBD的活动性/严重程度而开发的评分系统。当使用CIBDAI时，与正常情况相比，患有IBD的狗的六种胃肠道体征评分为0-3。将六种胃肠道体征中的每一种的得分相加，得出累积的CIBDAI得分。基于CIBDAI得分，将IBD分类为临床上不显著、轻度、中度或重度(附录1)。

在每次访视时，研究者完成CIBDAI得分eCRF。研究者考虑所有者对临床体征、PE、BW的变化等的报告/评估以完成CIBDAI评分。在筛选访视时，研究者评估狗与正常情况相比的姿势/活动、食欲、呕吐、粪便黏稠度、粪便频率和体重减轻。在所有随后的访视时，研究者对与基线相比的姿势/活动、食欲、呕吐、粪便黏稠度、粪便频率和体重减轻再评分。优选地，采访同一所有者，并且同一研究者在每次访视时完成CIBDAI得分eCRF。

所有者评估：在筛选访视时，所有者完成最能代表狗在筛选访视前两周内的临床体征和总体生活质量(QoL)的他们的狗的临床体征(活动、食欲、呕吐、粪便黏稠度、粪便频率)和QoL的所有者评估-基线CRF。在随后的每次计划访视时，所有者完成所有者评估CRF，以注明他们的狗自筛选访视以来的临床体征的变化。研究地点人员将所有者评估-基线CRF和所有者评估CRF改写为所有者评估-基线eCRF和所有者评估eCRF。优选地，同一所有者在每次访视时完成评估。如果狗在计划的访视时间期间寄宿，则不会完成所有者评估，并在备忘录(NTF)中记录解释。

基于Purina粪便评分系统(VET 1502B-06FSC/15-6843，Sociétédes ProduitsNestléS.A.，沃韦，瑞士)对粪便黏稠度分级。在筛选访视时，向所有者展示Purina粪便评分表，并报告最能代表筛选访视前两周内狗的粪便黏稠度的粪便得分。在随后的每次访视时，向所有者展示Purina粪便评分表，并报告最能代表自先前访视以来狗的粪便黏稠度的粪便得分。

临床病理学

中心实验室临床病理学：如在表3中指定的多次研究访视和任何计划外访视(如果必要)时经由静脉穿刺收集血液。根据中心实验室指南处理和发送血液和尿液样品。在筛选访视时，在禁食>8小时后收集血液样品。在访视3和5时，在禁食>6小时后收集血液样品。在施用犬源化TNFα抗体或CP和氰钴胺之前收集所有血液样品。

在中心实验室进行以下测试：

血液学(在筛选访视和访视3和5时完成)：总白细胞计数(WBC)、白细胞分类计数、红细胞计数(RBC)、血细胞比容(Hct)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血红蛋白(Hgb)和血小板计数。

生物化学(在筛选访视和访视3和5时完成)：淀粉酶、丙氨酸转氨酶(ALT)、脂肪酶、碱性磷酸酶(ALP)、胆固醇、血清天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐、总蛋白、葡萄糖、白蛋白、钙、球蛋白、钠、总胆红素、氯化物、钾、血尿素氮(BUN)、磷、肌酸磷酸激酶(CPK)、镁、γ-谷氨酰转移酶(GGT)和甘油三酯。

皮质醇(在筛选访视时完成)：在筛选访视时经由静脉穿刺收集血液，以用于评估皮质醇浓度。根据中心实验室指南处理和发送血液样品。

胰蛋白酶样免疫反应性(TLI)、钴胺素和叶酸(在筛选访视时完成)：在筛选访视时经由静脉穿刺收集血液，以用于评估TLI、钴胺素和叶酸浓度。根据中心实验室指南处理和发送血液样品。在抽血后，狗在筛选访视时接受氰钴胺注射。用如以下进一步描述的氰钴胺补充剂治疗基于筛选访视结果具有低钴胺素浓度的狗。

