CN111704676A - 一种长效重组促红细胞生成素及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种长效重组促红细胞生成素（EPO），使用结扎的羧基末端肽(CTP)的人类绒毛膜促性腺激素β亚基（hCGβ）到促红细胞生成素的编码序列的手段。本发明还通过将一个或多个CTP序列连接到EPO的C端或/和N端来设计类似物。EPO‑CTP类似物被转染的CHO细胞，选择稳定的EPO类似物克隆。对所选类似物的生物活性在体内和体外进行测试。含有EPO和CTP序列的嵌合基因能够产生长效的EPO，可以仅需每周一次给患者注射使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种长效重组促红细胞生成素及其制备方法和应用，属于基因
构建技术领域。
背景技术
促红细胞生成素(EPO)是一种主要由肾脏毛细血管内皮细胞产生的34-kDa糖蛋白激素，通过刺激红细胞生成来调节红细胞的生成。肾组织氧合减少后，EPO合成增加，它与骨髓中红细胞前体上的特定受体结合，导致增殖、分化和红细胞压积增加。与EPO相关的生物反应包括细胞内信号分子(如信号转换器等转录因子)的激活和转录激活蛋白(STAT)的激活，从而导致细胞的生长和分化。EPO受体属于同型二聚化受体家族，需要受体二聚才能触发与EPO相关的生物反应。慢性肾病患者贫血是由多种因素造成的，其中最常见的是红细胞生成素水平异常低。促红细胞生成素缺乏症贫血被认为是晚期肾衰竭，而不是早期肾脏疾病。缺乏促红细胞生成素会导致人类和动物贫血。EPO被一个o链和三个n链的低聚糖链严重糖基化。结果发现，o型连接寡糖链对分泌、受体结合亲和力、体内外生物活性均无影响。另一方面，n链寡糖在体外没有活性，但对体内生物活性至关重要。编码人促红细胞生成素的基因在1985年被克隆，从而产生了重组人促红细胞生成素(rHuEPO)。大黄被成功地用于治疗与慢性肾病相关的贫血。它还被批准用于治疗与癌症、艾滋病毒感染相关的贫血，并在手术环境中用于减少输血。因此，临床治疗方案中可用的刺激剂用于治疗患者需要经常注射EPO。建议每周2-3次皮下注射或静脉注射。因此，可以预期，提高EPO的体内半衰期将减少每周的注射次数。既往研究表明，该分子的唾液酸碳水化合物含量与其血清半衰期和体内生物活性有直接关系。结果表明，将亚基的羧基末端肽(CTP)与FSH、TSH、GH和EPO cDNA的四个o链寡糖链位点结合，并不影响FSH、TSH、GH和EPO cDNA的分泌、受体结合亲和力和体外生物活性。另一方面，在体内，在蛋白质的主干上添加o型连接的低聚糖可显著延长半衰期和寿命。假设在EPO的主链上添加12个o链寡糖链可以显著延长EPO的寿命。因此，在目前的研究中,三个羧基末端（C端）hCGβ亚基的肽(CTP),每个包含四个O-linked低聚糖识别网站是融合n端(1)和c端(2)人类促红细胞生成素的编码序列,结果表明，连接两个CTPs到EPO的编码序列可以显著提高EPO的体内效力和半衰期。本申请目的是涉及一种治疗贫血的人长效促红细胞生成素的开发。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供一种长效重组促红细胞生成素及其制备方法和应用其目的在于：通过使用结扎的羧基末端肽(CTP)的人类绒毛膜促性腺激素β亚基到促红细胞生成素的编码序列的手段，将一个或多个CTP序列连接到EPO的C端或/和N端来设计类似物。
本发明提供一种长效重组促红细胞生成素包含序列的变异hCGβ羧基末端肽(CTP)，一个或多个CTP序列可以连接到EPO的N端或/和C端。
所述的EPO野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的CTP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
本发明进一步保护一种长效重组促红细胞生成素的制备方法，包括：使用重叠的聚合酶链反应(PCR)构造促红细胞生成素（EPO）的嵌合基因含有人类CGβ亚基的羧基末端肽（CTP）的序列，其中CGβ亚基可以 i)两个在C端, ii)一个在C端,另一个N端, iii)一个在N端，另两个在C端，iv)两个在C端，另外两个在N端，这些嵌合基因将被测序并克隆到含有LTR/CMV启动子的真核表达载体或任何其他真核细胞中，将构建的含有EPO和CTP序列的载体转染到CHO细胞中，选择稳定的克隆，收集稳定克隆的培养基，纯化EPO变异体。
作为本发明进一步的改进，所述嵌合基因的构建包括如下步骤：S1. 构建EPO-(CTP)2；S2. 构建CTP-EPO-CTP；S3.构建CTP-EPO-(CTP) 2；S4.构建(CTP)2-EPO-(CTP)2。
作为本发明进一步的改进，步骤S1的包括如下步骤：
所述的EPO-(CTP)2是两个CTP序列和hCGβ序列的盒基因被用作模板，其制备方法分三步进行:
1、引物1和引物2以hCGβ基因作为模板；引物1包含含有一个限制位点的CTP 5端序列，引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码；
2、引物3以EPO-(CTP)2基因作为模板，引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码，引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点；