尿液分析(UA)和尿液培养±敏感性(在筛选访视和访视5(用于尿液分析)和筛选访视(用于尿液培养±敏感性)时完成)：评价完整的UA(包括尿比重、浸渍带和尿沉渣评价)和尿液培养±敏感性。理想情况下，通过膀胱穿刺术收集尿液；但是，如果无法进行膀胱穿刺术，则可以通过导管插入或排尿收集尿液。

其他实验室评估可以由研究者自行决定完成。

组织胞浆菌属抗原酶免疫测定：在筛选访视时，收集最少1mL的尿液以用于组织胞浆菌属抗原酶免疫测定(EIA)。

腹部超声检查：在准备结肠镜检查、麻醉、胃十二指肠镜检查和结肠镜检查之前，在筛选访视时进行腹部超声检查。

胃十二指肠镜检查和结肠镜检查和内镜胃肠道活检：在筛选访视时进行胃十二指肠镜检查和结肠镜检查。从胃、十二指肠和结肠收集最少六份内镜活检物。如果可能，在内镜下评价回肠，并在内镜指引下或盲法收集活检。筛选访视可以在两到四天内进行(不要求连续)，以允许完成和审查在进行结肠镜检查、麻醉和胃十二指肠镜检查和结肠镜检查准备之前所需的诊断测试，以及允许准备结肠镜检查。在诊断测试前，所有者可以将狗带回家，并在一到两天后返回，以开始为结肠镜检查做准备。

在准备结肠镜检查前，完成筛选访视特征描述、病史、PE、CIBDAI得分、所有者评估和腹部超声检查。除上述内容外，在进行麻醉和胃十二指肠镜检查和结肠镜检查之前，还完成并审查血液学、生物化学和皮质醇检查。

筛选访视的所有要求在允许在访视1(第0天)接收和审查组织病理学的时间范围内完成。

内镜胃肠道活检物的组织病理学：将内镜胃肠道活检物提交给研究者选择的病理学家以进行组织病理学评价。需要对狗进行特发性IBD(例如，淋巴浆细胞性肠炎、嗜酸性肠炎等)的组织病理学诊断，以使其有资格入组研究。

伴随药物和疗法：在筛选访视前一个月直至终止研究故意开出的或施用的药物被视为伴随药物。审查在研究开始前施用的药物，以确保狗符合研究入选的要求。

在施用任何不清楚其可接受用途的伴随药物之前联系临床研发管理者或指定的研究监测员。

允许的药物：在研究期间允许使用预计不会干扰治疗的新药物。这包括但不限于以下药物：

·液体疗法(例如，乳酸盐林格氏液、0.9％ NaCl等)

·不旨在治疗腹泻的抗生素

·抗组胺药(例如，苯海拉明)

·预防性治疗(例如，跳蚤控制、犬心丝虫预防等)

条件性允许的药物：如果在筛选访视前两周和研究期间没有改变处方，则允许使用现有药物。这包括并且限于以下药物：

·止吐剂(例如，甲氧氯普胺、昂丹司琼、马罗匹坦、米氮平等)

·抗酸剂(如奥美拉唑、法莫替丁、雷尼替丁、西咪替丁等)

·促动力剂(例如，西沙必利、红霉素、甲氧氯普胺、雷尼替丁等)

·益生菌(如Forti Flora、Proviable等)

·用于镇痛的阿片类物质(例如，曲马朵、丁丙诺啡等)

对于现有药物的要求的一个例外是在筛选访视期间针对内镜检查施用的止吐剂。在筛选访视期间进行内镜检查时，允许施用止吐剂。

氰钴胺补充剂：所有狗在采集血液样品后在筛选访视时接受皮下(SQ)注射25μg/kg氰钴胺。基于在筛选访视时的钴胺素浓度确定为缺乏钴胺素的狗在访视1、2、3和4时SQ接受25μg/kg氰钴胺。在任何访视时的氰钴胺剂量不超过1500μg的总剂量。由赞助者向研究地点提供氰钴胺。