3、1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和引物4的模板，用于放大CTP-EPO-CTP。
作为本发明进一步的改进，步骤S2的具体步骤如下：所述的CTP-EPO-CTP是两个CTP序列的EPO - (CTP) 2序列和hCGβ序列的盒基因被用作模板，其制备方法分三步进行:
1、引物1和引物2以hCGβ基因作为模板，引物1包含含有一个限制位点的CTP 5端序列，引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码；
2、引物3以EPO-(CTP)2基因作为模板，引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码，引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点；
3、1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和4的模板，用于放大CTP- EPO-(CTP)2；
作为本发明进一步的改进，步骤S3的具体步骤如下：所述的 CTP-EPO-(CTP) 2包含两个CTP序列的EPO - (CTP) 2序列和hCGβ序列的盒基因被用作模板，其制备方法分三步进行:
1、引物1和引物2以hCGβ基因作为模板，引物1包含含有一个限制位点的CTP 5端序列，引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码；
2、引物3以EPO-(CTP)2基因作为模板，引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码，引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点；
3、1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和4的模板，用于放大CTP- EPO-(CTP)2；
作为本发明进一步的改进，步骤S4的具体步骤如下：所述的(CTP)2-EPO-(CTP)2一个以EPO-(CTP)2编码序列为模板的盒基因分别包含2个CTP序列在EPO序列的N端和C端，(CTP)2-EPO -(CTP)2的构建采用重叠PCR技术，其制备方法分三步进行:
1、引物1和引物2以EPO-(CTP)2基因作为模板，引物1包含一个限制位点的CTP 5端序列，引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码；
2、引物3以EPO-(CTP)2基因为模板，引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码，引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点；
3、1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和4的模板，用于放大(CTP)2-EPO -(CTP)2。
本发明进一步保护上述长效重组促红细胞生成素在制备治疗治疗贫血药物中的应用。
本发明具有如下有益效果：开发一种长效人促红细胞生成素激素，通过使用结扎的羧基末端肽(CTP)的人类绒毛膜促性腺激素β亚基到促红细胞生成素的编码序列的手段。通过将一个或多个CTP序列连接到EPO的C端或/和N端来设计类似物。EPO-CTP类似物被转染的CHO细胞，选择稳定的EPO类似物克隆。对所选类似物的生物活性在体内和体外进行测试。含有EPO和CTP序列的嵌合基因能够产生长效的EPO，可以仅需每周一次给患者注射。
附图说明
图1为本发明实施例1中EPO-(CTP)2的序列结构图；
图2为本发明中实施例2中CTP-EPO-CTP的序列结构图；
图3为本发明中实施例3中CTP-EPO-(CTP) 2的序列结构图；
图4为本发明中实施例4中(CTP)2-EPO-(CTP)2的序列结构图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
本实施例的一种长效重组促红细胞生成素包含序列的变异hCGβ羧基末端肽(CTP)，一个或多个CTP序列可以连接到EPO的N端或/和C端。
实施例1：参照图1所示，其中EPO-(CTP)2是两个CTP序列和hCGβ序列的盒基因被用作模板，其制备方法为分三步进行:
步骤一、引物1和引物2以hCGβ基因作为模板；引物1包含含有一个限制位点的CTP 5端序列，引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码；
步骤二、引物3以EPO-(CTP)2基因作为模板，引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码，引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点；
步骤三、1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和引物4的模板，用于放大CTP-EPO-CTP。