禁用药物：在研究期间不允许使用预计会干扰IBD治疗和/或临床体征的药物。这包括但不限于以下药物：

·疫苗接种

·糖皮质激素(例如，泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、曲安西龙、倍他米松等)

·盐皮质激素(例如，去氧皮质酮新戊酸酯、氟氢可的松等)

·免疫抑制剂(例如，环孢菌素、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯等)

·烷基化剂(例如，苯丁酸氮芥等)

·全身性非甾体抗炎药(例如，卡洛芬、地拉考昔等)

·抗腹泻抗生素(例如，甲硝唑、泰乐菌素、柳氮磺胺吡啶等)

·抗腹泻药物(例如，洛哌丁胺、止泻宁等)

·胰酶补充剂

所有者日记：所有者将在从筛选访视到访视5/研究终止的整个研究过程中观察到的任何不利或意外事件记录在所有者日记：观察到的事件CRF上。由研究者在每次访视时审查所有者日记：观察到的事件CRF。所有者在访视1之前列出的观察结果不记录为不良事件。对于所有者在访视1后列出的每个观察结果，研究者指出观察结果是否构成如下定义的不良事件。

不良事件：不良事件(或AE)是在狗中是不利的和意外的并且是在任何使用兽用药品后发生的任何观察结果(无论是否视为IVP相关)。如果符合此描述的事件发生在访视1(第0天)时的首次治疗施用和研究终止之时或之间，则所述事件被视为AE。

对于每个病例，将从在狗接受研究治疗后收集的样品测定的任何新的一种或多种临床上显著的(CS)实验室结果(或相应疾病/病症)在不良事件eCRF上记录为AE。一种或多种临床上不显著的(NCS)实验室结果不记录为AE。

使用不良事件eCRF，研究者记录和描述AE，以包括临床体征/异常、开始/结束日期或正在进行的所采取的研究药物动作、AE与研究药物的关系的评估、事件的严重性、视为SAE的原因(如果适用)和事件的结局。赞助者使用药品监管机构兽医词典(VeterinaryDictionary for Drug Regulatory Authorities，VeDDRA)术语对每个AE编码。在研究结束时，赞助者根据具体情况评价AE并将AE最终分类为严重或非严重。

研究者就SAE而言和/或在观察到任何异常高频的非严重AE的情况下联系监测员。

严重不良事件(SAE)：SAE是指任何致命或危及生命、或需要专业干预并且被研究者认为是临床上严重的、或导致流产、死产、不孕、先天性异常或长期或永久性残疾或毁容的AE。发生SAE后，所有者尽快与研究者联系。研究者评估病例并确定是否需要治疗。在不良事件eCRF上注明对SAE的描述。

因果关系评估：研究者使用以下标准完成对每个AE的因果关系评估：

类别A-很可能：以下所有情况都适用：

·在IVP的施用与报告事件的开始和持续时间之间有合理的时间关联；

·鉴于已知的产品药理学和毒理学，对临床现象的描述应与其一致，或至少是合理的；

·对这种情况没有其他同样合理的一种或多种解释。特别地，在评估中应考虑其他产品的并行使用(以及可能的相互作用)或并发疾病。

类别B-可能：因果关系是描述的AE的可能且合理的原因(之一)，但数据不符合类别A的入选标准。

类别O-不可分类/不可评估：有关AE的可靠数据不可获取或不足以评估因果关系。

类别O1-不确定：不能忽视与IVP的关联，但因为其他因素无法得出结论。

类别N-不太可能：存在足够的信息，可以毫无疑问地确定对与IVP无关的AE有可替代的解释。

尸检和组织病理学

如有必要，为了确定死亡原因或导致安乐死的发病原因并且只有在获得所有者的自愿书面同意后，对在研究完成前死亡的任何入组的狗进行尸检。尸检可以包括对病理变化进行完整的大体检查，以及收集组织以用于组织病理学。

在尸检时收集以用于组织病理学的组织可以包括：心室、肺、肝、胆囊、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠/直肠、脾、左右肾、肾上腺、膀胱和任何其他认为必要的组织。