实施例2：参照图2所示，所述的CTP-EPO-CTP是两个CTP序列的EPO - (CTP) 2序列和hCGβ序列的盒基因被用作模板，它构建采用重叠PCR技术，分三步进行:
引物1和引物2以hCGβ基因作为模板。引物1包含含有一个限制位点的CTP 5端序列。引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码。
引物3以EPO-(CTP)2基因作为模板。引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码。引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点。
1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和4的模板，用于放大CTP- EPO-(CTP)2。
实施例3：参照图3所示，所述的 CTP-EPO-(CTP) 2一个包含两个CTP序列的EPO -(CTP) 2序列和hCGβ序列的盒基因被用作模板，CTP- EPO -(CTP)2的构建采用重叠PCR技术，分三步进行:
引物1和引物2以hCGβ基因作为模板。引物1包含含有一个限制位点的CTP 5端序列。引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码。
引物3以EPO-(CTP)2基因作为模板。引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码。引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点。
1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和4的模板，用于放大CTP- EPO-(CTP)2。
实施例4：参照图四所示，所述的(CTP)2-EPO-(CTP)2一个以EPO-(CTP)2编码序列为模板的盒基因分别包含2个CTP序列在EPO序列的N端和C端。(CTP)2- EPO -(CTP)2的构建采用重叠PCR技术，分三步进行:
引物1和引物2以EPO-(CTP)2基因作为的模板。引物1包含含有一个限制位点的CTP 5端序列。引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码。
引物3以EPO-(CTP)2基因为模板。引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码。引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点。
1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和4的模板，用于放大(CTP)2-EPO -(CTP)2。
本发明关于在体内的研究，雄性ICR小鼠将被安置在有空调的小房间，有12小时的亮/暗时间表。标准的食物和水是随意提供的。动物将使用EPO变体进行治疗：其中EPO-野生型每周处理1 - 3次，本EPO变异体每周处理1次。动物称重，每只皮下SC均相同数量的EPO变异体(0.2mL/只动物)。治疗频率为每周三次(第1、3、5天)或每周一次。血球压积水平每周测定三次，三周后停止实验。血压测定将使用麻醉状态下从下腔静脉填充两个肝素化微红细胞压积管获得的血样。此外，由于这些细胞在发育成成熟的红细胞之前在血液中存在约48小时，所以将使用网织红细胞计数。网织红细胞用来评价对急性实验系统是适当的。通过心脏穿刺从每只幼犬身上取血，放置于EDTA涂层管。然后混合亮甲酚蓝，在37◦C下培养20分钟。然后将血迹和污迹涂抹在玻片上，使用100倍油物镜评估网织红细胞个数。将静脉注射20IU（每只动物）到雄性ICR小鼠体内，测定EPO-WT和EPO-CTPs的代谢清除率。在注射后选定的时间间隔，收集血样，通过RIA测定EPO免疫反应活性。EPO-CTP类似物被转染的CHO细胞，选择稳定的EPO类似物克隆。对所选类似物的生物活性在体内和体外进行测试。含有EPO和CTP序列的嵌合基因能够产生长效的EPO，可以仅需每周一次给患者注射。
本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。
序列表
<110> 上海延立药业有限公司
<120> 一种长效重组促红细胞生成素及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 193
<212> PRT
<213> EPO野生型的氨基酸(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Thr Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Thr Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> CTP的氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25
Claims (8)
1.一种长效重组促红细胞生成素，其特征在于：包含序列的变异hCGβ羧基末端肽(CTP)，一个或多个CTP序列可以连接到EPO的N端或/和C端；