分析群体

有效性群体：有效性群体由所有符合有效性分析条件的入组的狗组成。资格标准包括完成直至且包括访视5的研究。不合格的标准包括因安全性和有效性以外的原因而中止，以及影响有效性评估的协议违反行为。所有有效性分析均基于有效性群体。根据具体情况确定包括或排除在主要有效性终点之前被终止研究的每只狗的有效性数据的决定。

安全性群体：安全性群体由所有接受至少一剂犬源化TNFα抗体或CP的入组的狗组成。基于安全性群体汇总伴随药物、AE和IVP暴露。

有效性结局

主要变量：CIBDAI得分的降低是主要有效性变量。疾病缓解和反应定义如下：

·完全缓解：CIBDAI得分降低≥75％或CIBDAI得分<4

·部分缓解：CIBDAI得分降低≥25％至<75％

·无反应：CIBDAI得分降低<25％，CIBDAI得分无变化，或CIBDAI得分升高

与在筛选访视时获得的CIBDAI得分相比，在访视5时评估反应或缓解。赞助者自行决定对CIBDAI得分的组分进行另外的探索性统计分析。

使用费希尔精确检验(SAS，SAS研究所，北科罗拉多州凯瑞(Cary)中的FREQ程序；版本9.4或更高)评价犬源化TNFα抗体对具有疾病反应的狗的百分比和缓解的狗的百分比的影响。此外，对跨时间收集的CIBDAI得分进行重复测量协方差分析(RMANCOVA)，其中治疗组、时间和治疗与时间相互作用作为固定效应，并且基线值作为协变量。假设协方差矩阵具有复合对称结构。鉴于小样本量，在此分析中忽略地点。如果相互作用显著，则在时间内评估治疗效果。如果相互作用不显著，则评价治疗的主要效果。

次要变量：评估另外的变量，如BW改善/增加、BCS改善/增加、MCS改善/增加、食欲增加、呕吐减少、肠运动频率降低、粪便得分改善等。在适当的情况下汇总这些结局，并且可以由赞助者自行决定进行统计分析。

安全性结局

不良事件和伴随药物：将不良事件和伴随药物数据汇总并制成表格以用于最终报告。

临床病理学实验室数据：在适当的情况下汇总每个临床病理学实验室变量。汇总尿分析结局。

生命体征、体重数据和分类观察结果：如上所述评价生命体征和BW数据以获得临床病理学结局。将包括AE在内的按性质分类的结局按频率和计数汇总。

实施例7.

用TNFα抗体治疗犬类IBD的初步分析

十只被诊断患有IBD的狗完成了实施例6中所述的直至访视5的研究。主要有效性变量是犬类炎性肠病活动指数(CIBDAI)得分的降低，在筛选时和第0、7、14、21和28天评估该得分。与安慰剂组的17％相比，75％的TNFα抗体组(2mg/kg剂量的KIND-509)实现完全缓解(定义为平均给药后CIBDAI得分相比于基线降低≥75％)。治疗效果是早发性的并且持久的。在第7天，即第一次给药后访视时，与安慰剂组的17％相比，75％的经KIND-509治疗的狗显示CIBDAI得分相比于基线降低≥75％。此外，遍及所有给药后访视，50％的经KIND-509治疗的狗实现并保持CIBDAI得分相比于基线100％降低，而安慰剂组没有一只达到相同的结果。

实施例8.

犬源化NGFαD11抗体的设计

将αD11大鼠抗NGF单克隆抗体的可变轻链(SEQ ID NO:71)犬源化为SEQ ID NO:73，并且将αD11大鼠抗NGF单克隆抗体的可变重链(SEQ ID NO:72)犬源化为SEQ ID NO:74。这导致可变重链CDR-H1中的两个氨基酸变化(参见SEQ ID NO:75)。还设计包含这些犬源化可变轻链和重链序列的示例性轻链和重链(SEQ ID NO:76-79)。

实施例9.

来自CHO细胞的双特异性抗犬类TNF和抗犬类NGF分子的表达与纯化

为了同时靶向TNF和NGF以减少炎症和减少与诸如骨关节炎、慢性疼痛、下背部疼痛、癌性疼痛和神经性疼痛的病症相关的疼痛，设计双特异性分子。

设计的示例性双特异性分子包含(1)具有犬类κ轻链恒定区的犬源化抗NGF可变轻链(SEQ ID NO:77)和(2)含有犬源化抗NGF可变重链(SEQ ID NO:74)、具有降低的C1q和CD16结合的工程化为长效的变体犬类IgG-B Fc以及犬源化抗TNF可变重链(SEQ ID NO:22)和轻链(SEQ ID NO:43)的单链可变片段(ScFv)的SEQ ID NO:81。

分子(SEQ ID NO:77和81)由哺乳动物细胞表达，并且通过单步蛋白A柱色谱法纯化。使用生物传感器Octet进行结合分析。包含SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:81的双特异性分子对于犬类TNFα的Kd是8.38x 10^-10，对于犬类NGF的Kd在个位数pM范围内。

反向设计第二示例性双特异性分子，所述第二示例性双特异性分子包含(1)具有犬类κ轻链恒定区的犬源化抗TNF可变轻链(SEQ ID NO:44)和(2)含有犬源化抗TNF可变重链(SEQ ID NO:22)、具有降低的C1q和CD16结合的工程化为长效的变体犬类IgG-B Fc以及犬源化抗NGF可变重链(SEQ ID NO:74)和轻链(SEQ ID NO:73)的单链可变片段(ScFv)的SEQ ID NO:83。

令人惊讶的是，没有观察到反向的双特异性分子(即，包含SEQ ID NO:44和83)的表达。

Claims

1.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含可变轻链的犬源化抗体，所述可变轻链包含(i)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L2；(iii)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR L3；和(iv)含有在位置3处的谷氨酰胺和在位置8处的赖氨酸的LC-FR2。

2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包含可变重链，所述可变重链包含(i)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2；和(iii)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR H3。

3.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述LC-FR2包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

4.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列或其变体，在所述变体中所述可变轻链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其变体，在所述变体中所述可变重链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

5.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

6.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含：(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQID NO:22的氨基酸序列；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

7.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46的氨基酸序列，所述可变重链包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列。

8.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的可变轻链和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变重链。

9.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的可变轻链和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变重链。

10.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含以下的犬源化抗体：

(a)轻链，所述轻链包含(i)含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2；(iii)含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR L3；和(iv)含有SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其变体的可变轻链，在所述变体中所述可变轻链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；

(b)重链，所述重链包含(i)含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)含有SEQID NO:53的氨基酸序列的CDR-H2；(iii)含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR H3；和(iv)含有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其变体的可变重链，在所述变体中所述可变重链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；或

(c)如在(a)中的轻链和如在(b)中的重链。

11.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含以下的犬源化抗体：

(a)轻链，所述轻链包含(i)含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2；(iii)含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR L3；和(iv)含有SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其变体的可变轻链，所述变体与SEQ IDNO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；

(b)重链，所述重链包含(i)含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)含有SEQID NO:53的氨基酸序列的CDR-H2；(iii)含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR H3；和(iv)含有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其变体的可变重链，所述变体与SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或

(c)如在(a)中的轻链和如在(b)中的重链。

12.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含：(i)含有SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列的可变轻链；(ii)含有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的可变重链；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含犬类恒定重链区和/或犬类恒定轻链区。

14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含选自IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D恒定区的犬类重链恒定区。

15.根据权利要求1至9、13或14中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：(i)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:44的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:15、SEQID NO:19、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)重链，所述重链包含SEQ ID NO:23或SEQID NO:64的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的轻链和如在(ii)中的重链。

16.根据权利要求1至9或权利要求13至15中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：(i)含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链，(ii)含有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链，或(iii)如在(i)中的轻链和如在(ii)中的重链。