所述的EPO野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的CTP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种权利要求1所述的长效重组促红细胞生成素的制备方法，其特征在于：方法为：使用重叠的聚合酶链反应(PCR)构造促红细胞生成素（EPO）的嵌合基因含有人类CGβ亚基的羧基末端肽（CTP）的序列，其中CGβ亚基可以 i)两个在C端, ii)一个在C端,另一个N端,iii)一个在N端，另两个在C端，iv)两个在C端，另外两个在N端，这些嵌合基因将被测序并克隆到含有LTR/CMV启动子的真核表达载体或任何其他真核细胞中，将构建的含有EPO和CTP序列的载体转染到CHO细胞中，然后选择稳定的克隆，收集稳定克隆的培养基，纯化EPO变异体。
3.根据权利要求2所述一种长效重组促红细胞生成素的制备方法，其特征在于，所述嵌合基因的构建包括如下步骤：（S1）.构建EPO-(CTP)2；（S2）. 构建CTP-EPO-CTP；（S3）.构建CTP-EPO-(CTP) 2；（S4）.构建(CTP)2-EPO-(CTP)2。
4.根据权利要求3所述一种长效重组促红细胞生成素的制备方法，其特征在于：步骤（S1）包括如下步骤：所述的EPO-(CTP)2是两个CTP序列和hCGβ序列的盒基因被用作模板，其构建方法分三步进行:（1）、引物1和引物2以hCGβ基因作为模板；引物1包含含有一个限制位点的CTP 5端序列，引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码；
（2）、引物3以EPO-(CTP)2基因作为模板，引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码，引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点；
（3）、1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和引物4的模板，用于放大CTP-EPO-CTP。
5.根据权利要求3所述一种长效重组促红细胞生成素的制备方法，其特征在于，步骤（S2）的具体步骤如下：所述的CTP-EPO-CTP是两个CTP序列的EPO - (CTP) 2序列和hCGβ序列的盒基因被用作模板，其制备方法分三步进行:
（1）、引物1和引物2以hCGβ基因作为模板，引物1包含含有一个限制位点的CTP 5端序列，引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码；
（2）、引物3以EPO-(CTP)2基因作为模板，引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码，引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点；
（3）、1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和4的模板，用于放大CTP- EPO-(CTP)2。
6.根据权利要求3所述一种长效重组促红细胞生成素的制备方法，其特征在于：步骤（S3）的具体步骤如下：所述的 CTP-EPO-(CTP) 2包含两个CTP序列的EPO - (CTP) 2序列和hCGβ序列的盒基因被用作模板，其制备方法分三步进行:
（1）、引物1和引物2以hCGβ基因作为模板，引物1包含含有一个限制位点的CTP 5端序列，引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码；
（2）、引物3以EPO-(CTP)2基因作为模板，引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码，引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点；
（3）、1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和4的模板，用于放大CTP- EPO-(CTP)2。
7.根据权利要求3所述一种长效重组促红细胞生成素的制备方法，其特征在于：步骤(S4)的具体步骤如下：所述的(CTP)2-EPO-(CTP)2一个以EPO-(CTP)2编码序列为模板的盒基因分别包含2个CTP序列在EPO序列的N端和C端，(CTP)2- EPO -(CTP)2的构建采用重叠PCR技术，其制备方法分三步进行:
(1)、引物1和引物2以EPO-(CTP)2基因作为模板，引物1包含一个限制位点的CTP 5端序列，引物2包含EPO序列的前4个基码和CTP 3端序列的后4个基码；
(2)、引物3以EPO-(CTP)2基因为模板，引物3包含CTP 3端序列的后4个基码和EPO序列的前4个基码，引物4包含CTP 3端序列的后4个基码和一个限制位点；
(3)、1号和2号反应的DNA模板被用作引物1和4的模板，用于放大(CTP)2-EPO -(CTP)2。
8.权利要求1所述的一种长效重组促红细胞生成素在制备治疗贫血药物中的应用。
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-
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