17.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链。

18.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链。

19.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含以下的犬源化抗体：

(a)轻链，所述轻链包含(i)含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1；(ii)含有SEQID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2；(iii)含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR L3；和(iv)含有SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60的氨基酸序列或其变体的轻链，所述变体与SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；

(b)重链，所述重链包含(i)含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)含有SEQID NO:53的氨基酸序列的CDR-H2；(iii)含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR H3；和(iv)含有SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的氨基酸序列或其变体的重链，所述变体与SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或

(c)如在(a)中的轻链和如在(b)中的重链。

20.一种与犬类TNFα结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:59或SEQID NO:60的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链。

21.一种与犬类NGF结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含以下的犬源化抗体：(i)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；(ii)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-H2；和(iii)含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-H3。

22.根据权利要求21所述的分离的抗体，其中所述抗体进一步包含(iv)含有SEQ IDNO:65的氨基酸序列的CDR-L1；(v)含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR-L2；和(vi)含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR L3。

23.根据权利要求21或权利要求22所述的分离的抗体，其中所述抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列、其变体，所述变体与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

24.一种与犬类NGF结合的分离的抗体，其中所述抗体是包含以下的犬源化抗体：(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列、其变体，所述变体与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQID NO:74的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的可变轻链和如在(ii)中的可变重链。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含(i)SEQ IDNO:73的可变轻链序列或其变体，在所述变体中所述可变轻链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；(ii)SEQ ID NO:74的可变重链序列或其变体，在所述变体中所述可变重链的1、2、3、4、5或6个氨基酸被不同的氨基酸取代；或(iii)如在(i)中的可变轻链序列和如在(ii)中的可变重链序列。

26.根据权利要求21至25中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含犬类恒定重链区和/或犬类恒定轻链区。

27.根据权利要求21至26中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含选自IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D恒定区的犬类重链恒定区。

28.根据权利要求21至27中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：(i)SEQ IDNO:77的轻链序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)SEQ ID NO:79的重链序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(iii)如在(i)中的轻链序列和如在(ii)中的重链序列。

29.根据权利要求21至28中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:77的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链。

30.一种与犬类NGF结合的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链。

31.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是选自Fv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和Fab'-SH的抗体片段。

32.一种与犬类TNFα和犬类NGF结合的分离的抗体，其中所述抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸或其变体，所述变体与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(iii)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(iv)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(v)如在(i)中的可变轻链序列、如在(ii)中的可变重链序列、如在(iii)中的可变轻链序列、以及如在(iv)中的可变重链序列。

33.根据权利要求32所述的分离的抗体，其中所述抗体包含(i)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:43的氨基酸或其变体，所述变体与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(ii)可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(iii)可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；(iv)可变重链，所述可变重链包含SEQID NO:74的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；或(v)如在(i)中的可变轻链序列、如在(ii)中的可变重链序列、如在(iii)中的可变轻链序列、以及如在(iv)中的可变重链序列。

34.一种与犬类TNFα和犬类NGF结合的分离的抗体，其中所述抗体包含(i)含有SEQ IDNO:43的氨基酸的可变轻链；(ii)含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变重链；(iii)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的可变轻链；和(iv)含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的可变重链。

35.根据权利要求33所述的分离的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列和SEQ ID NO:81的氨基酸序列。

36.一种或多种编码根据权利要求1至35中任一项所述的抗体的分离的核酸。

37.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求36所述的一种或多种核酸。

38.一种产生抗体的方法，所述方法包括培养根据权利要求37所述的宿主细胞以及分离所述抗体。

39.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至35中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

40.一种治疗患有与TNFα相关的病症的犬类的方法，所述方法包括向所述犬类施用治疗有效量的根据权利要求1至20和权利要求31至35中任一项所述的抗体或根据权利要求39所述的药物组合物。

41.一种维持犬类的与TNFα相关的病症的缓解的方法，所述方法包括向所述犬类施用治疗有效量的根据权利要求1至20和权利要求31至35中任一项所述的抗体或根据权利要求37所述的药物组合物。

42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述与TNFα相关的病症是炎性疾病。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述与TNFα相关的病症是胃肠道炎性疾病。

44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述与TNFα相关的病症是炎性肠病。

45.根据权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述与TNFα相关的病症是强直性脊柱炎、哮喘、癌症、克罗恩病、特发性关节炎、银屑病、斑块状银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎或溃疡性结肠炎。

46.一种治疗患有与NGF相关的病症的犬类的方法，所述方法包括向所述犬类施用治疗有效量的根据权利要求21至35中任一项所述的抗体或根据权利要求39所述的药物组合物。

47.一种维持犬类的与NGF相关的病症的缓解的方法，所述方法包括向所述犬类施用治疗有效量的根据权利要求21至35中任一项所述的抗体或根据权利要求39所述的药物组合物。

48.一种治疗犬类的疼痛的方法，所述方法包括向所述犬类施用治疗有效量的根据权利要求21至35中任一项所述的抗体或根据权利要求39所述的药物组合物。

49.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述与NGF相关的病症或所述疼痛是慢性疼痛、急性疼痛和/或炎性疼痛。

50.根据权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述与NGF相关的病症或所述疼痛是骨关节炎疼痛、背部疼痛、癌性疼痛和/或神经性疼痛。

51.根据权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述与NGF相关的病症或所述疼痛是与手术、断骨或骨折、牙科治疗、烧伤、割伤和/或分娩相关的疼痛。

52.根据权利要求40至51中任一项所述的方法，其中肠胃外施用所述抗体或所述药物组合物。

53.根据权利要求40至52中任一项所述的方法，其中所述抗体或所述药物组合物是通过肌肉内途径、腹膜内途径、脑脊髓内途径、皮下途径、动脉内途径、滑膜内途径、鞘内途径或吸入途径施用的。

54.根据权利要求40至53中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用IL17抗体、IL-5抗体、IL-31抗体、IL4抗体、IL13抗体、IL23抗体、IgE抗体、CD11α抗体、IL6R抗体、α4-整合素抗体、IL12抗体、IL1β抗体或抗BlyS抗体。

55.根据权利要求40至54中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用NGF激酶抑制剂、PI3K抑制剂、ras抑制剂、CGRP抑制剂、TNF抑制剂、IL17抑制剂、EGFR抑制剂和/或磷脂酶C途径抑制剂。

56.根据权利要求40至55中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用一种或多种疼痛治疗药物，如皮质类固醇、非甾体抗炎药(NSAID)、环氧合酶抑制剂、阿片类物质和/或大麻素。

57.根据权利要求40至56中任一项所述的方法，其中以每剂0.01mg/kg体重至100mg/kg体重范围内的量施用所述抗体。

58.根据权利要求40至57中任一项所述的方法，其中以2mg/kg体重的剂量施用所述抗体。

59.一种降低细胞中TNFα和/或NGF信号传导功能的方法，所述方法包括在允许所述抗体与TNFα和/或NGF结合的条件下向所述细胞暴露根据权利要求1至35中任一项所述的抗体或根据权利要求39所述的药物组合物，从而降低结合通过所述细胞的TNFα和/或NGF信号传导功能。

60.根据权利要求59所述的方法，其中将所述细胞离体暴露于所述抗体或所述药物组合物。

61.根据权利要求59所述的方法，其中将所述细胞在体内暴露于所述抗体或所述药物组合物。

62.根据权利要求59至61中任一项所述的方法，其中所述细胞是犬类细胞、猫类细胞或马类细胞。

63.一种用于检测来自伴生动物物种的样品中的TNFα和/或NGF的方法，所述方法包括在允许所述抗体与TNFα和/或NGF结合的条件下使所述样品与根据权利要求1至35中任一项所述的抗体或根据权利要求39所述的药物组合物接触，并且在所述样品中检测是否在所述抗体与TNFα和/或NGF之间形成复合物。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述样品是从犬类、猫类或马类获得的生物样品。